Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Wydział Lekarski. Małgorzata Bulanda

Transkrypt

1 Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Wydział Lekarski Małgorzata Bulanda Zastosowanie testu aktywacji bazofilów (BAT) w immunoterapii swoistej (SIT) alergenami wziewnymi Praca doktorska Promotor: dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska, prof. UJ Pracę wykonano w Zakładzie Alergologii Klinicznej i Środowiskowej Katedry Toksykologii i Chorób Środowiskowych UJCM Kierownik jednostki: dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska, prof. UJ Kraków, 2017

2 Składam serdeczne podziękowania: Pani Profesor Ewie Czarnobilskiej za nadzór nad wszystkimi etapami związanymi z przygotowaniem niniejszej rozprawy, życzliwość oraz stworzenie atmosfery inspirującej do pracy naukowej; Pracownikom Centrum Alergologii Klinicznej i Środowiskowej SU za współpracę podczas realizacji badań; Mężowi za nieocenioną pomoc i poświęcony czas; Siostrze, Mamie i Babci za wsparcie.

3 Praca została sfinansowana ze środków pracy statutowej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego K/ZDS/005621

4 Spis treści I NOTA INFORMACYJNA... 6 II WSTĘP ) Epidemiologia chorób alergicznych atopowych ) Immunoterapia swoista (SIT)... 9 a) Definicja i mechanizm... 9 b) Wskazania, przeciwwskazania, działania niepożądane i skuteczność. 11 c) Kwalifikacja Wywiad, testy skórne punktowe, pomiar stężenia swoistych IgE Test prowokacji donosowej Test aktywacji bazofilów (BAT) Leśniak M, Leśniak M, Czarnobilska E. Użyteczność testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnych. Przegl Lek. 2015; 72(12): d) Monitorowanie III CEL PRACY IV MATERIAŁ I METODY V PUBLIKACJE ORYGINALNE Zakres artykułów wchodzących w skład rozprawy Rozdział 1: Zastosowanie BAT w kwalifikacji do SIT Leśniak M, Dyga W, Rusinek B, Mazur M, Czarnobilska E: Comparison of the basophil activation test versus the nasal provocation test in qualifying for specific immunotherapy. Pol Arch Med Wewn. 2016; 126 (7-8): Bulanda M, Dyga W, Rusinek B, Czarnobilska E. Rola testu aktywacji bazofilów (BAT) w kwalifikacji do immunoterapii swoistej z alergenami wziewnymi. Przegl Lek. 2016; 73 (12): Rozdział 2: Zastosowanie BAT w monitorowaniu SIT Czarnobilska E, Bulanda M, Śpiewak R. The usefulness of basophil activation test in the monitoring of specific immunotherapy with house dust mite allergens. Adv Dermatol Allergol. - praca przyjęta do druku

5 Rozdział 3: Metodologiczne aspekty BAT Leśniak M, Dyga W, Porębski G, Czarnobilska E. Test aktywacji bazofilów - praktyczne aspekty cytometrycznej diagnostyki alergii oddechowych. Przegl Lek. 2015; 72(12): VI WNIOSKI VII PODSUMOWANIE VIII PIŚMIENNICTWO IX STRESZCZENIE X ABSTRACT XI OŚWIADCZENIA WSPÓŁAUTORÓW

6 Nota informacyjna I NOTA INFORMACYJNA Niniejsza rozprawa doktorska pt. Zastosowanie testu aktywacji bazofilów (BAT) w immunoterapii swoistej (SIT) alergenami wziewnymi składa się ze spójnego tematycznie cyklu 4 artykułów oryginalnych oraz artykułu poglądowego opublikowanych i przyjętych do druku w czasopismach naukowych obecnych w bazie PubMed. Łączna wartość Impact Factor wynosi 3,396; punktacja MNiSW 70 pkt. W 3 publikacjach tj.: Użyteczność testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnych, Test aktywacji bazofilów - praktyczne aspekty cytometrycznej diagnostyki alergii oddechowych oraz Comparison of the basophil activation test versus the nasal provocation test in qualifying for specific immunotherapy autorka rozprawy Małgorzata Bulanda widnieje pod panieńskim nazwiskiem Leśniak. 6

7 Wstęp II WSTĘP 1) Epidemiologia chorób alergicznych atopowych Atopia jest to dziedziczna skłonność do nadmiernej produkcji immunoglobulin E (IgE) w reakcji na alergeny środowiskowe. Częstość występowania atopii diagnozowanej jako co najmniej jeden dodatni wynik testu skórnego punktowego (skin prick test, SPT) dla badanych alergenów wziewnych wynosi w zależności od rejonu geograficznego 30-50%, w Polsce wg badania ECAP (Epidemiologia Chorób Alergicznych w Polsce) 40%. Należy podkreślić, że znaczna część osób z atopią nie wykazuje jednak istotnych klinicznie objawów chorobowych [1-3]. Do chorób alergicznych atopowych zalicza się alergiczny nieżyt nosa (allergic rhinitis, AR), astmę oskrzelową oraz atopowe zapalenie skóry (atopic dermatitis, AD). Na rozwój chorób alergicznych atopowych wpływają czynniki genetyczne i środowiskowe. Zidentyfikowano 25 regionów chromosomalnych predysponujących do ich rozwoju [4]. Oprócz dobrze poznanych czynników środowiskowych jak np. palenie tytoniu, zanieczyszczenie środowiska, infekcje, leki czy nieodpowiednia dieta, także alergia u matki ma wpływ na ilość we krwi pępowinowej limfocytów T regulatorowych (Treg), których znacznie obniżone stężenie usposabia do rozwoju choroby atopowej u dziecka. Kolejnymi czynnikami zwiększającymi ryzyko wystąpienia np. astmy u płodu są stres psychiczny oraz otyłość u ciężarnej (BMI > 35) [5]. Już we krwi pępowinowej płodu obecne są biologiczne markery świadczące o zwiększonym prawdopodobieństwie rozwinięcia alergii w przyszłości. W duńskim badaniu z ośrodka w Odense zestawienie dodatniego wywiadu rodzinnego i stężenia cige > 0,5 ku/l we krwi pępowinowej prognozowało zwiększoną częstość alergii pokarmowej i/lub AD przez pierwsze 10 lat życia [6]. Układ odpornościowy organizmu jest kształtowany przez ogromną liczbę czynników, w tym tzw. mikrobiom, który jest odpowiedzialny za kolonizację przewodu pokarmowego, a zasadnicze znaczenie dla jego rozwoju ma pierwsze 1000 dni życia. Uważa się, że zaburzenia mikrobiomu są jedną z przyczyn chorób alergicznych atopowych [7,8]. W ostatnich latach obserwuje się wzrost częstości występowania chorób alergicznych na świecie, ze znacznym zróżnicowaniem ze względu na rejon geograficzny. Bez wątpienia są to jedne z najczęstszych schorzeń przewlekłych u dzieci i dorosłych [2]. W 1990 roku częstość występowania chorób alergicznych w Europie i USA szacowano na około 25% 7

8 Wstęp populacji. Według najnowszych danych ponad 35% populacji krajów europejskich zgłasza objawy alergii [2,9]. Wyniki badań epidemiologicznych przeprowadzonych w latach w ramach projektu ECAP wykazały, że choroby alergiczne o różnej manifestacji klinicznej występują u 30-40% mieszkańców Polski [10,11]. AR dotyczy około 600 mln ludzi na świecie, w tym 130 mln w Europie [4]. Średnia częstość występowania AR to 20,9% (od 4,6 % do ponad 45%) [2]. Wyniki dwóch badań epidemiologicznych ISAAC (International Study of Asthma and Allergies in Childhood) oraz ECRHS (European Community Respiratory Health Survey) wykazały, że częstość AR wśród dzieci i młodzieży wynosi od 1,4 do 39,7% [12-14]. AR został zdiagnozowany u 28,9% badanych przez ECAP [10,11]. Miejski Programu profilaktyki astmy i chorób alergicznych przeprowadzony w latach objął uczniów ze wszystkich krakowskich szkół: osób w wieku 7-8 lat i osób w wieku lat, wśród których AR występował u 26% do 30% [15-17]. Na świecie na astmę choruje około 300 mln ludzi (prognozowany jest wzrost tej liczby o 100 milionów do 2025 roku) [4], w tym około 30 mln w Europie, a w Polsce około 4 mln. Średnia częstość jej występowania wynosi od 1% do 18% [2]. Wg badań ISAAC i ECRHS astma dotyczy od 2,0 do 8,4% populacji [12-14], wg ECAP od 4,2% do 6,5% Polaków [10,11,18], a wg Programu profilaktyki astmy i chorób alergicznych 9% do 12% dzieci i młodzieży z Krakowa [15-17]. Należy podkreślić, że niedoszacowanie występowania astmy może wynosić nawet 70%. Śmiertelność z powodu astmy na świecie wykazuje od 2000 roku tendencje spadkową i nie koreluje z częstością występowania. W USA w latach wynosiła średnio 0,15 na 1000 chorych [2]. Częstość występowania AD na świecie szacuje się u dorosłych na 7,1%, u młodzieży na 8,5%, u dzieci na 11,5%, a w Polsce na od 4% u dorosłych do 9% u młodzieży i dzieci [2,19,20]. Choroby alergiczne atopowe często współistnieją ze sobą. U 50% chorych na AR występuje astma. Z kolei wśród pacjentów z astmą ponad 70% zgłasza objawy AR. Dowiedziono, że 20% dzieci chorujących na AD rozwija w wieku dorosłym astmę [2]. Zarówno AR jak i astma występują częściej u mieszkańców miast niż wsi, co potwierdza m.in. badanie ECAP; tendencja ta może być związana z zanieczyszczeniem środowiska [15-17]. Szacuje się, że suma kosztów pośrednich i bezpośrednich chorób alergicznych w Europie sięga 29 miliardów euro, w tym samej astmy 20 miliardów euro. Niewłaściwe decyzje dotyczące sposobu leczenia chorób alergicznych mogą być istotnym czynnikiem 8

9 Wstęp wpływającym na wydatki przeznaczone na ochronę zdrowia [2]. Możliwe do uniknięcia koszty pośrednie braku prawidłowego leczenia chorób alergicznych w Unii Europejskiej szacowane są w przedziale między 55 a 151 mld euro rocznie [21]. Alergia stanowi zatem problem zarówno zdrowotny, jak i ekonomiczny [4]. Jedyną skuteczną metodą leczenia alergicznych chorób atopowych obok ograniczania ekspozycji na uczulające alergeny jest immunoterapia swoista (specific immunotherapy, SIT) [22]. 2) Immunoterapia swoista (SIT) a) Definicja i mechanizm SIT polega na podawaniu wzrastających dawek alergenu w postaci szczepionki. Celem takiego postępowania jest wywołanie tolerancji na uczulający alergen poprzez zmniejszenie wytwarzania swoistych IgE (sige), zahamowanie degranulacji komórek tucznych oraz zmniejszenie zapalenia alergicznego i objawów klinicznych choroby. Ze względu na drogę podania alergenu wyróżniamy: immunoterapię podskórną (subcutaneous immunotherapy, SCIT) oraz podjęzykową (sublingual immunotherapy, SLIT). Immunoterapia donosowa i dooskrzelowa z powodu działań niepożądanych nie są rutynowo stosowane. Ze względu na rodzaje szczepionek alergenowych wyróżniamy: wodne wyciągi alergenowe niemodyfikowane, wodne wyciągi alergenowe modyfikowane fizycznie, alergoidy oraz szczepionki zawierające alergeny rekombinowane [23]. Najczęściej stosowany schemat SIT zakłada iniekcje podskórne szczepionek w dawkach wzrastających co 1-2 tygodnie, a dawek podtrzymujących co 4-8 tygodni. Szczepienie powinno być kontynuowane 3 do 5 lat do osiągnięcia optymalnego efektu terapeutycznego. Istnieją schematy przyśpieszonego SIT typu cluster lub ultra rush stosowane najczęściej w przypadku immunoterapii na jady owadów błonkoskrzydłych (venom immunotherapy, VIT) [24]. Obecnie uważa się, że SLIT jest również skuteczna i bezpieczna oraz stanowi wygodną alternatywę dla immunoterapii podskórnej, szczególnie u dzieci [25]. Mechanizm SIT polega na modyfikacji odpowiedzi układu immunologicznego osoby z alergią IgE-zależną. Intensywnie oceniana jest rola bazofilów w reakcji alergicznej i rozwoju ochronnej odpowiedzi immunologicznej podczas SIT. Przyjmuje się, że skoro stymulacja tych komórek in vitro przypomina mechanizm in vivo prowadzący do rozwoju objawów, to supresja indukowanej alergenem ekspresji markerów aktywacji może korelować z rozwojem klinicznej tolerancji. SIT moduluje progi aktywacji bazofilów oraz obniża mediowane przez IgE wydzielanie histaminy. Jeszcze w początkowej fazie dochodzi do 9

10 Wstęp zmniejszenia ilości tych komórek i stopnia ich aktywacji oraz spadku produkcji IL-4 i IL-13. Supresja aktywacji bazofilów, wyczerpanie zapasów mediatorów komórek efektorowych przez powtarzalną stymulację i ich uwalnianie jest uważane za kluczowy mechanizm ochronny we wczesnej fazie SIT. Dlatego potwierdzenie w testach diagnostycznych, np. w teście aktywacji bazofilów (basophil activation test, BAT) wczesnej desensytyzacji bazofilów jest dobrym predyktorem przyszłej skuteczności SIT [26-29]. Następnie pojawia się supresja alergenowo-swoistych limfocytów Th2, co obrazuje rozwój tolerancji na alergeny. Dochodzi do przewagi linii Th1. Kluczowy dla rozwoju tolerancji jest wzrost liczby i aktywności indukowalnych epitopowo-swoistych limfocytów Treg, które dzielimy na dwie populacje: tak zwane naturalne limfocyty regulatorowe (ntreg) oraz indukowane limfocyty regulatorowe (itreg). Limfocyty ntreg to komórki CD4+ CD25+, ich funkcjonalnym markerem jest cząsteczka FOXP3 (Forkhead Box P3), a najważniejszą rolą jest tłumienie reakcji układu odpornościowego w stosunku do autoantygenów. Limfocyty itreg zawierają dwie główne subpopulacje: limfocyty Th3 (FOXP3+, wydzielające transformujący czynnik wzrostu β (transforming growth factor, TGF-β)) i Tr1 (FOXP3-, wydzielające IL-10). Limfocyty Th3 odgrywają bardzo ważną rolę w układzie pokarmowym, broniąc organizm przed nadmiernymi reakcjami układu odpornościowego w stosunku do antygenów pokarmowych. Limfocyty Tr1 mają funkcję obronną w stosunku do alergenów, w tym aeroalergenów. W dłuższym okresie czasu trwania SIT liczebność limfocytów Tr1 we krwi maleje, co może być związane z ich redystrybucją bądź z zaangażowaniem w mechanizmy supresyjne innych komórek regulatorowych, na przykład limfocytów T CD4+CD25+FOXP3+ wytwarzających IL-10 i TGF-β [30]. IL-10 oraz TGF-β determinują skład mikrośrodowiska korzystnego dla rozwoju dalszych zjawisk immunotolerancji i supresji odpowiedzi Th2; powodują: zmniejszenie wytwarzania alergenowo-swoistych IgE, zmianę klasy wytwarzanych przeciwciał przez alergenowo-swoiste limfocyty B na alergenowo-swoiste IgG4 (sigg4), hamowanie degranulacji komórek tucznych pod wpływem alergenu, aktywację apoptozy eozynofilów i zmniejszenie tkankowego nacieku zapalnego. Dodatkowymi skutkami immunoterapii są wygaszanie zapalenia alergicznego, zmniejszenie wytwarzania śluzu w drogach oddechowych oraz hamowanie aktywności alergenowo-swoistych komórek dendrytycznych [23,31]. Jak wynika z ostatnich badań w rozwoju tolerancji na alergeny ważną rolę odgrywają również alergenowo-swoiste limfocyty B regulatorowe (Breg, CD73-CD25+CD71+). Nadal brakuje jednomyślności wśród badaczy co do zmian stężenia sige podczas SIT - na początku wykazuje ono tendencję wzrostową, a następnie podczas fazy podtrzymującej 10

11 Wstęp spadkową. Po kilku miesiącach odnotowuje się wzrost stężenia sigg4 oraz spadek stosunku sige/sigg4. Niektórzy obserwują również obniżenie stężeń alergenowo-swoistych IgG1 i IgA [22]. b) Wskazania, przeciwwskazania, działania niepożądane i skuteczność SIT jest stosowana u pacjentów z AR, astmą alergiczną (dobrze kontrolowaną), alergicznym zapaleniem spojówek (o ciężkim przebiegu), alergią na jady owadów błonkoskrzydłych i AD (o udowodnionym podłożu alergicznym). Wskazania obejmują: niedostateczną kontrolę objawów AR, alergicznego zapalenia spojówek oraz AD mimo farmakoterapii i unikania alergenów; wystąpienie działań ubocznych leków; przypadki, w których unikanie alergenów jest niemożliwe; chęć modyfikacji przebiegu choroby oraz zapobieganie ryzyku wystąpienia anafilaksji u pacjentów z alergią na jady owadów błonkoskrzydłych. Z punktu widzenia ekonomicznego SIT jest bardziej opłacalna w porównaniu do wieloletniego stosowania leków [23]. Przeciwwskazania obejmują: niekontrolowaną astmę oskrzelową, niedobory odporności, aktywne choroby nowotworowe, choroby autoimmunologiczne w których SIT może powodować progresję oraz wiek poniżej 5 lat. W trakcie ciąży: dopuszczalne jest wdrażanie VIT jedynie w izolowanych przypadkach zagrażających życiu reakcji na żądlenie, po rozważeniu ryzyka i korzyści; nie należy natomiast rozpoczynać SIT w alergii wziewnej; zalecana jest kontynuacja VIT w przypadku zagrażającej życiu alergii na jady owadów błonkoskrzydłych; można również kontynuować SIT w alergii wziewnej, jeśli leczenie jest dobrze tolerowane przez pacjentkę [23,32-34]. Przyjmowanie leków z grup β-adrenolityków i inhibitorów konwertazy angiotensyny jest względnym przeciwwskazaniem do podjęcia SIT. Duże rozpowszechnienie ich stosowania, trudności w zastąpieniu innymi preparatami oraz badania pokazujące bezpieczeństwo immunoterapii sprawiają, że przy zachowaniu starannego monitorowania można kwalifikować również tak leczonych pacjentów do SIT. Nie ulega wątpliwości, że VIT jest wskazana w przypadku alergii na jady owadów błonkoskrzydłych, mimo przyjmowania β-adrenolityków, gdyż ryzyko zgonu z powodu reakcji anafilaktycznej po użądleniu jest większe niż to związane z przeprowadzaniem VIT [35,36]. W wyselekcjonowanych przypadkach SIT może być wdrażana, mimo zdiagnozowanych chorób stanowiących względne przeciwwskazania. Przykładem jest stabilna, dobrze kontrolowana lekami choroba Hashimoto czy cukrzyca typu I po porozumieniu ze specjalistą endokrynologiem lub diabetologiem. W przypadku innych chorób autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane, miastenia, toczeń 11

12 Wstęp rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów i choroba Leśniowskiego-Crohna przed rozpoczęciem SIT należy indywidualnie ocenić przebieg i aktywność choroby [34]. Wg wytycznych polskiej grupy ekspertów w celiakii, łuszczycy i bielactwie SIT nie jest wskazana [37]. SIT u pacjentów ze stabilną dobrze kontrolowaną infekcją HIV w trakcie wysoce aktywnej terapii antyretrowirusowej (highly active antiretroviral therapy, HAART), z zahamowaną replikacją wirusa HIV i prawidłową liczbą limfocytów CD4 jest bezpieczna i nie wpływa negatywnie na przebieg choroby podstawowej, brakuje jednak danych dotyczących jej skuteczności [38]. Wg wytycznych niemieckiej grupy ekspertów także stabilna choroba nowotworowa w wywiadzie nie jest bezwzględnym przeciwwskazaniem do SIT [34,39]. Przy wdrażaniu i kontynuacji SIT należy uwzględniać zawarte w charakterystyce produktów leczniczych przeciwwskazania [37]. Działania niepożądane w przebiegu SIT występują nawet u 71% pacjentów, ale najczęściej są miejscowe i łagodne. Częstość występowania reakcji uogólnionych mieści się w zakresie od 0,05% do 3,2% wstrzyknięć lub 0,84% do 46,7% pacjentów. Większość z nich manifestuje się jako pokrzywka [40,41]. Podstawowymi czynnikami decydującym o skuteczności SIT jest prawidłowa kwalifikacja pacjenta oraz właściwy dobór składu szczepionki i odpowiednie dawkowanie. Jest to szczególnie trudne u pacjentów uczulonych na wiele alergenów [42]. Stąd rosnąca potrzeba wprowadzenia do praktyki klinicznej markera, który byłby użyteczny w kwalifikacji oraz pomógł wytypować pacjentów, którzy odniosą korzyści z SIT i monitorować skuteczność leczenia [22]. c) Kwalifikacja Wywiad, testy skórne punktowe, pomiar stężenia swoistych IgE Kwalifikacja do SIT wg wytycznych Europejskiej Akademii Alergologii i Immunologii (European Academy of Allergy and Clinical Immunology, EAACI) obejmuje wywiad oraz SPT i/lub oznaczenia stężenia sige [43,44]. SPT są pośrednim dowodem na związanie w skórze przeciwciał IgE z mastocytem i jego zdolność do degranulacji po swoistej prowokacji alergenowej. Mierzą reakcję skóry na uwolnioną histaminę. Za dodatni wynik SPT przyjmuje się średnicę bąbla 3 mm lub więcej przy ujemnej kontroli negatywnej. W dużej metaanalizie obejmującej badania opublikowane w EBM Reviews w okresie 2005 r r., Embase 1980 r r., Ovid MEDLINE(R) 1946 r r. czułość SPT określono na % a swoistość na 70-12

13 Wstęp 91%. Za przyczyny rozbieżności w analizowanych parametrach uznano umiejętności personelu wykonującego testy, rodzaj używanego zestawu (lancet, siłę działania i stabilność odczynników) oraz kolor i reaktywność skóry pacjentów [45]. Czułość i swoistość pomiaru stężenia sige zależą od stosowanej metody i wynoszą maksymalnie 90-94%. Za normę przyjmuje się stężenie < 0,35 IU/ml (klasa 0). Stężenie sige przekraczające 0,35 IU/ml (1 klasa) uważane jest za wynik dodatni [46], a za istotne klinicznie przyjmuje się wyniki sige 0,7 kui/l (klasa 2). Powyższe punkty odcięcia są ustalone arbitralnie i nie zawsze korelują z objawami. Ponadto wykazano, że stężenia sige mogą różnić się w zależności od wieku czy naturalnej ekspozycji na alergeny w środowisku [47-49]. Nie zawsze wyniki SPT korelują ze stężeniem sige, co obserwuje się głównie u dzieci [50]. Przykładowo w badaniu Schoos i wsp. opublikowanym w 2015 r. w Allergy obejmującym pacjentów w wieku 6 miesięcy, 1,5 roku, 4 i 6 lat zgodność wyników ww. testów dla alergenów wziewnych została oceniona na niską do umiarkowanej [51]. Test prowokacji donosowej Test prowokacji donosowej (nasal provocation test, NPT) w praktyce klinicznej jest stosowany gdy występuje niezgodność między wywiadem i wynikami badań oraz gdy stwierdzi się rozbieżności między badaniami in vivo (np. SPT) i in vitro (np. sige). Wykonuje się go także u pacjentów uczulonych na kilka alergenów, u których trudno zidentyfikować rolę każdego z nich w wywoływaniu objawów i ustalić wskazania do SIT [52]. Wg wytycznych niemieckiej grupy ekspertów, w przypadku symptomów całorocznego AR przed kwalifikacją do SIT powinno się potwierdzić istotność kliniczną uczulenia na roztocze kurzu domowego za pomocą NPT [34]. Z definicji NPT polega na podaniu alergenu na nabłonek przestrzeni wewnątrznosowej w celu obserwacji reakcji błony śluzowej górnych dróg oddechowych [53]. Odpowiedź na prowokację bada się za pomocą metod subiektywnych i/lub obiektywnych. Do najczęściej obserwowanych objawów zalicza się: świąd nosa, podniebienia lub uszu, kichanie, wydzielinę oraz blokadę nosową i łzawienie spojówek. Metody subiektywne i obiektywne wzajemnie się uzupełniają i mogą mieć samodzielne znaczenie dyskryminujące w ocenie próby [54-56]. Bez wątpienia NPT odgrywa istotną rolę w diagnostyce pacjentów z lokalnym alergicznym nieżytem nosa (local allergic rhinitis, LAR). Znaczna liczba osób z rozpoznanym wcześniej niealergicznym nieżytem nosa (non allergic rhinitis, NAR) lub idiopatycznym zapaleniem błony śluzowej nosa rozwija LAR z produkcją nosowej sige i pozytywną 13

