Test aktywacji bazofilów - praktyczne aspekty cytometrycznej diagnostyki alergii oddechowych

PRACE ORYGINALNE Małgorzata LEŚNIAK Wojciech DYGA Grzegorz PORĘBSKI Ewa CZARNOBILSKA Test aktywacji bazofilów - praktyczne aspekty cytometrycznej diagnostyki alergii oddechowych Basophil activation test - a practical approach to diagnosis of common respiratory allergy Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej Katedra Toksykologii i Chorób Środowiskowych Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Kierownik: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska Dodatkowe słowa kluczowe: test aktywacji bazofilów techniczne aspekty BAT Additional key words: basophil activation test technical aspects of BAT Adres do korespondencji: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej CMUJ 31-531 Kraków, ul. Śniadeckich 10 Tel. (12) 424 88 98, fax: (12) 423 11 22 e-mail: ewa.czarnobilska@uj.edu.pl Wstęp: Diagnostyka alergii IgEzależnej opiera się na wywiadzie oraz badaniach dodatkowych, takich jak testy skórne punktowe (skin prick test, SPT) i/lub oznaczenia swoistych IgE (sige). Test aktywacji bazofilów (basophil activation test, BAT) może uzupełniać te metody, wyeliminować ich wady i potencjalnie zastąpić testy prowokacji, np. test prowokacji donosowej (nasal provocation test, NPT). W naszym badaniu ocenialiśmy wpływ czasu przechowywania próbki krwi na wynik testu aktywacji bazofilów. Dodatkowo porównaliśmy wyniki BAT z SPT, sige i NPT dla pospolitych alergenów wziewnych. Materiał i metodyka: BAT przeprowadzono u 12 pacjentów z alergicznym nieżytem nosa i alergią na pyłek brzozy lub roztocze kurzu domowego po 1, 4 oraz 24 godzinach od pobrania próbki krwi. Jako markera aktywacji bazofilów używano CD63. Stosowano trzy seryjne 10-krotne rozcieńczenia (1:1, 1:10, 1:100) alergenu. Do drugiej części zakwalifikowano 10 pacjentów z sugestywnym wywiadem alergii na roztocze kurzu domowego. Przeprowadzono pełną diagnostykę alergologiczną obejmującą: SPT, oznaczenia sige, NPT oraz BAT. Krzywe ROC (receiver operating characteristics curves) użyto do porównania wartości diagnostycznej testów, uwzględniając techniczne aspekty wykonywania BAT. Wyniki: Aktywacja bazofilów przedstawiona jako indeks stymulacji (stimulation index, SI) nie zmniejszyła się znacząco przez 24 godziny obserwacji. Stymulacja badanymi alergenami spowodowała wzrost aktywacji bazofilów mierzonej na podstawie ekspresji CD63. Nie obserwowano istotnych różnic w wynikach zastosowanych metod diagnostycznych ocenianych przez porównanie krzywych ROC. Wnioski: Diagnostyka cytometryczna oparta na pomiarze stymulowanej alergenem ekspresji markerów aktywacji bazofilów jest użytecznym testem in vitro pozwalającym zidentyfikować klinicznie istotny alergen. BAT z alergenami wziewnymi można wykonywać przez okres 24 godzin od pobrania Background: The diagnosis of immediate allergy is based on clinical data, skin prick tests (SPT), and measurements of allergen-specific IgE (sige). Basophil activation test (BAT) can supplement these methods and obviate their disadvantages, and possibly replace allergen challenge tests, such as a nasal provocative test (NPT). In this study, we assessed the influence of different storage times on BAT results. Futhermore, we compared the results of SPT, sige and NPT against BAT for common aeroallergens. Methods: BAT was performed in twelve patients with allergic rhinitis sensitized to birch pollen or mites 1, 4 and 24 hours after blood sampling. CD63 was used as an activation marker. Three serial 10-fold dilutions (1:1, 1:10, 100) of allergen extract were employed. The further 10 individuals allergic to mites undergone complete diagnostic evaluation including SPT, sige measurements, NPT and BAT. Receiver operating characteristic (ROC) curves were used to compare the diagnostic techniques and tests conditions. Results: Basophil activation expressed as stimulation index did not decline significantly up to 24h. Exposure to causal allergens resulted in a dose-dependent increase in expression of CD63 on peripheral blood basophils in tested individuals. We did not observed substantial differences in results of the investigated diagnostic methods determined by a ROC analysis. Conclusions: Flow-assisted diagnosis of common respiratory allergy relies upon allergen-induced activation of blood basophils can be a useful approach to determine the clinically relevant allergen in sensitized individuals. BAT with inhaled allergens can be performed within 24 hours after blood collecting into a tube with EDTA. Allergen suitable for NPT in appropriate dilutions is a good reagent for use in BAT. Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 12 725

