Użyteczność testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnych

Transkrypt

1 PRACE POGLĄDOWE Małgorzata LEŚNIAK 1 Magdalena LEŚNIAK 2 Ewa CZARNOBILSKA 1 Użyteczność testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnych Usefulness of basophil activation test for the diagnosis of inhaled allergies 1 Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej Katedra Toksykologii i Chorób Środowiskowych Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Kierownik: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska 2 Studenckie Koło Naukowe przy Zakładzie Alergologii Klinicznej i Środowiskowej Dodatkowe słowa kluczowe: test aktywacji bazofilów alergia wziewna diagnostyka Additional key words: basophil activation test inhalant allergy diagnostics Choroby alergiczne to istotny problem zdrowotny. W ich diagnostyce kluczową rolę odgrywa dobrze zebrany wywiad uzupełniony wynikami badań dodatkowych. Cytometryczny test aktywacji bazofilów (basophil activation test, BAT) jest szeroko stosowaną techniką diagnostyczną m.in. w alergii wziewnej, pokarmowej, na jady owadów błonkoskrzydłych i na leki. Celem naszego przeglądu jest usystematyzowanie dostępnej wiedzy na temat możliwości zastosowania BAT, szczególnie w diagnostyce alergii wziewnych. Markerami aktywacji bazofilów o udowodnionej czułości i swoistości są CD63 oraz CD203c - obydwa mają swoich zwolenników i przeciwników wśród badaczy. Zastosowanie pierwszego jest popularniejsze ze względu na bezpośredni związek jego pojawienia się na błonie komórkowej z degranulacją bazofilów. Użyteczność BAT została potwierdzona w diagnostyce alergii na pyłki traw, drzew i roztocze kurzu domowego u dzieci i dorosłych. Podkreśla się porównywalną do rutynowo stosowanych testów czułość i wyższą (wynoszącą w większości badań 100%) swoistość testu. Wadą BAT może być obserwowana przez niektórych autorów nadreaktywność bazofilów u pacjentów atopowych, która prowadzi do pojawiania się wyników fałszywie dodatnich. Test aktywacji bazofilów wydaje się mieć istotną przewagę nad testami skórnymi pod względem bezpieczeństwa i z powodu braku potrzeby odstawienia leków przeciwhistaminowych przed badaniem. Przyszłe badania powinny skupić się nad zastosowaniem BAT w trudnych diagnostycznie przypadkach oraz w monitorowaniu immunoterapii. Allergic diseases are important health problems. Medical history and results of additional tests play a crucial role in the diagnosis. Cytometric basophil activation test (BAT) is widely evaluated technique in inhaled, food, Hymenoptera venom and drugs allergy. The aim of our review is to systematize the available knowledge about possibilities of applying BAT, especially in the diagnosis of inhaled allergies. Basophil activation markers with proven sensitivity and specificity are CD63 and CD203c - each of them has its supporters and opponents among researchers. Use of the first one is more popular because of the direct relation of its appearance on the cell membrane of basophils with degranulation. The usefulness of BAT has been confirmed in the diagnosis of grass pollen, trees and house dust mites allergies in children and adults. BAT has a comparable to the routinely used tests sensitivity and higher (in most studies evaluated as 100%) specificity. The disadvantage of BAT that has been observed by some authors is hyperreactivity of basophils in atopic patients, leading to the appearance of false positives results. Basophil activation test seems to have a significant advantage over skin tests due to safety and lack of necessary to withdrawal antihistamines medications. Future research should focus on the use of BAT in diagnostically difficult cases and in monitoring of immunotherapy. Adres do korespondencji: Dr hab. n. med. Ewa Czarnobilska Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej CMUJ Kraków, ul. Śniadeckich 10 Tel. (12) fax: (12) ewa.czarnobilska@uj.edu.pl Wstęp Choroby alergiczne to istotny problem zdrowotny, nieprzypadkowo nazywany epidemią XXI wieku. Kiedy Clemens von Pirquet wprowadził termin alergia, aby opisać patologiczną reakcję organizmu spowodowaną przez kontakt z antygenami, dotyczyła ona mniej niż 1% ludzkości. Obecnie ponad 30% mieszkańców krajów uprzemysłowionych cierpi na choroby wywołane alergenami, a wśród nich najczęściej: alergiczny nieżyt nosa, zapalenie spojówek, astmę oskrzelową, alergiczne choroby skóry czy alergie pokarmowe [1,2]. Mechanizm pojawienia się objawów klinicznych po kontakcie z alergenem jest złożony. Głównymi komórkami efektorowymi odpowiedzialnymi za rozwój IgE-zależnej reakcji alergicznej są bazofile i mastocyty. Na powierzchni ich błony komórkowej znajdują się receptory o wysokim powinowactwie dla immunoglobuliny E (FcεRI). Przegląd Lekarski 2015 / 72 /

2 Po ich związaniu z IgE u osób uczulonych dochodzi do mostkowania receptorów za pomocą cząsteczki alergenu, co prowadzi do degranulacji komórek. Bazofile mogą także być pobudzane przez komplement lub chemokiny. Aktywacja przebiega przez dwie główne drogi: anafilaktyczną lub stopniową. Skutkiem aktywacji bazofilów na drodze anafilaktycznej jest uwolnienie do przestrzeni pozakomórkowej mediatorów reakcji alergicznej, takich jak histamina i liczne cytokiny. Podczas stopniowej degranulacji nie dochodzi do egzocytozy. Efektem aktywacji są zmiany na powierzchni błony komórkowej, polegające między innymi na zwiększeniu ekspresji antygenów charakterystycznych dla stanu aktywacji, różnych w zależności od jej mechanizmu [3,4]. W diagnostyce alergii wziewnych kluczową rolę odgrywa dobrze zebrany wywiad, uzupełniony wynikami skórnych testów punktowych (skin prick test, SPT) i/lub pomiarem stężenia swoistych IgE (sige) w surowicy oraz niekiedy testami prowokacji swoistej. Niestety jest wiele przypadków, kiedy rutynowo stosowane badania