14 Wstęp odpowiedzią na NPT [57]. Niestety wykonanie NPT wymaga uwzględnienia szeregu przeciwwskazań, odpowiedniego przygotowania pacjenta oraz wiąże się z wywołaniem objawów alergicznych. Bezwzględnymi przeciwwskazaniami do przeprowadzenia NPT są: wiek poniżej 3 lat, przebyta uogólniona reakcja anafilaktyczna, zaostrzenie choroby alergicznej, choroby dolnych dróg oddechowych z zaawansowanymi zaburzeniami restrykcyjnymi i obturacyjnymi, ciężkie postacie chorób ogólnoustrojowych, zaawansowana choroba niedokrwienna serca, ciąża, ostra bakteryjna lub wirusowa infekcja dróg oddechowych, obecność przeciwwskazań do podania adrenaliny, leczenie β-adrenolitykami i inhibitorami konwertazy angiotensyny, brak bezpośredniego dostępu do podstawowych leków oraz sprzętu do leczenia wstrząsu anafilaktycznego. Do względnych przeciwskazań należą: wszelkiego rodzaju deformacje nosa, polipy nosa, zanikowy nieżyt błony śluzowej nosa, mniej niż 6 tygodni odstępu od zakończenia objawów AR; szczepienie wykonane w ciągu tygodnia przed badaniem; mniej niż 8 tygodni odstępu od leczenia chirurgicznego nosa (szczególnie zabiegu korekcji małżowiny nosowej dolnej); ostre zakażenie górnych dróg oddechowych w ciągu 2-4 tygodni poprzedzających badanie. Przed prowokacją wymagane jest przygotowanie pacjenta obejmujące m.in. odpowiednio wczesne odstawienie leków (glikokortykosteroidów podawanych ogólnie - 4 tyg., glikokortykosteroidów donosowych - 4 tyg., leków antyleukotrienowych - 3 tyg., leków hipotensyjnych takich jak rezerpina i klonidyna - 3 tyg, trójcyklicznych i czterocyklicznych leków przeciwdepresyjnych - 3 tyg., ketotifenu - 2 tyg., leków przeciwhistaminowych podawanych ogólnie - 1 tydz., leków przeciwhistaminowych podawanych donosowo - 3 dni, nedokromilu - 3 dni, cholinolityków podawanych donosowo - 3 dni, α-mimetyków podawanych donosowo - 2 dni, a w przypadku nadużywania 2-3 tyg., α-mimetyków podawanych ogólnie - 2 dni, β-mimetyków podawanych wziewnie - 2 dni, metyloksantyn - 2 dni) [53,58-60]. NPT uważa się za stosunkowo bezpieczne badanie. Test ten wiąże się jednak ze sprowokowanym wystąpieniem objawów AR, które ustępują samoistnie w ciągu kilkunastu minut po zakończeniu badania, a gdy są bardzo dokuczliwe można je złagodzić podaniem donosowych leków przeciwhistaminowych oraz obkurczających błonę śluzową. Powikłania po NPT zdarzają się rzadko. Po prowokacji mogą wystąpić świąd i obrzęk części nosowej gardła, niedrożność trąbki słuchowej objawiająca się jako uczucie zatkanego ucha, zapalenie zatok, zapalenie spojówek. Należy pamiętać o możliwości wywołania przez NPT ostrych 14

15 Wstęp objawów ze strony krtani, kaszlu, skurczu oskrzeli, a nawet reakcji anafilaktycznej oraz późnej fazy reakcji alergicznej. Schematy postępowania w powikłaniach NPT są opracowane w wytycznych Standardy wykonywania donosowych prób prowokacyjnych [53,61]. Zdarzająca się niezgodność między wynikami SPT i NPT utrudnia jednoznaczne postawienie rozpoznania. U pacjentów z ujemnym wynikiem SPT i dodatnim NPT w diagnostyce różnicowej należy uwzględnić LAR oraz nieswoistą nadreaktywność błony śluzowej nosa. W tych przypadkach pomocna jest próba prowokacyjna z zimnym suchym powietrzem [62-64]. Nie ulega wątpliwości, że NPT jest czasochłonny i nie zawsze możliwy do wykonania, dlatego badacze zainteresowali się poszukiwaniem testu, który mógłby go zastąpić. Riechelmann i wsp. na grupie 95 pacjentów porównywali wyniki testu prowokacji dospojówkowej (conjunctival provocation tests, CPT) i NPT uzyskując wyniki zgodne w 90% [65]. Anantasit i wsp. wykonywali CPT i NPT u 55 dzieci z AR i alergią na roztocze kurzu domowego i stwierdzili, że prowokacja dospojówkowa może zastąpić donosową nawet u pacjentów, u których nie występują objawy spojówkowe [66]. Niestety CPT jest również badaniem in vivo. W związku z powyższymi poszukuje się alternatywnej metody in vitro nie narażającej chorych na wystąpienie objawów klinicznych. Takim testem jest test aktywacji bazofilów [67]. Test aktywacji bazofilów (BAT) Opis roli BAT w kwalifikacji do SIT zawarto w poniższej publikacji: Leśniak M, Leśniak M, Czarnobilska E. Użyteczność testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnych. Przegl Lek. 2015; 72(12):

16 PRACE POGLĄDOWE Małgorzata LEŚNIAK 1 Magdalena LEŚNIAK 2 Ewa CZARNOBILSKA 1 Użyteczność testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnych Usefulness of basophil activation test for the diagnosis of inhaled allergies 1 Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej Katedra Toksykologii i Chorób Środowiskowych Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Kierownik: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska 2 Studenckie Koło Naukowe przy Zakładzie Alergologii Klinicznej i Środowiskowej Dodatkowe słowa kluczowe: test aktywacji bazofilów alergia wziewna diagnostyka Additional key words: basophil activation test inhalant allergy diagnostics Choroby alergiczne to istotny problem zdrowotny. W ich diagnostyce kluczową rolę odgrywa dobrze zebrany wywiad uzupełniony wynikami badań dodatkowych. Cytometryczny test aktywacji bazofilów (basophil activation test, BAT) jest szeroko stosowaną techniką diagnostyczną m.in. w alergii wziewnej, pokarmowej, na jady owadów błonkoskrzydłych i na leki. Celem naszego przeglądu jest usystematyzowanie dostępnej wiedzy na temat możliwości zastosowania BAT, szczególnie w diagnostyce alergii wziewnych. Markerami aktywacji bazofilów o udowodnionej czułości i swoistości są CD63 oraz CD203c - obydwa mają swoich zwolenników i przeciwników wśród badaczy. Zastosowanie pierwszego jest popularniejsze ze względu na bezpośredni związek jego pojawienia się na błonie komórkowej z degranulacją bazofilów. Użyteczność BAT została potwierdzona w diagnostyce alergii na pyłki traw, drzew i roztocze kurzu domowego u dzieci i dorosłych. Podkreśla się porównywalną do rutynowo stosowanych testów czułość i wyższą (wynoszącą w większości badań 100%) swoistość testu. Wadą BAT może być obserwowana przez niektórych autorów nadreaktywność bazofilów u pacjentów atopowych, która prowadzi do pojawiania się wyników fałszywie dodatnich. Test aktywacji bazofilów wydaje się mieć istotną przewagę nad testami skórnymi pod względem bezpieczeństwa i z powodu braku potrzeby odstawienia leków przeciwhistaminowych przed badaniem. Przyszłe badania powinny skupić się nad zastosowaniem BAT w trudnych diagnostycznie przypadkach oraz w monitorowaniu immunoterapii. Allergic diseases are important health problems. Medical history and results of additional tests play a crucial role in the diagnosis. Cytometric basophil activation test (BAT) is widely evaluated technique in inhaled, food, Hymenoptera venom and drugs allergy. The aim of our review is to systematize the available knowledge about possibilities of applying BAT, especially in the diagnosis of inhaled allergies. Basophil activation markers with proven sensitivity and specificity are CD63 and CD203c - each of them has its supporters and opponents among researchers. Use of the first one is more popular because of the direct relation of its appearance on the cell membrane of basophils with degranulation. The usefulness of BAT has been confirmed in the diagnosis of grass pollen, trees and house dust mites allergies in children and adults. BAT has a comparable to the routinely used tests sensitivity and higher (in most studies evaluated as 100%) specificity. The disadvantage of BAT that has been observed by some authors is hyperreactivity of basophils in atopic patients, leading to the appearance of false positives results. Basophil activation test seems to have a significant advantage over skin tests due to safety and lack of necessary to withdrawal antihistamines medications. Future research should focus on the use of BAT in diagnostically difficult cases and in monitoring of immunotherapy. Adres do korespondencji: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej CMUJ Kraków, ul. Śniadeckich 10 Tel. (12) fax: (12) ewa.czarnobilska@uj.edu.pl Wstęp Choroby alergiczne to istotny problem zdrowotny, nieprzypadkowo nazywany epidemią XXI wieku. Kiedy Clemens von Pirquet wprowadził termin alergia, aby opisać patologiczną reakcję organizmu spowodowaną przez kontakt z antygenami, dotyczyła ona mniej niż 1% ludzkości. Obecnie ponad 30% mieszkańców krajów uprzemysłowionych cierpi na choroby wywołane alergenami, a wśród nich najczęściej: alergiczny nieżyt nosa, zapalenie spojówek, astmę oskrzelową, alergiczne choroby skóry czy alergie pokarmowe [1,2]. Mechanizm pojawienia się objawów klinicznych po kontakcie z alergenem jest złożony. Głównymi komórkami efektorowymi odpowiedzialnymi za rozwój IgE-zależnej reakcji alergicznej są bazofile i mastocyty. Na powierzchni ich błony komórkowej znajdują się receptory o wysokim powinowactwie dla immunoglobuliny E (FcεRI). Przegląd Lekarski 2015 / 72 /

17 Po ich związaniu z IgE u osób uczulonych dochodzi do mostkowania receptorów za pomocą cząsteczki alergenu, co prowadzi do degranulacji komórek. Bazofile mogą także być pobudzane przez komplement lub chemokiny. Aktywacja przebiega przez dwie główne drogi: anafilaktyczną lub stopniową. Skutkiem aktywacji bazofilów na drodze anafilaktycznej jest uwolnienie do przestrzeni pozakomórkowej mediatorów reakcji alergicznej, takich jak histamina i liczne cytokiny. Podczas stopniowej degranulacji nie dochodzi do egzocytozy. Efektem aktywacji są zmiany na powierzchni błony komórkowej, polegające między innymi na zwiększeniu ekspresji antygenów charakterystycznych dla stanu aktywacji, różnych w zależności od jej mechanizmu [3,4]. W diagnostyce alergii wziewnych kluczową rolę odgrywa dobrze zebrany wywiad, uzupełniony wynikami skórnych testów punktowych (skin prick test, SPT) i/lub pomiarem stężenia swoistych IgE (sige) w surowicy oraz niekiedy testami prowokacji swoistej. Niestety jest wiele przypadków, kiedy rutynowo stosowane badania in vivo i in vitro są niewystarczające lub przeciwwskazane. Dlatego też od wielu lat trwają poszukiwania testu in vitro, który mógłby uzupełnić i/lub zastąpić metody in vivo [5]. Ocena stężeń mediatorów reakcji alergicznych, takich jak histamina i cytokiny uwalnianych z ziarnistości bazofilów podczas degranulacji okazywała się bardzo czaso- i pracochłonna, a wyniki nie zawsze korelowały ze stanem klinicznym [6]. Badania Knola i wsp. [7], które w 1991 roku doprowadziły do odkrycia, że marker CD63 pojawia się na powierzchni bazofilów w momencie ich degranulacji, umożliwiły rozwój cytometrycznego testu aktywacji bazofilów (basophil activation test, BAT). W ciągu ostatnich lat opisano kilka protokołów przeprowadzania BAT i nowe markery aktywacji. Identyfikację bazofilów zapoczątkowano poprzez zastosowanie przeciwciał przeciwko powszechnemu dla leukocytów antygenowi CD45 oraz przeciw IgE. Obecnie ocenia się m.in. ekspresję IgE, CRTH2 lub CD123 oraz CCR3. Michova i wsp. [8] porównywali protokoły Basotest (OPREGEN Pharma, Heidelberg, Niemcy; marker identyfikacji - IgE, aktywacji - CD63 ) i BD FastImmune test (BD, San Jose, CA, USA; (marker identyfikacji - CD123 + / HLA-DR -, aktywacji - CD63) u pacjentów z alergią wziewną. Bez względu na metodę identyfikacji bazofilów uzyskali kolejno dla Basotest i FastImmune wysoką czułość (85% i 72%) oraz swoistość (100% i 92%). Korelacja między wynikami sige i testami cytometryczymi była wysoka: tau=0,92 (Basotest) i tau=0,71 (FastImmune). Autorzy reasumują, iż oba protokoły mogą być używane w diagnostyce alergii wziewnej, a FastImmune test jest szczególnie użyteczny w przypadku niskiej ekspresji IgE. Protokół CRTH2 + /CD3 - /CD203c + pozwala uzyskać wysoką czystość identyfikacji bazofilów, jego główną wadą jest jednak konieczność zastosowania trzech barwników. Bazofile można oznaczyć również jako CCR3 + / SSC low stosując dwa barwniki [3,9-11]. Markerami aktywacji bazofilów o udowodnionej wielokrotnie czułości i swoistości są obok Rycina 1 Schemat BAT. Diagram of BAT. 1, 3- Identyfikacja bazofila. 2- Identyfikacja aktywowanego bazofila. Na podst: Boumiza R, Debard AL, Monneret G.: The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clin Mol Allergy 2005; 3: modyfikacja własna. CD63 także CD203c i kinaza p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase). W pojedynczych badaniach opisano też zastosowanie CD164, CD107a, CD13 i CD69 [12-14]. Na rycinie 1 przedstawiono schemat protokołów aktywacji bazofila ocenianej w cytometrze przepływowym. O popularności testu aktywacji bazofilów i jego znaczeniu dla przyszłości diagnostyki alergologicznej świadczy wyodrębnienie się wśród członków Europejskiej Akademii Alergologii i Immunologii (European Academy of Allergy and Clinical Immunology, EAACI) grupy roboczej zainteresowanej oceną zastosowania BAT w praktyce klinicznej (The European Interest Group for the Evaluation of BAT in clinical routine, EuroBAT). Celem naszego przeglądu jest usystematyzowanie dostępnej wiedzy na temat możliwości zastosowania testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnych. Rola markera CD63 CD63, czyli związana z lizosomami glikoproteina błonowa (lysosomal-associated membrane glycoprotein 3, LAMP-3) należy do rodziny białek przezbłonowych tetraspanin. W spoczynku jest ona zlokalizowana w błonie wewnątrzkomórkowych ziarnistości. Po aktywacji FcεRI dochodzi do ekspresji CD63 na powierzchni bazofila [7]. Proces ten został opisany na przykładzie mastocytów u szczurów i potwierdzony również dla bazofilów: ziarnistości z CD63 osiągają błonę komórkową bardzo szybko po aktywacji - ze średnią prędkością 100 nm/s [15,16]. Większość CD63 jest związanymi z błoną integrynami i w ciągu pierwszych minut po stymulacji prawdopodobnie w mechanizmie zależnym od synaptotagminy dochodzi do ich odnowy [17-19]. Należy pamiętać, że aktywacja może być także zapoczątkowana przez czynniki preanalityczne [20] i indywidualnie ustalać punkt odcięcia, po przekroczeniu którego wynik BAT będzie uważany za dodatni [21]. Pâris-Köhler i wsp. [22] w 2000 roku analizowali możliwość zastosowania testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnej na alergeny pyłku cyprysa. Grupę badaną stanowiło 42 pacjentów: 34 z sugestywnym wywiadem, dodatnimi SPT i testem prowokacji donosowej (nasal provocation test, NPT) oraz 8 bezobjawowych osób z dodatnimi SPT, a grupę kontrolną 33 osoby z ujemnym wywiadem i wynikami badań. Wykonywano pomiary BAT, sige oraz u niektórych pacjentów test uwalniania histaminy (histamine release test, HRT). Test aktywacji bazofilów cechował się wyższą czułością (91,2%) niż oznaczenie sige (76%). Autorzy konkludują, że BAT jest użyteczny w diagnostyce alergii wziewnej na alergeny pyłku cyprysa. Sanz i wsp. [23] przeprowadzili duże badanie obejmujące następujące grupy pacjentów: 53 z alergią na roztocze kurzu domowego (Dermatophagoides pteronyssinus, Dp), 51 z alergią na życicę (Lolium perenne, Lp), 24 atopowych i nieuczulonych na Dp i Lp osób oraz 38 bez atopii i uczuleń na Dp i Lp. Wykazali znamienną korelację między wynikami BAT oraz SPT (r=0,72; p<0,001), HRT (r=0,80; p<0,001), testem komórkowego stymulowania alergenami (cellular antigen-stimulation test, CAST), w którym mierzono stężenie sulfidoleukotrienów (r=0,7; p<0,001) i sige (r=0,71; p<0,001). Autorzy podsumowują, że BAT jest wartościowym narzędziem w diagnostyce alergii wziewnych na roztocze kurzu domowego i trawy. González-Muñoz i wsp. [24] analizowali zastosowanie BAT w diagnostyce alergii u dzieci. U 2 z badanych otrzymali negatywny wynik SPT i BAT oraz fałszywie dodatni sige (>43 ku/l) dla roztoczy kurzu domowego. U tych samych pacjentów stwierdzili dodatnie SPT (>1 cm średnicy), BAT (>87%) oraz sige dla krewetek (>100 ku/l). Alergeny te 774 M. Leśniak i wsp. 17

18 wykazują reaktywność krzyżową. Autorzy podkreślają porównywalną do rutynowo stosowanych testów czułość i wyższą (wynoszącą w ich badaniu 100%) swoistość BAT. Czarnobilska i wsp. [25 32] u 52 pacjentów zakwalifikowanych do immunoterapii swoistej (specific immunotherapy, SIT) na podstawie wywiadu i wyników testów skórnych wykonywali dodatkowo BAT z pomiarem ekspresji CD63. Wynik testu aktywacji bazofilów weryfikował obecność swoistej nadwrażliwości na alergeny szczepionki i pozwolił odstąpić od niepotrzebnej SIT u 4 (7,7%) z 52 badanych pacjentów, a tym samym uniknąć długotrwałej, uciążliwej, kosztownej oraz nieskutecznej immunoterapii u nieprawidłowo zakwalifikowanych pacjentów. Khan i wsp. [33] w 2012 roku w grupie 41 atopowych pacjentów oraz 31-osobowej grupie kontrolnej (ujemny wywiad alergologiczny i wyniki SPT) porównywali czułość i swoistość testu aktywacji bazofilów do rutynowo stosowanych metod diagnostycznych. Co ciekawe używali tego samego alergenu w różnych stężeniach do przeprowadzenia BAT i SPT. Korelacja pomiędzy wynikami testu aktywacji bazofilów i testów skórnych była istotna statystycznie (ale nie doskonała) dla wszystkich badanych alergenów. Współczynnik korelacji sige-spt był wyższy niż BAT-SPT. Również czułość sige była wyższa niż BAT, z powodu fałszywie pozytywnych wyników testu aktywacji bazofilów (BAT+ SPT-). Wyniki sugerują, że bazofile pacjentów atopowych mogą wykazywać nadreaktywność. Trudno jednoznacznie odnieść się do tych wyników niespotykanych Tabela I Porównanie właściwości CD63 i CD203c. A comparison of features of CD63 and CD203c. CD 63 Zakotwiczony w błonie ziarnistości bazofilów Ekspresja na powierzchni bazofila po degranulacji Może występować również na innych komórkach, np. trombocytach w innych badaniach. Khan i wsp. postulują, iż powodem obserwowanej nadreaktywności bazofilów może być wysoki poziom całkowitych IgE u pacjentów atopowych, wysoki poziom śledzionowej kinazy tyrozynowej (Spleen tyrosine kinase, Syk), kluczowego czynnika regulatorowego w mediowanej przez IgE drodze transdukcji sygnałów w reakcji alergicznej w mastocytach i bazofilach lub aktywacja przez IL-3. Niewątpliwym ograniczeniem badania było zastosowanie jako złotego standardu testów skórnych, które mogą być dodatnie u 29-46% bezobjawowych pacjentów i ujemne u osób z sugestywnym wywiadem alergologicznym. Autorzy konkludują, że przyszłe badania powinny skupić się na porównaniu BAT do testów prowokacji swoistej jako złotych standardów diagnostycznych. CD 203c Stałe obecny na powierzchni bazofila Wzrost ekspresji na powierzchni bazofila po degranulacji Ekspresja tylko na bazofilach i mastocytach Niezależna od aktywacji nadekspresja u pacjentów z nowotworami dróg żółciowych oraz okrężnicy Tabela II Zastosowanie testu aktywacji bazofilów w alergii wziewnej- wybrane badania. Clinical application of the basophil activation test in inhalated allergy- selected studies. Rola markera CD203c CD203c to odkryta w 1999 roku przezbłonowa, glikozylowana molekuła, która należy do rodziny fosfodiesteraz/pirofosfotaz i występuje na CD34+ komórkach progenitorowych, bazofilach i mastocytach. Jest konstytutywnie obecna na powierzchni bazofilów, a po aktywacji przez alergen dochodzi do wzrostu jej ekspresji [34-36]. Ozdemir i wsp. [37] przeprowadzili test aktywacji bazofilów z pomiarem ekspresji CD203c poza sezonem ekspozycji na alergen w grupie 31 pacjentów z alergicznym nieżytem nosa i uczuleniem na pyłek roślin i w 9-osobowej grupie kontrolnej. Autorzy wskazują na wyższą czułość BAT od oznaczeń sige oraz umiarkowanie dodatnią korelację między tymi testami dla stężeń alergenu używanych do stymulacji bazofilów wynoszących 4,5 x 10-4 i 4,5 x 10-5 µg/ml i słabszą korelację dla stężeń 45,1 i 4,5 µg/ml. Wytłumaczeniem obserwowanej prawidłowości może być większa reaktywność bazofilów na mostkowanie sige przy niższych stężeniach alergenu, osiąganie maksymalnego plateau odpowiedzi przez bazofile oraz fakt, że powyżej pewnego progu stężenia alergenów aktywacja bazofilów staje się niezależna od zewnątrzkomórkowego sige. Autorzy podkreślają użyteczność BAT u pacjentów z sezonowym alergicznym nieżytem nosa i konieczność prowadzenia dalszych badań nad zastosowaniem tego testu w trudnych diagnostycznie przypadkach. Potapińska i wsp. [38] przeprowadzili również pomiar ekspresji CD203c u pacjentów z alergią na pyłek traw i roztocze kurzu domowego uzyskując wysoką czułość (92,3%) i swoistość (100%) BAT. Kahlert i wsp. [39] porównywali oryginalne ekstrakty alergenowe pyłku traw, alergoidy, hipoalergiczne pochodne alergenów oraz rekombinowane alergeny przeprowadzając test aktywacji bazofilów z pomiarem ekspresji CD203c. Wykonali dodatkowo HRT, który dał podobne rezultaty do BAT. Alergoidy pyłku traw wykazały od 10 do krotne zmniejszenie zdolności aktywacji bazofilów mierzonej ekspresją CD203c w porównaniu do ekstraktów alergenów. Rekombinowany alergen charakteryzował się od 50 do krotną redukcją wyników pomiarów BAT w porównaniu do naturalnych alergenów. Autorzy konkludują, że test aktywacji bazofilów to szybki i czuły sposób szacowania właściwości alergenowych preparatu. Rekombinowane hipoalergiczne preparaty mogą stanowić ulepszoną alternatywę dla stosowanych w praktyce klinicznej szczepionek. Porównanie markerów CD63 i CD203c Ze względu na odrębne mechanizmy ekspresji trudno jednoznacznie porównywać użyteczność CD63 i CD203c, a każdy z nich ma swoich zwolenników i przeciwników wśród badaczy. W tabeli I przedstawiono porównanie tych markerów, a w tabeli II Autor (rok) Marker Inne testy Czułość (%) Swoistość (%) Pacjenci (liczba os.) Grupa kontrolna (liczba os.) Pâris-Köhler (2000) CD63 sige 91,2 100% Sanz (2001) CD63 SPT, HRT, CAST, sige 93,3 98, Ocmant(2006) CD63, CD203c SPT, sige Michova (2006) CD63 SPT, sige Aerts (2009) CD63, p38 MAPK SPT, sige González-Muñoz (2008) CD63 SPT, sige Potapińska(2009) CD203c SPT 92, Wolanczyk-Medrala (2009) CD63 SPT 75-93, Ozdemir (2011) CD203c SPT, sige Czarnobilska (2012) CD63 SPT, sige 89,3-96,6 88, Khan (2012) CD63 SPT, sige sige- swoiste IgE, SPT- test skórny punktowy, CAST- test komórkowego stymulowania alergenami, HRT- test uwalniania histaminy Przegląd Lekarski 2015 / 72 /

