MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 27-37 Waldemar Rastawicki HUMORALNA ODPOWIEDŹ NA WYBRANE ANTYGENY PAŁECZEK YERSINIA ENTEROCOLITICA I YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS W PRZEBIEGU JERSINIOZY U LUDZI. IV. OCENA SWOISTOŚCI ANTYGENÓW Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Oceniono swoistość lipopolisacharydów (LPS) pałeczek Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis oraz białek wydzielniczych Yop używanych powszechnie jako antygeny w serodiagnostyce jersiniozy. Wykazano podobieństwo budowy antygenowej pomiędzy LPS pałeczek Yersinia należących do różnych grup serologicznych jak również, w mniejszym stopniu, pomiędzy LPS pałeczek Yersinia i Salmonella. Nie stwierdzono silnych reakcji krzyżowych pomiędzy antygenami pałeczek Yersinia a przeciwciałami dla antygenów B. burgdorferi czy też tkanki tarczycowej. Z powodu powszechnego występowania pałeczek Yersinia w wodzie, glebie i produktach spożywczych, często dochodzi do objawowych bądź bezobjawowych zakażeń człowieka i wytwarzania przeciwciał dla różnych antygenów pałeczek Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis. Problemy z prawidłową interpretacją wyników serologicznych badań w kierunku zakażeń pałeczkami Yersinia sprawia jednak wzajemne podobieństwo budowy antygenowej tych pałeczek oraz podobieństwo do antygenów drobnoustrojów należących do innych przedstawicieli rodziny Enterobacteriaceae, np. do: Morganella morganii, E. coli O157:H7 czy Salmonella sp. (5, 7, 14, 15, 16, 23, 24). Podobieństwo budowy antygenowej stwierdzono również pomiędzy pałeczkami Y. enterocolitica O3 a drobnoustrojami z rodzaju Rickettsia (20). Szczególne jednak zainteresowanie, zwłaszcza osób rutynowo zajmujących się serodiagnostyką brucelozy u zwierząt, wywołuje podobieństwo budowy antygenowej lipopolisacharydów pałeczek Y. enterocolitica z grupy serologicznej O9 i drobnoustrojów z rodzaju Brucella. Reakcje krzyżowe pomiędzy przeciwciałami dla pałeczek Y. enterocolitica O9 a antygenem S-LPS pałeczek Brucella sp. powodują występowanie licznych, fałszywie dodatnich wyników (7, 15, 21). Celem podjętych badań była ocena swoistości lipopolisacharydów pałeczek Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis należących do różnych grup serologicznych oraz białek wydzielniczych Yop używanych powszechnie jako antygeny w serodiagnostyce jersiniozy.
28 W. Rastawicki Nr 1 MATERIAŁ I METODY 1.Próbki surowicy badanych osób 1.1. Próbki surowicy osób chorych na jersiniozę. Badaniom poddano próbki surowicy uzyskanych od 9 pacjentów z objawami bólów brzucha, od których wyizolowano pałeczki Y. enterocolitica. 1.2. Próbki surowicy osób chorych na salmonelozę, boreliozę i chorobę Gravesa-Basedowa. W celu dokonania oceny swoistości użytych preparatów antygenowych zbadano: - 53 próbek surowicy uzyskanych od osób z salmonelozą - 30 próbek surowicy uzyskanych od osób z boreliozą - 60 próbek surowicy uzyskanych od osób z nadczynnością tarczycy (chorobą Gravesa- Basedowa). 1.3. Próbki surowicy krwiodawców. Zbadano próbki surowicy pochodzące od 200 klinicznie zdrowych, dorosłych osób w wieku powyżej 20 lat (krwiodawców). 2. Próbki surowicy immunizowanych królików. Badaniu poddano próbki surowicy królików immunizowanych następującymi szczepami bakteryjnymi: Y. enterocolitica O3 (105 P), Y. enterocolitica O8 (WA-314), Y. enterocolitica O9 (96 P), Y. enterocolitica O5,27 i Y. pseudotuberculosis I, Y. enterocolitica O5, Y. enterocolitica O7,8. 3. Absorpcja próbek surowicy.w celu wyabsorbowania z próbki surowicy przeciwciał dla somatycznych antygenów pałeczek Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis należących do różnych grup serologicznych postępowano następująco: w 200 μl badanej próbki surowicy, wstępnie rozcieńczonej 10 - krotnie roztworem PBS, rozprowadzano osad uzyskany po zwirowaniu 200 μl 20% zawiesiny bakteryjnej odpowiedniego szczepu pałeczek Yersinia. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 o C, próbkę surowicy odwirowywano i zostawiano przez noc w temp. 4 o C. Po ponownym zwirowaniu próbkę surowicy badano w odczynie ELISA. 4. Odczyn immunoenzymatyczny ELISA.Oczyszczone preparaty antygenów somatycznych otrzymano we własnym zakresie zmodyfikowaną metodą Boivina (12) z pałeczek Y. enterocolitica należących do grupy serologicznej O3, O5,27, O8, O9 oraz pałeczek Y. pseudotuberculosis I. Preparatykę wydzielniczych białek Yop przeprowadzono zgodnie z metodyką podaną przez innych autorów z uwzględnieniem własnych modyfikacji (10). Odczyn wykonywano na płytkach polistyrenowych firmy Nunc zgodnie z metodyką opisaną uprzednio (18) z uwzględnieniem niezbędnych modyfikacji. Poziom przeciwciał dla antygenów pałeczek Yersinia w próbkach surowicy immunizowanych królików oznaczano łącznie w klasach IgA+IgG+IgM. W badaniach posłużono się kozimi immunoglobulinami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Cappel MP Biomedicals, Inc). 5. Statystyka. Istotność różnic w częstości wykrywania przeciwciał w próbkach surowicy osób chorych i osób z grupy kontrolnej oraz istotność różnic w częstości wykrywania przeciwciał w zależności od objawów klinicznych, wieku i płci oceniano testem niezależności chi-kwadrat z zastosowaniem poprawki Yatesa. Dla próbek n < 40 i O i (liczebność oczekiwana) < 5 stosowano dokładny test Fishera. Za znamienne statystycznie przyjęto różnice, gdzie poziomy istotności p były mniejsze od 0,05 (p < 0,05).
Nr 1 Humoralna odpowiedź w jersiniozie 29 WYNIKI W pierwszym etapie pracy dokonano oceny swoistości uzyskanych we własnym zakresie preparatów antygenowych wobec odpornościowych surowic króliczych oraz wybranych surowic ludzkich. W tym celu immunizowano króliki zawiesinami pałeczek Y. enterocolitica O3, O5, O7,8 O8, O9, O5,27 oraz Y. pseudotuberculosis I a uzyskane odpornościowe surowice jak i surowice uzyskane od królików przed rozpoczęciem immunizacji posłużyły do oceny przygotowanych preparatów somatycznych antygenów tych pałeczek oraz białek wydzielniczych Yop pod względem ich reaktywności ze swoistymi przeciwciałami. Wyniki tych badań przeprowadzonych odczynem ELISA zebrano w tabeli I. Tabela I. Poziom przeciwciał dla somatycznych antygenów pałeczek Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis oraz wydzielniczych białek Yop w próbkach surowicy królików immunizowanych zawiesiną pałeczek Y. enterocolitica O3, O5,27, O5, O9, O8 i O7,8 oraz Y. pseudotuberculosis I przed i po absorpcji masą bakteryjną. Zawiesina pałeczek Yersinia użyna użyta do ab- Y.ent. Y. ent. Y. ent. Y. ent. Y.pst. Masa bakteryj- Miano przeciwciał w klasie IgA/G/M dla antygenów: * Yop ta do immunizacji sorpcji surowic O3 O5,27 O8 O9 I Bez absorpcji >10.000 678 0 851 0 1.660 Y. ent. O3 0 0 0 0 0 nb Y. ent. O3 Y. ent.o5,27 >10.000 0 0 0 0 nb Y. ent. O9 >10.000 0 0 0 0 nb Y. ent. O5,27 Y. ent. O5 Y. ent. O9 Y. pst. I Y. ent. O8 Y. ent. O7,8 Bez absorpcji 0 5.137 0 476 0 349 Y. ent.o5,27 0 0 0 0 0 nb Y. ent. O9 0 254 0 0 0 nb Y. ent. O5 0 1.780 0 0 0 nb Bez absorpcji 0 3.200 0 0 0 0 Y. ent. O5 0 0 0 0 0 nb Y. ent. O5,27 0 0 0 0 0 nb Bez absorpcji 817 676 0 >10.000 114 236 Y. ent. O3 0 0 0 >10.000 0 nb Y. ent. O5,27 0 0 0 >10.000 0 nb Y. ent. O9 0 0 0 0 0 nb Y. pseud.i 0 0 0 0 0 nb Bez absorpcji 0 0 0 370 >10.000 355 Y. ent. O9 0 0 0 0 >10.000 nb Y.pseud. I 0 0 0 0 0 nb Bez absorpcji 0 0 723 0 0 379 Y. ent. O8 0 0 0 0 0 nb Y. ent. O7,8 0 0 112 0 0 nb Y. ent. O7 0 0 787 0 0 nb Bez absorpcji 0 0 668 0 0 0 Y. ent. O8 0 0 0 0 0 nb Y. ent. O7,8 0 0 0 0 0 nb Y. ent. O7 0 0 472 0 0 nb nb nie badano * średnia wartość miana przeciwciał wyliczona na podstawie badania odczynem ELISA próbek surowicy uzyskanych od 2 królików immunizowanych zawiesiną wybranych szczepów pałeczek Yersinia