in vivo i in vitro są niewystarczające lub przeciwwskazane. Dlatego też od wielu lat trwają poszukiwania testu in vitro, który mógłby uzupełnić i/lub zastąpić metody in vivo [5]. Ocena stężeń mediatorów reakcji alergicznych, takich jak histamina i cytokiny uwalnianych z ziarnistości bazofilów podczas degranulacji okazywała się bardzo czaso- i pracochłonna, a wyniki nie zawsze korelowały ze stanem klinicznym [6]. Badania Knola i wsp. [7], które w 1991 roku doprowadziły do odkrycia, że marker CD63 pojawia się na powierzchni bazofilów w momencie ich degranulacji, umożliwiły rozwój cytometrycznego testu aktywacji bazofilów (basophil activation test, BAT). W ciągu ostatnich lat opisano kilka protokołów przeprowadzania BAT i nowe markery aktywacji. Identyfikację bazofilów zapoczątkowano poprzez zastosowanie przeciwciał przeciwko powszechnemu dla leukocytów antygenowi CD45 oraz przeciw IgE. Obecnie ocenia się m.in. ekspresję IgE, CRTH2 lub CD123 oraz CCR3. Michova i wsp. [8] porównywali protokoły Basotest (OPREGEN Pharma, Heidelberg, Niemcy; marker identyfikacji - IgE, aktywacji - CD63 ) i BD FastImmune test (BD, San Jose, CA, USA; (marker identyfikacji - CD123 + / HLA-DR -, aktywacji - CD63) u pacjentów z alergią wziewną. Bez względu na metodę identyfikacji bazofilów uzyskali kolejno dla Basotest i FastImmune wysoką czułość (85% i 72%) oraz swoistość (100% i 92%). Korelacja między wynikami sige i testami cytometryczymi była wysoka: tau=0,92 (Basotest) i tau=0,71 (FastImmune). Autorzy reasumują, iż oba protokoły mogą być używane w diagnostyce alergii wziewnej, a FastImmune test jest szczególnie użyteczny w przypadku niskiej ekspresji IgE. Protokół CRTH2 + /CD3 - /CD203c + pozwala uzyskać wysoką czystość identyfikacji bazofilów, jego główną wadą jest jednak konieczność zastosowania trzech barwników. Bazofile można oznaczyć również jako CCR3 + / SSC low stosując dwa barwniki [3,9-11]. Markerami aktywacji bazofilów o udowodnionej wielokrotnie czułości i swoistości są obok Rycina 1 Schemat BAT. Diagram of BAT. 1, 3- Identyfikacja bazofila. 2- Identyfikacja aktywowanego bazofila. Na podst: Boumiza R, Debard AL, Monneret G.: The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clin Mol Allergy 2005; 3: modyfikacja własna. CD63 także CD203c i kinaza p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase). W pojedynczych badaniach opisano też zastosowanie CD164, CD107a, CD13 i CD69 [12-14]. Na rycinie 1 przedstawiono schemat protokołów aktywacji bazofila ocenianej w cytometrze przepływowym. O popularności testu aktywacji bazofilów i jego znaczeniu dla przyszłości diagnostyki alergologicznej świadczy wyodrębnienie się wśród członków Europejskiej Akademii Alergologii i Immunologii (European Academy of Allergy and Clinical Immunology, EAACI) grupy roboczej zainteresowanej oceną zastosowania BAT w praktyce klinicznej (The European Interest Group for the Evaluation of BAT in clinical routine, EuroBAT). Celem naszego przeglądu jest usystematyzowanie dostępnej wiedzy na temat możliwości zastosowania testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnych. Rola markera CD63 CD63, czyli związana z lizosomami glikoproteina błonowa (lysosomal-associated membrane glycoprotein 3, LAMP-3) należy do rodziny białek przezbłonowych tetraspanin. W spoczynku jest ona zlokalizowana w błonie wewnątrzkomórkowych ziarnistości. Po aktywacji FcεRI dochodzi do ekspresji CD63 na powierzchni bazofila [7]. Proces ten został opisany na przykładzie mastocytów u szczurów i potwierdzony również dla bazofilów: ziarnistości z CD63 osiągają błonę komórkową bardzo szybko po aktywacji - ze średnią prędkością 100 nm/s [15,16]. Większość CD63 jest związanymi z błoną integrynami i w ciągu pierwszych minut po stymulacji prawdopodobnie w mechanizmie zależnym od synaptotagminy dochodzi do ich odnowy [17-19]. Należy pamiętać, że aktywacja może być także zapoczątkowana przez czynniki preanalityczne [20] i indywidualnie ustalać punkt odcięcia, po przekroczeniu którego wynik BAT będzie uważany za dodatni [21]. Pâris-Köhler i wsp. [22] w 2000 roku analizowali możliwość zastosowania testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnej na alergeny pyłku cyprysa. Grupę badaną stanowiło 42 pacjentów: 34 z sugestywnym wywiadem, dodatnimi SPT i testem prowokacji donosowej (nasal provocation test, NPT) oraz 8 bezobjawowych osób z dodatnimi SPT, a grupę kontrolną 33 osoby z ujemnym wywiadem i wynikami badań. Wykonywano pomiary BAT, sige oraz u niektórych pacjentów test uwalniania histaminy (histamine release test, HRT). Test aktywacji bazofilów cechował się wyższą czułością (91,2%) niż oznaczenie sige (76%). Autorzy konkludują, że BAT jest użyteczny w diagnostyce alergii wziewnej na alergeny pyłku cyprysa. Sanz i wsp. [23] przeprowadzili duże badanie obejmujące następujące grupy pacjentów: 53 z alergią na roztocze kurzu domowego (Dermatophagoides pteronyssinus, Dp), 51 z alergią na życicę (Lolium perenne, Lp), 24 atopowych i nieuczulonych na Dp i Lp osób oraz 38 bez atopii i uczuleń na Dp i Lp. Wykazali znamienną korelację między wynikami BAT oraz SPT (r=0,72; p<0,001), HRT (r=0,80; p<0,001), testem komórkowego stymulowania alergenami (cellular antigen-stimulation test, CAST), w którym mierzono stężenie sulfidoleukotrienów (r=0,7; p<0,001) i sige (r=0,71; p<0,001). Autorzy podsumowują, że BAT jest wartościowym narzędziem w diagnostyce alergii wziewnych na roztocze kurzu domowego i trawy. González-Muñoz i wsp. [24] analizowali zastosowanie BAT w diagnostyce alergii u dzieci. U 2 z badanych otrzymali negatywny wynik SPT i BAT oraz fałszywie dodatni sige (>43 ku/l) dla roztoczy kurzu domowego. U tych samych pacjentów stwierdzili dodatnie SPT (>1 cm średnicy), BAT (>87%) oraz sige dla krewetek (>100 ku/l). Alergeny te 774 M. Leśniak i wsp.