19 wybrane badania nad rolą BAT w diagnostyce alergii wziewnych. Zastosowanie CD63 jest popularniejsze ze względu na bezpośredni związek jego pojawienia się na błonie komórkowej z degranulacją bazofilów oraz dlatego, że nie jest konstytutywnym markerem. Prawdopodobnie nigdy nie uda się osiągnąć kompromisu w odpowiedzi na pytanie, który marker jest lepszy, ale nie ulega wątpliwości, że oba są powszechnie akceptowane [3,5,40]. Hauswirth i wsp. [41] wykonywali pomiary ekspresji CD63 i CD203c na aktywowanych bazofilach oraz HRT u pacjentów z alergią na brzozę (Bet v 1: n=15; Bet v 2: n=8), trawy (Phl p 1: n =15; Phl p 2: n=10; Phl p 5: n=14) oraz u 10 nieuczulonych osób. Badani byli rekrutowani na podstawie sugestywnego wywiadu, wyników SPT oraz sige. Autorzy podsumowują, że BAT jest czułym, swoistym i szybkim testem diagnostycznym w alergii wziewnej, a ekspresja markerów CD63 i CD203c wykazuje istotną wzajemną korelację. Ocmant i wsp. [42] porównywali wyniki testu aktywacji bazofilów z pomiarem ekspresji CD63 i CD203c w grupie 20 osób z alergią na sierść kota oraz 19 osobowej grupie kontrolnej. Uzyskali czułość BAT wynoszącą 100% dla CD63 oraz 95% dla CD203c. Potwierdzili także hipotezę, że dodatek IL-3 znacząco zwiększa aktywność bazofilów. BAT u pacjentów przyjmujących doustne leki przeciwhistaminowe Przed przeprowadzeniem testów skórnych czy testu prowokacji donosowej należy na około 7 dni przerwać stosowanie doustnych leków przeciwhistaminowych, ponieważ mogą one spowodować fałszywie negatywny wynik testu. Wolanczyk-Medrala i wsp. [43] przeprowadzali SPT i BAT dwukrotnie - przed i 2 godziny po zażyciu cetyryzyny, zauważając istotne statystycznie zmniejszenie średnicy bąbla skórnego po przyjęciu leku i brak zmian w czułości BAT przy stymulacji alergenem o wyższym stężeniu. Test aktywacji bazofilów wydaje się mieć istotną przewagę nad testami skórnymi, z powodu bardzo słabego hamującego efektu doustnych leków przeciwhistaminowych na indukowane alergenem zwiększenie ekspresji markera CD63. BAT w sezonie pylenia Podawaną przez literaturę zaletą przeprowadzania BAT w stosunku do NPT jest możliwość diagnostyki w sezonie pylenia. Należy jednak pamiętać, że w okresie naturalnej ekspozycji na alergen odpowiedź bazofilów mierzona ekspresją CD63 jest mniejsza, co negatywnie wpływa na czułość BAT. Saporta i wsp. [44] oceniali użyteczność testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnej w przypadku naturalnej ekspozycji na pyłek traw. U 13 pacjentów uczulonych na tymotkę powtarzali oznaczenia BAT przed i w trakcie okresu pylenia. Grupę kontrolną stanowiło 8 nieuczulonych osób. Autorzy konkludują, że chociaż aktywacja bazofilów spada podczas sezonu pylenia, wynik BAT pozostaje pozytywny i test może być przeprowadzany niezależnie od naturalnej ekspozycji. Podobnie badanie Aerts i wsp. [45] zostało przeprowadzone w okresie naturalnej ekspozycji, co więcej pacjenci przyjmowali doustne leki przeciwhistaminowe i miejscowe glikokortykosteroidy. Autorzy u 18 pacjentów z alergią na brzozę, 5 z alergią na trawę i 5 zdrowych, po 3 i 20 minutach stymulacji bazofilów alergenem brzozy (rbet v 1) mierzyli ekspresję CD63 i fosforylację kinazy p38 MAPK. Raportują bardzo wysoką, bo wynoszącą aż 94% czułość i 100% swoistość BAT. Przyszłość zastosowania BATw diagnostyce alergii wziewnej Gomez i wsp. [46] oceniali zastosowanie testu aktywacji bazofilów w diagnostyce pacjentów z lokalnym alergicznym nieżytem nosa (local allergic rhinitis, LAR). W praktyce klinicznej rozróżnienie między alergicznym (allergic rhinitis, AR) i niealergicznym nieżytem nosa (nonallergic rhinitis, NAR) może być trudne. Dodatkowo badania przeprowadzane w ostatnich latach pokazują, że znacząca liczba pacjentów (nawet około 25% wszystkich z nieżytem nosa) poprzednio zdiagnozowanych jako chorych na NAR, cierpi na LAR. W lokalnym alergicznym nieżycie nosa występuje pozytywna odpowiedź na test prowokacji donosowej (nasal provacation test, NPT), przy braku objawów systemowej atopii (ujemne SPT i sige). Dlatego też identyfikacja pacjentów z LAR jest trudna i duża liczba przypadków pozostaje niewłaściwie zdiagnozowana. Gomez i wsp. przeprowadzili swoje badanie w grupie pacjentów z potwierdzonym LAR (16 osób), AR z powodu alergii na roztocze kurzu domowego (14 osób) oraz grupie z NAR (10 osób) i zdrowej kontrolnej (15 osób). Czułość BAT obliczono na 85% u pacjentów z AR i 50% u pacjentów z LAR, a swoistość 93% w obu ww. grupach. Wartość predykcyjna dodatnia BAT dla AR wynosiła 0,92 a dla LAR 0,89. Wartość predykcyjna ujemna odpowiednio 0,87 i 0,62. Biorąc pod uwagę czasochłonność wykonywania NPT, zwłaszcza przy nieznajomości alergenu potencjalnie odpowiedzialnego za objawy kliniczne oraz niską czułość innych testów w LAR, np. wynoszącą tylko 22% dla pomiaru sige dla Dp w wydzielinie nosowej, BAT wydaje się użytecznym narzędziem w diagnostyce LAR. Autorzy postulują, że w przypadku lokalnej produkcji sige aktywacja bazofilów krwi obwodowej może być jedynym dowodem IgE-zależnego mechanizmu reakcji i wyprzedza pojawienie się wolnych osoczowych sige oraz uczulenie mastocytów skórnych. Potrzebne są dalsze badania nad określeniem roli BAT w diagnostyce lokalnego alergicznego nieżytu nosa. Nie ulega wątpliwości, że ważne jest różnicowanie między klinicznie nieistotnym uczuleniem a nadwrażliwością, która daje objawy chorobowe. Znacząca liczba pacjentów ma dodatnie wyniki SPT i sige dla alergenów, które nie wywołują dolegliwości. Niemniej badania kliniczne pokazały, że pozytywne wyniki rutynowo stosowanych testów są czynnikiem predykcyjnym rozwinięcia się choroby alergicznej. Zidarn i wsp. [47] oceniali humoralne i komórkowe mechanizmy, które mogą być związane z pojawieniem się objawów alergicznego nieżytu nosa w grupie 26 pacjentów. W okresie zimy przeprowadzali test aktywacji bazofilów oraz test prowokacji donosowej z alergenami pyłków traw, a w następnym sezonie analizowali objawy kliniczne. Pokazali korelację między wynikami BAT, NPT oraz symptomami chorobowymi. Podsumowują, że objawy alergicznego nieżytu nosa są istotnie powiązane z wrażliwością bazofilów na alergen. Wydaje się, że BAT jest testem, który odzwierciedla równocześnie alergię i nadwrażliwość dającą objawy kliniczne. Autorzy podkreślają, że ich wnioski wymagają potwierdzenia w dalszych badaniach. Caballero i wsp. [48] zajmowali się zawodowym uczuleniem na enzymy grzybów wśród pracowników przemysłu produkcji pasz zwierzęcych. Zgodność między wynikami SPT i BAT u osób uczulonych wynosiła 95%, natomiast SPT oraz sige była niższa (84%), co można przypisać istnieniu epitopów konformacyjnych. Doniesienia te sugerują, że BAT może być narzędziem stosowanym w ocenie skutków ekspozycji zawodowej na enzymy grzybów. Inne zastosowania BAT w alergologii Według niektórych doniesień czułość i swoistość BAT w diagnostyce alergii pokarmowej są wyższe niż SPT i sige - wynoszą około 90% [49]. Od 1999 roku, kiedy Moneret-Vautrin i wsp. [50] jako pierwsi zaproponowali zastosowanie BAT w badaniach diagnostycznych alergii pokarmowych, test ten został użyty w wielu eksperymentach [51-54]. BAT jest również wykorzystywany w diagnostyce alergii pokarmowej będącej efektem krzyżowej reakcji np. z pyłkiem brzozy [55-57]. Ze względu na potencjalne zagrożenie związane z alergią na leki, wczesna i wiarygodna diagnostyka jest kluczowa. Dlatego też BAT został szybko uznany za potencjalną alternatywę dla dostępnych testów [58]. Do tej pory ponad 40% badań z użyciem protokołu opartego na pomiarze ekspresji CD63 skupiało się na lekach [59], ich czułość szacowana jest na około 60%, a specyficzność na % [60-61]. BAT jest wykorzystywany w diagnostyce nadwrażliwości na antybiotyki, leki blokujące płytkę nerwowo - mięśniową, niesteroidowe przeciwzapalne, biologiczne oraz środki kontrastowe [62-64]. Test aktywacji bazofilów jest również pomocnym narzędziem diagnostycznym w alergii na jady owadów błonkoskrzydłych, zwłaszcza w przypadku trudności ze zidentyfikowaniem żądlącego owada, niejednoznacznych wyników rutynowo stosowanych testów oraz długiego czasu od użądlenia. BAT wydaje się także użytecznym testem u pacjentów z alergią na jady owadów błonkoskrzydłych i mastocytozą [65]. Korosec i wsp. [66] wykonali test aktywacji bazofilów oraz testy śródskórne (intradermal skin tests, IDT) u 37 pacjentów z dodatnim wywiadem alergii na jady owadów błonkoskrzydłych i negatywnymi wynikami SPT i sige. Czułość BAT była znacząco wyższa w porównaniu do IDT (76% vs 46 %). Korelacja między wynikami BAT a SPT oraz sige jest wysoka i według różnych danych waha się w zakresie 0,71 do 0,82 [67-69]. W badaniach opisujących zastosowanie testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii na lateks autorzy otrzymywali czułość i swoistość wynoszące ok. 90%. Tylko 776 M. Leśniak i wsp. 19

20 w jednym badaniu czułość wyniosła 75% przy użyciu markera CD203c i 50% z CD63. Uważa się, że BAT najlepiej odzwierciedla próby prowokacji swoistej [70]. Wzrastająca liczba badań potwierdza użyteczność testu aktywacji bazofilów jako narzędzia diagnostycznego i wyjaśniającego mechanizm przewlekłej idiopatycznej pokrzywki [71-72]. BAT może być dobrym markerem oceniającym skuteczność immunoterapii. W kilku badaniach oceniano skuteczność testu aktywacji bazofilów jako metody monitorowania odpowiedzi na immunoterapię [73-79]. Podsumowując, przyszłe badania nad rolą BAT w alergii wziewnej powinny skupić się na porównaniu testu aktywacji bazofilów do testów prowokacji swoistej jako złotych standardów diagnostycznych. Dalszych badań wymaga także ocena zastosowania BAT w monitorowaniu efektów immunoterapii. Wnioski - BAT zarówno z pomiarem ekspresji markera CD63 jak i CD203c jest użytecznym narzędziem diagnostycznym w alergii wziewnej o czułości i swoistości porównywalnej do punktowych testów skórnych i oznaczeń sige. - BAT jest pomocny w trudnych diagnostycznie przypadkach, przy niezgodności między wywiadem klinicznym i wynikami badań, w rozbieżnościach między badaniami in vivo (SPT) i in vitro (sige), trudnościach w zidentyfikowaniu uczulającego alergenu i przy ustalaniu wskazań do swoistej immunoterapii. - BAT pozwala wytypować istotną klinicznie nadwrażliwość. - BAT jest użytecznym testem diagnostycznym w alergii pokarmowej, na leki, jady owadów błonkoskrzydłych, lateks czy w idiopatycznej pokrzywce. Piśmiennictwo 1. Kieć-Świerczyńska M, Pałczyński C [red.]: Jak żyć i pracować z chorobą alergiczną? Poradnik dla osób z chorobami alergicznymi skóry i układu oddechowego. Instytut Medycyny Pracy. Łódź, Niederberger V: Allergen-specific immunotherapy. Immunol Lett. 2009; 122: Boumiza R, Debard AL, Monneret G: The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clin Mol Allergy 2005; 3: Dvorak AM, Galli SJ, Schulman ES, Lichtenstein LM, Dvorak HF: Basophil and mast cell degranulation: ultrastructural analysis of mechanisms of mediator release. Fed Proc. 1983; 42: McGowan EC, Saini S: Update on the performance and application of basophil activation tests. Curr Allergy Asthma Rep. 2013; 13: Grzegorczyk J, Kujawiak M, Kłos Z: Testy aktywacji komórek w alergii i nadwrażliwości. Alerg Astma Immun. 2008; 13: Knol EF, Mul FP, Jansen H, Calafat J, Roos D: Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. J Allergy Clin Immunol. 1991; 88: Michova A, Abugalia M, Ivanova T, Nikolov G, Taskov H, Petrunov B: Comparision of two-flow cytometry methods for basophil degranulation in patients sensitized to grass pollen. Allergy 2006; 61: Roux PP, Blenis J: ERK and p38 MAPK-activated protein kinases: a family of protein kinases with diverse biological functions. Microbiol Mol Biol Rev. 2004; 68: Chirumbolo S: CD164 and other recently discovered activation markers as promising tools for allergy diagnosis: what s new? Clin Exp Med. 2011; 11: Skotny A, Kmiecik B, Zbrojewicz E, Siwak E, Mędrala W: Cytometria przepływowa w diagnostyce alergii protokoły identyfikacji bazofilów. Alergoprofil 2012; 8: Hausmann OV, Gentinetta T, Fux M, Ducrest S, Pichler WJ, Dahinden CA: Robust expression of CCR3 as a single basophil selection marker in flow cytometry. Allergy 2011; 66: Hennersdorf F, Florian S, Jakob A, Baumgärtner K, Sonneck K. et al: Identification of CD13, CD107a, and CD164 as novel basophil-activation markers and dissection of two response patterns in time kinetics of IgE-dependent upregulation. Cell Res. 2005; 15: Boumiza R, Monneret G, Forissier MF, Savoye J, Gutowski MC. et al: Marked improvement of the basophil activation test by detecting CD203c instead of CD63. Clin Exp Allergy 2003; 33: Amano T, Furuno T, Hirashima N, Ohyama N, Nakanishi M: Dynamics of intracellular granules with CD63-GFP in rat basophilic leukemia cells. J Biochem. 2001; 129: Chirumbolo S, Vella A, Ortolani R, De Gironcoli M, Solero P. et al: Differential response of human basophil activation markers: a multi-parameter flow cytometry approach. Clin Mol Allergy 2008; 6: Sagi-Eisenberg R: The mast cell: where endocytosis and regulated exocytosis meet. Immunol Rev. 2007; 217: Wu M, Baumgart T, Hammond S, Holowka D, Baird B: Differential targeting of secretory lysosomes and recycling endosomes in mast cells revealed by patterned antigen arrays. J Cell Sci. 2007; 120: Gu Z, Noss EH, Hsu VW, Brenner MB: Integrins traffic rapidly via circular dorsal ruffles and macropinocytosis during stimulated cell migration. J Cell Biol. 2011; 193: Sturm EM, Kranzelbinder B, Heinemann A, Groselj-Strele A, Aberer W, Sturm GJ: CD203cbased basophil activation test in allergy diagnosis: characteristics and differences to CD63 upregulation. Cytometry B Clin Cytom. 2010; 78: MacGlashan DW Jr: Expression of CD203c and CD63 in human basophils: relationship to differential regulation of piecemeal and anaphylactic degranulation processes. Clin Exp Allergy 2010; 40: Pâris-Köhler A, Demoly P, Persi L, Lebel B, Bousquet J, Arnoux B: In vitro diagnosis of cypress pollen allergy by using cytofluorimetric analysis of basophils (Basotest). J Allergy Clin Immunol. 2000; 105: Sanz ML, Sánchez G, Gamboa PM, Vila L, Uasuf C. et al: Allergen-induced basophil activation:cd63 cell expression detected by flow cytometry in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Loliumperenne. Clin Exp Allergy 2001; 31: González-Muñoz M, Villota J, Moneo I: Analysis of basophil activation by flow cytometry in pediatric house dust mite allergy. Pediatr Allergy Immunol. 2008; 19: Czarnobilska E, Gregorius A, Porebski G, Spiewak R, Sacha M: The benefits of using basophil activation test as a diagnostic tool prior to specific immunotherapy with inhalant allergens. Przegl Lek. 2012; 69: Mazur M, Czarnobilska E: Rola testu aktywacji bazofilów w diagnostyce i ocenie skuteczności immunoterapii swoistej chorób alergicznych. Alergol Immunol. 2012; 9: Gregorius A, Czarnobilska E, Śpiewak R: Defining the optimal cut-off values for flow-assisted basophil activation test in children with respiratory allergy to Dermatophagoides pteronyssinus. Allergy 2013; 68 (Suppl. 97): Czarnobilska E, Porebski G, Gregorius A, Zyla M, Lesniak M, Spiewak R: The benefits of using basophil activation tests as a diagnostic tool prior to specific immunotherapy with mite allergens. Allergy 2012; 67 (Suppl. 96): abstr Gregorius A, Czarnobilska E, Śpiewak R: Optimisation of the basophil activation test with Dermatophagoides pteronyssinus and D. farinae in pediatric population with respiratory allergy to house dust mite. Allergy diagnosis: new in vitro methods. Allergy 2011; 66 (Suppl. 94): 329 abstr Czarnobilska E, Gregorius A, Żyła M, Śpiewak R: Korzyści z wykonywania testu aktywacji bazofilów (BAT) w kwalifikacji do immunoterapii swoistej. Alerg Astma Immunol. 2011; 16 (Supl. 1): Śpiewak R, Gregorius A, Czarnobilska E: Porównanie dwóch protokołów cytometrycznego testu aktywacji bazofilów (BAT). Alerg Astma Immunol. 2011; 16 (Supl. 1): Gregorius A, Czarnobilska E, Śpiewak R: Test aktywacji bazofilów z alergenami Dermatophagoides pteronyssinus i D. farinae u dzieci z alergią wziewną na roztocze kurzu domowego. Alerg Astma Immunol. 2011; 16 (Supl. 1): Khan FM, Ueno-Yamanouchi A, Serushago B, Bowen T, Lyon AW. et al: Basophil activation test compared to skin prick test and fluorescence enzyme immunoassay for aeroallergen-specific immunoglobulin-e. Allergy Asthma Clin Immunol. 2012; 8: Buhring HJ, Simmons PJ, Pudney M, Müller R, Jarrossay D. et al: The monoclonal antibody 97A6 defines a novel surface antigen expressed on human basophils and their multipotent and unipotent progenitors. Blood 1999; 94: Buhring HJ, Seiffert M, Giesert C, Marxer A, Kanz L. et al: The basophil activation marker defined by antibody 97A6 is identical to the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3. Blood 2001; 97: Hauswirth AW, Sonneck K, Florian S, Krauth MT, Bohm A. et al: Interleukin-3 promotes the expression of E-NPP3/CD203C on human blood basophils in healthy subjects and in patients with birch pollen allergy. Int J Immunopathol Pharmacol. 2007; 20: Ozdemir SK, Guloglu D, Sin BA, Elhan AH, Ikinciogullari A, Misirligil Z: Reliability of basophil activation test using CD203c expression in diagnosis of pollen allergy. Am J Rhinol Allergy 2011; 25: Potapińska O, Górska E, Zawadzka-Krajewska A, Kulus M, Wasik M, Demkow U: The usefulness of CD203c expression measurement on basophils after activation with grass pollen and Dermatophagoides pteronyssinus antigens. Preliminary study. Pneumonol Alergol Pol. 2009; 77: Kahlert H, Cromwell O, Fiebig H: Measurement of basophil-activating capacity of grass pollen allergens, allergoids and hypoallergenic recombinant derivatives by flow cytometry using anti-cd203c. Clin Exp Allergy 2003; 33: Bavbek S, Ikincioğullari A, Dursun AB, Guloğlu D, Arikan M. et al: Upregulation of CD63 or CD203c alone or in combination is not sensitive in the diagnosis of nonsteroidal anti-inflammatory drug intolerance. Int Arch Allergy Immunol. 2009; 150: Hauswirth AW, Natter S, Ghannadan M, Majlesi Y, Schernthaner GH. et al: Recombinant allergens promote expression of CD203c on basophils in sensitized individuals. J Allergy Clin Immunol. 2002; 110: Ocmant A, Peignois Y, Mulier S, Hanssens L, Michils A, Schandené L: Flow cytometry for basophil activation markers: the measurement of CD203c up-regulation is as reliable as CD63 expression in the diagnosis of cat allergy. J Immunol Methods 2007; 320: Wolanczyk-Medrala A, Gogolewski G, Liebhart J, Gomulka K, Litwa M. et al: A new variant of the basophil activation test for allergen-induced basophil CD63 upregulation. The effect of cetirizine. J Investig Allergol Clin Immunol. 2009; 19: Saporta M, Kamei S, Persi L, Bousquet J, Arnoux B: Basophil activation during pollen season in patients monosensitized to grass pollens. Allergy 2001; 56: Aerts NE, Dombrecht EJ, Bridts CH, Hagendorens MM, de Clerck LS. et al: Simultaneous flow cytometric detection of basophil activation marker CD63 and intracellular phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase in birch pollen allergy. Cytometry B Clin Cytom. 2009; 76: Gómez E, Campo P, Rondón C, Barrionuevo E, Blanca-López N. et al: Role of the basophil activation test in the diagnosis of local allergic rhinitis. J Allergy Przegląd Lekarski 2015 / 72 /

21 Clin Immunol. 2013; 132: Zidarn M, Košnik M, Silar M, GrahekA, Korošec P: Rhinitis symptoms caused by grass pollen are associated with elevated basophile allergen sensitivity and a larger grass-specific immunoglobulin E fraction. Clin Exp Allergy 2012; 42: Caballero ML, Gómez M, González-Muñoz M, Reinoso L, Rodríguez-Pérez R. et al: Occupational sensitization to fungal enzymes used in animal feed industry. Int Arch Allergy Immunol. 2007; 144: Rubio A, Vivinus-Nebot M, Bourrier T, Saggio B, Albertini M, Bernard A: Benefit of the basophil activation test in deciding when to reintroduce cow s milk in allergic children. Allergy 2011; 66: Moneret-Vautrin DA, Sainte-Laudy J, Kanny G, Fremont S: Human basophil activation measured by CD63 expression and LTC4 release in IgE-mediated food allergy. Ann Allergy Asthma Immunol. 1999; 82: Lee JY, Jin HJ, Park JW, Jung SK, Jang JY, Park HS: A case of korean ginseng-induced anaphylaxis confirmed by open oral challenge and basophil activation test. Allergy Asthma Immunol Res. 2012; 4: Garcia-Ortega P, Scorza E, Teniente A: Basophil activation test in the diagnosis of sulphite-induced immediate urticaria. Clin Exp Allergy 2010; 40: Kim JH, An S, Kim JE, Choi GS, Ye YM, Park HS: Beef-induced anaphylaxis confirmed by the basophil activation test. Allergy Asthma Immunol Res. 2010; 2: Ebo DG, Sainte-Laudy J, Bridts CH, Mertens CH, Hagendorens MM. et al: Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy 2006; 61: Erdmann SM, Heussen N, Moll-Slodowy S, Merk HF, Sachs B: CD63 expression on basophils as a tool for the diagnosis of pollen-associated food allergy: sensitivity and specificity. Clin Exp Allergy 2003; 33: Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH, Schuerwegh AJ, De Clerck LS, Stevens WJ: Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry B Clin Cytom. 2005; 64: Erdmann SM, Sachs B, Schmidt A, Merk HF, Scheiner O. et al: In vitro analysis of birch-pollen associated food allergy by use of recombinant allergens in the basophil activation test. Int Arch Allergy Immunol. 2005; 136: Choquet-Kastylevsky G, Vial T, Descotes J: Drug allergy diagnosis in humans: possibilities and pitfalls. Toxicology 2001; 158: Gómez E, Blanca-Lopez N, Torres MJ, Requena G, Rondon C. et al: Immunoglobulin E-mediated immediate allergic reactions to dipyrone: value of basophil activation test in the identification of patients. Clin Exp Allergy 2009; 39: Sanz ML, Gamboa PM, Mayorga C: Basophil activation tests in the evaluation of immediate drug hypersensitivity. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2009; 9: Eberlein B, León Suárez I, Darsow U, Ruëff F, Behrendt H, Ring J: A new basophil activation test using CD63 and CCR3 in allergy to antibiotics. Clin Exp Allergy 2010; 40: Song WJ, Chang YS: Recent applications of basophil activation tests in the diagnosis of drug hypersensitivity. Asia Pac Allergy 2013; 3: Piotrowicz-Wójcik K, Porębski G, Dyga W, Obtułowicz K, Czarnobilska E: Test aktywacji bazofilów w diagnostyce natychmiastowej nadwrażliwości na ibuprofen. Opis przypadku. Alergol Immunol. 2012; 9: Obtułowicz K, Dyga W, Obtułowicz A, Czarnobilska E, Zdziłowska E, Piotrowicz-Wójcik K: Bazotest. Cytometryczny laboratoryjny test aktywacji bazofilów (CD 63+) w diagnostyce alergii na leki. Alergol Immunol. 2009; 6: Ebo DG, Van Vaerenbergh M, de Graaf DC, Bridts CH, De Clerck LS, Sabato V: In vitro diagnosis of Hymenoptera venom allergy and further development of component resolved diagnostics. Expert Rev Clin Immunol. 2014; 10: Korosec P, Erzen R, Silar M, Bajrovic N, Kopac P, Kosnik M: Basophil responsiveness in patients with insect sting allergies and negative venom-specific immunoglobulin E and skin prick test results. Clin Exp Allergy 2009; 39: de Weck AL, Sanz ML, Gamboa PM, Aberer W, Bienvenu J. et al: Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. Int Arch Allergy Immunol. 2008; 146: Scherer K, Weber JM, Jermann TM, Krautheim A, Tas E. et al: Cellular in vitro assays in the diagnosis of hymenoptera venom allergy. Int Arch Allergy Immunol. 2008; 146: Czarnobilska E, Sacha M, Gregorius A, Chmielewska A, Czarnobilski K, Śpiewak R: The benefits of performing basophil activation test in the qualification for wasp and bee venom-specific immunotherapy in cases of contradictions between history and routine allergy tests. Allergy 2013; 68 (Suppl. 97): Ebo DG, Lechkar B, Schuerwegh AJ, Bridts CH, De Clerk LS, Stevens WJ: Validation of a two-color flow cytometric assay detecting in vitro basophil activation for the diagnosis of IgE-mediated natural rubber latex allergy. Allergy 2002; 57: Frezzolini A, Provini A, Teofoli P, Pomponi D, De Pita O: Serum-induced basophil CD63 expression by means of a tricolor flow cytometric method for the in vitro diagnosis of chronic urticaria. Allergy 2006; 61: Vasagar K, Vonakis BM, Gober LM, Viksman A, Gibbons SP Jr, Saini SS: Evidence of in vivo basophil activation in chronic urticaria. Clin Exp Allergy 2006; 36: Erzen R, Kosnik M, Silar M, Korosec P: Basophil response and the induction of a tolerance in venom immunotherapy: a long-term sting challenge study. Allergy 2012; 67: Zitnik SE, Vesel T, Avcin T, Silar M, Kosnik M, Korosec P: Monitoring honeybee venom immunotherapy in children with the basophil activation test. Pediatr Allergy Immunol. 2012; 23: Cichocka-Jarosz E, Dorynska A, Pietrzyk JJ, Spiewak R: Laboratory markers of mast cell and basophil activation in monitoring rush immunotherapy in bee venom-allergic children. Immunotherapy 2011; 3: Erdmann SM, Sachs B, Kwiecien R, Moll-Slodowy S, Sauer I, Merk HF: The basophil activation test in wasp venom allergy: sensitivity, specificity and monitoring specific immunotherapy. Allergy 2004; 59: van Overtvelt L, Baron-Bodo V, Horiot S, Moussu H, Ricarte C. et al: Changes in basophil activation during grass-pollen sublingual immunotherapy do not correlate with clinical efficacy. Allergy 2011; 66: Lasa Luaces EM, Tabar Purroy AI, Garcia Figueroa BE, Anda Apiñaniz M, Sanz Laruga ML. et al: Component-resolved immunologic modifications, efficacy, and tolerance of latex sublingual immunotherapy in children. Ann Allergy Asthma Immunol. 2012; 108: Swamy RS, Reshamwala N, Hunter T, Vissamsetti S, Santos CB. et al: Epigenetic modifications and improved regulatory T-cell function in subjects undergoing dual sublingual immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 2012; 130: M. Leśniak i wsp. 21