krwi do probówki z EDTA. Alergen przeznaczony do NPT w odpowiednich rozcieńczeniach jest dobrym odczynnikiem do stosowania w BAT. Wstęp Diagnostyka alergologiczna IgE-zależnej alergii obejmuje wywiad i badania dodatkowe, takie jak: testy skórne punktowe (skin prick test, SPT) i/lub oznaczenia swoistych IgE (sige) oraz w niektórych przypadkach próby prowokacji. Niestety nie zawsze możliwa jest identyfikacja alergenu dającego objawy kliniczne. Dlatego od dawna poszukuje się testów in vitro, które mogą uzupełnić i/lub zastąpić obecnie stosowane metody. Test aktywacji bazofilów (basophil activation test, BAT) jest badaniem cytometrycznym oceniającym stopień aktywacji komórek po stymulacji alergenem. Pierwszy protokół oparty na pomiarze ekspresji CD63 został opracowany przez Sainte-Laudy i Sabbah w 1994 roku, a opis tej techniki opublikowano w 1996 roku. Na rycinie 1 przedstawiono schemat aktywacji bazofilów podczas BAT. W ostatnich latach trwają intensywne prace nad udoskonaleniem protokołu badania [1]. BAT jest stosowany jako test diagnostyczny w alergii wziewnej, na jady owadów błonkoskrzydłych, na leki, na pokarmy, na lateks, w pokrzywce oraz w monitorowaniu immunoterapii. Mimo ogromnego zainteresowania badaczy, nadal istnieją znaczne różnice w metodyce wykonywania tego testu pomiędzy różnymi ośrodkami oraz problemy techniczne, które nie zostały rozwiązane. Wśród członków Europejskiej Akademii Alergologii i Immunologii (European Academy of Allergy and Clinical Immunology, EAACI) wyodrębniła się grupa robocza zainteresowana oceną zastosowania BAT w praktyce klinicznej (The European Interest Group for the Evaluation of BAT in clinical routine, EuroBAT). Badacze stosują komercyjnie dostępne testy lub wdrażają własne protokoły. Pierwszą generację zestawów do wykonywania BAT stanowią: BASOTEST, Orpegen, Heidelberg, Germany; Fastimmune, Becton Dickinson, Mountain View, Calif., USA i FlowCast, Bühlmann Laboratories, Allschwil, Switzerland. Modyfikacja to test Allergenicity, Beckmann-Coulter, Marseille, France; dostępne są też nowe testy drugiej generacji. Markery takie jak: IgE, CCR3 i CD123 są powszechnie wykorzystane do identyfikacji bazofilów, natomiast CD63 i CD203c do oceny ich aktywacji [2-6]. Poprawne wykonanie badania wymaga dbałości o szczegóły, począwszy od przygotowania pacjenta, pobrania próbki krwi, przez monitorowanie czasu i temperatury jej przechowywania, po opracowanie materiału. Pacjent do badania powinien się zgłosić na czczo. Nie ma konieczności przerywania stosowania doustnych leków przeciwhistaminowych, natomiast poleca się zrezygnowanie z przyjmowania glikokortykosteroidów systemowych przez 7 dni przed testem [7,8]. Należy również pamiętać, że leki immunosupresyjne i immunomodulujące mogą zmniejszać, a nawet znosić odpowiedź bazofilów na stymulację, np. cyklosporyna A ma działanie hamujące ekspresję CD203c. Podobnie statyny wpływają na IgE-zależną regulację CD203c. Badania naukowe wskazują również na wpływ preinkubacji z chlorochiną, dapsonem, mizolastyną i lidokainą na aktywację mierzoną za pośrednictwem CD63 [9]. W zależności od metody krew jest pobierana do probówek z wersenianem sodu (EDTA), cytrynianem lub z heparyną. Zastosowanie EDTA jako podłoża pozwala wyeliminować wpływ trombocytów na aktywację. Czas pobrania próbki jest istotny z uwagi na dobową zmienność ekspresji CD203c pod wpływem stymulacji alergenem obserwowano niższe wartości aktywacji w godzinach wieczornych u pacjentów z sezonowym alergicznym nieżytem nosa [10]. BAT można wykonywać z krwi pełnej lub izolowanych komórek [11]. Mimo, iż eksperymenty prowadzone na izolowanych bazofilach niosą ryzyko przypadkowego ich zniszczenia lub aktywacji, to przez eliminację wpływu innych składników osocza umożliwiają zwiększenie czułości testu. Izolacja komórek jest prowadzona za pomocą metod wirowania lub przy zastosowaniu gradientu gęstości. Z kolei zastosowanie krwi pełnej jest prostsze technicznie, a obecność wszystkich składników krwi może lepiej odzwierciedlać fizjologiczne i patologiczne warunki in vivo [12]. Bazofile, aby zareagować natychmiast po stymulacji, wymagają optymalnej temperatury, odpowiednich czasów inkubacji i właściwego składu buforu do rozcieńczania