3 wykazują reaktywność krzyżową. Autorzy podkreślają porównywalną do rutynowo stosowanych testów czułość i wyższą (wynoszącą w ich badaniu 100%) swoistość BAT. Czarnobilska i wsp. [25 32] u 52 pacjentów zakwalifikowanych do immunoterapii swoistej (specific immunotherapy, SIT) na podstawie wywiadu i wyników testów skórnych wykonywali dodatkowo BAT z pomiarem ekspresji CD63. Wynik testu aktywacji bazofilów weryfikował obecność swoistej nadwrażliwości na alergeny szczepionki i pozwolił odstąpić od niepotrzebnej SIT u 4 (7,7%) z 52 badanych pacjentów, a tym samym uniknąć długotrwałej, uciążliwej, kosztownej oraz nieskutecznej immunoterapii u nieprawidłowo zakwalifikowanych pacjentów. Khan i wsp. [33] w 2012 roku w grupie 41 atopowych pacjentów oraz 31-osobowej grupie kontrolnej (ujemny wywiad alergologiczny i wyniki SPT) porównywali czułość i swoistość testu aktywacji bazofilów do rutynowo stosowanych metod diagnostycznych. Co ciekawe używali tego samego alergenu w różnych stężeniach do przeprowadzenia BAT i SPT. Korelacja pomiędzy wynikami testu aktywacji bazofilów i testów skórnych była istotna statystycznie (ale nie doskonała) dla wszystkich badanych alergenów. Współczynnik korelacji sige-spt był wyższy niż BAT-SPT. Również czułość sige była wyższa niż BAT, z powodu fałszywie pozytywnych wyników testu aktywacji bazofilów (BAT+ SPT-). Wyniki sugerują, że bazofile pacjentów atopowych mogą wykazywać nadreaktywność. Trudno jednoznacznie odnieść się do tych wyników niespotykanych Tabela I Porównanie właściwości CD63 i CD203c. A comparison of features of CD63 and CD203c. CD 63 Zakotwiczony w błonie ziarnistości bazofilów Ekspresja na powierzchni bazofila po degranulacji Może występować również na innych komórkach, np. trombocytach w innych badaniach. Khan i wsp. postulują, iż powodem obserwowanej nadreaktywności bazofilów może być wysoki poziom całkowitych IgE u pacjentów atopowych, wysoki poziom śledzionowej kinazy tyrozynowej (Spleen tyrosine kinase, Syk), kluczowego czynnika regulatorowego w mediowanej przez IgE drodze transdukcji sygnałów w reakcji alergicznej w mastocytach i bazofilach lub aktywacja przez IL-3. Niewątpliwym ograniczeniem badania było zastosowanie jako złotego standardu testów skórnych, które mogą być dodatnie u 29-46% bezobjawowych pacjentów i ujemne u osób z sugestywnym wywiadem alergologicznym. Autorzy konkludują, że przyszłe badania powinny skupić się na porównaniu BAT do testów prowokacji swoistej jako złotych standardów diagnostycznych. CD 203c Stałe obecny na powierzchni bazofila Wzrost ekspresji na powierzchni bazofila po degranulacji Ekspresja tylko na bazofilach i mastocytach Niezależna od aktywacji nadekspresja u pacjentów z nowotworami dróg żółciowych oraz okrężnicy Tabela II Zastosowanie testu aktywacji bazofilów w alergii wziewnej- wybrane badania. Clinical application of the basophil activation test in inhalated allergy- selected studies. Rola markera CD203c CD203c to odkryta w 1999 roku przezbłonowa, glikozylowana molekuła, która należy do rodziny fosfodiesteraz/pirofosfotaz i występuje na CD34+ komórkach progenitorowych, bazofilach i mastocytach. Jest konstytutywnie obecna na powierzchni bazofilów, a po aktywacji przez alergen dochodzi do wzrostu jej ekspresji [34-36]. Ozdemir i wsp. [37] przeprowadzili test aktywacji bazofilów z pomiarem ekspresji CD203c poza sezonem ekspozycji na alergen w grupie 31 pacjentów z alergicznym nieżytem nosa i uczuleniem na pyłek roślin i w 9-osobowej grupie kontrolnej. Autorzy wskazują na wyższą czułość BAT od oznaczeń sige oraz umiarkowanie dodatnią korelację między tymi testami dla stężeń alergenu używanych do stymulacji bazofilów wynoszących 4,5 x 10-4 i 4,5 x 10-5 µg/ml i słabszą korelację dla stężeń 45,1 i 4,5 µg/ml. Wytłumaczeniem obserwowanej prawidłowości może być większa reaktywność bazofilów na mostkowanie sige przy niższych stężeniach alergenu, osiąganie maksymalnego plateau odpowiedzi przez bazofile oraz fakt, że powyżej pewnego progu stężenia alergenów aktywacja bazofilów staje się niezależna od zewnątrzkomórkowego sige. Autorzy podkreślają użyteczność BAT u pacjentów z sezonowym alergicznym nieżytem nosa i konieczność prowadzenia dalszych badań nad zastosowaniem tego testu w trudnych diagnostycznie przypadkach. Potapińska i wsp. [38] przeprowadzili również pomiar ekspresji CD203c u pacjentów z alergią na pyłek traw i roztocze kurzu domowego uzyskując wysoką czułość (92,3%) i swoistość (100%) BAT. Kahlert i wsp. [39] porównywali oryginalne ekstrakty alergenowe pyłku traw, alergoidy, hipoalergiczne pochodne alergenów oraz rekombinowane alergeny przeprowadzając test aktywacji bazofilów z pomiarem ekspresji CD203c. Wykonali dodatkowo HRT, który dał podobne rezultaty do BAT. Alergoidy pyłku traw wykazały od 10 do krotne zmniejszenie zdolności aktywacji bazofilów mierzonej ekspresją CD203c w porównaniu do ekstraktów alergenów. Rekombinowany alergen charakteryzował się od 50 do krotną redukcją wyników pomiarów BAT w porównaniu do