30 W. Rastawicki Nr 1 Jak wykazały badania żaden z użytych preparatów antygenowych nie reagował w odczynie ELISA z próbkami surowicy uzyskanymi od królików przed rozpoczęciem immunizacji. Wszystkie badane preparaty somatycznych antygenów pałeczek Yersinia reagowały natomiast w układach homologicznych z przeciwciałami króliczymi. Stwierdzono, że niektóre z tych preparatów reagowały też, wprawdzie w ponad 10-krotnie niższym mianie, z przeciwciałami króliczymi w układach heterologicznych. I tak, preparat antygenu somatycznego O3 Y. enterocolitica reagował z przeciwciałami dla pałeczek z grupy serologicznej O9, preparat antygenu O5,27 reagował z przeciwciałami dla pałeczek z grupy O3, O5, i O9, preparat antygenu O9 reagował z przeciwciałami dla pałeczek z grupy O3, O5,27 i Y. pseudotuberculosis I, natomiast preparat antygenu Y. pseudotuberculosis I reagował z przeciwciałami dla pałeczek z grupy O9. Preparat antygenu somatycznego O8 Y. enterocolitica reagował ze swoistymi przeciwciałami króliczymi i przeciwciałami dla antygenu O7,8. Przeprowadzone absorpcje odpornościowych surowic króliczych masą bakteryjną homologicznych szczepów pałeczek Yersinia prowadziły do całkowitego usunięcia swoistych i nieswoistych przeciwciał dla badanych preparatów antygenów somatycznych. Natomiast absorpcje odpornościowych surowic króliczych masą bakteryjną heterologicznych szczepów pałeczek Yersinia nie powodowały usunięcia swoistych przeciwciał dla tych antygenów, usuwały natomiast wszystkie nieswoiste przeciwciała. Przeciwciała dla białek wydzielniczych Yop wykryto wyłącznie w próbkach surowicy królików immunizowanych zawiesiną pałeczek należących do grup serologicznych uważanych za patogenne dla ludzi. Swoistość przygotowanych preparatów antygenów somatycznych badano również posługując się próbkami surowicy uzyskanymi od wybranych osób z podejrzeniem jersiniozy oraz osób, od których izolowano z próbek kału pałeczki Y. enterocolitica. Wyniki tych badań przedstawiono na wybranych przykładach w kolejnych tabelach II-IV. Tabela II. Poziom przeciwciał dla antygenu O3 i O9 Y. enterocolitica w próbkach surowicy uzyskanych od 2 osób z jersiniozą przed i po absorpcji masą bakteryjną tych drobnoustrojów. Lp Masa bakteryjna użyta do absorpcji surowicy Miano przeciwciał dla somatycznego antygenu pałeczek: Y. enterocolitica O3 Y. enterocolitica O9 IgA IgG IgM IgA IgG IgM 1 Bez absorpcji 278 468 421 193 117 291 Y. enterocolitica O3 0 0 0 0 0 0 Y. enterocolitica O9 120 265 229 0 0 0 2 Bez absorpcji 280 170 345 1561 764 2793 Y. enterocolitica O3 0 0 0 519 256 770 Y. enterocolitica O9 0 0 0 0 0 0 Jak wynika z tabeli II w próbkach surowicy uzyskanych od 2 osób z podejrzeniem jersiniozy wykryto w klasie immunoglobulin A, G i M przeciwciała dla somatycznych antygenów pałeczek Y. enterocolitica O3 i O9. Przeprowadzone absorpcje tych surowic pozwoliły stwierdzić, że w przypadku pierwszej próbki absorpcja surowicy masą bakteryjną pałeczek z grupy serologicznej O3 prowadziła do całkowitego usunięcia przeciwciał dla preparatu antygenu O3 i O9 natomiast absorpcja masą bakteryjną pałeczek z grupy O9 nie usuwała przeciwciał dla preparatu antygenu O3. W przypadku drugiej próbki surowicy sytuacja była odwrotna. Absorpcja masą bakteryjną pałeczek z grupy O9 prowadziła do