odczynników. Niektórzy autorzy postulują, że krótka preinkubacja z IL-3 może zwiększyć czułość testów opartych na pomiarze CD63. Jednak IL-3 zwiększa ekspresję Rycina 1 Mechanizm testu aktywacji bazofilów. Mechanism of basophil activation test. Na podstawie: Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH, Schuerwegh AJ, De Clerck LS, Stevens WJ: In vitro allergy diagnosis: should we follow the flow? Clin Exp Allergy 2004; 34: 332-339 modyfikacja własna. CD203c na nieaktywowanych bazofilach i zmniejsza czułość BAT z CD203c, dlatego jej zastosowanie jest kontrowersyjne [13]. Prawidłowa interpretacja BAT wymaga uwzględnienia odpowiedniej kontroli negatywnej oraz pozytywnej. Kontrola negatywna ocenia spontaniczną ekspresję markerów aktywacji. Przeprowadza się ją przez inkubację komórek w roztworze płuczącym. Ilość aktywowanych bazofilów w kontroli negatywnej nie przekracza zwykle 5% (w wieloośrodkowych badaniach stymulacja 0%-5% u 79,9%; 5%-10% u 13,6%; powyżej 10% u 6,5% osób) [14]. Jako kontroli pozytywnej specyficznej używa się przeciwciała anty-ige. Alternatywą jest monoklonalne przeciwciało anty-fcεri. W przypadku braku odpowiedzi na anty-ige lub anty-fcεri wykorzystuje się IgE-niezależne bodźce, takie jak N-formyl-etionyl-leucylo fenyloalanina (fmlp). W prawidłowo przeprowadzonym teście pozytywnej stymulacji powinniśmy uzyskać >10% aktywowanych bazofilów. Kontrola pozytywna niespecyficzna z fmlp może być wykorzystywana do określenia żywotności komórek [15]. Przy ocenie wyniku testu aktywacji bazofilów należy wziąć pod uwagę chorych, u których po stymulacji kontrolą pozytywną specyficzną bazofile nie są aktywowane i nie wydzielają mediatorów. Populacja ta określana mianem niewydzielaczy (non-responders) stanowi około 10% badanych. Pomimo prawidłowej ekspresji receptorów FcεRI na powierzchni bazofilów u tych osób, po stymulacji nie dochodzi do wydzielania histaminy lub jej ilość jest minimalna. Niektórzy autorzy sugerują, że przyczyną jest zmniejszona aktywność kinazy tyrozynowej Syk, jak również zaburzenia kinaz Fyn i Lyn. Udowodniono, że brak reakcji nie jest zależny od struktury łańcucha FcεRI. Ponadto opisano wpływ zewnątrzkomórkowego stężenia wapnia na ekspresję markerów powierzchniowych. W przypadku niskiego poziomu Ca 2+ możemy mieć do czynienia ze zjawiskiem fałszywego non-responder [2,16]. Wyniki fałszywie ujemne mogą być tłumaczone przejściową refrakcją bazofilów spowodowaną niedawną ekspozycją na alergen. U tych pacjentów, w wyniku zużycia sige w czasie ostrego incydentu reakcji alergicznej, mogą występować przejściowo obniżone poziomy sige krążących i związanych z błoną komórkową. Dlatego należy odroczyć termin wykonania testu na 4-6 tygodni po ostrej reakcji alergicznej. Ponadto fałszywie ujemne wyniki mogą być związane z przyczynami technicznymi, takimi jak nieprawidłowe przechowywanie i transportowanie probówek czy stymulacja źle dobranymi alergenami. Alergeny używane do BAT powinny skutecznie aktywować bazofile oraz nie zawierać środków cytotoksycznych (dodatki, konserwanty) ani substancji niespecyficznie stymulujących (endotoksyny, lektyny) [7]. Nie ulega wątpliwości, że BAT należy wykonać możliwie szybko po pobraniu próbki krwi, wg różnych autorów do 3-4 godzin. Inni badacze twierdzą, że w odpowiednich 726 M. Leśniak i wsp.

warunkach można przechowywać materiał do 24, a nawet 48 godzin [4]. Z uwagi na konieczność przeprowadzania testu w laboratorium posiadającym odpowiedni sprzęt i doświadczony w cytometrii personel, dokładne określenie, jak długo po pobraniu można transportować materiał ma istotne znaczenie dla rozpowszechnienia BAT. Cel pracy Celem badania była ocena wpływu czasu przechowywania próbki na wynik testu z alergenami wziewnymi oraz porównanie komercyjnie dostępnego wyciągu alergenu z wyciągiem alergenu stosowanym w teście prowokacji donosowej (nasal provocation test, NPT) jako odczynników do stymulacji bazofilów podczas BAT. Materiał i metodyka W pierwszej części badania analizie poddano 12 próbek krwi pobranych od pacjentów z alergią wziewną na brzozę (Betula alba) lub roztocze kurzu domowego (Dermatophagoides pteronyssinus, Dp). BAT wykonywano trzykrotnie po godzinie, 4 godzinach oraz 24 godzinach od pobrania krwi. Krew była pobierana do probówek z EDTA, przechowywana w temperaturze 4 0 C. Do drugiej części zakwalifikowano 10 pacjentów z alergią wziewną na roztocze kurzu domowego BAT wykonywano zarówno z komercyjnie dostępnymi odczynnikami (Bühlman Laboratories), jak i z alergenami przeznaczonymi do wykonywania NPT (Allergopharma Nexter). BAT z alergenami do NPT przeprowadzono również u zdrowego ochotnika. Aktywację pod wpływem obu odczynników porównywano do wyników SPT, sige i NPT. Do wykonania BAT używano 400 μl krwi. Komórki były pobudzane roztworami alergenów w odpowiednich rozcieńczeniach 1:1, 1:10, 1:100. Aktywację bazofilów oceniono przez pomiar ekspresji antygenu CD63. Jednocześnie wykonano kontrolę pozytywną (degranulację za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-ige), kontrolę negatywną (z buforem do rozcieńczania alergenów, PBS) i próby badane. Stosowano mieszaninę przeciwciał monoklonalnych anty-cd63, anty-ccr3 sprzężonych z fluorochromami, odpowiednio izotiocjanianem fluoresceiny (FITC) i fikoerytryną (PE). Do próbki dodawano 100 μl roztworu aktywującego i 100 μl pełnej krwi obwodowej. Mieszanina po krótkim wytrząsaniu była inkubowana 15 minut w temperaturze 37 0 C i wilgotności >95%. Następnie zatrzymywano reakcję przez dodanie roztworu hamującego, erytrocyty lizowano z użyciem 2 ml roztworu lizującego i przepłukiwano dwukrotnie w 5 ml PBS, a następnie zawieszano w 0,5 ml roztworu utrwalającego. Próbki odczytywano na cytometrze przepływowym w ciągu pół godziny od zakończenia procedury przygotowawczej. Bazofile oznaczano jako komórki CCR3 + /SSC low. Analizę wykonano przy użyciu cytometru przepływowego FacsCalibur firmy Becton, Dickinson and Company (New Jersey, USA). Za wynik dodatni SPT (wyciągi alergenowe Allergopharma) przyjęto średnicę bąbla w odczynie testowym na badany alergen większą lub równą 3 mm. Za wynik dodatni sige uznano wartość powyżej 3,5 kui/l (UniCap Pharmacia, oznaczenie wykonywane według protokołu producenta). NPT interpretowano za pomocą skali objawów klinicznych uwzględniając: ilość wydzieliny nosowej (0-2 pkt), ilość kichnięć (0-2 pkt), świąd nosa (0-1 pkt), blokadę nosa (0-2 pkt), świąd podniebienia lub uszu (0-1 pkt), łzawienie lub zapalenie spojówek, pokrzywkę, kaszel lub duszność (0-1 pkt). Za wynik dodatni NPT przyjęto 3 punkty lub więcej. Wyniki BAT przedstawiono za pomocą indeksu stymulacji (stimulation indeks, SI) zdefiniowanego jako procent ilości bazofilów aktywowanych badanym alergenem w stosunku do procentu ilości bazofilów aktywowanych w kontroli niestymulowanej; przyjmując wynik większy lub równy 2 za dodatni. Do porównania wyników pomiędzy poszczególnymi punktami czasowymi użyto testu Wilcoxona. W drugiej części obliczeń w celu porównania komercyjnie dostępnego wyciągu alergenu z wyciągiem alergenu stosowanym w teście prowokacji donosowej analizowano pola pod krzywą ROC (receiver operating characteristic curve). Statystyka wyliczona została w oparciu o metodę nieparametryczną DeLonga. Wartość p<0,05 uznano za istotną statystycznie. Praca finansowana w ramach Projektu Badawczego CMUJ (praca statutowa K/ZDS/005621). Wyniki W badaniu zdrowego ochotnika odczynnik do NPT nie spowodował wzrostu aktywacji bazofilów. Na rycinie 2 przedstawiono przykładowy wynik analizy cytometrycznej testu aktywacji bazofilów u pacjenta z alergią na pyłek brzozy. Przez okres 24 godzin nie doszło do istotnych statystycznie zmian mediany aktywacji bazofilów w kontroli pozytywnej dla całej grupy, co przedstawiono na rycinie 3. Mediany indeksów stymulacji po 1 godzinie od pobrania krwi dla rozcieńczeń 1:1, 1:10 oraz 1:100 wynosiły odpowiednio 1,94 (zakres wartości od 0,44 do 204,09); 17,39 (0,52-203,93); 26,54 (0,41-204,84). Po upływie 4 godzin mediana wzrosła dla rozcieńczenia 1:1 do 5,71 (0,6-204,7) oraz dla 1:10 do 24,51 (2,41-201,77), natomiast dla rozcieńczenia 1:100 nieznacznie zmalała do 26,48 (5,38-205,61). Po 24 godzinach otrzymano następujące zmiany median: dla 1:1 do 4,23 (0,64-199,57); dla 1:10 do 25,09 (3,89-209,82); dla 1:100 do 24,95 (4,40-204,57). Porównując mediany indeksów stymulacji po 1 godzinie oraz po 24 godzinach od pobrania próbki, dla rozcieńczenia 1:1 oraz 1:10 otrzymano wzrost, a dla rozcieńczenia 1:100 spadek wartości. Wszystkie wyżej opisane zmiany nie były istotne statystycznie. Na rycinie 4 i rycinie 5 przedstawiono wpływ czasu przechowywania próbki na zmiany indeksu stymulacji dla poszczególnych rozcieńczeń. W porównaniu do SPT dla badanych odczynników otrzymaliśmy: - w rozcieńczeniu 1:1 dla odczynnika firmy Nexter wartości pola pod krzywą ROC (area under curve, AUC) równe 0,687, natomiast dla odczynnika firmy Bühlmann AUC=0,875; p=0,449; że przy