naturalnych alergenów. Autorzy konkludują, że test aktywacji bazofilów to szybki i czuły sposób szacowania właściwości alergenowych preparatu. Rekombinowane hipoalergiczne preparaty mogą stanowić ulepszoną alternatywę dla stosowanych w praktyce klinicznej szczepionek. Porównanie markerów CD63 i CD203c Ze względu na odrębne mechanizmy ekspresji trudno jednoznacznie porównywać użyteczność CD63 i CD203c, a każdy z nich ma swoich zwolenników i przeciwników wśród badaczy. W tabeli I przedstawiono porównanie tych markerów, a w tabeli II Autor (rok) Marker Inne testy Czułość (%) Swoistość (%) Pacjenci (liczba os.) Grupa kontrolna (liczba os.) Pâris-Köhler (2000) CD63 sige 91,2 100% Sanz (2001) CD63 SPT, HRT, CAST, sige 93,3 98, Ocmant(2006) CD63, CD203c SPT, sige Michova (2006) CD63 SPT, sige Aerts (2009) CD63, p38 MAPK SPT, sige González-Muñoz (2008) CD63 SPT, sige Potapińska(2009) CD203c SPT 92, Wolanczyk-Medrala (2009) CD63 SPT 75-93, Ozdemir (2011) CD203c SPT, sige Czarnobilska (2012) CD63 SPT, sige 89,3-96,6 88, Khan (2012) CD63 SPT, sige sige- swoiste IgE, SPT- test skórny punktowy, CAST- test komórkowego stymulowania alergenami, HRT- test uwalniania histaminy Przegląd Lekarski 2015 / 72 /

4 wybrane badania nad rolą BAT w diagnostyce alergii wziewnych. Zastosowanie CD63 jest popularniejsze ze względu na bezpośredni związek jego pojawienia się na błonie komórkowej z degranulacją bazofilów oraz dlatego, że nie jest konstytutywnym markerem. Prawdopodobnie nigdy nie uda się osiągnąć kompromisu w odpowiedzi na pytanie, który marker jest lepszy, ale nie ulega wątpliwości, że oba są powszechnie akceptowane [3,5,40]. Hauswirth i wsp. [41] wykonywali pomiary ekspresji CD63 i CD203c na aktywowanych bazofilach oraz HRT u pacjentów z alergią na brzozę (Bet v 1: n=15; Bet v 2: n=8), trawy (Phl p 1: n =15; Phl p 2: n=10; Phl p 5: n=14) oraz u 10 nieuczulonych osób. Badani byli rekrutowani na podstawie sugestywnego wywiadu, wyników SPT oraz sige. Autorzy podsumowują, że BAT jest czułym, swoistym i szybkim testem diagnostycznym w alergii wziewnej, a ekspresja markerów CD63 i CD203c wykazuje istotną wzajemną korelację. Ocmant i wsp. [42] porównywali wyniki testu aktywacji bazofilów z pomiarem ekspresji CD63 i CD203c w grupie 20 osób z alergią na sierść kota oraz 19 osobowej grupie kontrolnej. Uzyskali czułość BAT wynoszącą 100% dla CD63 oraz 95% dla CD203c. Potwierdzili także hipotezę, że dodatek IL-3 znacząco zwiększa aktywność bazofilów. BAT u pacjentów przyjmujących doustne leki przeciwhistaminowe Przed przeprowadzeniem testów skórnych czy testu prowokacji donosowej należy na około 7 dni przerwać stosowanie doustnych leków przeciwhistaminowych, ponieważ mogą one spowodować fałszywie negatywny wynik testu. Wolanczyk-Medrala i wsp. [43] przeprowadzali SPT i BAT dwukrotnie - przed i 2 godziny po zażyciu cetyryzyny, zauważając istotne statystycznie zmniejszenie średnicy bąbla skórnego po przyjęciu leku i brak zmian w czułości BAT przy stymulacji alergenem o wyższym stężeniu. Test aktywacji bazofilów wydaje się mieć istotną przewagę nad testami skórnymi, z powodu bardzo słabego hamującego efektu doustnych leków przeciwhistaminowych na indukowane alergenem zwiększenie ekspresji markera CD63. BAT w sezonie pylenia Podawaną przez literaturę zaletą przeprowadzania BAT w stosunku do NPT jest możliwość diagnostyki w sezonie pylenia. Należy jednak pamiętać, że w okresie naturalnej ekspozycji na alergen odpowiedź bazofilów mierzona ekspresją CD63 jest mniejsza, co negatywnie wpływa na czułość BAT. Saporta i wsp. [44] oceniali użyteczność testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii wziewnej w przypadku naturalnej ekspozycji na pyłek traw. U 13 pacjentów uczulonych na tymotkę powtarzali oznaczenia BAT przed i w trakcie okresu pylenia. Grupę kontrolną stanowiło 8 nieuczulonych osób. Autorzy konkludują, że chociaż aktywacja bazofilów spada podczas sezonu pylenia, wynik BAT pozostaje pozytywny i test może być przeprowadzany niezależnie od naturalnej ekspozycji. Podobnie badanie Aerts i wsp. [45] zostało przeprowadzone w okresie naturalnej ekspozycji, co więcej pacjenci przyjmowali doustne leki przeciwhistaminowe i miejscowe glikokortykosteroidy. Autorzy u 18 pacjentów z alergią na brzozę, 5 z alergią na trawę i 5 zdrowych, po 3 i 20 minutach stymulacji bazofilów alergenem brzozy (rbet v 1) mierzyli ekspresję CD63 i fosforylację kinazy p38 MAPK. Raportują bardzo wysoką, bo wynoszącą aż 94% czułość i 100% swoistość BAT. Przyszłość zastosowania BATw diagnostyce alergii wziewnej Gomez i wsp. [46] oceniali zastosowanie testu aktywacji bazofilów w diagnostyce pacjentów z lokalnym alergicznym nieżytem nosa (local allergic rhinitis, LAR). W praktyce klinicznej rozróżnienie między alergicznym (allergic rhinitis, AR) i niealergicznym nieżytem nosa (nonallergic rhinitis, NAR) może być trudne. Dodatkowo badania przeprowadzane w ostatnich latach pokazują, że znacząca liczba pacjentów (nawet około 25% wszystkich z nieżytem nosa) poprzednio