22 Wstęp d) Monitorowanie Decyzję o zakończeniu SIT podejmuje się w oparciu o kliniczną ocenę jej skuteczności, gdyż stosowane w kwalifikacji testy takie jak SPT czy sige często pozostają dodatnie i ich wyniki nie korespondują z odczuwaną przez pacjentów poprawą [68]. Dotychczas przeprowadzone badania pokazują, że zmiany immunologiczne podczas SIT nie są w ścisłym stopniu związane z poprawą. Przydatne wydaje się monitorowanie stosunku sige/sigg4. Często nie udaje się jednak wykryć różnic na poziomie komórkowym, mimo odczuwanego przez pacjentów ustąpienia objawów [69]. Biorąc pod uwagę udział bazofilów w nabywaniu tolerancji podczas SIT obiecujące wydaje się zastosowanie BAT w jej monitorowaniu. Popularnymi parametrami mierzącymi aktywność bazofilów są: procent aktywowanych alergenem bazofilów oraz indeks stymulacji (stimulation index, SI). Niedawno wprowadzonymi pojęciami opisującymi aktywność bazofilów są: reaktywność bazofilów (basophil reactivity, BR) - odzwierciedlający reaktywność czyli odpowiedź na stymulację oraz czułość bazofilów (basophil sensitivity, oznaczany również jako CD-sensitivity, CD-sens) - odzwierciedlający wrażliwość tj. ilość alergenu jaką bazofile mogą tolerować przed reakcją (im wyższy, tym wyższa wrażliwość na alergen) [70]. W ostatnich publikacjach podkreśla się, że należy odpowiednio do problemu klinicznego dobrać oceniany wskaźnik aktywacji bazofilów [71]. Przykładem jest praca Erdman i wsp. gdzie nie obserwowano korelacji między zmianą aktywacji bazofilów podczas VIT a odpowiedzią na kontrolny test prowokacji użądleniem. Autorzy oceniali zmiany wskaźnika reaktywności bazofilów a nie ich czułości [72], co jak podkreślają Ebo i wsp. mogło być przyczyną uzyskania błędnych wyników [73]. W świetle powyższych danych oceniając aktywność bazofilów podczas SIT oprócz tradycyjnie obliczanych parametrów należy także analizować CD-sens. Nopp i wsp. oraz Lalek i wsp. pokazali istotną rolę CD-sens w monitorowaniu przebiegu SIT z alergenami sezonowymi [74,75]. Kosnik i wsp. pokazali użyteczność tego parametru w monitorowaniu VIT [76]. W badaniach Jones i wsp. oraz Glaumann i wsp. u pacjentów poddanych doustnej immunoterapii negatywny wynik CD-sens wykluczał alergię na orzeszki ziemne [77,78]. W literaturze opisano szereg innych zastosowań CD-sens, np. jako markera wrażliwości dróg oddechowych na alergen czy w monitorowaniu terapii przeciwciałem monoklonalnym anty- IgE [79-82]. Bez wątpienia konieczne są dalsze badania nad zastosowaniem CD-sens, które wydaje się obiecujące zwłaszcza w monitorowaniu SIT. Jakkolwiek nie należy zapominać 22

23 Wstęp o potwierdzonej użyteczności oceny takich parametrów jak procent aktywowanych alergenem bazofilów czy SI w diagnostyce alergii wziewnej, pokarmowej, na leki i jady owadów [70]. 23

24 Cel pracy III CEL PRACY - Cel główny: Porównanie czułości i swoistości BAT w odniesieniu do NPT w kwalifikacji do SIT z alergenami roztoczy kurzu domowego (Dermatophagoides pteronyssinus, Dp) i brzozy. - Cele dodatkowe: 1. Ocena zastosowania BAT w kwalifikacji do SIT u pacjentów z niezgodnymi wynikami SPT i sige. 2. Ocena użyteczności BAT w monitorowaniu SIT z alergenami Dp. 3. Ocena wpływu metodologii na wynik BAT: a) czasu przechowywania próbki krwi; b) rodzaju odczynnika; c) stężenia odczynnika; d) wskaźnika oceniającego aktywację bazofilów. 24

25 Materiały i metody IV MATERIAŁ I METODY Materiał 1) Zastosowanie BAT w kwalifikacji do SIT Do badania włączonych zostało 30 dorosłych pacjentów (18 kobiet, 12 mężczyzn) z rozpoznaniem AR na podstawie objawów klinicznych, SPT i/lub sige z powodu alergii na Dp lub brzozę przed kwalifikacją do SIT. Kryteriami wykluczającymi były SIT w wywiadzie i obecność przeciwwskazań do NPT. Badanych podzielono na 2 grupy. Grupa 1 obejmowała 15 pacjentów z dodatnim wynikiem SPT z alergenami brzozy i ujemnym wynikiem SPT z alergenami Dp. Grupa 2 obejmowała 15 pacjentów z dodatnim wynikiem SPT z alergenami Dp oraz i ujemnym wynikiem SPT z alergenami brzozy. Badanie przeprowadzono w okresie czerwiec-luty (około 6 tygodni po sezonie pylenia brzozy) w grupie 1 oraz marzec-wrzesień w grupie 2. Przygotowanie pacjentów dotyczyło odstawienia leków wg zaleceń Standardów wykonywania donosowych prób prowokacyjnych [53]. Badanie obejmowało 30 minutową aklimatyzację, podczas której pobierano krew na oznaczenie BAT oraz wykonywano spirometrię. Doświadczony laryngolog-alergolog na podstawie wywiadu i badania fizykalnego kwalifikował pacjentów do prowokacji. Wyniki BAT porównywano do wyników SPT, sige i NPT z alergenami Dp i brzozy. 2) Zastosowanie BAT w monitorowaniu SIT Do badania włączonych zostało 31 dzieci zakwalifikowano do SIT z alergenami Dp na podstawie objawów klinicznych, wyników SPT, oznaczeń sige i testu aktywacji bazofilów (BAT 1). W drugim etapie wykonywano kontrolne pomiary BAT podczas SIT po podaniu pacjentom tej samej dawki kumulacyjnej alergenu - odpowiednio 12487,5 PNU po skończeniu jednego (BAT 2) oraz PNU po dwóch opakowaniach szczepionki (BAT 3). 3) Metodologiczne aspekty BAT a) Wpływ czasu na wynik BAT Analizie poddano 12 próbek krwi pobranych od pacjentów z alergią wziewną na brzozę lub roztocze kurzu domowego. Trzykrotnie - po godzinie, 4 godzinach oraz 24 godzinach od pobrania krwi wykonywano BAT. 25

26 Materiały i metody b) Wpływ rodzaju odczynnika na wynik BAT Analizie poddano próbki krwi pobrane od 10 pacjentów z alergią wziewną na Dp. BAT wykonywano zarówno z komercyjnie dostępnymi odczynnikami (Bühlman Laboratories AG, Schönenbuch, Switzerland) jak i z alergenami przeznaczonymi do wykonywania NPT (Allergopharma GmbH, Reinbek, Germany). Wyniki BAT z każdym z odczynników porównywano do wyników SPT, sige i NPT. Metody BAT Do wykonania BAT używano 400 μl krwi, pobranej do probówek zawierających wersenian sodu (EDTA). Ocena aktywacji bazofilów przez pomiar ekspresji antygenu CD63 była przeprowadzona testem Flow2 CAST (Bühlmann Laboratories AG, Schönenbuch, Switzerland). Jako kontrolę pozytywną zastosowano przeciwciała monoklonalne anty-fcɛri (przeciwciało przeciw receptorowi o wysokim powinowactwie do IgE), jako kontroli negatywnej użyto bufor do rozcieńczania alergenów. Komórki były pobudzane roztworami odpowiednich alergenów w określonych stężeniach. Stosowano przeciwciała monoklonalne sprzężone z fluorochromami. Do zawiesiny komórek dodawano mieszaniny przeciwciał monoklonalnych anty-cd63, anty-ccr3 sprzężonych z fluorochromami, odpowiednio izotiocjanianem fluoresceiny (FITC) i fikoerytryną (PE), inkubowano przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 o C, dodawano 2 ml roztworu lizującego erytrocyty, wirowano, zawieszano w 0,3 ml buforu płuczącego i analizowano w ciągu godziny na cytometrze przepływowym. Bazofile oznaczano jako komórki CCR3+/SSC low. W kontroli negatywnej (inkubacja z buforem) ustalano próg odcięcia aktywacji. W kontroli pozytywnej oceniano zdolność bazofilów do aktywacji na drodze IgE-zależnej (stymulacja alergenami). Analizę wykonano przy użyciu cytometru przepływowego FacsCalibur firmy Becton, Dickinson and Company (New Jersey, USA). Wynik BAT wyrażono za pomocą procentu aktywowanych alergenem bazofilów/si/ BR/CD-sens. SI zdefiniowano jako procent ilości bazofilów aktywowanych badanym alergenem w stosunku do procentu ilości bazofilów aktywowanych w kontroli ujemnej. BR obliczono jako procent ilości bazofilów aktywowanych badanym alergenem w stosunku do procentu ilości bazofilów aktywowanych w kontroli dodatniej. CD-sens zdefiniowano jako 26

27 Materiały i metody odwróconą wartość stężenia alergenu dającego połowę maksymalnej ekspresji CD63 pomnożoną przez 100 i użyto do opisania wrażliwości pacjentów na alergen. SPT, sige Za wynik dodatni SPT (Allergopharma GmbH, Reinbek, Germany) przyjęto średnicę bąbla w odczynie testowym na badany alergen większą lub równą 3 mm przy ujemnej kontroli negatywnej. Średnicę bąbla obliczono z sumy największego wymiaru i wymiaru do niego prostopadłego podzielonej przez 2. Za wynik dodatni sige uznano wartość powyżej 0,7 kui/l (UniCapPhadia, oznaczenie wykonywane według protokołu producenta). NPT NPT wykonywano najpierw podając roztwór kontrolny, a następnie po 20 minutach alergen Dp lub alergen brzozy białej (Allergopharma GmbH, Reinbek, Germany). Stosowano obustronną prowokację z jednym stężeniem roztworu badanego (podawanym w objętości 0,04-0,05 ml). Oceniano fazę wczesną reakcji alergicznej. NPT interpretowano po 5, 15 oraz 60 minutach za pomocą skali objawów klinicznych uwzględniając: ilość wydzieliny nosowej (0-2 pkt), ilość kichnięć (0-2 pkt), świąd nosa (0-1 pkt), blokadę nosa (0-2 pkt), świąd podniebienia lub uszu (0-1 pkt), łzawienie lub zapalenie spojówek, pokrzywkę, kaszel lub duszność (0-1 pkt). Za wynik dodatni NPT przyjęto 3 punkty lub więcej w co najmniej jednej ocenie, w interpretacji brano pod uwagę najwyższy z uzyskanych w trzech pomiarach wynik. 27

28 Publikacje oryginalne V PUBLIKACJE ORYGINALNE Zakres artykułów wchodzących w skład rozprawy doktorskiej Niniejsza praca doktorska składa się z monotematycznego cyklu 4 publikacji oryginalnych, podzielonych na 3 rozdziały opisujące kolejno zastosowanie BAT w kwalifikacji i monitorowaniu SIT oraz metodologiczne aspekty wykonywania BAT. W pierwszym artykule Comparison of the basophil activation test versus the nasal provocation test in qualifying for specific immunotherapy porównano czułość oraz swoistość BAT i NPT u dorosłych pacjentów kwalifikowanych do SIT z alergenami Dp i brzozy. W drugim artykule Rola testu aktywacji bazofilów (BAT) w kwalifikacji do immunoterapii swoistej z alergenami wziewnymi, skupiono się na porównaniu BAT do rutynowo stosowanych testów diagnostycznych tj SPT i sige oraz znaczeniu BAT w przypadku niezgodności między wynikami wyżej wymienionych testów. W trzecim artykule The usefulness of basophil activation test in the monitoring of specific immunotherapy with house dust mite allergens opisano zastosowanie BAT w monitorowaniu SIT z alergenami Dp u dzieci. W czwartym artykule Test aktywacji bazofilów - praktyczne aspekty cytometrycznej diagnostyki alergii oddechowych, przedstawiono metodologiczne problemy związane z wykonywaniem BAT skupiając się na ocenie wpływu czasu przechowywania próbki krwi na wynik testu oraz kwestii doboru odpowiedniego odczynnika alergenowego do stymulacji bazofilów w cytometrze. 28

29 Publikacje oryginalne Rozdział 1. Zastosowanie BAT w kwalifikacji do SIT Leśniak M, Dyga W, Rusinek B, Mazur M, Czarnobilska E: Comparison of the basophil activation test versus the nasal provocation test in qualifying for specific immunotherapy. Pol Arch Med Wewn. 2016; 126 (7-8): Bulanda M, Dyga W, Rusinek B, Czarnobilska E. Rola testu aktywacji bazofilów (BAT) w kwalifikacji do immunoterapii swoistej z alergenami wziewnymi. Przegl Lek. 2016; 73 (12):

30 ORIGINAL ARTICLE Comparison of the basophil activation test versus the nasal provocation test in establishing eligibility for specific immunotherapy Małgorzata Leśniak, Wojciech Dyga, Barbara Rusinek, Marcel Mazur, Ewa Czarnobilska Unit of Clinical and Environmental Allergology, Department of Toxicology and Environmental Diseases, Jagiellonian University Medical College, Kraków, Poland KEY WORDS basophil reactivity, nasal provocation test, stimulation index Correspondence to: Ewa Czarnobilska, MD, PhD, Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej, Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum, ul. Śniadeckich 10, Kraków, Poland, phone: , ewa.czarnobilska@uj.edu.pl Received: May 24, Revision accepted: June 21, Published online: August 25, Conflict of interest: none declared. Pol Arch Med Wewn. 2016; 126 (7-8): doi: /pamw.3525 Copyright by Medycyna Praktyczna, Kraków 2016 ABSTRACT INTRODUCTION Allergic rhinitis (AR) is the most common atopic disease. Specific immunotherapy (SIT) is the only effective treatment method for AR. In uncertain diagnostic cases, before establishing eligibility for SIT, nasal provocation tests (NPTs) should be performed. However, there are numerous contraindications to performing NPTs, and there is ongoing search for an alternative in vitro method. OBJECTIVES The aim of the study was to determine whether a specific in vitro provocation, that is, the basophil activation test (BAT), may replace a specific in vivo provocation, that is, the NPT, in establishing patient s eligibility for SIT. PATIENTS AND METHODS The study included 30 patients with AR caused by allergy to house dust mite or birch pollen, referred for SIT. The assessment of basophil activation by measuring CD63 antigen expression was performed using the Flow2 CAST test. Basophils were stimulated with allergen preparation (concentrations of 5000, 500, and 50 standardized biological units) used in NPTs. BAT results were expressed as stimulation index (SI) and basophil reactivity (BR). RESULTS Allergen concentrations of 500 and 50 SBU proved to be appropriate for basophil stimulation. Median SI and BR were higher for positive NPT results than for negative NPT results (P <0.001). Sensitivity for SI and BR was in the range from 83% to 100%; specificity, from 78% to 89%; positive predictive value, from 75% to 87%; and negative predictive value, from 89% to 100%. We observed a high correlation of the analyzed parameters for the allergen concentrations of 500 and 50 SBU (range, ; P <0.05). CONCLUSIONS If there are contraindications to performing the NPT, BAT may be regarded as an alternative in establishing patients eligibility for SIT. The optimal concentrations of allergen preparations are 500 and 50 SBU. Both SI and BR are good indicators of basophil activation. INTRODUCTION Allergic rhinitis (AR) is the most frequent atopic disease. According to different authors, it affects from 10% to 40% of the global population. The ECAP (Epidemiology of Allergic Diseases in Poland) study 1 conducted in the years demonstrated that AR affects 25% of the Polish population. AR significantly decreases the quality of patients life, and, if untreated, may lead to complications such as sinusitis or asthma. Specific immunotherapy (SIT) is the only causative and therefore effective method of AR treatment. 2 The most important components of diagnostic workup in patients with AR include a properly conducted interview, physical examination, skin prick tests (SPTs), and the measurement of specific immunoglobulin E (sige) concentrations. Positive results of the above tests indicate an allergy, but they do not confirm clinically significant hypersensitivity, that is, an allergic disease. In uncertain diagnostic cases, where there is no correlation of clinical symptoms with SPT results or sige concentrations (or both), particularly prior ORIGINAL ARTICLE Comparison of BAT versus NPT in establishing eligibility for SIT

31 to establishing eligibility for SIT, nasal provocation tests (NPTs) must be performed. 2 German guidelines emphasize the value of NPTs in proving the clinical relevance of house dust mite allergy before referral for SIT. 3 Specific NPT consists of eliciting a response from the nasal mucosa by controlled exposure to allergens. 4,5 Absolute contraindications to performing an NPT are a history of an anaphylactic shock, allergic disease exacerbation, diseases of the lower airways with advanced restrictive or obstructive disorders, severe forms of systemic diseases, advanced ischemic heart disease, pregnancy, acute bacterial or viral infection of the upper or lower airways, use of β-adrenolytics and angiotensin-converting enzyme inhibitors, lack of access to basic medications and medical equipment for treatment of an anaphylactic shock, and age under 3 years. The patient must discontinue treatment with systemic or intranasal glucocorticosteroids (or both) 4 weeks prior to the NPT, and with oral second-generation antihistamines 1 to 2 weeks prior to the NPT. 4 Therefore, there is a search for diagnostic tests that could be used instead of NPTs, especially in patients with contraindications to perform NPTs, while maintaining reliability and repeatability of results. The use of in vitro tests is a safe alternative to NPTs. The basophil activation test (BAT) is a test during which basophil activation after stimulation with an allergen with the use of various cell membrane markers, such as CD63 or CD203c, 6 is monitored using flow cytometry. Currently, various parameters are used in BAT assessment, including the stimulation index (SI) 7 and basophil reactivity (BR). 8 The aim of our research was to assess whether a specific in vitro provocation test (ie, BAT with house dust mite [HDM, Dermatophagoides pteronyssinus] or birch pollen allergens) may replace a specific in vivo provocation test (ie, NPT) in establishing patients eligibility for SIT. PATIENTS AND METHODS Patients The study included 30 adult subjects (18 women, 12 men) with AR due to allergy to HDM or birch pollen, diagnosed on the basis of clinical symptoms, SPT results, or the measurement of sige levels prior to being referred for SIT. The exclusion criteria were an SIT in the interview and the presence of contraindications to undergo an NPT. 4 All patients had an NPT and BAT done with both allergens, and the results were compared in all 30 patients. Participants were later divided into 2 groups. Group 1 included patients with a positive result of a birch-allergen SPT and a negative result of an HDM-allergen SPT. Group 2 included patients with a positive result of an HDM-allergen and a negative result of a birch-allergen SPT. Group 2 constituted a control group for group 1 and vice versa. The results for SPTs and the measurement of sige concentrations of the patients are compared in TABLES 1 and 2. Methods The study was conducted in the years : in the June February period (approx. 6 weeks after the birch pollination season) in a group of subjects allergic to birch pollen (group 1) and the March September period (outside of the heating season) in a group of subjects allergic to HDM (group 2). Preparation of patients involved the discontinuation of medications according to The Nasal Provocation Tests Performance Standards. 4 The study included a 30-minute acclimatization during which blood samples were collected for BAT determination and spirometry was performed. An experienced laryngologistallergist referred patients for provocation based on an interview and physical examination. The provocation with HDM and birch pollen allergens was performed starting with the allergen expected not to cause the reaction. The study project was approved by the Bioethics Committee of the Jagiellonian University (opinion no.: KBET/183/B/2014). Basophil activation test To perform BAT, 400 μl of blood collected to test tubes containing EDTA was used. The test was performed within 2 hours from blood collection. The assessment of basophil activation by measuring CD63 antigen expression was carried out by means of the Flow2 CAST test (Bühlmann Laboratories AG, Schönenbuch, Switzerland). As a positive control, anti-fceri monoclonal antibodies (antibodies against the high- affinity IgE receptor) were used, and as a negative control, a stimulation buffer was used. Cells were stimulated with NPT allergen solutions (Allergopharma GmbH, Reinbek, Germany) in the following concentrations: 5000, 500, and 50 standardized biological units (SBU), corresponding to serial dilutions of 1:1, 1:10, and 1:100. The whole process was conducted according to the manufacturer s instructions as described elsewhere. 9 To determine BAT outcome, the SI and BR were calculated. SI was defined as the ratio between the percentage of activated basophils in the presence and absence of antigen. 7 The basophil reactivity was calculated as the percentage of the amount of basophils activated by the allergen used in the study in relation to the percentage of basophils activated by the positive control (allergen CD63/anti -IgE CD63). 10,11 In determining the positive cut-off value for BAT, receiver operating characteristic (ROC) curves were used according to recommendations in the literature. 12,13 Nasal provocation test The NPT was performed by first administering a control solution, followed after 20 minutes by the HDM or white birch pollen allergen (Allegropharma GmbH, Reinbek, Germany). Bilateral provocation with a single concentration of the studied solution was used (administered in the volume of ml). The early phase of the allergic reaction was assessed. The NPT was interpreted after 5, 15, and 60 minutes, with the use of a clinical symptom scale, taking into consideration the amount of nasal discharge 522 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2016; 126 (7-8) 31