zastosowaniu oryginalnego odczynnika w najmniejszym rozcieńczeniu uzyskuje się wartości bardziej zbliżone do wyników SPT - różnica nieistotna statystycznie.; - pokrywające się krzywe ROC dla rozcieńczenia 1:10, AUC=0,875; - w rozcieńczeniu 1:100 dla odczynnika Rycina 2 Wynik analizy cytometrycznej testu aktywacji bazofilów u pacjenta z alergią na pyłek brzozy; A) rozkład komórek pełnej krwi hemolizowanej z widocznymi populacjami limocytów, monocytów i ganulocytów; B) schemat bramkowania bazofilów na podstawie silnej ekspresji CCR3 i niskiego rozpraszania bocznego (SSC); C) schemat pomiaru ilości aktywowanych bazofilów na podstawie ekspresji CD63. Result of BAT cytometric analysis in patient with birch pollen allergy; A) Three discrete populations (lymphocytes, monocytes and granulocytes) of hemolysed whole blood in FSC/SSC histogram; B) Selection of entire basophil population on the base of positive CCR3 and low Side Scatter (SSC); C) Selection of activated fraction of basophiles on the base of high expression of CD63. Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 12 727

Rycina 3 Zależne od czasu zmiany mediany aktywacji w kontroli pozytywnej. Time-dependent changes in median basophil activation in the positive control. Rycina 4 Zależne od czasu zmiany wartości indeksów stymulacji dla badanych rozcieńczeń. Time-dependent changes in the stimulation index for analyzed dilutions. Rycina 5 Wpływ czasu przechowywania próbki na zmiany indeksu stymulacji. Influence of storage time of the sample to changes in stimulation index. Rycina 6 Porównanie krzywych ROC dla odczynników firmy Nexter i Bühlmann w rozcieńczeniu 1:100 do SPT. Comparison of ROC curves for reagents from Nexter and Bühlmann laboratory at a dilution 1: 100 to SPT. Skróty: IS - indeks stymulacji, Dp(N) - aktywacja bazofilów po stymulacji odczynnikiem firmy Nexter, Dp(B) aktywacja bazofilów po stymulacji odczynnikiem firmy Bühlmann. Abbreviations: IS - stimulation index, Dp (N) - activation of basophils after stimulation by the reagent from Nexter company, Dp (B) - activation of basophils after stimulation by the reagent from Bühlmann company. firmy Nexter AUC=0,937, natomiast dla odczynnika firmy Bühlmann AUC=0,875; p=0,999; co oznacza, że przy zastosowaniu nowego odczynnika uzyskuje się wartości bardziej zbliżone do wyników SPT różnica nieistotna statystycznie. W porównaniu do sige dla badanych odczynników otrzymaliśmy: - takie same wartości pola pod krzywą ROC dla rozcieńczenia 1:1, AUC=0,857; - pokrywające się krzywe ROC dla rozcieńczenia 1:10, AUC=0,857; - w rozcieńczeniu 1:100 dla odczynnika firmy Nexter AUC=0,904, natomiast dla odczynnika firmy Bühlmann AUC=0,809; p=0,371; co oznacza, że przy zastosowaniu nowego odczynnika uzyskuje się wartości bardziej zbliżone do wyników sige różnica nieistotna statystycznie. Porównanie obu odczynników do NPT dało następujące wyniki: - w rozcieńczeniu 1:1 dla odczynnika firmy Nexter AUC=0,761, natomiast dla odczynnika firmy Bühlmann AUC=0,571, p=0,615; co oznacza, że przy zastosowaniu nowego odczynnika w najmniejszym rozcieńczeniu uzyskuje się wartości bardziej zbliżone do wyników NPT - przewaga nieistotna statystycznie; - pokrywające się krzywe ROC dla rozcieńczenia 1:10, AUC=0,571; - w rozcieńczeniu 1:100 dla odczynnika firmy Nexter AUC=0,619, natomiast dla odczynnika firmy Bühlmann AUC=0,571, p=0,479; co oznacza, że przy zastosowaniu nowego odczynnika w największym rozcieńczeniu otrzymujemy wartości zbliżone do wyników NPT różnica nieistotna statystycznie. Na rycinach 6-8 przedstawiono porównania krzywych ROC dla reprezentatywnego rozcieńczenia 1:100. Dyskusja W 2009 i 2010 roku Sturm i wsp. [8,17] przeprowadzili dwa badania, w których wykazano, że przechowywanie próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza skutkuje spadkiem aktywacji bazofilów mierzonej przez ocenę ekspresji CD63 i CD203c u pacjentów z alergią na jady owadów błonkoskrzydłych. Co więcej, wyżej wymieniony efekt dla niższych stężeń stymulujących przeciwciał anty-ige zauważalny był już po 4 godzinach. Po 18 godzinach przechowywania próbki uzyskano kilka fałszywie negatywnych wyników BAT. Po 48 godzinach odnotowano aż 58,5% spadek aktywacji bazofilów w kontroli pozytywnej. Dlatego też autorzy rekomendują wykonanie testu do 3 godzin od pobrania krwi. Do innych wniosków dotyczących wpływu czasu na wynik BAT doszli Sousa i wsp. [18]. W badaniu autorów po stymulacji przeciwcia- 728 M. Leśniak i wsp.