zdiagnozowanych jako chorych na NAR, cierpi na LAR. W lokalnym alergicznym nieżycie nosa występuje pozytywna odpowiedź na test prowokacji donosowej (nasal provacation test, NPT), przy braku objawów systemowej atopii (ujemne SPT i sige). Dlatego też identyfikacja pacjentów z LAR jest trudna i duża liczba przypadków pozostaje niewłaściwie zdiagnozowana. Gomez i wsp. przeprowadzili swoje badanie w grupie pacjentów z potwierdzonym LAR (16 osób), AR z powodu alergii na roztocze kurzu domowego (14 osób) oraz grupie z NAR (10 osób) i zdrowej kontrolnej (15 osób). Czułość BAT obliczono na 85% u pacjentów z AR i 50% u pacjentów z LAR, a swoistość 93% w obu ww. grupach. Wartość predykcyjna dodatnia BAT dla AR wynosiła 0,92 a dla LAR 0,89. Wartość predykcyjna ujemna odpowiednio 0,87 i 0,62. Biorąc pod uwagę czasochłonność wykonywania NPT, zwłaszcza przy nieznajomości alergenu potencjalnie odpowiedzialnego za objawy kliniczne oraz niską czułość innych testów w LAR, np. wynoszącą tylko 22% dla pomiaru sige dla Dp w wydzielinie nosowej, BAT wydaje się użytecznym narzędziem w diagnostyce LAR. Autorzy postulują, że w przypadku lokalnej produkcji sige aktywacja bazofilów krwi obwodowej może być jedynym dowodem IgE-zależnego mechanizmu reakcji i wyprzedza pojawienie się wolnych osoczowych sige oraz uczulenie mastocytów skórnych. Potrzebne są dalsze badania nad określeniem roli BAT w diagnostyce lokalnego alergicznego nieżytu nosa. Nie ulega wątpliwości, że ważne jest różnicowanie między klinicznie nieistotnym uczuleniem a nadwrażliwością, która daje objawy chorobowe. Znacząca liczba pacjentów ma dodatnie wyniki SPT i sige dla alergenów, które nie wywołują dolegliwości. Niemniej badania kliniczne pokazały, że pozytywne wyniki rutynowo stosowanych testów są czynnikiem predykcyjnym rozwinięcia się choroby alergicznej. Zidarn i wsp. [47] oceniali humoralne i komórkowe mechanizmy, które mogą być związane z pojawieniem się objawów alergicznego nieżytu nosa w grupie 26 pacjentów. W okresie zimy przeprowadzali test aktywacji bazofilów oraz test prowokacji donosowej z alergenami pyłków traw, a w następnym sezonie analizowali objawy kliniczne. Pokazali korelację między wynikami BAT, NPT oraz symptomami chorobowymi. Podsumowują, że objawy alergicznego nieżytu nosa są istotnie powiązane z wrażliwością bazofilów na alergen. Wydaje się, że BAT jest testem, który odzwierciedla równocześnie alergię i nadwrażliwość dającą objawy kliniczne. Autorzy podkreślają, że ich wnioski wymagają potwierdzenia w dalszych badaniach. Caballero i wsp. [48] zajmowali się zawodowym uczuleniem na enzymy grzybów wśród pracowników przemysłu produkcji pasz zwierzęcych. Zgodność między wynikami SPT i BAT u osób uczulonych wynosiła 95%, natomiast SPT oraz sige była niższa (84%), co można przypisać istnieniu epitopów konformacyjnych. Doniesienia te sugerują, że BAT może być narzędziem stosowanym w ocenie skutków ekspozycji zawodowej na enzymy grzybów. Inne zastosowania BAT w alergologii Według niektórych doniesień czułość i swoistość BAT w diagnostyce alergii pokarmowej są wyższe niż SPT i sige - wynoszą około 90% [49]. Od 1999 roku, kiedy Moneret-Vautrin i wsp. [50] jako pierwsi zaproponowali zastosowanie BAT w badaniach diagnostycznych alergii pokarmowych, test ten został użyty w wielu eksperymentach [51-54]. BAT jest również wykorzystywany w diagnostyce alergii pokarmowej będącej efektem krzyżowej reakcji np. z pyłkiem brzozy [55-57]. Ze względu na potencjalne zagrożenie związane z alergią na leki, wczesna i wiarygodna diagnostyka jest kluczowa. Dlatego też BAT został szybko uznany za potencjalną alternatywę dla dostępnych testów [58]. Do tej pory ponad 40% badań z użyciem protokołu opartego na pomiarze ekspresji CD63 skupiało się na lekach [59], ich czułość szacowana jest na około 60%, a specyficzność na % [60-61]. BAT jest wykorzystywany w diagnostyce nadwrażliwości na antybiotyki, leki blokujące płytkę nerwowo - mięśniową, niesteroidowe przeciwzapalne, biologiczne oraz środki kontrastowe [62-64]. Test aktywacji bazofilów jest również pomocnym narzędziem diagnostycznym w alergii na jady owadów błonkoskrzydłych, zwłaszcza w przypadku trudności ze zidentyfikowaniem żądlącego owada, niejednoznacznych wyników rutynowo stosowanych testów oraz długiego czasu od użądlenia. BAT wydaje się także użytecznym testem u pacjentów z alergią na jady owadów błonkoskrzydłych i mastocytozą [65]. Korosec i wsp. [66] wykonali test aktywacji bazofilów oraz testy śródskórne (intradermal skin tests, IDT) u 37 pacjentów z dodatnim wywiadem alergii na jady owadów błonkoskrzydłych i negatywnymi wynikami SPT i sige. Czułość BAT była znacząco wyższa w porównaniu do IDT (76% vs 46 %). Korelacja między wynikami BAT a SPT oraz sige jest wysoka i według różnych danych waha się w zakresie 0,71 do 0,82 [67-69]. W badaniach opisujących zastosowanie testu aktywacji bazofilów w diagnostyce alergii na lateks autorzy otrzymywali czułość i swoistość wynoszące ok. 90%. Tylko 776 M. Leśniak i wsp.