32 TABLE 1 dust mite Results of skin prick tests and specific immunoglobulin E concentrations in patients with allergy to house Patient SPT histamine, a mm SPT HDM, a mm SPT birch, a mm sige HDM, kui/l sige birch, kui/l median a The mean diameters of wheals were calculated from the sum of the largest measurement across the wheal and the largest wheal measurement perpendicular to the former divided by 2. Abbreviations: HDM, house dust mite; sige, specific immunoglobulin E; SPT, skin prick test TABLE 2 pollen Results of skin prick tests and specific immunoglobulin E concentrations in patients with allergy to birch Patient SPT histamine, a mm SPT HDM, mm SPT birch, a mm sige HDM, kui/l sige birch, kui/l median a The mean diameters of wheals were calculated from the sum of the largest measurement across the wheal and the largest wheal measurement perpendicular to the former divided by 2. Abbreviations: see TABLE 1 (0 2 points), number of sneezes (0 2 points), nasal itching (0 1 point), nasal congestion (0 2 points), palate or ear itching (0 1 point), lachrymation or conjunctivitis, urticaria, cough, or dyspnea (0 1 points). Getting 3 or more points in a single test was considered as a positive result, and the highest of the 3 results was later considered the final result. Statistical analysis Data distribution was calculated using the Shapiro Wilk test. The results were presented as the median and range. ROC curves were plotted with PQStat (PQStat Software, Poznań, Poland). They were used to assess the BAT optimal positive cut-off value. The area under the ROC curve (AUC) was calculated to quantify the accuracy of BAT (SI, BR) and to compare it with ORIGINAL ARTICLE Comparison of BAT versus NPT in establishing eligibility for SIT

33 A 250 NPT(+) C 250 NPT( ) SI 100 SI B 5000 SBU 500 SBU 50 SBU D 5000 SBU 500 SBU 50 SBU 1.5 NPT(+) 1.5 NPT( ) BR BR SBU 500 SBU 50 SBU SBU 500 SBU 50 SBU FIGURE 1 Stimulation index (SI) and basophil reactivity (BR) for positive and negative nasal provocation test (NPT) results. SI and BR were higher in the case of a positive NPT result; data are presented as median and quartiles; A SI for positive NPT; B SI for negative NPT; C BR for positive NPT; D BR for negative NPT the results of NPT, SPT, and sige measurement. Sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV) were calculated. Correlation coefficients were calculated using the Spearman s rank correlation. To compare the SI and BR between patients with positive and negative NPT results, the Mann Whitney test was used. Probability values of less than 0.05 were considered as significant. Analyses were performed using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, California, United States). RESULTS The median basophil activation in the positive control was 78.81% (range, 14.01% 94.3%). Among 30 subjects enrolled in the study, a positive result of NPT with birch allergens in group 1 was obtained in 14 patients and with HDM allergens in group 2 in 12 patients. In all patients with positive NPT results, the median symptom scale was 4 (range, 3 6), and with negative NPT results, it was 0 (range, 0 1). In 1 female patient with AR due to birch pollen allergy, the NPT could not be performed because of aggravated rhinitis symptoms at baseline. In positive NPTs, the median SI for HDM and birch allergens for a dilution of 1:1 was 4.45 ( ); for a dilution of 1:10, (2.1 to ); and for that of 1:100, 34.1 ( ). In negative NPTs, the median SI was lower: for a dilution of 1:1, it was 0.86 ( ); for a dilution of 1:10, 1.03 ( ); and for that of 1:100, 1.19 ( ). The differences between all dilutions in positive and negative NPTs were significant (P <0.001). The BR parameter was also higher in the case of a positive NPT result. The median BR for HDM and birch allergens for a dilution of 1:1 was 0.13 (0 to 1.01); for a dilution of 1:10, 0.84 (0.12 to 1.26); and for that of 1:100, 0.94 (0.15 to 1.26). In the case of a negative NPT result, the median BR was 0.01 (0 0.53), 0.02 (0 0.92), and 0.02 (0 1) for the dilutions of 1:1, 1:10, and 1:100, respectively. The differences between all dilutions in positive and negative NPTs were significant (P <0.001). FIGURE 1 presents SI and BR graphs for positive and negative provocation results. On the basis of the ROC curve analysis for HDM and birch allergen at dilutions of 1:10 and 1:100, SI results were highly comparable to NPT results. In the case of HDM dilution of 1:10, the optimum SI cut-off point in relation to NPT was set at the level of 16.76; SI sensitivity was 83%; specificity, 89%; 524 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2016; 126 (7-8) 33

34 TABLE 3 Results of the receiver-operating characteristic curve analysis considering optimum cut-off values for the stimulation index with house dust mites and birch allergens in comparison with nasal provocation test Dilution AUC Sensitivity, % Specificity, % PPV, % NPV, % ACC, % r HDM SI 1: a a HDM SI 1: a a HDM SI 1: a a birch SI 1: birch SI 1: a a birch SI 1: a a a P <0.001 Abbreviations: ACC, accuracy; AUC, area under the curve; birch SI, stimulation index for birch allergen; HDM SI, stimulation index for house dust mite allergen; NPV, negative predictive value; PPV, positive predictive value TABLE 4 Results of the receiver-operating characteristic curve analysis considering optimum cut-off values for the basophil reactivity with house dust mites and birch allergens in comparison with nasal provocation test Dilution AUC Sensitivity, % Specificity, % PPV, % NPV, % ACC, % r HDM BR 1: a b HDM BR 1: b b HDM BR 1: b b Birch BR 1: Birch BR 1: b b Birch BR 1: b b a P <0.05, b P <0.001 Abbreviations: birch BR, basophil reactivity for birch allergen; HDM BR, basophil reactivity for house dust mite allergen; others, see TABLE 3 PPV, 83%; NPV, 89%; and accuracy, 87%. The AUC for HDM at a dilution of 1:10 was 0.87 (P <0.001), which indicates high conformity of BAT and NPT results. The respective values for birch allergen dilution of 1:10 at the cut-off point of 4.35 were as follows: sensitivity, 92%; specificity, 88%; PPV, 86%; NPV, 94%; and accuracy, 90%. The area under the ROC curve for birch allergen at this dilution was 0.95 (P <0.0001). TABLE 3 presents the results obtained from the ROC curve analysis considering optimum cut-off values for the SI with HDM and birch allergens in comparison with NPT. Adopting the SI PPV for the cut-off point of 2, as recommended in the available literature for HDM at dilutions of 1:10 and 1:100, we obtained a sensitivity and NPV of 100%, specificity of 44% and 61%, PPV of 54% and 53%, and accuracy of 66% and 77%, respectively. For the birch allergen at dilutions of 1:10 and 1:100, NPV was also 100%, while specificity was 76% and 82%, PPV was 76% and 81%, and accuracy was 86% and 90%, respectively. BR demonstrated higher sensitivity, specificity, PPV, and NPV in comparison with NPT. The results obtained from the ROC curve analysis for BR and NPT are compared in TABLE 4. The ROC curves with optimal cut-off points for the BR received after stimulating basophils with HDM and birch pollen allergen at a dilution of 1:10 are presented in FIGURE 2. To calculate the correlation between analyzed basophil activation parameters, namely, the SI and BR, for all allergen concentrations with NPT results, the Spearman s rank correlation test was used. For all measurements, except for the those for the birch allergen at a dilution of 1:1 (r = 0.30, P = for SI and r = 0.34, P = 0.06 for BR), we obtained a significant correlation ranging from 0.58 to 0.74 (TABLES 2 and 3). The correlation of the SI and BR with NPT results for the optimal HDM and birch allergen at a dilution of 1:10 is presented in FIGURE 3. DISCUSSION Our results demonstrated that BAT may replace NPT, while maintaining high diagnostic sensitivity and specificity. BAT is currently the subject of intensive research, and it has been gradually introduced into diagnostic workup of allergic diseases. Nevertheless, there is still no standardized methodology of performing the test. 8,13 In our study, we used CD63 as an activation marker due to the direct association of its expression with poststimulation basophil degranulation. 14,16 The BAT was performed using the same 3 dilutions of allergen preparations as in the NPT. 9 Therefore, to adhere to the recommendations, we used the ROC curves to establish an optimum positive cutoff value for BAT. 11,12 HDM and birch allergen concentrations of 500 and 50 SBU were found to be adequate for ORIGINAL ARTICLE Comparison of BAT versus NPT in establishing eligibility for SIT

35 A 1 B sensitivity sensitivity specificity specificity FIGURE 2 Receiver-operating characteristic curves with optimal cut-off points for basophil reactivity received after stimulating basophils with the optimal house dust mite and birch pollen allergens at a dilution of 1:10; A house dust mite allergen; B birch pollen allergen A 160 C BR SI B NPT 6 SI D BR NPT NPT NPT 6 FIGURE 3 Correlation of stimulation index (SI) and basophil reactivity (BR) with nasal provocation test (NPT) results for the optimal house dust mite and birch allergens at a dilution of 1:10; A SI for house dust mite allergen; B SI for birch pollen allergen; C BR for house dust mite allergen; D BR for birch pollen allergen Abbreviations: see FIGURE 1 basophil stimulation. Compared with the NPT, the results obtained for the SI corresponded with those reported by other authors. In the study by Gomez et al, 7 BAT sensitivity with HDM allergens (ALK-Abelló, Madrid, Spain) expressed by the SI was 85%; specificity, 93%; PPV, 92%; and NPV, 87%. The authors suggested that the application of BAT was a good alternative to NPT in local AR, especially that it is time consuming to perform NPT in cases where the allergen potentially 526 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2016; 126 (7-8) 35

36 responsible for clinical symptoms is unknown. They also emphasized the low sensitivity of other tests in local AR. 7 Until now, BR has been compared mostly with oral challenge test results. In our study, we found a significant correlation between the BR for HDM and birch allergen dilutions of 1:10 and 1:100 and intensification of response in specific nasal provocation. Santos et al 10 and Rubio et al 11 reported that also patients with more intensified reactions in specific oral provocation with food had a higher BR. On the other hand, Blumchen et al 17 compared BAT to specific oral provocation and showed no correlation with the severity of clinical reaction but only with threshold levels for peanut allergy. Zidarn et al 18 performed BAT with grass allergens (AQUAGEN SQ, freeze-dried allergen extract of grass pollen mix L299; ALK-Abelló) and NPT with grass pollen allergen solution (Mixed Grasses; HAL Allergy, Leiden, The Netherlands). Patients with a positive NPT result had a significantly higher CD63 expression after stimulation with an allergen at a submaximum concentration. 18 In our study, in subjects with a positive NPT result, we obtained significantly higher values both of the SI and of BR. Similarly, Nopp et al 19 obtained similar results of BAT assessed with the use of basophil allergen threshold sensitivity (CD-sens) and NPT assessed with the use of clinical symptoms scale in 22 of 26 patients, whereas when a positive peak nasal inspiratory flow (PNIF) criterion was introduced in 24 of 26 patients. After repeated provocation, the same symptoms occurred in 14 of 18 patients, and with the same positive peak nasal inspiratory flow in 17 of 18 patients. All patients had identical CD-sens classification. Dahlen et al 20 performed bronchial provocation and BAT and confirmed that a BAT result is an objective marker of respiratory tract sensitivity to an allergen in patients with stable allergic asthma and may replace specific bronchial provocation. 20 In comparison to NPT, the advantages of BAT, apart from saving the patient from exposition to an incidence of allergic symptoms during the test, include the possibility of diagnosis regardless of the pollination season 21,22 and no requirement to discontinue the use of many symptom- relief medications. 23 In our study, NPT could not be performed in just 1 patient because of exacerbation of rhinitis symptoms at baseline. In this patient, the BAT confirmed clinical significance of birch pollen allergy. The false positive results (BAT[+] NPT[ ]) we obtained may be explained by basophil hyperreactivity occurring in atopic patients. Khan et al 24 postulated that it may be due to a high level of total IgE in atopic patients, high level of spleen tyrosine kinase, a key regulatory factor in an IgE- mediated signal transduction route in the allergic reaction in mastocytes or basophils, or activation by interleukin In our study, we did not obtain any false negative results (BAT[ ] NPT[+]). We applied clinical instead of objective NPT evaluation. However, the procedure was conducted by a laryngologist-allergist with many years of experience in performing and interpreting NPTs. Similarly, Zidarn et al 18 did not apply nasal provocation objectification in comparing its results against those of BAT. The good correlation between BAT and specific nasal provocation confirmed in our study seems to result directly from the type I allergic reaction mechanism: after stimulation with an allergen, basophil degranulation and CD63 expression occur. Earlier studies proved that basophils are recruited in the respiratory tract during a specific provocation and are responsible for a local reaction. 25 Hence, BAT with an assessment of appropriate parameters may reflect a target organ s sensitivity to an allergen. Research into the pathogenesis of allergy is the challenge for the future. 26 Currently, several biomarkers are available for airway diseases that help individualize diagnosis and treatment. 27 It seems that the development of assays based on the mechanisms of allergy reactions is a promising strategy. 28 Conclusions NPT is still a gold standard in the diagnosis of AR. Where there are contraindications to perform NPT, BAT may be regarded as an alternative in establishing patients eligibility for SIT, but further research is needed to confirm this. In the case of using an allergen preparation for NPT in BAT, its optimum concentrations are 500 and 50 SBU. Both the SI and BR are good indicators of basophil activation. Contribution statement ML contributed to the concept and design of the study, enrolled subjects into the study, performed nasal provocation tests and statistical analysis, wrote the original draft of the manuscript, and approved the final version of the manuscript. WD conducted all in vitro assays and read and approved the final version of the manuscript. BR participated in the enrollment of subjects into the study, performed the nasal provocation tests, and read and approved the final version of the manuscript. MM participated in the enrollment of subjects into the study, and read, corrected, and approved the final version of the manuscript. EC ccontributed to the concept and design of the study, participated in the interpretation of data, and read and approved the final version of the manuscript. Acknowledgments The study project was financed from the statutory task fund of Jagiellonian University Medical College (no.: K/ZDS/005621; to ECz). REFERENCES 1 Samoliński B, Sybilski AJ, Raciborski F, et al. Prevalence of rhinitis in Polish population according to the ECAP (Epidemiology of Allergic Disorders in Poland) study. Otolaryngol Pol. 2009; 63: Bousquet J, Schunemann HJ, Fonseca J, et al. MACVIA-ARIA Sentinel NetworK for allergic rhinitis (MASK-rhinitis): the new generation guideline implementation. Allergy. 2015; 70: ORIGINAL ARTICLE Comparison of BAT versus NPT in establishing eligibility for SIT

37 3 Pfaar O, Bachert C, Bufe A, et al. Guideline on allergen-specific immunotherapy in IgE-mediated allergic diseases: S2k Guideline of the German Society for Allergology and Clinical Immunology (DGAKI), the Society for Pediatric Allergy and Environmental Medicine (GPA), the Medical Association of German Allergologists(AeDA), the Austrian Society for Allergy and Immunology (ÖGAI), the Swiss Society for Allergy and Immunology (SGAI), the German Society of Dermatology (DDG), the German Society of Oto- Rhino-Laryngology, Head and Neck Surgery (DGHNO-KHC), the German Society of Pediatrics and Adolescent Medicine (DGKJ), the Society for Pediatric Pneumology (GPP), the German Respiratory Society (DGP), the German Association of ENT Surgeons (BV-HNO), the Professional Federation of Paediatricians and Youth Doctors (BVKJ), the Federal Association of Pulmonologists (BDP) and the German Dermatologists Association (BVDD). Allergo J Int. 2014; 23: Samoliński B, Rapiejko P, Krzych-Fałta E, et al. [Standards of nasal provocation tests]. Post Dermatol Alergol. 2010; 27: Polish. 5 Dordal MT, Lluch-Bernal M, Sánchez MC, et al. Allergen-specific nasal provocation testing: review by the rhinoconjunctivitis committee of the Spanish Society of Allergy and Clinical Immunology. J Investig Allergol Clin Immunol. 2011; 2: McGowan EC, Saini S. Update on the performance and application of basophil activation tests. Curr Allergy Asthma Rep. 2013; 13: Gómez E, Campo P, Rondón C, et al. Role of the basophil activation test in the diagnosis of local allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 2013; 132: Hoffmann HJ, Santos AF, Mayorga C, et al. The clinical utility of basophil activation testing in diagnosis and monitoring of allergic disease. Allergy. 2015; 70: Leśniak M, Dyga W, Porębski G, et al. [Basophil activation test-a practical approach to diagnosis of common respiratory allergy]. Przegl Lek. 2015; 72: Polish. 10 Santos AF, Du Toit G, Douiri A, et al. Distinct parameters of the basophil activation test reflect the severity and threshold of allergic reactions to peanut. J Allergy Clin Immunol. 2015; 135: Rubio A, Vivinus-Nébot M, Bourrier T, et al. Benefit of the basophil activation test in deciding when to reintroduce cow s milk in allergic children. Allergy. 2011; 66: Ebo DG, Sainte-Laudy J, Bridts CH, et al. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 2006; 61: Tantilipikorn P, Vichyanond P, Lacroix JS. Nasal provocation test: how to maximize its clinical use? Asian Pac J Allergy Immunol. 2010; 28: Czarnobilska E, Gregorius A, Porebski G, et al. [The benefits of using basophil activation test as a diagnostic tool prior to specific immunotherapy with inhalant allergens]. Przegl Lek. 2012; 69: Polish. 15 De Weck AL, Sanz ML, Gamboa PM, et al. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 2008; 18: Kleine-Tebbe J, Erdmann S, Knol EF, et al. Diagnostic tests based on human basophils: potentials, pitfalls and perspectives. Int Arch Allergy Immunol. 2006; 141: Blumchen K, Beder A, Beschorner J, et al. Modified oral food challenge used with sensitization biomarkers provides more real-life clinical thresholds for peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 2014; 134: Zidarn M, Košnik M, Silar M, et al. Rhinitis symptoms caused by grass pollen are associated with elevated basophile allergen sensitivity and a larger grass-specific immunoglobulin E fraction. Clin Exp Allergy. 2012; 42: Nopp A, Cardell LO, Johansson SG. CD-sens can be a reliable and easyto-use complement in the diagnosis of allergic rhinitis. Int Arch Allergy Immunol. 2013; 161: Dahlen B, Nopp A, Johansson SGO, et al. Basophil allergen threshold sensitivity, CD-sens, is a measure of allergen sensitivity in asthma. Clin Exp Allergy. 2011; 41: Saporta M, Kamei S, Persi L, et al. Basophil activation during pollen season in patients monosensitized to grass pollens. Allergy. 2001; 56: Aerts NE, Dombrecht EJ, Bridts CH, et al. Simultaneous flow cytometric detection of basophil activation marker CD63 and intracellular phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase in birch pollen allergy. Cytometry B Clin Cytom. 2009; 76: Wolanczyk-Medrala A, Gogolewski G, Liebhart J, et al. A new variant of the basophil activation test for allergen-induced basophil CD63 upregulation. The effect of cetirizine. J Investig Allergol Clin Immunol. 2009; 19: Khan FM, Ueno-Yamanouchi A, Serushago B, et al. Basophil activation test compared to skin prick test and fluorescence enzyme immunoassay for aeroallergen-specific immunoglobulin-e. Allergy Asthma Clin Immunol. 2012; 8: Klein Jan A, McEuen AR, Dijkstra MD, et al. Basophil and eosinophil accumulation and mast cell degranulation in the nasal mucosa of patients with hay fever after local allergen provocation. J Allergy Clin Immunol. 2000; 106: Hartley R, Berair R, Brightling CE. Severe asthma: novel advances in the pathogenesis and therapy. Pol Arch Med Wewn. 2014; 124: Dasgupta A, Nair P. When are biomarkers useful in the management of airway diseases? Pol Arch Med Wewn. 2013; 123: Porębski G, Czarnobilska E, Bosak M. Cytotoxic -based assays in delayed drug hypersensitivity reactions induced by antiepileptic drugs. Pol Arch Med Wewn. 2015; 125: POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2016; 126 (7-8) 37

38 ARTYKUŁ ORYGINALNY Porównanie testu aktywacji bazofilów z testem prowokacji donosowej w kwalifikacji do immunoterapii swoistej Małgorzata Leśniak, Wojciech Dyga, Barbara Rusinek, Marcel Mazur, Ewa Czarnobilska Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej, Katedra Toksykologii i Chorób Środowiskowych, Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum, Kraków SŁOWA KLUCZOWE indeks stymulacji, reaktywność bazofilów, test prowokacji donosowej STRESZCZENIE WPROWADZENIE Najczęstszą z chorób atopowych jest alergiczny nieżyt nosa (ANN). Immunoterapia swoista (specific immunotherapy SIT) jest jedyną efektywną metodą leczenia ANN. W wątpliwych przypadkach diagnostycznych przed kwalifikacją do SIT należy wykonać donosowe próby prowokacyjne (nasal provocation tests NPT). Wykonanie NPT wiąże się z szeregiem przeciwwskazań, dlatego trwają poszukiwania alternatywnej metody in vitro. CELE Celem badania była ocena, czy w kwalifikacji do SIT swoista prowokacja in vitro, czyli test aktywacji bazofilów (basophil activation test BAT), może zastąpić swoistą prowokację in vivo, czyli NPT. PACJENCI I METODY Do badania włączono 30 pacjentów z ANN z uczuleniem na roztocze kurzu domowego lub pyłek brzozy kwalifikowanych do SIT. Ocenę aktywacji bazofilów przez pomiar ekspresji antygenu CD63 przeprowadzono za pomocą testu Flow2 CAST. Bazofile stymulowano preparatem alergenowym brzozy i roztoczy (stężenia 5000, 500 i 50 standaryzowanych jednostek biologicznych) stosowanym w NPT. Wyniki BAT wyrażano jako indeks stymulacji (stimulation index SI) oraz reaktywność bazofilów (basophil reactivity BR). WYNIKI Stężeniami alergenu odpowiednimi do stymulacji bazofilów okazały się 500 i 50 SBU. Mediana SI oraz BR dla alergenów w przypadku pozytywnego wyniku NPT była wyższa niż dla alergenów przy negatywnym wyniku NPT (p <0,001). Dla SI i BR czułość wahała się w zakresie %, swoistość 78 89%, wartość predykcyjna dodatnia 75 87%, a wartość predykcyjna ujemna %. Korelacja analizowanych parametrów dla alergenów w stężeniach 500 i 50 SBU była wysoka (zakres 0,58 0,74; p <0,05). WNIOSKI Jeśli istnieją przeciwwskazania do NPT, BAT może być alternatywą w kwalifikacji do SIT. Optymalnymi stężeniami roztworów alergenowych są 500 i 50 SBU. Zarówno SI, jak i BR są dobrymi wskaźnikami aktywacji bazofilów. Adres do korespondencji: dr hab. med. Ewa Czarnobilska, Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej, Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum, ul. Śniadeckich 10, Kraków, tel.: , e mail: ewa.czarnobilska@uj.edu.pl Praca wpłynęła: Przyjęta do druku: Publikacja online: Nie zgłoszono sprzeczności interesów. Pol Arch Med Wewn. 2016; 126 (7-8): doi: /pamw.3525 Copyright by Medycyna Praktyczna, Kraków 2016 ARTYKUŁ ORYGINALNY Porównanie BAT i NPT w kwalifikacji do SIT

39 prace oryginalne Małgorzata Bulanda Wojciech Dyga Barbara Rusinek Ewa Czarnobilska Rola testu aktywacji bazofilów (BAT) w kwalifikacji do immunoterapii swoistej z alergenami wziewnymi The role of the basophil activation test (BAT) in qualification for specific immunotherapy with inhalant allergens Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej Katedra Toksykologii i Chorób Środowiskowych Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Kierownik: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska, prof. UJ Dodatkowe słowa kluczowe: alergia wziewna immunoterapia swoista test aktywacji bazofilów Additional key words: inhalant allergy specific immunotherapy basophil activation test Badania wykonano w ramach pracy statutowej K/ZDS/ Adres do korespondencji: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska, prof. UJ Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej CMUJ ul. Śniadeckich 10, Kraków Tel: (12) , fax: (12) , ewa.czarnobilska@uj.edu.pl Kwalifikacja do immunoterapii swoistej (SIT) wg wytycznych Europejskiej Akademii Alergologii i Immunologii (EAACI) obejmuje wywiad oraz testy skórne punktowe (SPT) i/ lub pomiar stężenia sige. W przypadku niezgodności między wywiadem a wynikami SPT/sIgE lub rozbieżności między SPT i sige konieczne jest wykonanie dodatkowych testów diagnostycznych. Test aktywacji bazofilów (BAT) jest badaniem, w którym ocenia się ekspresje markerów aktywacji tych komórek, np. CD63 lub CD203c po stymulacji. Celem naszego badania była ocena użyteczności BAT w kwalifikacji do SIT w porównaniu do SPT i sige oraz w przypadku niezgodności między wynikami SPT i sige. Do badania włączonych zostało 30 dorosłych pacjentów z alergicznym nieżytem nosa wywołanym alergią na roztocze kurzu domowego (Dermatophagoides pteronyssinus, Dp) lub brzozę przed kwalifikacją do SIT. U wszystkich pacjentów wykonano SPT, sige i BAT. Grupa pacjentów z alergią na brzozę stanowiła kontrolną dla grupy z alergią na Dp i odwrotnie. Ocena aktywacji bazofilów przez pomiar ekspresji antygenu CD63 była przeprowadzona testem Flow2 CAST. Komórki były pobudzane preparatem alergenowym Dp i brzozy w następujących stężeniach: 50, 500 i 5000 SBU/ ml. Wyniki BAT przedstawiono za pomocą indeksu stymulacji. Dla optymalnych stężeń 50 i 500 SBU/ ml parametry porównujące BAT do SPT oraz sige jako złotych standardów wynosiły kolejno: czułość % i %, swoistość 50-94% i 47-89%, wartość predykcyjna dodatnia 65-94% i 61-87%, wartość predykcyjna ujemna % i %. Korelacja BAT - SPT oraz BAT - sige wahała się odpowiednio w granicach 0,59 do 0,84 i 0,51 do 0,72. Wynik BAT był pomocny u 2 z 30 pacjentów z niezgodnymi wynikami SPT i sige. Optymalnymi stężeniami roztworów alergenowych stymulujących bazofile Qualification for specific immunotherapy (SIT) according to the guidelines of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (EAACI) includes medical history, skin prik tests (SPT) and/or measuring the concentration of sige. It is necessary to perform additional diagnostic tests in case of discrepancies between the history and the results of SPT/sIgE or differences between SPT and sige. Basophil activation test (BAT) assesses the expression of activation markers of these cells, eg. CD63 and CD203c after stimulation. The aim of our study was to evaluate the usefulness of BAT in the qualification for the SIT in comparison to the SPT and sige and in case of discrepancies between the results of SPT and sige. The study included 30 patients with allergic rhinitis (AR) caused by allergy to house dust mite (Dermatophagoides pteronyssinus, Dp) or birch pollen qualified for SIT. All patients had SPT, sige and BAT determination. The group of patients with allergy to birch was a control group for Dp allergic and vice versa. BAT with CD63 antigen expression was performed using a Flow2CAST test. Basophils were stimulated with allergen preparation (50, 500, and 5000 SBU/ml concentrations). BAT results were expressed as a stimulation index (SI). For optimal concentrations of 50 and 500 SBU/ml parameters comparing BAT to SPT and sige as the gold standards were consecutively: sensitivity % and %, specificity 50-94% and 47-89%, positive predictive value 65-94% and 61-87%, negative predictive value % and %. Correlation BAT - SPT and BAT - sige ranged within 0.59 to 0.84 and 0.51 to BAT was helpful in 2 of 30 patients with incompatible results of SPT and sige. Optimal concentrations for basophil stimulation are 50 and 500 SBU/ M. Bulanda i wsp.