Rycina 7 Porównanie krzywych ROC dla odczynników firmy Nexter i Bühlmann w rozcieńczeniu 1:100 do sige. Comparison of ROC curves for reagents from Nexter and Bühlmann laboratory at a dilution 1: 100 to sige. Skróty: IS - indeks stymulacji, Dp(N) - aktywacja bazofilów po stymulacji odczynnikiem firmy Nexter, Dp(B) aktywacja bazofilów po stymulacji odczynnikiem firmy Bühlmann. Abbreviations: IS - stimulation index, Dp (N) - activation of basophils after stimulation by the reagent from Nexter company, Dp (B) - activation of basophils after stimulation by the reagent from Bühlmann company. Rycina 8 Porównanie krzywych ROC dla odczynników firmy Nexter i Bühlmann w rozcieńczeniu 1:100 do NPT. Comparison of ROC curves for reagents from Nexter and Bühlmann laboratory at a dilution 1: 100 to NPT. Skróty: IS - indeks stymulacji, Dp(N) - aktywacja bazofilów po stymulacji odczynnikiem firmy Nexter, Dp(B) aktywacja bazofilów po stymulacji odczynnikiem firmy Bühlmann. Abbreviations: IS - stimulation index, Dp (N) - activation of basophils after stimulation by the reagent from Nexter company, Dp (B) - activation of basophils after stimulation by the reagent from Bühlmann company. łami anty-ige oraz alergenami Dp i tymotki (Phleum pretensje) aktywacja bazofilów była podobna w świeżo pobranych i przechowywanych przez 24 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza próbkach. Po 48 godzinach wynik testu był wciąż dodatni. Obserwowano utrzymywanie się na podobnym poziomie aktywacji bazofilów w próbkach pobranych na EDTA i na cytrynian. Niestety badanie zostało przeprowadzone w grupie jedynie 3 pacjentów. W naszym badaniu przez 24 godziny obserwacji zmiany w aktywności bazofilów nie były istotne statystycznie. Odpowiedni dobór roztworów alergenów jest warunkiem koniecznym prawidłowego wykonania BAT. Obecnie najczęściej stosuje się naturalne alergeny; należy jednak pamiętać, że mogą one mieć zmienny skład, zawierać czynniki nieswoiście stymulujące lub hamujące aktywację bazofilów. Dodatkowo, siła działania ekstraktów może zmniejszać się z upływem czasu, m.in. w wyniku degradacji białek. Komercyjnie dostępne wyciągi do wykonywania SPT nie zawsze są odpowiednie do zastosowania w BAT, ponieważ mogą zawierać substancje niespecyficznie aktywujące czy działające cytotoksycznie i/lub hamująco na bazofile [11,19]. Wg niektórych autorów ekstrakty glicerolu (<1%) mogą być stosowane w BAT tylko w rozcieńczeniach przekraczających 1:100 [20]. Do innych wniosków doszli Potapińska i wsp. [21] - autorzy zmierzyli odsetek aktywowanych bazofilów po wstępnej inkubacji w roztworze glicerolu oraz w soli fizjologicznej, który wynosił odpowiednio 4,8% i 3,85%. Dla rozcieńczeń1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500 i 1:1000 glicerol nie powodował niespecyficznej aktywacji bazofilów. Khan i wsp. [22] również używali tych samych alergenu do wykonania BAT i SPT; ekstrakty zawierały 50% glicerolu i 0,4% fenolu. Negatywną kontrolę stanowił 0,9% roztwór chlorku sodu w 50% glicerolu i 0,4% fenolu. Rozcieńczenia alergenów stosowane do BAT zostały dobrane we wstępnych eksperymentach, w których stosowano 5-, 10-, 50-, 100- i 1000- razy niższe stężenie niż w SPT; 100-krotnie niższe stężenie dawało najwyższy odsetek stymulacji ekspresji CD63. Stosując rekombinowane alergeny można uniknąć wpływu substancji niespecyficznie stymulujących lub hamujących [23]. Hauswirth i wsp. [24] inkubowali próbki krwi z kilkoma rozcieńczeniami (10-7 do 10 ng/ml) rekombinowanych alergenów brzozy (Bet v 1, Bet v 2) i traw (Phl p 1,Phl p 2, Phl p 5) i otrzymali zależny od stężenia wzrost ekspresji CD203c. Przyjmuje się, że pojedyncze stężenie alergenu nie jest wystarczające, aby przeanalizować odpowiedź bazofilów na stymulację. Udowodniono, że w praktyce z reguły wystarczające są dwa stężenia alergenów białkowych i trzy stężenia leków w rozcieńczeniach przynajmniej 1:5 [20]. Aby poprawnie zinterpretować wynik BAT bezwzględna liczba analizowanych bazofilów powinna wynosić co najmniej 150 [25]. Dodatni wynik BAT wskazuje na IgEzależną reakcję pod warunkiem, że został użyty odpowiedni alergen, który u zdrowego ochotnika nie powoduje aktywacji bazofilów oraz gdy uzyskano pozytywną odpowiedź w kontroli dodatniej. Podobnie negatywny wynik BAT może wykluczyć IgE-zależną reakcję. Odczynnik do NPT spełnia te wymagania [26]. Wynik BAT uznaje się za dodatni jeśli uzyskuje się odpowiednio wysoką ekspresję markerów aktywacji i/lub wartość indeksu stymulacji [27]. Literatura proponuje następujące kryteria dodatniego BAT: dla alergenów