5 w jednym badaniu czułość wyniosła 75% przy użyciu markera CD203c i 50% z CD63. Uważa się, że BAT najlepiej odzwierciedla próby prowokacji swoistej [70]. Wzrastająca liczba badań potwierdza użyteczność testu aktywacji bazofilów jako narzędzia diagnostycznego i wyjaśniającego mechanizm przewlekłej idiopatycznej pokrzywki [71-72]. BAT może być dobrym markerem oceniającym skuteczność immunoterapii. W kilku badaniach oceniano skuteczność testu aktywacji bazofilów jako metody monitorowania odpowiedzi na immunoterapię [73-79]. Podsumowując, przyszłe badania nad rolą BAT w alergii wziewnej powinny skupić się na porównaniu testu aktywacji bazofilów do testów prowokacji swoistej jako złotych standardów diagnostycznych. Dalszych badań wymaga także ocena zastosowania BAT w monitorowaniu efektów immunoterapii. Wnioski - BAT zarówno z pomiarem ekspresji markera CD63 jak i CD203c jest użytecznym narzędziem diagnostycznym w alergii wziewnej o czułości i swoistości porównywalnej do punktowych testów skórnych i oznaczeń sige. - BAT jest pomocny w trudnych diagnostycznie przypadkach, przy niezgodności między wywiadem klinicznym i wynikami badań, w rozbieżnościach między badaniami in vivo (SPT) i in vitro (sige), trudnościach w zidentyfikowaniu uczulającego alergenu i przy ustalaniu wskazań do swoistej immunoterapii. - BAT pozwala wytypować istotną klinicznie nadwrażliwość. - BAT jest użytecznym testem diagnostycznym w alergii pokarmowej, na leki, jady owadów błonkoskrzydłych, lateks czy w idiopatycznej pokrzywce. Piśmiennictwo 1. Kieć-Świerczyńska M, Pałczyński C [red.]: Jak żyć i pracować z chorobą alergiczną? Poradnik dla osób z chorobami alergicznymi skóry i układu oddechowego. Instytut Medycyny Pracy. Łódź, Niederberger V: Allergen-specific immunotherapy. Immunol Lett. 2009; 122: Boumiza R, Debard AL, Monneret G: The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clin Mol Allergy 2005; 3: Dvorak AM, Galli SJ, Schulman ES, Lichtenstein LM, Dvorak HF: Basophil and mast cell degranulation: ultrastructural analysis of mechanisms of mediator release. Fed Proc. 1983; 42: McGowan EC, Saini S: Update on the performance and application of basophil activation tests. Curr Allergy Asthma Rep. 2013; 13: Grzegorczyk J, Kujawiak M, Kłos Z: Testy aktywacji komórek w alergii i nadwrażliwości. Alerg Astma Immun. 2008; 13: Knol EF, Mul FP, Jansen H, Calafat J, Roos D: Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. J Allergy Clin Immunol. 1991; 88: Michova A, Abugalia M, Ivanova T, Nikolov G, Taskov H, Petrunov B: Comparision of two-flow cytometry methods for basophil degranulation in patients sensitized to grass pollen. Allergy 2006; 61: Roux PP, Blenis J: ERK and p38 MAPK-activated protein kinases: a family of protein kinases with diverse biological functions. Microbiol Mol Biol Rev. 2004; 68: Chirumbolo S: CD164 and other recently discovered activation markers as promising tools for allergy diagnosis: what s new? Clin Exp Med. 2011; 11: Skotny A, Kmiecik B, Zbrojewicz E, Siwak E, Mędrala W: Cytometria przepływowa w diagnostyce alergii protokoły identyfikacji bazofilów. Alergoprofil 2012; 8: Hausmann OV, Gentinetta T, Fux M, Ducrest S, Pichler WJ, Dahinden CA: Robust expression of CCR3 as a single basophil selection marker in flow cytometry. Allergy 2011; 66: Hennersdorf F, Florian S, Jakob A, Baumgärtner K, Sonneck K. et al: Identification of CD13, CD107a, and CD164 as novel basophil-activation markers and dissection of two response patterns in time kinetics of IgE-dependent upregulation. Cell Res. 2005; 15: Boumiza R, Monneret G, Forissier MF, Savoye J, Gutowski MC. et al: Marked improvement of the basophil activation test by detecting CD203c instead of CD63. Clin Exp Allergy 2003; 33: Amano T, Furuno T, Hirashima N, Ohyama N, Nakanishi M: Dynamics of intracellular granules with CD63-GFP in rat basophilic leukemia cells. J Biochem. 2001; 129: Chirumbolo S, Vella A, Ortolani R, De Gironcoli M, Solero P. et al: Differential response of human basophil activation markers: a multi-parameter flow cytometry approach. Clin Mol Allergy 2008; 6: Sagi-Eisenberg R: The mast cell: where endocytosis and regulated exocytosis meet. Immunol Rev. 2007; 217: Wu M, Baumgart T, Hammond S, Holowka D, Baird B: Differential targeting of secretory lysosomes and recycling endosomes in mast cells revealed by patterned antigen arrays. J Cell Sci. 2007; 120: Gu Z, Noss EH, Hsu VW, Brenner MB: Integrins traffic rapidly via circular dorsal ruffles and macropinocytosis during stimulated cell migration. J Cell Biol. 2011; 193: Sturm EM, Kranzelbinder B, Heinemann A, Groselj-Strele A, Aberer W, Sturm GJ: CD203cbased basophil activation test in allergy diagnosis: characteristics and differences to CD63 upregulation. Cytometry B Clin Cytom. 2010; 78: MacGlashan DW Jr: Expression of CD203c and CD63 in human basophils: relationship to differential regulation of piecemeal and anaphylactic degranulation processes. Clin Exp Allergy 2010; 40: Pâris-Köhler A, Demoly P, Persi L, Lebel B, Bousquet J, Arnoux B: In vitro diagnosis of cypress pollen allergy by using cytofluorimetric analysis of basophils (Basotest). J Allergy Clin Immunol. 2000; 105: Sanz ML, Sánchez G, Gamboa PM, Vila L, Uasuf C. et al: Allergen-induced basophil activation:cd63 cell expression detected by flow cytometry in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Loliumperenne. Clin Exp Allergy 2001; 31: González-Muñoz M, Villota J, Moneo I: Analysis of basophil activation by flow cytometry in pediatric house dust mite allergy. Pediatr Allergy Immunol. 