40 są 50 i 500 SBU/ml. BAT może być pomocnym narzędziem diagnostycznym w kwalifikacji do SIT przy niezgodności między wynikami SPT a sige. ml. BAT may be useful diagnostic tool in the qualification for the SIT in case of discrepancies between the results of SPT and sige. Wstęp Immunoterapia swoista (specific immunotherapy, SIT) stanowi jedyne leczenie przyczynowe w IgE-zależnych chorobach, takich jak alergiczny nieżyt nosa (allergic rhinitis, AR), astma oskrzelowa i atopowe zapalenie skóry oraz w alergii na jady owadów błonkoskrzydłych. Kwalifikacja do SIT wg wytycznych Europejskiej Akademii Alergologii i Immunologii (European Academy of Allergy and Clinical Immunology, EAACI) obejmuje wywiad oraz testy skórne punktowe (Skin Prick Test, SPT) i/lub oznaczenia stężenia swoistych IgE (sige) [1]. Za dodatni wynik SPT przyjmuje się średnicę bąbla 3 mm lub więcej, za pozytywny wynik sige 0,35 ku/l (klasa 1) [2], a za istotne klinicznie przyjmuje się wyniki sige 0,7 kui/l (klasa 2) [2]. Powyższe punkty odcięcia są ustalone arbitralnie i nie zawsze korelują z objawami. Ponadto wykazano, że stężenia specyficznych IgE mogą różnić się w zależności od wieku, czy naturalnej ekspozycji na alergeny w środowisku [3]. Podobnie reaktywność skóry w SPT zmienia się wraz z wiekiem [4]. W praktyce klinicznej przed kwalifikacją do SIT wątpliwości stwarzają sytuacje niezgodności między wynikami SPT a sige wymagające poszerzenia diagnostyki. Test aktywacji bazofilów (Basophil Activation Test, BAT) jest badaniem, w którym ocenia się ekspresje markerów aktywacji tych komórek po stymulacji. Do tej pory opisano kilka protokołów przeprowadzania BAT. Bazofile są identyfikowane przy użyciu różnych kombinacji przeciwciał w cytometrze przepływowym. Pierwszymi markerami, którymi znakowano bazofile były antygen CD45 oraz IgE. Innymi powszechnie stosowanymi kombinacjami są niskie rozproszenie boczne (Side Scatter, SCC) oraz CD123+/HLADR, CRTH2+, CD203c+ lub CD193+. Na spoczynkowych bazofilach można też oznaczać ekspresję CD193 (CCR3). Najczęściej stosowanym markerem aktywacji bazofilów jest ulegający ekspresji dopiero po ich degranulacji CD63. Natomiast CD203c jest stale obecny na powierzchni bazofila i jego ekspresja ulega zwiększeniu po aktywacji, dlatego może służyć zarówno jako marker identyfikacji, jak i aktywacji [5,6]. Celem naszego badania była ocena użyteczności BAT w kwalifikacji do SIT w porównaniu do SPT i sige oraz w przypadku niezgodności między wynikami SPT i sige. Materiał i Metodyka Badanie przeprowadzono w latach Do badania włączonych zostało 30 dorosłych pacjentów (18 kobiet, 12 mężczyzn; średni wiek 35,3 lat) do tej pory nie odczulanych, skierowanych na podstawie objawów klinicznych do Centrum Alergologii Klinicznej i Środowiskowej UJ CM z rozpoznaniem AR przed kwalifikacją do SIT. Badanych podzielono na 2 grupy. Grupa 1 obejmowała 15 pacjentów z dodatnim wynikiem SPT z alergenami brzozy i ujemnym wynikiem SPT z alergenami roztoczy kurzu domowego (Dermatophagoides pteronyssinus, Dp). Grupa 2 obejmowała 15 pacjentów z dodatnim wynikiem SPT z alergenami Dp oraz ujemnym wynikiem SPT z alergenami brzozy. Grupa 2 stanowiła kontrolę dla grupy 1 i odwrotnie. Projekt badania uzyskał pozytywną opinię Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Jagiellońskiego: KBET/183/B/2014. Badanie zostało sfinansowane z pracy statutowej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego: K/ ZDS/ SPT, sige Za wynik dodatni SPT (wyciągi alergenowe Allergopharma) przyjęto średnicę bąbla w odczynie testowym na badany alergen większą lub równą 3 mm. Średnicę bąbla obliczono z sumy największego wymiaru i wymiaru do niego prostopadłego podzielonej przez 2. Za punkt odcięcia wartości dodatniej sige uznano wartość 0,7 kui/l (UniCapPhadia, oznaczenie wykonywane według protokołu producenta). BAT Do wykonania BAT używano 400 μl krwi pobranej do probówek zawierających wersenian sodu (EDTA). Ocena aktywacji bazofilów przez pomiar ekspresji antygenu CD63 była przeprowadzona testem Flow2 CAST (Bühlmann Laboratories AG, Schönenbuch, Switzerland). Jako kontrolę pozytywną zastosowano przeciwciała monoklonalne anty-fcɛri (przeciwciało przeciw receptorowi o wysokim powinowactwie do IgE), jako kontroli negatywnej użyto buforu do rozcieńczania alergenów. Komórki były pobudzane preparatami alergenowymi Dp lub brzozy, które są używane do testu prowokacji donosowej (nasal provocation test, NPT) (Allegropharma GmbH, Reinbek, Germany) w następujących rozcieńczeniach: 1:1, 1:10, 1:100, odpowiadającym kolejnym stężeniom 5000, 500 i 50 SBU/ml (standaryzowanych jednostek biologicznych). Badanie zostało przeprowadzone według instrukcji producenta [7]. Wyniki BAT przedstawiono za pomocą indeksu stymulacji (stimulation index, SI), który zdefiniowano jako procent ilości bazofilów aktywowanych badanym alergenem w stosunku do procentu ilości bazofilów aktywowanych w kontroli niestymulowanej [8]. Przy określaniu progu odcięcia wartości dodatniej BAT korzystano zgodnie z zaleceniami z literatury z krzywych ROC (receiver operating characteristics curves) [9]. Analiza statystyczna Rozkład danych oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka. Wyniki zaprezentowano w postaci median. Krzywe ROC utworzono za pomocą programu PQStat. Krzywych ROC użyto do oceny optymalnego punktu odcięcia dodatniego wyniku BAT. Dla BAT, przyjmując kolejno SPT a następnie sige jako złoty standard, obliczono pole pod krzywą (Area Under the Curve, AUC), czułość, swoistość, wartość predykcyjną dodatnią (Positive Predictive Values, PPV), wartość predykcyjną ujemną (Negative Predictive Values, NPV), dokładność (Accuracy, ACC). Powyższe parametry zdefiniowano następująco: czułość - zdolność testu do wykrywania osób rzeczywiście uczulonych, swoistość - zdolność testu do wykrywania osób rzeczywiście nieuczulonych, PPV - procent pacjentów z dodatnim wynikiem testu, którzy rzeczywiście są uczuleni, NPV - procent pacjentów z ujemnym wynikiem testu, którzy rzeczywiście nie są uczuleni, ACC - procent pacjentów prawidłowo zakwalifikowanych przez test diagnostyczny jako uczuleni lub nieuczuleni i obliczono wg powszechnie przyjętych wzorów [10]. Korelację rang Spearmana zastosowano w celu oceny korelacji między BAT a SPT oraz BAT a sige. Za istotną statystycznie uznano wartość p<0,05. Użyto pakietu statystycznego GraphPad- Prism 6. Wyniki W tabeli I zestawiono wyniki uzyskane przez analizę krzywych ROC oraz korelacje indeksu stymulacji z alergenami roztoczy kurzu domowego i brzozy w porównaniu do SPT. Dla rozcieńczeń alergenów Dp i brzozy 1:10 oraz 1:100 uzyskano porównywalne do SPT wyniki SI. Przy rozcieńczeniu Dp 1:100 optymalny punkt odcięcia SI względem SPT ustalony został na poziomie 10,59; czułość SI wynosiła 86%, swoistość 88%, wartość predykcyjna dodatnia 88%, ujemna 88%, a dokładność 88%. Pole pod krzywą ROC dla Dp w rozcieńczeniu 1:100 wyniosło 0,89 (p<0,001), co wskazuje na zgodność wyników BAT i SPT. Powyższe wartości dla rozcieńczenia 1:100 alergenu brzozy przy punkcie odcięcia 4,2 wynosiły odpowiednio: czułość 100%, swoistość 94%, PPV 94%, NPV 100%, ACC 97%. Pole pod krzywą ROC dla brzozy w rozcieńczeniu 1:100 wyniosło 0,98 (p<0,00001). Przyjmując zalecany w literaturze punkt odcięcia wartości dodatniej SI na poziomie 2 otrzymaliśmy dla Dp w rozcieńczeniach 1:10 oraz 1:100 odpowiednio: wysoką czułość (100% i 93%) i wartość predykcyjną ujemną (100% i 91%) przy niższych swoistości (50%, 63%) oraz wartości predykcyjnej dodatniej (65%, 70%) i dokładności (74%, 77%). Dla brzozy w rozcieńczeniach 1:10 oraz 1:100 z uwzględnieniem powyższego punktu odcięcia SI 2 zarówno czułość jak i NPV wynosiły 100% przy wysokiej swoistości (81%, 88%) oraz PPV (93%, 88%) i ACC (90%, 94%). W tabeli II przedstawiono wyniki uzyskane przez analizę krzywych ROC oraz korelacje dla indeksu stymulacji z alergenami roztoczy kurzu domowego i brzozy w porównaniu do sige. Zestawienie to Przegląd Lekarski 2016 / 73 /

41 Tabela I Wyniki uzyskane przez analizę krzywych ROC oraz korelacje dla indeksu stymulacji z alergenami roztoczy kurzu domowego i brzozy w porównaniu do punktowych testów skórnych. The results obtained by analyzing the ROC curves and correlations for the stimulation index with house dust mites and birch allergens compared to skin prick tests. Alergen (SBU/ml) Dp SI 5000 Dp SI 500 Dp SI 50 Brzoza SI 5000 Brzoza SI 500 Brzoza SI 50 AUC 0,81 (p<0,01) 0,85 (p<0,001) 0,89 (p<0,001) 0,63 (p=0,21) 0,971 (p<0,00001) 0,98 (p<0,00001) Czułość (%) 60 (67)* 82 (100)* 86 (93)* 60 (53)* 93 (100)* 100 (100)* Swoistość (%) 88 (69)* 75 (50)* 88 (63)* 88 (88)* 94 (81)* 94 (88)* PPV (%) 82 (67)* 76 (65) * 88 (70)* 82 (80)* 93 (93)* 94 (88)* NPV (%) 70 (69)* 86 (100)* 88 (91)* 70 (67)* 94 (100)* 100 (100)* ACC (%) 74 (68)* 81 (74)* 88 (77)* 74 (71)* 94 (90)* 97 (94)* R 0,60 (p<0,001) 0,59 (p<0,001) 0,69 (p<0,0001) 0,18 (p=0,35) 0,84 (p<0,000001) 0,84 (p<0,000001) *Punkt odcięcia wartości dodatniej SI 2 Skróty: Dp SI 5000, 500, 50 - indeks stymulacji dla alergenu roztoczy kurzu domowego w kolejnych stężeniach 5000, 500, 50 SBU/ml; Brzoza SI 5000, 500, 50 - indeks stymulacji dla alergenu brzozy w kolejnych stężeniach 5000, 500, 50 SBU/ml; AUC - pole pod krzywą; PPV - wartość predykcyjna dodatnia; NPV - wartość predykcyjna ujemna; ACC - dokładność; R współczynnik korelacji Tabela II Wyniki uzyskane przez analizę krzywych ROC oraz korelacje dla indeksu stymulacji z alergenami roztoczy kurzu domowego i brzozy w porównaniu do sige. The results obtained by analyzing the ROC curves and correlations for the stimulation index with house dust mites and birch allergens compared to sige. Alergen (SBU/ml) Dp SI 5000 Dp SI 500 Dp SI 50 Brzoza SI 5000 Brzoza SI 500 Brzoza SI 50 AUC 0,79 (p<0,01) 0,87 (p<0,001) 0,93 (p<0,0001) 0,70 (p=0,06) 0,96 (p<0,0001) 0,94 (p<0,0001) Czułość (%) 57 (64)* 93 (100)* 93 (100)* 58 (58)* 100 (100)* 100 (100)* Swoistość (%) 94 (65)* 76 (47)* 88 (65)* 89 (84)* 89 (68)* 79 (74)* PPV (%) 89 (60)* 76 (61)* 87 (70)* 78 (70)* 86 (66)* 75 (71)* NPV (%) 73 (69)* 93 (100)* 94 (100)* 77 (76)* 100 (100)* 100 (100)* ACC (%) 77 (65)* 84 (71)* 90 (81)* 77 (74)* 94 (80)* 87 (84)* R 0,57 (p=0,01) 0,51 (p=0,03) 0,60 (p=0,007) 0,36 (p=0,13) 0,72 (p<0,001) 0,72 (p<0,001) *Punkt odcicia wartości dodatniej SI 2 Skróty: Dp SI 5000, 500, 50 - indeks stymulacji dla alergenu roztoczy kurzu domowego w kolejnych stężeniach 5000, 500, 50 SBU/ml; Brzoza SI 5000, 500, 50 - indeks stymulacji dla alergenu brzozy w kolejnych stężeniach 5000, 500, 50 SBU/ml; AUC - pole pod krzywą; PPV - wartość predykcyjna dodatnia; NPV - wartość predykcyjna ujemna; ACC - dokładność; R współczynnik korelacji Tabela III Analiza przypadków niezgodnych wyników SPT oraz sige. Analysis of cases with inconsistent results of SPT and sige. SPT* [mm] sige [kui/l] NPT SI 5000 SBU/ml SI 500 SBU/ml SI 50 SBU/ml 1 4 0,51 ujemna 6,5 2,86 0, ,25 dodatnia 2,0 2,57 5,3 *Średnicę bąbla obliczono przez zsumowanie najdłuższego wymiaru oraz wymiaru do niego prostopadłego i podzielenie przez 2. Skróty: SPT - test skórny punktowy, sige - stężenie swoistych IgE, NPT - test prowokacji donosowej, SI - indeks stymulacji wykazało wysoką czułość, swoistość, PPV oraz NPV SI. Obliczono korelację między SI a SPT oraz sige - wyniki zestawiono w tabelach I i II. Dla rozcieńczeń 1:10 oraz 1:100 Dp i brzozy, a także dla rozcieńczenia 1:1 alergenu Dp otrzymano istotne statystycznie wyniki. U 2 spośród 30 osób stwierdzono niezgodność wyników SPT i sige (tabela III). W przypadku pacjenta zgłaszającego objawy całorocznego nieżytu nosa z dodatnimi wynikami testów skórnych punktowych (średnica bąbla 4 mm, przy histaminie 4 mm) dla Dp i niskimi sige (0,51 kui/l) wykonany NPT z alergenami Dp dał wynik ujemny. SI dla rozcieńczenia 1:100 był negatywny. Z kolei u 1 osoby z objawami alergicznego nieżytu nosa w okresie pylenia brzozy i dodatnimi testami skórnymi punktowymi dla tego alergenu sige były niskie. Natomiast BAT był dodatni dla wszystkich rozcieńczeń, co odpowiadało dodatniej NPT z alergenem brzozy. Wynik BAT był pomocny u 2 spośród 30 pacjentów z niezgodnymi wynikami SPT i sige, tj. 7% pacjentów spełniających kryteria EAACI byłoby nieprawidłowo zakwalifikowanych do SIT. Dyskusja BAT okazał się użytecznym testem in vitro w diagnostyce alergii wziewnej. W opisywanym badaniu użyliśmy testu Flow2 CAST (Bühlmann Laboratories AG, Schönenbuch, Switzerland) z CD63 jako markerem aktywacji. Wyniki naszych badań [11,12], jak również doświadczenia innych autorów [5] pokazały wysoką czułość i swoistość komercyjnie dostępnych odczynników do BAT. Modyfikowane [13] i rekombinowane [14,15] preparaty mogą być również stosowane z dobrymi efektami diagnostycznymi. Khan i wsp. oraz Potapińska i wsp. używali tego samego alergenu w różnych stężeniach do przeprowadzenia BAT i SPT z pospolitymi alergenami wziewnymi [16,17]. W opisywanym badaniu do stymulacji bazofilów użyliśmy także preparatów alergenowych Dp i brzozy przeznaczonych do NPT (Allegropharma GmbH, Reinbek, Germany) [7,18]. W analizie wyników BAT można wykorzystywać procent aktywowanych bazofilów, indeks stymulacji lub niedawno opisane parametry takie jak reaktywność (basophil reactivity) i czułość (basophil sensitivity) bazofilów. W naszym badaniu interpretowaliśmy indeksy stymulacji w celu uwzględnienia wpływu niespecyficznej stymulacji bazofilów [7]. Uzyskane wyniki dotyczące porównania BAT SPT korespondują z danymi z literatury. Sanz i wsp. dla Dp i życicy ustalili za pomocą krzywych ROC punkt odcięcia wartości dodatniej BAT wynoszący 15% aktywowanych bazofilów oraz wykazali wysoką czułość (93,3%), swoistość (98,4%), PPV (99%), NPV (89,7%), a także znamienną korelację wyników BAT z SPT (r=0,72; p<0,001) [19]. W badaniu Czarnobilskiej i wsp. czułość i swoistość BAT z alergenami Dp i Dermatophagoides farinae (Df) wynosiły odpowiednio 89,3-96,6% oraz 88,9-100% (przyjęty punkt odcięcia 788 M. Bulanda i wsp. 41

42 wartości dodatniej: 15% aktywowanych bazofilów) [12]. Podobnie Wolanczyk-Medrala i wsp. podają wysoką czułość i swoistość BAT z alergenami Dp (punkt odcięcia wartości dodatniej 15%) i pyłku traw (punkt odcięcia wartości dodatniej 9% aktywowanych bazofilów) wynoszące odpowiednio 75-93,75% oraz 100% w porównaniu do SPT jako złotego standardu [20]. Także parametry diagnostyczne BAT w porównaniu do sige odpowiadają danym z literatury. Ozdemir i wsp. wskazują na wyższą czułość BAT od oznaczeń sige oraz umiarkowanie dodatnią korelację między tymi testami dla stężeń alergenu stymulującego bazofile 4,5 x 10-4 i 4,5 x 10-5 µg/ml, i słabszą korelację dla stężeń 45,1 i 4,5 µg/ml [21]. Podobnie w badaniu Pâris-Köhler i wsp. BAT cechował się wyższą czułością (91,2%) niż pomiar stężenia sige (76%) [22]. González-Muñoz i wsp. za pomocą krzywych ROC ustalili punkt odcięcia wartości dodatniej BAT na poziomie 18% aktywowanych bazofilów z czułością i swoistością wynoszącą 96% dla Dp w stężeniu 16 ug/ml. Autorzy uzyskali dwa fałszywie dodatnie wyniki sige (>43 ku/l) przy ujemnym SPT i BAT dla Dp, które wynikały z krzyżowej reaktywności z krewetkami [23]. Do innych wniosków doszli Khan i wsp. - przy zastosowaniu SPT jako złotego standardu czułość BAT i pomiarów stężeń sige była podobna, przy niższej swoistości BAT. Korelacja pomiędzy wynikami BAT i SPT była istotna statystycznie (ale nie doskonała) dla wszystkich badanych alergenów wziewnych (kot, pies, Dp, Df, Alternaria, Hormodendrum/Cladosporium, tymotka, ambrozja, brzoza) [16]. Z kolei w badaniu Bokanovic i wsp. żaden z wykonywanych testów, czyli BAT, SPT, test prowokacji dospojówkowej ani oznaczenia sige dla komponentów alergenowych (Component-Resolved Diagnosis, CRD) u 49 pacjentów z alergią na pyłek traw nie korelował z objawami klinicznymi. Autorzy podkreślają niższą swoistość BAT w grupie pacjentów z atopią (58%, w porównaniu do 100% w grupie bez atopii) oraz z wyższym całkowitym IgE (67% w grupie z cige>100 ku/l oraz 84% w przypadku cige 100 ku/l) [24]. Wymienianą w literaturze przewagą BAT w stosunku do SPT i sige jest fakt, że BAT jest testem, na którego wynik wpływają: stężenie, specyficzność, różnorodność i powinowactwo sige, a także inne czynniki surowicze [25,26]. Według wytycznych niemieckich, w przypadku objawów całorocznego nieżytu nosa przed kwalifikacją do SIT powinno się potwierdzić istotność kliniczną uczulenia na roztocze kurzu domowego za pomocą NPT [27]. W badaniu Haxel i wsp. obejmującym 161 pacjentów oceniano zgodność wyników SPT i sige z NPT. U pacjentów z dodatnim wynikiem SPT ( 3 mm) alergia została potwierdzona NPT u 69% w przypadku alergenu Dp i 71% dla Df. Dla pozytywnego wyniku sige (punkt odcięcia wartości dodatniej przyjęty przez autorów dla testu ImmunoCAP klasa 2) uzyskano dodatnią NPT podobnie u 69% z Dp i 70% z Df. Warto podkreślić, że wartość predykcyjna dodatnia kombinacji SPT i sige wynosiła tylko 0,77 dla Dp i 0,69 dla Df [28]. W naszej grupie u 1 z 15 analizowanych pacjentów kwalifikacja do SIT zgodnie z wytycznymi EAACI jedynie na podstawie zgłaszanych objawów oraz dodatnich wyników SPT byłaby nieprawidłowa. Przeprowadzony NPT był negatywny, podobnie indeks stymulacji dla rozcieńczenia 1:100 dał wynik ujemny. Także w badaniu Czarnobilskiej i wsp. u dwojga dzieci zakwalifikowanych do SIT na podstawie dodatniego SPT z Dp i Df, BAT wykazał nieswoiste pobudzenie bazofilów. Testy prowokacji donosowej Dp i Df były także ujemne, potwierdzając fałszywie dodatni wynik SPT, co może być tłumaczone współistnieniem pokrzywki u obu tych dzieci [12]. Ww. przykłady sugerują, że w praktyce klinicznej należy z dużą ostrożnością podchodzić do interpretacji uzyskanych wyników testów diagnostycznych, gdyż mogą być one fałszywie dodatnie [10]. W naszym badaniu u 1 pacjenta mimo dodatniego SPT dla brzozy stwierdzono niskie miano sige. Wątpliwości rozstrzygnęło wykonanie NPT, który dał pozytywny wynik oraz oznaczenie indeksu stymulacji dla alergenu brzozy. W przypadku przeciwskazań do NPT testem potwierdzającym istotność kliniczną uczulenia może być BAT, wnioski te wymagają jednak potwierdzenia w dalszych badaniach [18,29]. Biorąc pod uwagę koszt i czasochłonność SIT oraz brak efektu przy nieprawidłowej kwalifikacji w wątpliwych przypadkach przed wdrożeniem terapii należy poszerzyć diagnostykę alergii o dodatkowe testy, wśród których obiecującym wydaje się BAT [12]. Wnioski Optymalnymi stężeniami roztworów alergenowych stymulujących bazofile są 50 i 500 SBU/ml. BAT może być pomocnym narzędziem diagnostycznym w kwalifikacji do SIT przy niezgodności między wynikami SPT a sige. Piśmiennictwo 1. Alvarez-Cuesta E, Bousquet J, Canonica GW, Durham SR, Malling HJ. et al: Standards for practical allergen-specific immunotherapy. Allergy 2006; 61 (Suppl. 82): Custovic A, Lazic N, Simpson A: Pediatric asthma and development of atopy. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2013; 13: Matsui EC, Sampson HA, Bahnson HT, Gruchalla RS, Pongracic JA. et al: Allergen-specific IgE as a biomarker of exposure plus sensitization in inner-city adolescents with asthma. Allergy 2010; 65: Al-Mousawi MSH, Lovel H, Behbehani N, Arifhodzic N, Woodcock A, Custovic A: Asthma and sensitization in a community with low indoor allergen levels and low petkeeping frequency. J Allergy Clin Immunol. 2004; 114: Hoffmann HJ, Santos AF, Mayorga C, Nopp A, Eberlein B.et al: The clinical utility of basophil activation testing in diagnosis and monitoring of allergic disease. Allergy 2015; 70: Boumiza R, Debard AL, Monneret G: The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clin Mol Allergy 2005; 3: Leśniak M, Dyga W, Porębski G, Czarnobilska E: Basophil activation test-a practical approach to diagnosis of common respiratory allergy. Przegl Lek. 2015; 72: Valent P, Hauswirth AW, Natter S, Sperr WR, Bühring HJ, Valenta R: Assays for measuring in vitro basophil activation induced by recombinant allergens. Methods 2004; 32: De Weck AL, Sanz ML, Gamboa PM, Aberer W, Bienvenu J. et al: Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 2008; 18: Gregorius A, Śpiewak R: Podstawy racjonalnego wyboru testów diagnostycznych w alergologii. Alergia Astma Immunologia 2013; 18: Leśniak M, Leśniak M, Czarnobilska E: Usefulness of basophil activation test for the diagnosis of inhaled allergies. Przegl Lek. 2015; 72: Czarnobilska E, Gregorius A, Porebski, Spiewak R, Sacha M: The benefits of using basophil activation test as a diagnostic tool prior to specific immunotherapy with inhalant allergens. Przegl Lek. 2012; 69: Ceuppens JL, Bullens D, Kleinjans H, van der Werf J, PURETHAL Birch Efficacy Study Group: Immunotherapy with a modified modified birch pollen extract in allergic rhinoconjunctivitis: clinical and immunological effects. Clin Exp Allergy 2009; 39: Ocmant A, Peignois Y, Mulier S, Hanssens L, Michils A, Schandene L: Flow cytometry for basophil activation markers: the measurement of CD203c up-regulation is as reliable as CD63 expression in the diagnosis of cat allergy. J Immunol Methods 2007; 320: Hauswirth AW, Natter S, Ghannadan M, Majlesi Y, Schernthaner GH. et al: Recombinant allergens promote expression of CD203c on basophils in sensitized sensitized individuals. J Allergy Clin Immunol. 2002; 110: Khan FM, Ueno-Yamanouchi A, Serushago B, Bowen T, Lyon AW. et al: Basophil activation test compared to skin prick test and fluorescence enzyme immunoassay for aeroallergen-specific immunoglobulin-e. Allergy Asthma Clin Immunol. 2012; 8: Potapińska O, Górska E, Zawadzka-Krajewska A, Kulus M, Wasik M, Demkow U: The usefulness of CD203c expression measurement on basophils after activation with grass pollen and Dermatophagoides pteronyssinus antigens. Preliminary study. Pneumonol Alergol Pol. 2009; 77: Leśniak M, Dyga W, Rusinek B, Mazur M, Czarnobilska E: Comparison of the basophil activation test versus the nasal provocation test in qualifying for specific immunotherapy. Pol Arch Med Wewn. 2016; 126: Sanz ML, Sánchez G, Gamboa PM, Vila L, Uasuf C. et al: Allergen-induced basophil activation:cd63 cell expression detected by flow cytometry in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Lolium perenne. Clin Exp Allergy. 2001; 31: Wolanczyk-Medrala A, Gogolewski G, Liebhart J, Gomulka K, Litwa M. et al: A new variant of the basophil activation test for allergen-induced basophil CD63 upregulation. The effect of cetirizine. J Investig Allergol Clin Immunol. 2009; 19: Ozdemir SK, Guloglu D, Sin BA, Elhan AH, Ikinciogullari A, Misirligil Z: Reliability of basophil activation test using CD203c expression in diag- Przegląd Lekarski 2016 / 73 /