wziewnych i pokarmowych ekspresja markerów aktywacji >15%, dla jadów owadów błonkoskrzydłych >10%, a dla leków: antybiotyki ß-laktamowe >5% i SI >2, metamizol >5% i SI >5, aspiryna i NLPZ >5% i SI >2. Niestymulowane bazofile (kontrola negatywna) mogą wykazywać rożny procent aktywacji, dlatego też ważne jest uwzględnienie tej wartości w ocenie wyniku [28-31]. W naszym badaniu u jednego pacjenta procent aktywacji bazofilów w kontroli negatywnej wyniósł aż 32,3%, dlatego zdecydowaliśmy o zastosowaniu w analizie indeksu stymulacji. W celu ustalenia właściwych punktów odcięcia wartości dodatnich BAT dla każdego alergenu przydatne jest zastosowanie krzywej ROC. Krzywa ta może być używana, gdy dysponujemy wynikami badań od co najmniej 7 pacjentów [2]. Najczęściej stosuje się krzywą przedstawiającą zależność częstości występowania wartości prawdziwie dodatnich (czułość) od wartości fałszywie dodatnich (1-swoistość). Analiza krzywej ROC pozwala na ustalenie najbardziej akceptowalnego kompromisu pomiędzy czułością a swoistością testu, a tym samym osiągnięcie największej skuteczności w wykrywaniu uczulenia na konkretny alergen. Zdolność testu do prawidłowego różnicowania osób uczulonych od nieuczulonych rośnie w miarę zbliżania się krzywej do lewego górnego rogu wykresu [32]. W przedstawionym badaniu przy użyciu krzywych ROC wykazaliśmy, że zastosowanie odczynnika do NPT w BAT daje równie dobre wyniki jak odczynnika oryginalnego, przy czym korzyści z użycia nowego odczynnika rosną wraz ze wzrostem rozcieńczenia. Rozpuszczalnik w zestawie do NPT stanowi roztwór soli fizjologicznej stabilizowany wodorowęglanem sodu i konserwowany fenolem. Wnioskujemy, że większe rozcieńczenie odczynnika, czyli mniejsze stężenie fenolu w badanej próbie pozwala uzyskać bardziej wiarygodne wyniki BAT. Rozcieńczenie 1:10 daje wyniki analogiczne do oryginalnego odczynnika. Wnioski - BAT z alergenami wziewnymi można wykonywać przez okres 24 godzin od po- Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 12 729

brania krwi do probówki z EDTA, przechowywanej w temperaturze 4 o C. - Alergen przeznaczony do NPT w odpowiednich rozcieńczeniach jest dobrym odczynnikiem do stosowania w cytometrii. - Wyniki naszych badań mają znaczenie z perspektywy upowszechniania BAT, wprowadzenia tego testu do rutynowej diagnostyki alergologicznej i poszerzenia jego zastosowań w nowych obszarach laboratoryjnej diagnostyki alergologicznej [33]. Piśmiennictwo 1. Sabbah A, Sainte-Laudy J: Flow cytometry applied to the analysis of lymphocyte and basophil activation. ACI Int. 1996; 8: 116-119. 2. Hoffmann HJ, Santos AF, Mayorga C, Nopp A, Eberlein B. et al: The clinical utility of basophil activation testing in diagnosis and monitoring of allergic disease. Allergy 2015; doi: 10.1111/all.12698. [Epub ahead of print]. 3. de Weck AL, Sanz ML, Gamboa PM, Aberer W, Bienvenu J. et al: Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. Int Arch Allergy Immunol. 2008; 146: 177-189. 4. McGowan EC, Saini S: Update on the performance and application of basophil activation tests. Curr Allergy Asthma Rep. 2013; 13: 101-109. 5. Czarnobilska E, Gregorius A, Porebski G, Spiewak R, Sacha M: The benefits of using basophil activation test as a diagnostic tool prior to specific immunotherapy with inhalant allergens. Przegl Lek. 2012; 69: 1249-1253. 6. Mazur M, Czarnobilska E: Rola testu aktywacji bazofilów w diagnostyce i ocenie skuteczności immunoterapii swoistej chorób alergicznych. Alergol Immunol. 2012; 9: 16-20. 7. Wolanczyk-Medrala A, Gogolewski G, Liebhart J, Gomulka K, Litwa M. et al: A new variant of the basophil activation test for allergen-induced basophil CD63 upregulation. The effect of cetirizine. J Investig Allergol Clin Immunol. 2009; 19: 465-473. 8. Sturm EM, Kranzelbinder B, Heinemann A, Groselj- Strele A, Aberer W, Sturm GJ: CD203c-based basophil activation test in allergy diagnosis: characteristics and differences to CD63 upregulation. Cytometry B Clin Cytom. 2010; 78: 308-318. 9. Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH, Schuerwegh AJ, De Clerck LS, Stevens WJ: In vitro allergy diagnosis: should we follow the flow? Clin Exp Allergy 2004; 34: 332-339. 10. Ando N, Nakamura Y, Ishimaru K, Ogawa H, Okumura K. et al: Allergen specific basophil reactivity exhibits daily variations in seasonal allergic rhinitis. Allergy 2015; 70: 319-322. 11. Ebo DG, Bridts CH, Hagendorens MM, Aerts NE, De Clerck LS, Stevens WJ: Basophil activation test by flow cytometry: present and future applications in allergology. Cytometry B Clin Cytom. 