2008; 19: Czarnobilska E, Gregorius A, Porebski G, Spiewak R, Sacha M: The benefits of using basophil activation test as a diagnostic tool prior to specific immunotherapy with inhalant allergens. Przegl Lek. 2012; 69: Mazur M, Czarnobilska E: Rola testu aktywacji bazofilów w diagnostyce i ocenie skuteczności immunoterapii swoistej chorób alergicznych. Alergol Immunol. 2012; 9: Gregorius A, Czarnobilska E, Śpiewak R: Defining the optimal cut-off values for flow-assisted basophil activation test in children with respiratory allergy to Dermatophagoides pteronyssinus. Allergy 2013; 68 (Suppl. 97): Czarnobilska E, Porebski G, Gregorius A, Zyla M, Lesniak M, Spiewak R: The benefits of using basophil activation tests as a diagnostic tool prior to specific immunotherapy with mite allergens. Allergy 2012; 67 (Suppl. 96): abstr Gregorius A, Czarnobilska E, Śpiewak R: Optimisation of the basophil activation test with Dermatophagoides pteronyssinus and D. farinae in pediatric population with respiratory allergy to house dust mite. Allergy diagnosis: new in vitro methods. Allergy 2011; 66 (Suppl. 94): 329 abstr Czarnobilska E, Gregorius A, Żyła M, Śpiewak R: Korzyści z wykonywania testu aktywacji bazofilów (BAT) w kwalifikacji do immunoterapii swoistej. Alerg Astma Immunol. 2011; 16 (Supl. 1): Śpiewak R, Gregorius A, Czarnobilska E: Porównanie dwóch protokołów cytometrycznego testu aktywacji bazofilów (BAT). Alerg Astma Immunol. 2011; 16 (Supl. 1): Gregorius A, Czarnobilska E, Śpiewak R: Test aktywacji bazofilów z alergenami Dermatophagoides pteronyssinus i D. farinae u dzieci z alergią wziewną na roztocze kurzu domowego. Alerg Astma Immunol. 2011; 16 (Supl. 1): Khan FM, Ueno-Yamanouchi A, Serushago B, Bowen T, Lyon AW. et al: Basophil activation test compared to skin prick test and fluorescence enzyme immunoassay for aeroallergen-specific immunoglobulin-e. Allergy Asthma Clin Immunol. 2012; 8: Buhring HJ, Simmons PJ, Pudney M, Müller R, Jarrossay D. et al: The monoclonal antibody 97A6 defines a novel surface antigen expressed on human basophils and their multipotent and unipotent progenitors. Blood 1999; 94: Buhring HJ, Seiffert M, Giesert C, Marxer A, Kanz L. et al: The basophil activation marker defined by antibody 97A6 is identical to the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3. Blood 2001; 97: Hauswirth AW, Sonneck K, Florian S, Krauth MT, Bohm A. et al: Interleukin-3 promotes the expression of E-NPP3/CD203C on human blood basophils in healthy subjects and in patients with birch pollen allergy. Int J Immunopathol Pharmacol. 2007; 20: Ozdemir SK, Guloglu D, Sin BA, Elhan AH, Ikinciogullari A, Misirligil Z: Reliability of basophil activation test using CD203c expression in diagnosis of pollen allergy. Am J Rhinol Allergy 2011; 25: Potapińska O, Górska E, Zawadzka-Krajewska A, Kulus M, Wasik M, Demkow U: The usefulness of CD203c expression measurement on basophils after activation with grass pollen and Dermatophagoides pteronyssinus antigens. Preliminary study. Pneumonol Alergol Pol. 2009; 77: Kahlert H, Cromwell O, Fiebig H: Measurement of basophil-activating capacity of grass pollen allergens, allergoids and hypoallergenic recombinant derivatives by flow cytometry using anti-cd203c. Clin Exp Allergy 2003; 33: Bavbek S, Ikincioğullari A, Dursun AB, Guloğlu D, Arikan M. et al: Upregulation of CD63 or CD203c alone or in combination is not sensitive in the diagnosis of nonsteroidal anti-inflammatory drug intolerance. Int Arch Allergy Immunol. 2009; 150: Hauswirth AW, Natter S, Ghannadan M, Majlesi Y, Schernthaner GH. et al: Recombinant allergens promote expression of CD203c on basophils in sensitized individuals. J Allergy Clin Immunol. 2002; 110: Ocmant A, Peignois Y, Mulier S, Hanssens L, Michils A, Schandené L: Flow cytometry for basophil activation markers: the measurement of CD203c up-regulation is as reliable as CD63 expression in the diagnosis of cat allergy. J Immunol Methods 2007; 320: Wolanczyk-Medrala A, Gogolewski G, Liebhart J, Gomulka K, Litwa M. et al: A new variant of the basophil activation test for allergen-induced basophil CD63 upregulation. The effect of cetirizine. J Investig Allergol Clin Immunol. 2009; 19: Saporta M, Kamei S, Persi L, Bousquet J, Arnoux B: Basophil activation during pollen season in patients monosensitized to grass pollens. Allergy 2001; 56: Aerts NE, Dombrecht EJ, Bridts CH, Hagendorens MM, de Clerck LS. et al: Simultaneous flow cytometric detection of basophil activation marker CD63 and intracellular phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase in birch pollen allergy. Cytometry B Clin Cytom. 2009; 76: Gómez E, Campo P, Rondón C, Barrionuevo E, Blanca-López N. et al: Role of the basophil activation test in the diagnosis of local allergic rhinitis. J Allergy Przegląd Lekarski 2015 / 72 /