43 nosis of pollen allergy. Am J Rhinol Allergy 2011; 25: Pâris-Köhler A, Demoly P, Persi L, Lebel B, Bousquet J, Arnoux B: In vitro diagnosis of cypress pollen allergy by using cytofluorimetric analysis of basophils (Basotest). J Allergy Clin Immunol. 2000; 105: González-Muñoz M, Villota J, Moneo I: Analysis of basophil activation by flow cytometry in pediatric house dust mite allergy. Pediatr Allergy Immunol. 2008; 19: Bokanovic D, Aberer W, Hemmer W, Heinemann A, Komericki P. et al: Determination of sige to rphl p 1 is sufficient to diagnose grass pollen allergy. Allergy 2013; 68: Santos AF, Du Toit G, Douiri A, Radulovic S, Stephens A. et al: Distinct parameters of the basophil activation test reflect the severity and threshold of allergic reactions to peanut. J Allergy Clin Immunol. 2015; 135: Rubio A, Vivinus-Nébot M, Bourrier T, Saggio B, Albertini M, Bernard A: Benefit of the basophil activation test in deciding when to reintroduce cow s milk in allergic children. Allergy 2011; 66: Pfaar O, Bachert C, Bufe A, Buhl R, Ebner C. et al: Guideline on allergen-specific immunotherapy in IgE-mediated allergic diseases: S2k Guideline of the German Society for Allergology and Clinical Immunology (DGAKI), the Society for Pediatric Allergy and Environmental Medicine (GPA), the Medical Association of German Allergologists(AeDA), the Austrian Society for Allergy and Immunology (ÖGAI), the Swiss Society for Allergy and Immunology (SGAI), the German Society of Dermatology (DDG), the German Society of Oto- Rhino-Laryngology, Head and Neck Surgery (DGHNO-KHC), the German Society of Pediatrics and Adolescent Medicine (DGKJ), the Society for Pediatric Pneumology (GPP), the German Respiratory Society (DGP), the German Association of ENT Surgeons (BV-HNO), the Professional Federation of Paediatricians and Youth Doctors (BVKJ), the Federal Association of Pulmonologists (BDP) and the German Dermatologists Association (BVDD). Allergo J Int. 2014; 23: Haxel BR, Huppertz T, Boessert P, Bast F, Fruth K: Correlation of skin test results and specific immunoglobulin E blood levels with nasal provocation testing for house-dust mite allergies. Am J Rhinol Allergy 2016; 30: Heffler E: Basophil activation test: a reliable biomarker for allergen immunotherapy? Pol Arch Med Wewn. 2016; 126: M. Bulanda i wsp. 43

44 Publikacje oryginalne Rozdział 2. Zastosowanie BAT w monitorowaniu SIT List od Redakcji Postępy Dermatologii i Alergologii. Czarnobilska E, Bulanda M, Śpiewak R. The usefulness of basophil activation test in the monitoring of specific immunotherapy with house dust mite allergens. Adv Dermatol Allergol. - praca przyjęta do druku. 44

45 Powered by TCPDF ( ADA Authors: Ewa Czarnobilska, Małgorzata Bulanda, Radosław Śpiewak Decision letter: December 01, 2016 ADA The usefulness of basophil activation test in the monitoring of specific immunotherapy with house dust mite allergens. Dear Radosław Śpiewak, I am pleased to inform you that your manuscript, entitled: The usefulness of basophil activation test in the monitoring of specific immunotherapy with house dust mite allergens., has been finally accepted for publication in our journal. We would like to inform that your paper will be published after receiving publishing fee. In order to receive the invoice, please complete the form including data for invoicing, which is available in the payment bookmark. Failure to complete this form means that you choose not to obtain the invoice. Please log in to your account: to proceed with the payment. If you are paying by wire transfer please indicate manuscript number the name of the contact author and the title. In case of any problems or questions please do not hesitate to contact the technical editor at: eshelp@termedia.pl. We would appreciate if you could confirm payment within 14 days. Thank you for submitting your work to us. Kindest regards, Rafał Czajkowski Editor-in-Chief Advances in Dermatology and Allergology Review 1: The aim of the paper is interesting as well as for both clinical and scientific perspectives. 45

46 Publikacje oryginalne The usefulness of basophil activation test in the monitoring of specific immunotherapy with house dust mite allergens Ewa Czarnobilska 1, Małgorzata Bulanda 1, Radosław Śpiewak 2 1. Department of Clinical and Environmental Allergology, Jagiellonian University, Faculty of Medicine, Head: Ewa Czarnobilska Assoc Prof, MD, PhD. 2. Radosław Śpiewak, Department of Experimental Dermatology and Cosmetology, Faculty of Pharmacy of the Jagiellonian University, Head: Radosław Śpiewak Assoc Prof, MD, PhD. Corresponding Author: Radosław Śpiewak Assoc Prof, MD, PhD. 46

47 Publikacje oryginalne Abstract Introduction: In clinical practice, reliable tools for monitoring specific immunotherapy (SIT) are of utmost importance. Aim: Our study aimed at assessing the usefulness of the basophil activation test (BAT) in monitoring SIT in paediatric patients with allergy to house dust mites (HDM). Material and methods: 31 children qualified for SIT with HDM, of whom 21 completed the SIT during the observation period. BAT was carried out prior to commencing the SIT (time point BAT1) and upon finishing the initial pack of allergy vaccine (cumulative dose of allergen PNU; BAT2), as well as after the second vaccine pack (cumulative dose of allergen PNU; BAT3). Peripheral blood of the patients was stimulated with allergen solutions in five concentrations from ng/ml to 22.5 ng/ml. Basophil activation was measured by CD63 expression in flow cytometry. Results: For allergen concentration ng/ml, a statistically significant decrease in median basophil activation was observed, from 51.29% at BAT1 to 8.48% at BAT2 (p=0.004) and 4.21% at BAT3 (p<0.001). For allergen concentration of ng/ml, a statistically significant decrease was seen between BAT1 (1.72%) and BAT3 (0.21%,p=0.01). Median CD-sens index decreased significantly from at BAT1 to at BAT2 (p<0.002) and at BAT3 (p<0.001). Conclusions: There is a significant decrease in BAT results in the course of specific immunotherapy with HDM allergens in children, with the optimum allergen concentration for monitoring basophil response at ng/ml. The CD-sens index seems a better monitoring parameter than the plain percentage of CD63-expressing basophils. 47

48 Publikacje oryginalne Introduction Allergic symptoms may be alleviated with medications, however, only specific immunotherapy (SIT) constitutes a causal treatment of atopic diseases. The SIT may interrupt the allergic march and cause clinical improvement to persist years after cessation of the treatment [1]. Unfortunately, providing a univocal answer to the question of the optimum duration of immunotherapy in a given patient proves difficult in clinical conditions. The clinical effectiveness of SIT seems related to the administered dose of allergen, rather than merely the duration of the therapy, therefore, assessing the therapeutic effects after administering defined cumulative doses of allergen seems reasonable [2]. In practice, the time of administration of the same cumulative dose may vary substantially, which is due to individual tolerance and compliance, as well as complicating health conditions (e.g. infections). The role of basophils in the allergic reaction and in development of immunological tolerance during a SIT has been studied intensively [3]. It is assumed that basophil stimulation in vitro replicates an in vivo mechanism that leads to the development of allergic symptoms. The SIT has been demonstrated to modulate basophil and mastocyte activation thresholds and decreases IgE-mediated histamine release [4,5]. Studies into the course of immunotherapy demonstrated that SIT initially decreases basophil activation by the allergen with subsequent decrease in basophil count and production of IL-4 and IL-13 [6]. The decrease in basophil activation as well as depletion of mediator reserves due to repetitive allergen stimulation are considered as key mechanism at early stages of SIT [7]. Hence, a decrease in basophil activation in response to the allergen in vitro seems a promising marker of clinical tolerance developing during the course of SIT [8]. Despite basophil activation test (BAT) is considered as an aid in diagnosis of airborne allergy, drug allergy, Hymenoptera venom allergy, and in autoimmune urticaria, as well as in qualification to SIT, the protocols used and results obtained still vary from centre to centre [9]. Basophil activation markers with proven sensitivity and specificity are CD63 and CD203c. CD63, i.e. lysosomal-associated membrane glycoprotein-3, LAMP-3 in a resting basophil is located in the membrane of intracellular secretory granules. Upon FcεRI activation, it is expressed on the basophil surface [10]. CD203c to is a transmembranous, glycosylated molecule, which is constitutively present on basophil surfaces, and upon being activated by allergen, its expression increases [11]. Both markers are characterised by similar sensitivity and specificity.cd63 is used more widely due to the direct connection between its membrane expression and basophil degranulation [12,13]. 48

49 Publikacje oryginalne Two outcome measures of basophil activations are used: basophil reactivity, i.e. the number of basophils activated by allergen, and basophil sensitivity, i.e. allergen concentration causing half of the basophils to degranulate. Basophil sensitivity provides additional information about the sensitivity to allergen - how much allergen basophils can tolerate before they react. On the curve of reactivity vs allergen concentration, the eliciting concentration at which 50% of basophils respond (EC50) is determined. EC50 can be expressed as CD-sens by inversion and multiplication by 100. Basophil reactivity may be expressed as CD-max (see below) [9]. Aim The aim of the present study was to assess the usefulness of a BAT in monitoring SIT in paediatric patients with allergy to HDM. Material and Methods Study Protocol During the first stage of the study conducted in the years , the results of which were published elsewhere [14], out of the group of 52 children with respiratory allergy aged 7-18 years, 31 had been qualified to the SIT with HDM allergens based on the clinical symptoms, SPT results, and sige concentration. First basophil activation test (BAT1) was carried out in those patients before commencing SIT. Control BATs were performed after administering to the subjects defined cumulative dose of the allergen - respectively PNU (the total allergen amount in the initial pack of allergy vaccines; measuring point (BAT2)) and PNU (cumulative dose from the first and second packs of the vaccine (BAT3)). Fig 1 presents the study design. Changes in two parameters of basophil activation upon stimulation were analysed during the SIT. The first was calculated by subtracting the baseline basophil activation recorded in negative control from the maximum activation after stimulation with allergen at defined concentrations. The second parameter - the CD-sens used to describe subjects sensitivity to the allergen was calculated by reversing the allergen concentration required to cause CD63 expression on 50% of all basophils in sample and multiplying the product by 100 [15]. The study project was approved by the Committee of Bioethics of the Jagiellonian University; opinion no.: KBET/119/B/2011 of 1 July Written informed consent was obtained for each participant from a parent. 49

50 Publikacje oryginalne BAT Patients blood (each 400 μl) was collected to test-tubes containing ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) before commencing SIT (BAT1), after completing the initial pack of allergy vaccine (BAT2), as well as after completing the second pack (BAT3). The test was performed within 2 hours from the blood collection. The assessment of basophil activation by measuring CD63 antigen expression was carried out by means of the Flow2 CAST test (Bühlmann Laboratories AG, Schönenbuch, Switzerland). Anti-FcɛRI monoclonal antibodies and fmlp oligopeptides were used as positive control, unstimulated sample served as negative control. Cells were stimulated with allergen of Dermatophagoides pteronyssinus (Dp) at following concentrations: 22.5 ng/ml, 2.25 ng/ml, ng/ml, ng/ml, and ng/ml. A mixture of FITC-conjugated anti-cd63 monoclonal antibodies, and PE-conjugated anti-ccr3 antibodies was added to the cellular suspension and incubated for 15 minat 37 o C, after which 2 ml of erythrocyte lysing solution were added, samples were centrifuged, resuspended in 0.3 ml of washing buffer, and analysed within one hour on a flow cytometer (FacsCalibur, Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA) with basophils gated as CCR3 + /SSC low cells. Statistical Analysis As the distribution of raw data was non-gaussian, medians were used in the description of results and Wilcoxon s test was applied in testing statistical significance of differences observed. The analysis was performed with the application of the GraphPadPrism 6 package. Results A total of 31 patients were qualified for the SIT, their results are presented in Table 1. Of these patients, 21 subjects actually undertook the SIT, of whom 14 patients (67%) reported for the BAT2 testing 4 weeks after administration of the last dose from the initial pack of the vaccine, and 21 patients (100%) reported for the BAT3 carried out 4 weeks after administration of the last dose from the second pack of the vaccine. An overview of the results is shown in Fig 2. Significant changes were observed for BAT results expressed as percentage of activated basophils at the allergen concentrations ng/ml and ng/ml, as well as for CD-sens (Table 2). A comparison of indices that decreased significantly in the course of SIT is shown in Figure 3. 50

51 Publikacje oryginalne Discussion In our study, the BAT turned out to be a good objective parameter for the monitoring of SIT with an HDM allergen in children. We applied a protocol measuring basophil activation in whole blood, used a CD63 as a basophil activation marker [14, 16-19], and measured SIT effects after having administered an earlier planned identical cumulative dose of the allergen. In SIT monitoring, we used five 10-fold allergen dilutions identified in the preliminary tests [20]. The basophil activation thus calculated decreased significantly in the second measurement for concentration of ng/ml, and in the third for concentrations of ng/ml and ng/ml respectively. So far there has been few studies using a BAT to assess SIT effectiveness in allergy to HDM. In the study Ciepiela et al. basophil activitation after stimulation Dp or Dermatophagoides farinae (Df) or grass pollen allergens in 0.2 IR/mL concentration, decreased in the majority of children after a year of sublingual immunotherapy (SLIT) [21]. Sánchez et al. observed that basophil activation after Dp simulation in 1ng/mL concentration is lower than in the control group after a year of the SIT with Dp/Df allergens in children with atopic dermatitis [22]. The BAT is more often applied in monitoring of immunotherapy for seasonal aeroallergens and Hymenoptera venom. Gokmen et al. for the olive pollen allergen concentration of 1 ng/ml, obtained a decrease in basophil activation after 7 preseasonal injections [23]. In the study Kepil Özdemir et al. basophil activation in response to stimulation with grass allergens in and μg/ml concentrations decreased after the completed preseasonal immunotherapy and remained on a low level during the next grass pollination season [24]. Zitnik et al. demonstrated a decrease in CD63 expression output values in response to a submaximum concentration equal 0.1 lg/ml after 6 months of desensitisation to bee venom [25]. In a study by Ebo et al., after 6 months of venom immunotherapy (VIT), a decrease in basophil activation, also limited to a submaximum concentration of 0.01 mg/ml was recorded which, according to the authors, suggests that 6 months of immunotherapy induces a decrease in a basophil response, but not a total suppression of these cells [26]. Not all researchers record decreases in basophil activation during immunotherapy. Van Overtvelt et al. did not observe significant changes in basophil activation despite the sigg induction in patients receiving a SLIT with grass pollens for four months [27]. Erdman et al. did not observe a correlation between a change in basophil activation during a VIT and a 51

52 Publikacje oryginalne response to a control sting provocation test. Unfortunately, basophil activation was performed with two allergen concentrations: 100 ng and 1 ug, and due to this fact the authors only assessed the changes in basophil reactivity, but not basophil sensitivity, which may have resulted in obtaining false results [26,28]. The latest publications emphasise that based on CD-max, clinicians may draw erroneous conclusions pertaining to continuation/cessation of a SIT or anti-ige treatment [29]. In assessing changes in basophil activitation during an immunotherapy, the CD-sens should be analysed [30-32]. In our study changes in CD-sens were significant in all the subjects already in the first measurement during the SIT, while in the following determination we observed a further decrease in CD-sens. In the paediatric population, due to the lack of cooperation, it is frequently difficult to perform a specific provocation, constituting a gold standard in assessment of an allergen s impact on the target organ and, for this reason, application of a CD-sens reflecting the sensitivity to an allergen is of peculiar importance in this group. Our results correlated with a clinical improvement experienced by patients. Similar results were obtained by other authors in the case of SIT monitoring with birch and timothy as well as with Hymenoptera venom. In the study by Nopp et al. a decrease in CDsens in the early stage of immunotherapy was accompanied by an increase in IgG4 antibodies concentration and lack of changes in basophil reactivity [33]. Schmid et al. described a decrease in basophil sensitivity already after 3 weeks, while Lalek et al. after two months of a SIT, which correlated with a reduction in clinical symptoms [34,35]. Conclusions There is a significant decrease in BAT results in the course of specific immunotherapy with house dust mite allergens in children, with the optimum allergen concentration for monitoring basophil response at ng/ml. The CD-sens index seems a better monitoring parameter than the plain percentage of CD63-expressing basophils. Conflict of interest The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments The study project was financed from the statutory task fund of the Jagiellonian University Medical College K/ZDS/

53 Publikacje oryginalne References: 1. Cox L, Calderon M, Pfaar O. Subcutaneous allergen immunotherapy for allergic disease: examining efficacy, safety and cost-effectiveness of current and novel formulations. Immunotherapy 2012; 4: Frew AJ, Powell RJ, Corrigan CJ, Durham SR. Efficacy and safety of specific immunotherapy with SQ allergen extract in treatment-resistant seasonal allergic rhinoconjunctivitis. J Allergy Clin Immunol 2006; 117: Patil SU, Shreffler WG. Immunology in the Clinic Review Series; focus on allergies: basophils as biomarkers for assessing immune modulation. Clin Exp Immunol 2012; 167: Jutel M, Akdis CA Immunological mechanisms of allergen-specific immunotherapy. Allergy 2011; 66: Maintz L, Bussmann C, Bieber T, Novak N. Contribution of histamine metabolism to tachyphylaxis during the buildup phase of rush immunotherapy. J Allergy Clin Immunol 2009; 123: Siegmund R, Vogelsang H, Machnik A, Herrmann D. Surface membrane antigen alteration on blood basophils in patient with Hymenoptera venom allergy under immunotherapy. J Allergy Clin Immunol 2000; 106: Plewako H, Wosińska K, Arvidsson M, et al. Basophil interleukin 4 and interleukin 13 production is suppressed during the early phase of rush immunotherapy. Int Arch Allergy Immunol 2006; 141: Mikkelsen S, Bibby BM, Dolberg MK, et al. Basophil sensitivity through CD63 or CD203c is a functional measure for specific immunotherapy. Clin Mol Allergy 2010; 8: Hoffmann HJ, Santos AF, Mayorga C, et al. The Clinical Utility of Basophil Activation Testing in Diagnosis and Monitoring of Allergic Disease. Allergy 2015; 70: Knol EF, Mul FP, Jansen H, et al. Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. J Allergy Clin Immunol 1991; 88:

54 Publikacje oryginalne 11. Buhring HJ, Simmons PJ, Pudney M, et al. The monoclonal antibody 97A6 defines a novel surface antigen expressed on human basophils and their multipotent and unipotent progenitors. Blood 1999; 94: Chirumbolo S. Basophil activation test in allergy: time for an update? Int Arch Allergy Immunol 2012; 158: McGowan EC, Saini S. Update on the performance and application of basophil activation tests. Curr Allergy Asthma Rep 2013; 13: Czarnobilska E, Gregorius A, Porebski G, et al. [The benefits of using basophil activation test as a diagnostic tool prior to specific immunotherapy with inhalant allergens]. Przegl Lek 2012; 69: Johansson SG, Nopp A, van Hage M, et al. Passive IgE-sensitization by blood transfusion. Allergy 2005; 60: Chirumbolo S. Immunotherapy in allergy and cellular tests: state of art. Hum Vaccin Immunother 2014; 10: Leśniak M, Dyga W, Rusinek B, et al. Comparison of the basophil activation test versus the nasal provocation test in establishing eligibility for specific immunotherapy. Pol Arch Med Wewn 2016; 126: Leśniak M, Dyga W, Porębski G, Czarnobilska E. [Basophil activation test-a practical approach to diagnosis of common respiratory allergy]. Przegl Lek 2015; 72: De Week AL, Sanz ML, Gamboa PM, et al. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol 2008; 18: Gregorius A. Optymalizacja testu aktywacji bazofilów w diagnostyce i kwalifikacji do leczenia w postaci alergenowej immunoterapii swoistej u dzieci z alergią oddechową na roztocze kurzu domowego. (Thesis). Jagiellonian University Medical College, Krakow Ciepiela O, Zawadzka-Krajewska A, Kotuła I, Demkow U. The influence of sublingual immunotherapy on several parameters of immunological response in 54