2008; 74B: 201-210. 12. De Weck AL, Gamboa P, Sanz ML: Comparison of two commercial basophil activation cytofluorometric tests for the diagnosis of allergies and pseudoallergies. EAACI Paris. 2003: 369-370 (Abstr 1299). 13. Ocmant A, Peignois Y, Mulier S, Hanssens L, Michils A, Schandene L: Flow cytometry for basophil activation markers: the measurement of CD203c up-regulation is as reliable as CD63 expression in the diagnosis of cat allergy. J Immunol Methods 2007; 320: 40-48. 14. De Weck AL, Sanz ML, Gamboa PM, Aberer W, Sturm G. et al: Diagnosis of hypersensitivity tononsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in vitro by flow cytometry (Flow-CAST) and sulfidoleukotriene assay. A multicentric study. EAACI Vienna, 2006: (Abstr 654). 15. Piotrowicz-Wójcik K, Dyga W, Obtułowicz K: Test aktywacji bazofilów (CD63+): porównanie metod BAZOTEST Orpegen oraz Flow2CAST Bühlmann Laboratories. Alergol Immunol. 2010; 7: 16-18. 16. Jensen BM, Assing K, Hummelshoj L, Glue C, Skov PS, Poulsen LK: Are basophile histamine release and high affinity IgE receptor expression involved in asymptomatic skin sensitization? Allergy 2006; 61: 303-310. 17. Sturm GJ, Kranzelbinder B, Sturm EM, Heinemann A, Groselj-Strele A, Aberer W: The basophil activation test in the diagnosis of allergy: technical issues and critical factors. Allergy 2009; 64: 1319-1326. 18. Sousa N, Martinez-Aranguren R, Fernandez-Benitez M, Ribeiro F, Sanz ML: Comparison of basophil activation test results in blood preserved in acid citrate dextrose and EDTA. J Investig Allergol Clin Immunol. 2010; 20: 535-536. 19. Saporta M, Kamei S, Persi L, Bousquet J, Arnoux B: Basophil activation during pollen season in patients monosensitized to grass pollens. Allergy 2001; 56: 442-445. 20. De Week AL, Sanz ML, Gamboa PM, Aberer W, Bienvenu J. et al: Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 2008; 18: 143-155. 21. Potapińska O, Górska E, Zawadzka-Krajewska A, Kulus M, Wasik M, Demkow U: The usefulness of CD203c expression measurement on basophils after activation with grass pollen and Dermatophagoides pteronyssinus antigens. Preliminary study. Pneumonol Alergol Pol. 2009; 77: 138-144. 22. Khan FM, Ueno-Yamanouchi A, Serushago B, Bowen T, Lyon AW. et al: Basophil activation test compared to skin prick test and fluorescence enzyme immunoassay for aeroallergen-specific immunoglobulin-e. Allergy Asthma Clin Immunol. 2012; 8: 1-13. 23. Susani M, Jertschin P, Dolecek C, Sperr WR, Valent P. et al: High level expression of birch pollen profilin (Bet v 2) in Escherichia coli: purification and characterization of the recombinant allergen. Biochem Biophys Res Commun. 1995; 215: 250-263. 24. Hauswirth AW, Natter S, Ghannadan M, Majlesi Y, Schernthaner GH. et al: Recombinant allergens promote expression of CD203c on basophils in sensitized individuals. J Allergy Clin Immunol. 2002; 110: 102-109. 25. De Weck AL, Sanz ML: Flow cytometric Cellular Allergen Stimulation Test (FAST / Flow CAST): technical and clinical evaluation of a new diagnostic test in allergy and pseudoallergy. ACI International 2002; 14: 204-215. 26. Kleine-Tebbe J, Erdmann S, Knol EF, MacGlashan DW Jr, Poulsen LK, Gibbs BF: Diagnostic tests based on human basophils: potentials, pitfalls and perspectives. Int Arch Allergy Immunol. 2006; 141: 79-90. 27. Gamboa PM, Cáceres O, Antepara I, Sánchez- Monge R, Ahrazem O. et al: Two different profiles of peach allergy in the north of Spain. Allergy 2007; 62: 408-414. 28. Ebo DG, Sainte-Laudy J, Bridts CH, Mertens CH, Hagendorens MM: Flow-assisted allergy diagnosis: current application and future perspectives. Allergy 2006; 61: 1028-1039. 29. Boumiza R, Debard AL, Monneret G: The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clin Mol Allergy 2005; 3: 9-17. 30. Valent P, Hauswirth AW, Natter S, Sperr WR, Bühring HJ, Valenta R: Assays for measuring in vitro basophil activation induced by recombinant allergens. Methods 2004; 32: 265-270. 31. Sainte-Laudy J, Boumediene A, Touraine F, Orsel I, Brianchon C. et al: Use of both CD63 up regulation and IgE down regulation for the flow cytometric analysis of allergen induced basophil activation. Definition of an activation index. Inflamm Res. 2007; 56: 291-296. 32. Gregorius A, Śpiewak R: Podstawy racjonalnego wyboru testów diagnostycznych w alergologii. Alerg Astma Immun. 2013, 18: 221-230. 33. Schnyder B, Porebski G, Pichler WJ: Allergy workup of severe cutaneous adverse drug reactions: a light at the end of the tunnel? Br J Dermatol. 2013; 168: 463-464. 730 M. Leśniak i wsp.