6 Clin Immunol. 2013; 132: Zidarn M, Košnik M, Silar M, GrahekA, Korošec P: Rhinitis symptoms caused by grass pollen are associated with elevated basophile allergen sensitivity and a larger grass-specific immunoglobulin E fraction. Clin Exp Allergy 2012; 42: Caballero ML, Gómez M, González-Muñoz M, Reinoso L, Rodríguez-Pérez R. et al: Occupational sensitization to fungal enzymes used in animal feed industry. Int Arch Allergy Immunol. 2007; 144: Rubio A, Vivinus-Nebot M, Bourrier T, Saggio B, Albertini M, Bernard A: Benefit of the basophil activation test in deciding when to reintroduce cow s milk in allergic children. Allergy 2011; 66: Moneret-Vautrin DA, Sainte-Laudy J, Kanny G, Fremont S: Human basophil activation measured by CD63 expression and LTC4 release in IgE-mediated food allergy. Ann Allergy Asthma Immunol. 1999; 82: Lee JY, Jin HJ, Park JW, Jung SK, Jang JY, Park HS: A case of korean ginseng-induced anaphylaxis confirmed by open oral challenge and basophil activation test. Allergy Asthma Immunol Res. 2012; 4: Garcia-Ortega P, Scorza E, Teniente A: Basophil activation test in the diagnosis of sulphite-induced immediate urticaria. Clin Exp Allergy 2010; 40: Kim JH, An S, Kim JE, Choi GS, Ye YM, Park HS: Beef-induced anaphylaxis confirmed by the basophil activation test. Allergy Asthma Immunol Res. 2010; 2: Ebo DG, Sainte-Laudy J, Bridts CH, Mertens CH, Hagendorens MM. et al: Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy 2006; 61: Erdmann SM, Heussen N, Moll-Slodowy S, Merk HF, Sachs B: CD63 expression on basophils as a tool for the diagnosis of pollen-associated food allergy: sensitivity and specificity. Clin Exp Allergy 2003; 33: Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH, Schuerwegh AJ, De Clerck LS, Stevens WJ: Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry B Clin Cytom. 2005; 64: Erdmann SM, Sachs B, Schmidt A, Merk HF, Scheiner O. et al: In vitro analysis of birch-pollen associated food allergy by use of recombinant allergens in the basophil activation test. Int Arch Allergy Immunol. 2005; 136: Choquet-Kastylevsky G, Vial T, Descotes J: Drug allergy diagnosis in humans: possibilities and pitfalls. Toxicology 2001; 158: Gómez E, Blanca-Lopez N, Torres MJ, Requena G, Rondon C. et al: Immunoglobulin E-mediated immediate allergic reactions to dipyrone: value of basophil activation test in the identification of patients. Clin Exp Allergy 2009; 39: Sanz ML, Gamboa PM, Mayorga C: Basophil activation tests in the evaluation of immediate drug hypersensitivity. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2009; 9: Eberlein B, León Suárez I, Darsow U, Ruëff F, Behrendt H, Ring J: A new basophil activation test using CD63 and CCR3 in allergy to antibiotics. Clin Exp Allergy 2010; 40: Song WJ, Chang YS: Recent applications of basophil activation tests in the diagnosis of drug hypersensitivity. Asia Pac Allergy 2013; 3: Piotrowicz-Wójcik K, Porębski G, Dyga W, Obtułowicz K, Czarnobilska E: Test aktywacji bazofilów w diagnostyce natychmiastowej nadwrażliwości na ibuprofen. Opis przypadku. Alergol Immunol. 2012; 9: Obtułowicz K, Dyga W, Obtułowicz A, Czarnobilska E, Zdziłowska E, Piotrowicz-Wójcik K: Bazotest. Cytometryczny laboratoryjny test aktywacji bazofilów (CD 63+) w diagnostyce alergii na leki. Alergol Immunol. 2009; 6: Ebo DG, Van Vaerenbergh M, de Graaf DC, Bridts CH, De Clerck LS, Sabato V: In vitro diagnosis of Hymenoptera venom allergy and further development of component resolved diagnostics. Expert Rev Clin Immunol. 2014; 10: Korosec P, Erzen R, Silar M, Bajrovic N, Kopac P, Kosnik M: Basophil responsiveness in patients with insect sting allergies and negative venom-specific immunoglobulin E and skin prick test results. Clin Exp Allergy 2009; 39: de Weck AL, Sanz ML, Gamboa PM, Aberer W, Bienvenu J. et al: Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. Int Arch Allergy Immunol. 2008; 146: Scherer K, Weber JM, Jermann TM, Krautheim A, Tas E. et al: Cellular in vitro assays in the diagnosis of hymenoptera venom allergy. Int Arch Allergy Immunol. 2008; 146: Czarnobilska E, Sacha M, Gregorius A, Chmielewska A, Czarnobilski K, Śpiewak R: The benefits of performing basophil activation test in the qualification for wasp and bee venom-specific immunotherapy in cases of contradictions between history and routine allergy tests. Allergy 2013; 68 (Suppl. 97): Ebo DG, Lechkar B, Schuerwegh AJ, Bridts CH, De Clerk LS, Stevens WJ: Validation of a two-color flow cytometric assay detecting in vitro basophil activation for the diagnosis of IgE-mediated natural rubber latex allergy. Allergy 2002; 57: Frezzolini A, Provini A, Teofoli P, Pomponi D, De Pita O: Serum-induced basophil CD63 expression by means of a tricolor flow cytometric method for the in vitro diagnosis of chronic urticaria. Allergy 2006; 61: Vasagar K, Vonakis BM, Gober LM, Viksman A, Gibbons SP Jr, Saini SS: Evidence of in vivo basophil activation in chronic urticaria. Clin Exp Allergy 2006; 36: Erzen R, Kosnik M, Silar M, Korosec P: Basophil response and the induction of a tolerance in venom immunotherapy: a long-term sting challenge study. Allergy 2012; 67: Zitnik SE, Vesel T, Avcin T, Silar M, Kosnik M, Korosec P: Monitoring honeybee venom immunotherapy in children with the basophil activation test. Pediatr Allergy Immunol. 2012; 23: Cichocka-Jarosz E, Dorynska A, Pietrzyk JJ, Spiewak R: Laboratory markers of mast cell and basophil activation in monitoring rush immunotherapy in bee venom-allergic children. Immunotherapy 2011; 3: Erdmann SM, Sachs B, Kwiecien R, Moll-Slodowy S, Sauer I, Merk HF: The basophil activation test in wasp venom allergy: sensitivity, specificity and monitoring specific immunotherapy. Allergy 2004; 59: van Overtvelt L, Baron-Bodo V, Horiot S, Moussu H, Ricarte C. et al: Changes in basophil activation during grass-pollen sublingual immunotherapy do not correlate with clinical efficacy. Allergy 2011; 66: Lasa Luaces EM, Tabar Purroy AI, Garcia Figueroa BE, Anda Apiñaniz M, Sanz Laruga ML. et al: Component-resolved immunologic modifications, efficacy, and tolerance of latex sublingual immunotherapy in children. Ann Allergy Asthma Immunol. 2012; 108: Swamy RS, Reshamwala N, Hunter T, Vissamsetti S, Santos CB. et al: Epigenetic modifications and improved regulatory T-cell function in subjects undergoing dual sublingual immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 2012; 130: M. Leśniak i wsp.