55 Publikacje oryginalne children suffering from atopic asthma and allergic rhinitis depending on asthma features. Pneumonol Alergol Pol 2014; 82: Sánchez J, Cardona R. Effect of immunotherapy on basophil activation induced by allergens in patients with atopic dermatitis. Rev Alerg Mex 2014; 61: Gokmen NM, Ersoy R, Gulbahar O, et al. Desensitization effect of preseasonal seveninjection allergoid immunotherapy with olive pollen on basophil activation: the efficacy of olive pollen-specific preseasonal allergoid immunotherapy on basophils. Int Arch Allergy Immunol 2012; 159: Kepil Özdemir S, Sin BA, Güloğlu D, et al. Short-term preseasonal immunotherapy: is early clinical efficacy related to the basophil response? Int Arch Allergy Immunol 2014; 164: Zitnik SE, Vesel T, AvcinT, et al. Monitoring honeybee venom immunotherapy in children with the basophil activation test. Pediatr Allergy Immunol 2012; 23: Ebo DG, Hagendorens MM, Schuerwegh AJ, et al. Flow-assisted quantification of in vitro activated basophils in the diagnosis of wasp venom allergy and follow-up of wasp venom immunotherapy. Cytometry B Clin Cytom 2007; 72: Van Overtvelt L, Baron-Bodo V, Horiot S, et al. Changes in basophil activation during grass-pollen sublingual immunotherapy do not correlate with clinical efficacy. Allergy 2011; 66: Erdmann SM, Sachs B, Kwiecien R, et al. The basophil activation test in wasp venom allergy: sensitivity, specificity and monitoring specific immunotherapy. Allergy 2004; 59: Glaumann S, Nopp A, Johansson SG, et al. Basophil allergen threshold sensitivity, CD-sens, IgE-sensitization and DBPCFC in peanut-sensitized children. Allergy 2012; 67: MacGlashan DW Jr. Releasability of human basophils: cellular sensitivity and maximal histamine release are independent variables. J Allergy Clin Immunol 1993; 91:

56 Publikacje oryginalne 31. Nopp A, Johansson SGO, Ankerst J, et al. Basophil allergen threshold sensitivity: a useful approach to anti-ige treatment efficacy evaluation. Allergy 2006; 61: Dahlen B, Nopp A, Johansson SGO, et al. Basophil allergen threshold sensitivity, CDsens, is a measure of allergen sensitivity in asthma. Clin Exp Allergy 2011; 41: Nopp A, Cardell LO, Johansson SG, Oman H. CD-sens: a biological measure of immunological changes stimulated by ASIT. Allergy 2009; 64: Schmid JM, Würtzen PA, Dahl R, Hoffmann HJ. Early improvement in basophil sensitivity predicts symptom relief with grass pollen immunotherapy. J Allergy Clin Immunol 2014; 134: Lalek N, Kosnik M, Silar M, Korosec P. Immunoglobulin G-dependent changes in basophil allergen threshold sensitivity during birch pollen immunotherapy. Clin Exp Allergy 2010; 40:

57 Publikacje oryginalne Table 1. BAT results in all 31 patients who were qualified for the SIT. Basophil activation* Allergen concentration ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml Median 64.01% 67.49% 46.42% 4.87% -0.19% Minimum 5.20% 1.80% -2.67% -5.48% -6.77% Maximum 92.09% 89.10% 87.46% 52.32% 8.00% *basophil activation expressed as percent of basophils expressing CD63 on their surface in response to allergen, after subtracting the baseline activity (negative control) Table 2. BAT parameters that changed significantly during specific immunotherapy. Variable Measuring point BAT1 BAT2 BAT3 Basophil activation at ng/ml Median 51.29% 8.48%* 4.21%** Range % % % Basophil Median 1.72% 0% 0.21%* activation at ng/ml Range % % % CD-sens Median * ** Range *p<0.05; ** p<

58 Publikacje oryginalne Fig 1. Design of the study. The BAT, SPT, sige ware carried out prior to commencing the SIT (BAT1) and after completing initial pack (BAT2; cumulative allergen dose PNU),and after completing two packages (BAT3; cumulative allergen dose PNU). 58

59 Publikacje oryginalne Figure 2. An overview of changes in basophil activation for each concentration and changes in CD-sens during the SIT. Horizontal lines indicate medians and ranges. 59

60 Publikacje oryginalne Figure 3. Significant changes in percentages of activated basophils and CD-sens in the course of SIT. 60

61 Publikacje oryginalne Rozdział 3. Metodologiczne aspekty BAT Leśniak M, Dyga W, Porębski G, Czarnobilska E. Test aktywacji bazofilów - praktyczne aspekty cytometrycznej diagnostyki alergii oddechowych. Przegl Lek. 2015; 72(12):

62 PRACE ORYGINALNE Małgorzata LEŚNIAK Wojciech DYGA Grzegorz PORĘBSKI Ewa CZARNOBILSKA Test aktywacji bazofilów - praktyczne aspekty cytometrycznej diagnostyki alergii oddechowych Basophil activation test - a practical approach to diagnosis of common respiratory allergy Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej Katedra Toksykologii i Chorób Środowiskowych Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Kierownik: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska Dodatkowe słowa kluczowe: test aktywacji bazofilów techniczne aspekty BAT Additional key words: basophil activation test technical aspects of BAT Adres do korespondencji: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej CMUJ Kraków, ul. Śniadeckich 10 Tel. (12) , fax: (12) ewa.czarnobilska@uj.edu.pl Wstęp: Diagnostyka alergii IgEzależnej opiera się na wywiadzie oraz badaniach dodatkowych, takich jak testy skórne punktowe (skin prick test, SPT) i/lub oznaczenia swoistych IgE (sige). Test aktywacji bazofilów (basophil activation test, BAT) może uzupełniać te metody, wyeliminować ich wady i potencjalnie zastąpić testy prowokacji, np. test prowokacji donosowej (nasal provocation test, NPT). W naszym badaniu ocenialiśmy wpływ czasu przechowywania próbki krwi na wynik testu aktywacji bazofilów. Dodatkowo porównaliśmy wyniki BAT z SPT, sige i NPT dla pospolitych alergenów wziewnych. Materiał i metodyka: BAT przeprowadzono u 12 pacjentów z alergicznym nieżytem nosa i alergią na pyłek brzozy lub roztocze kurzu domowego po 1, 4 oraz 24 godzinach od pobrania próbki krwi. Jako markera aktywacji bazofilów używano CD63. Stosowano trzy seryjne 10-krotne rozcieńczenia (1:1, 1:10, 1:100) alergenu. Do drugiej części zakwalifikowano 10 pacjentów z sugestywnym wywiadem alergii na roztocze kurzu domowego. Przeprowadzono pełną diagnostykę alergologiczną obejmującą: SPT, oznaczenia sige, NPT oraz BAT. Krzywe ROC (receiver operating characteristics curves) użyto do porównania wartości diagnostycznej testów, uwzględniając techniczne aspekty wykonywania BAT. Wyniki: Aktywacja bazofilów przedstawiona jako indeks stymulacji (stimulation index, SI) nie zmniejszyła się znacząco przez 24 godziny obserwacji. Stymulacja badanymi alergenami spowodowała wzrost aktywacji bazofilów mierzonej na podstawie ekspresji CD63. Nie obserwowano istotnych różnic w wynikach zastosowanych metod diagnostycznych ocenianych przez porównanie krzywych ROC. Wnioski: Diagnostyka cytometryczna oparta na pomiarze stymulowanej alergenem ekspresji markerów aktywacji bazofilów jest użytecznym testem in vitro pozwalającym zidentyfikować klinicznie istotny alergen. BAT z alergenami wziewnymi można wykonywać przez okres 24 godzin od pobrania Background: The diagnosis of immediate allergy is based on clinical data, skin prick tests (SPT), and measurements of allergen-specific IgE (sige). Basophil activation test (BAT) can supplement these methods and obviate their disadvantages, and possibly replace allergen challenge tests, such as a nasal provocative test (NPT). In this study, we assessed the influence of different storage times on BAT results. Futhermore, we compared the results of SPT, sige and NPT against BAT for common aeroallergens. Methods: BAT was performed in twelve patients with allergic rhinitis sensitized to birch pollen or mites 1, 4 and 24 hours after blood sampling. CD63 was used as an activation marker. Three serial 10-fold dilutions (1:1, 1:10, 100) of allergen extract were employed. The further 10 individuals allergic to mites undergone complete diagnostic evaluation including SPT, sige measurements, NPT and BAT. Receiver operating characteristic (ROC) curves were used to compare the diagnostic techniques and tests conditions. Results: Basophil activation expressed as stimulation index did not decline significantly up to 24h. Exposure to causal allergens resulted in a dose-dependent increase in expression of CD63 on peripheral blood basophils in tested individuals. We did not observed substantial differences in results of the investigated diagnostic methods determined by a ROC analysis. Conclusions: Flow-assisted diagnosis of common respiratory allergy relies upon allergen-induced activation of blood basophils can be a useful approach to determine the clinically relevant allergen in sensitized individuals. BAT with inhaled allergens can be performed within 24 hours after blood collecting into a tube with EDTA. Allergen suitable for NPT in appropriate dilutions is a good reagent for use in BAT. Przegląd Lekarski 2015 / 72 /

63 krwi do probówki z EDTA. Alergen przeznaczony do NPT w odpowiednich rozcieńczeniach jest dobrym odczynnikiem do stosowania w BAT. Wstęp Diagnostyka alergologiczna IgE-zależnej alergii obejmuje wywiad i badania dodatkowe, takie jak: testy skórne punktowe (skin prick test, SPT) i/lub oznaczenia swoistych IgE (sige) oraz w niektórych przypadkach próby prowokacji. Niestety nie zawsze możliwa jest identyfikacja alergenu dającego objawy kliniczne. Dlatego od dawna poszukuje się testów in vitro, które mogą uzupełnić i/lub zastąpić obecnie stosowane metody. Test aktywacji bazofilów (basophil activation test, BAT) jest badaniem cytometrycznym oceniającym stopień aktywacji komórek po stymulacji alergenem. Pierwszy protokół oparty na pomiarze ekspresji CD63 został opracowany przez Sainte-Laudy i Sabbah w 1994 roku, a opis tej techniki opublikowano w 1996 roku. Na rycinie 1 przedstawiono schemat aktywacji bazofilów podczas BAT. W ostatnich latach trwają intensywne prace nad udoskonaleniem protokołu badania [1]. BAT jest stosowany jako test diagnostyczny w alergii wziewnej, na jady owadów błonkoskrzydłych, na leki, na pokarmy, na lateks, w pokrzywce oraz w monitorowaniu immunoterapii. Mimo ogromnego zainteresowania badaczy, nadal istnieją znaczne różnice w metodyce wykonywania tego testu pomiędzy różnymi ośrodkami oraz problemy techniczne, które nie zostały rozwiązane. Wśród członków Europejskiej Akademii Alergologii i Immunologii (European Academy of Allergy and Clinical Immunology, EAACI) wyodrębniła się grupa robocza zainteresowana oceną zastosowania BAT w praktyce klinicznej (The European Interest Group for the Evaluation of BAT in clinical routine, EuroBAT). Badacze stosują komercyjnie dostępne testy lub wdrażają własne protokoły. Pierwszą generację zestawów do wykonywania BAT stanowią: BASOTEST, Orpegen, Heidelberg, Germany; Fastimmune, Becton Dickinson, Mountain View, Calif., USA i FlowCast, Bühlmann Laboratories, Allschwil, Switzerland. Modyfikacja to test Allergenicity, Beckmann-Coulter, Marseille, France; dostępne są też nowe testy drugiej generacji. Markery takie jak: IgE, CCR3 i CD123 są powszechnie wykorzystane do identyfikacji bazofilów, natomiast CD63 i CD203c do oceny ich aktywacji [2-6]. Poprawne wykonanie badania wymaga dbałości o szczegóły, począwszy od przygotowania pacjenta, pobrania próbki krwi, przez monitorowanie czasu i temperatury jej przechowywania, po opracowanie materiału. Pacjent do badania powinien się zgłosić na czczo. Nie ma konieczności przerywania stosowania doustnych leków przeciwhistaminowych, natomiast poleca się zrezygnowanie z przyjmowania glikokortykosteroidów systemowych przez 7 dni przed testem [7,8]. Należy również pamiętać, że leki immunosupresyjne i immunomodulujące mogą zmniejszać, a nawet znosić odpowiedź bazofilów na stymulację, np. cyklosporyna A ma działanie hamujące ekspresję CD203c. Podobnie statyny wpływają na IgE-zależną regulację CD203c. Badania naukowe wskazują również na wpływ preinkubacji z chlorochiną, dapsonem, mizolastyną i lidokainą na aktywację mierzoną za pośrednictwem CD63 [9]. W zależności od metody krew jest pobierana do probówek z wersenianem sodu (EDTA), cytrynianem lub z heparyną. Zastosowanie EDTA jako podłoża pozwala wyeliminować wpływ trombocytów na aktywację. Czas pobrania próbki jest istotny z uwagi na dobową zmienność ekspresji CD203c pod wpływem stymulacji alergenem obserwowano niższe wartości aktywacji w godzinach wieczornych u pacjentów z sezonowym alergicznym nieżytem nosa [10]. BAT można wykonywać z krwi pełnej lub izolowanych komórek [11]. Mimo, iż eksperymenty prowadzone na izolowanych bazofilach niosą ryzyko przypadkowego ich zniszczenia lub aktywacji, to przez eliminację wpływu innych składników osocza umożliwiają zwiększenie czułości testu. Izolacja komórek jest prowadzona za pomocą metod wirowania lub przy zastosowaniu gradientu gęstości. Z kolei zastosowanie krwi pełnej jest prostsze technicznie, a obecność wszystkich składników krwi może lepiej odzwierciedlać fizjologiczne i patologiczne warunki in vivo [12]. Bazofile, aby zareagować natychmiast po stymulacji, wymagają optymalnej temperatury, odpowiednich czasów inkubacji i właściwego składu buforu do rozcieńczania odczynników. Niektórzy autorzy postulują, że krótka preinkubacja z IL-3 może zwiększyć czułość testów opartych na pomiarze CD63. Jednak IL-3 zwiększa ekspresję Rycina 1 Mechanizm testu aktywacji bazofilów. Mechanism of basophil activation test. Na podstawie: Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH, Schuerwegh AJ, De Clerck LS, Stevens WJ: In vitro allergy diagnosis: should we follow the flow? Clin Exp Allergy 2004; 34: modyfikacja własna. CD203c na nieaktywowanych bazofilach i zmniejsza czułość BAT z CD203c, dlatego jej zastosowanie jest kontrowersyjne [13]. Prawidłowa interpretacja BAT wymaga uwzględnienia odpowiedniej kontroli negatywnej oraz pozytywnej. Kontrola negatywna ocenia spontaniczną ekspresję markerów aktywacji. Przeprowadza się ją przez inkubację komórek w roztworze płuczącym. Ilość aktywowanych bazofilów w kontroli negatywnej nie przekracza zwykle 5% (w wieloośrodkowych badaniach stymulacja 0%-5% u 79,9%; 5%-10% u 13,6%; powyżej 10% u 6,5% osób) [14]. Jako kontroli pozytywnej specyficznej używa się przeciwciała anty-ige. Alternatywą jest monoklonalne przeciwciało anty-fcεri. W przypadku braku odpowiedzi na anty-ige lub anty-fcεri wykorzystuje się IgE-niezależne bodźce, takie jak N-formyl-etionyl-leucylo fenyloalanina (fmlp). W prawidłowo przeprowadzonym teście pozytywnej stymulacji powinniśmy uzyskać >10% aktywowanych bazofilów. Kontrola pozytywna niespecyficzna z fmlp może być wykorzystywana do określenia żywotności komórek [15]. Przy ocenie wyniku testu aktywacji bazofilów należy wziąć pod uwagę chorych, u których po stymulacji kontrolą pozytywną specyficzną bazofile nie są aktywowane i nie wydzielają mediatorów. Populacja ta określana mianem niewydzielaczy (non-responders) stanowi około 10% badanych. Pomimo prawidłowej ekspresji receptorów FcεRI na powierzchni bazofilów u tych osób, po stymulacji nie dochodzi do wydzielania histaminy lub jej ilość jest minimalna. Niektórzy autorzy sugerują, że przyczyną jest zmniejszona aktywność kinazy tyrozynowej Syk, jak również zaburzenia kinaz Fyn i Lyn. Udowodniono, że brak reakcji nie jest zależny od struktury łańcucha FcεRI. Ponadto opisano wpływ zewnątrzkomórkowego stężenia wapnia na ekspresję markerów powierzchniowych. W przypadku niskiego poziomu Ca 2+ możemy mieć do czynienia ze zjawiskiem fałszywego non-responder [2,16]. Wyniki fałszywie ujemne mogą być tłumaczone przejściową refrakcją bazofilów spowodowaną niedawną ekspozycją na alergen. U tych pacjentów, w wyniku zużycia sige w czasie ostrego incydentu reakcji alergicznej, mogą występować przejściowo obniżone poziomy sige krążących i związanych z błoną komórkową. Dlatego należy odroczyć termin wykonania testu na 4-6 tygodni po ostrej reakcji alergicznej. Ponadto fałszywie ujemne wyniki mogą być związane z przyczynami technicznymi, takimi jak nieprawidłowe przechowywanie i transportowanie probówek czy stymulacja źle dobranymi alergenami. Alergeny używane do BAT powinny skutecznie aktywować bazofile oraz nie zawierać środków cytotoksycznych (dodatki, konserwanty) ani substancji niespecyficznie stymulujących (endotoksyny, lektyny) [7]. Nie ulega wątpliwości, że BAT należy wykonać możliwie szybko po pobraniu próbki krwi, wg różnych autorów do 3-4 godzin. Inni badacze twierdzą, że w odpowiednich 726 M. Leśniak i wsp. 63

64 warunkach można przechowywać materiał do 24, a nawet 48 godzin [4]. Z uwagi na konieczność przeprowadzania testu w laboratorium posiadającym odpowiedni sprzęt i doświadczony w cytometrii personel, dokładne określenie, jak długo po pobraniu można transportować materiał ma istotne znaczenie dla rozpowszechnienia BAT. Cel pracy Celem badania była ocena wpływu czasu przechowywania próbki na wynik testu z alergenami wziewnymi oraz porównanie komercyjnie dostępnego wyciągu alergenu z wyciągiem alergenu stosowanym w teście prowokacji donosowej (nasal provocation test, NPT) jako odczynników do stymulacji bazofilów podczas BAT. Materiał i metodyka W pierwszej części badania analizie poddano 12 próbek krwi pobranych od pacjentów z alergią wziewną na brzozę (Betula alba) lub roztocze kurzu domowego (Dermatophagoides pteronyssinus, Dp). BAT wykonywano trzykrotnie po godzinie, 4 godzinach oraz 24 godzinach od pobrania krwi. Krew była pobierana do probówek z EDTA, przechowywana w temperaturze 4 0 C. Do drugiej części zakwalifikowano 10 pacjentów z alergią wziewną na roztocze kurzu domowego BAT wykonywano zarówno z komercyjnie dostępnymi odczynnikami (Bühlman Laboratories), jak i z alergenami przeznaczonymi do wykonywania NPT (Allergopharma Nexter). BAT z alergenami do NPT przeprowadzono również u zdrowego ochotnika. Aktywację pod wpływem obu odczynników porównywano do wyników SPT, sige i NPT. Do wykonania BAT używano 400 μl krwi. Komórki były pobudzane roztworami alergenów w odpowiednich rozcieńczeniach 1:1, 1:10, 1:100. Aktywację bazofilów oceniono przez pomiar ekspresji antygenu CD63. Jednocześnie wykonano kontrolę pozytywną (degranulację za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-ige), kontrolę negatywną (z buforem do rozcieńczania alergenów, PBS) i próby badane. Stosowano mieszaninę przeciwciał monoklonalnych anty-cd63, anty-ccr3 sprzężonych z fluorochromami, odpowiednio izotiocjanianem fluoresceiny (FITC) i fikoerytryną (PE). Do próbki dodawano 100 μl roztworu aktywującego i 100 μl pełnej krwi obwodowej. Mieszanina po krótkim wytrząsaniu była inkubowana 15 minut w temperaturze 37 0 C i wilgotności >95%. Następnie zatrzymywano reakcję przez dodanie roztworu hamującego, erytrocyty lizowano z użyciem 2 ml roztworu lizującego i przepłukiwano dwukrotnie w 5 ml PBS, a następnie zawieszano w 0,5 ml roztworu utrwalającego. Próbki odczytywano na cytometrze przepływowym w ciągu pół godziny od zakończenia procedury przygotowawczej. Bazofile oznaczano jako komórki CCR3 + /SSC low. Analizę wykonano przy użyciu cytometru przepływowego FacsCalibur firmy Becton, Dickinson and Company (New Jersey, USA). Za wynik dodatni SPT (wyciągi alergenowe Allergopharma) przyjęto średnicę bąbla w odczynie testowym na badany alergen większą lub równą 3 mm. Za wynik dodatni sige uznano wartość powyżej 3,5 kui/l (UniCap Pharmacia, oznaczenie wykonywane według protokołu producenta). NPT interpretowano za pomocą skali objawów klinicznych uwzględniając: ilość wydzieliny nosowej (0-2 pkt), ilość kichnięć (0-2 pkt), świąd nosa (0-1 pkt), blokadę nosa (0-2 pkt), świąd podniebienia lub uszu (0-1 pkt), łzawienie lub zapalenie spojówek, pokrzywkę, kaszel lub duszność (0-1 pkt). Za wynik dodatni NPT przyjęto 3 punkty lub więcej. Wyniki BAT przedstawiono za pomocą indeksu stymulacji (stimulation indeks, SI) zdefiniowanego jako procent ilości bazofilów aktywowanych badanym alergenem w stosunku do procentu ilości bazofilów aktywowanych w kontroli niestymulowanej; przyjmując wynik większy lub równy 2 za dodatni. Do porównania wyników pomiędzy poszczególnymi punktami czasowymi użyto testu Wilcoxona. W drugiej części obliczeń w celu porównania komercyjnie dostępnego wyciągu alergenu z wyciągiem alergenu stosowanym w teście prowokacji donosowej analizowano pola pod krzywą ROC (receiver operating characteristic curve). Statystyka wyliczona została w oparciu o metodę nieparametryczną DeLonga. Wartość p<0,05 uznano za istotną statystycznie. Praca finansowana w ramach Projektu Badawczego CMUJ (praca statutowa K/ZDS/005621). Wyniki W badaniu zdrowego ochotnika odczynnik do NPT nie spowodował wzrostu aktywacji bazofilów. Na rycinie 2 przedstawiono przykładowy wynik analizy cytometrycznej testu aktywacji bazofilów u pacjenta z alergią na pyłek brzozy. Przez okres 24 godzin nie doszło do istotnych statystycznie zmian mediany aktywacji bazofilów w kontroli pozytywnej dla całej grupy, co przedstawiono na rycinie 3. Mediany indeksów stymulacji po 1 godzinie od pobrania krwi dla rozcieńczeń 1:1, 1:10 oraz 1:100 wynosiły odpowiednio 1,94 (zakres wartości od 0,44 do 204,09); 17,39 (0,52-203,93); 26,54 (0,41-204,84). Po upływie 4 godzin mediana wzrosła dla rozcieńczenia 1:1 do 5,71 (0,6-204,7) oraz dla 1:10 do 24,51 (2,41-201,77), natomiast dla rozcieńczenia 1:100 nieznacznie zmalała do 26,48 (5,38-205,61). Po 24 godzinach otrzymano następujące zmiany median: dla 1:1 do 4,23 (0,64-199,57); dla 1:10 do 25,09 (3,89-209,82); dla 1:100 do 24,95 (4,40-204,57). Porównując mediany indeksów stymulacji po 1 godzinie oraz po 24 godzinach od pobrania próbki, dla rozcieńczenia 1:1 oraz 1:10 otrzymano wzrost, a dla rozcieńczenia 1:100 spadek wartości. Wszystkie wyżej opisane zmiany nie były istotne statystycznie. Na rycinie 4 i rycinie 5 przedstawiono wpływ czasu przechowywania próbki na zmiany indeksu stymulacji dla poszczególnych rozcieńczeń. W porównaniu do SPT dla badanych odczynników otrzymaliśmy: - w rozcieńczeniu 1:1 dla odczynnika firmy Nexter wartości pola pod krzywą ROC (area under curve, AUC) równe 0,687, natomiast dla odczynnika firmy Bühlmann AUC=0,875; p=0,449; że przy zastosowaniu oryginalnego odczynnika w najmniejszym rozcieńczeniu uzyskuje się wartości bardziej zbliżone do wyników SPT - różnica nieistotna statystycznie.; - pokrywające się krzywe ROC dla rozcieńczenia 1:10, AUC=0,875; - w rozcieńczeniu 1:100 dla odczynnika Rycina 2 Wynik analizy cytometrycznej testu aktywacji bazofilów u pacjenta z alergią na pyłek brzozy; A) rozkład komórek pełnej krwi hemolizowanej z widocznymi populacjami limocytów, monocytów i ganulocytów; B) schemat bramkowania bazofilów na podstawie silnej ekspresji CCR3 i niskiego rozpraszania bocznego (SSC); C) schemat pomiaru ilości aktywowanych bazofilów na podstawie ekspresji CD63. Result of BAT cytometric analysis in patient with birch pollen allergy; A) Three discrete populations (lymphocytes, monocytes and granulocytes) of hemolysed whole blood in FSC/SSC histogram; B) Selection of entire basophil population on the base of positive CCR3 and low Side Scatter (SSC); C) Selection of activated fraction of basophiles on the base of high expression of CD63. Przegląd Lekarski 2015 / 72 /