Nr 1 Humoralna odpowiedź w jersiniozie 31 całkowitego usunięcia przeciwciał zarówno dla preparatu antygenu O3 jak i O9 natomiast absorpcja masą bakteryjną pałeczek z grupy O3 usuwała przeciwciała tylko dla antygenu tej grupy serologicznej. Tabela III. Poziom przeciwciał dla antygenów O3, O9 i O5,27 Y. enterocolitica w próbce surowicy uzyskanej od pacjenta z bólami brzucha, od którego wyizolowano z kału pałeczki Y. enterocolitica O3, przed i po absorpcji masą bakteryjną tych drobnoustrojów. Masa bakteryjna użyta do absorpcji surowicy Miano przeciwciał dla antygenu: Y. enterocolitica O3 Y. enterocolitica O9 Y. enterocolitica O5,27 IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM Bez absorpcji 555 810 432 275 518 394 164 444 347 Y. ent. O3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Y. ent. O9 497 634 189 0 0 0 0 0 0 Y. ent. O5,27 523 520 238 0 0 0 0 0 0 W tabeli III przedstawiono wynik badania próbki surowicy uzyskanej od pacjenta z objawami bólów brzucha, od którego w badaniu bakteriologicznym wyizolowano z próbki kału pałeczki Y. enterocolitica O3. W badanej próbce surowicy wykryto w klasie immunoglobulin A, G i M przeciwciała dla antygenów somatycznych Y. enterocolitica O3, O9 i O5,27. Absorpcja próbki surowicy masą bakteryjną pałeczek z grupy serologicznej O3 prowadziła do usunięcia przeciwciał dla wszystkich preparatów antygenowych, natomiast absorpcja masą bakteryjną pałeczek z grupy O9 lub O5,27 tylko przeciwciał dla antygenów somatycznych tych dwu grup. Tabela IV. Poziom przeciwciał dla somatycznych antygenów pałeczek Y. enterocolitica i wydzielniczych białek Yop u 9 pacjentów z objawami bólów brzucha, od których wyizolowano pałeczki Y. enterocolitica. Pacjent Pałeczki Y. enterocolitica Miano przeciwciał dla: wyizo- lowane z próbki Somatycznych antygenów pałeczek Yersinia Wydzielniczych białek Yop kału IgA IgG IgM IgA IgG IgM ZK Y. ent. O8 103 411 354 81 281 122 MN Y. ent. O3 356 1237 451 65 128 45 JK Y. ent. O3 5239 9650 460 483 9200 194 AL Y. ent. O3 110 1218 604 110 1218 604 SG Y. ent. O3 100 314 391 50 1082 138 KP Y. ent. O3 82 641 1197 95 1300 211 HJ Y. ent. O3 124 772 196 0 280 68 KF Y. ent. O3 451 547 1182 390 1358 9500 TN Y. ent. O3 0 178 67 0 356 35 Zebrane w tabeli IV wyniki badań próbek surowicy uzyskane od 9 osób z objawami bólów brzucha, od których izolowano pałeczki Y. enterocolitica wykazały, że przygotowane we własnym zakresie preparaty antygenów somatycznych swoiście reagują z przeciwciałami dla pałeczek Yersinia powstającymi w przebiegu choroby. Reakcje te, z dwoma wyjątkami,
32 W. Rastawicki Nr 1 wykryto odczynem ELISA we wszystkich klasach immunoglobulin. We wszystkich badanych próbkach surowicy wykryto także odczynem ELISA przeciwciała dla uzyskanego we własnym zakresie preparatu wydzielniczych białek Yop. Analizując swoistość preparatów antygenów oraz możliwość występowania ewentualnych reakcji krzyżowych w serodiagnostyce jersiniozy badaniom poddano również próbki surowicy uzyskane od 30 osób z boreliozą i 53 osób z salmonelozą. W próbkach surowicy uzyskanych od tych osób potwierdzono we wcześniejszych rutynowych badaniach wysoki poziom swoistych przeciwciał dla czynnika etiologicznego odpowiedzialnego za wywołanie choroby. Dodatkowo badaniom poddano również 60 próbek surowicy osób z nadczynnością tarczycy (chorobą Gravesa-Basedowa). Przeciwciała klasy IgA, IgG bądź IgM w mianie diagnostycznie znamiennym dla somatycznych antygenów pałeczek Yersinia stwierdzano u 20% osób z boreliozą, 22,6% osób z salmonelozą i 8,3% z chorobą Gravesa-Basedowa. Najczęściej stwierdzano przeciwciała w klasie IgG dla antygenów O3 pałeczek Y. enterocolitica. Przeciwciała dla białek wydzielniczych Yop występowały u osób z boreliozą i salmonelozą jeszcze rzadziej, odpowiednio u 10% i 13,2%. U osób z nadczynnością tarczycy przeciwciała klasy IgA i IgG dla białek wydzielniczych Yop występowały u 5 (8,3%) osób natomiast przeciwciała klasy IgM u 3 osób na 60 badanych (5,0%). Łącznie przeciwciała dla białek wydzielniczych Yop wykryto u 9 (15,0%) osób z chorobą Gravesa- Basedowa (Tabela V). Tabela V. Poziom przeciwciał dla somatycznych antygenów pałeczek Yersinia i wydzielniczych białek Yop u osób chorych z salmonelozą, boreliozą i chorobą Gravesa-Basedowa oraz u osób klinicznie zdrowych krwiodawców. Grupa (liczba) badanych osób Osoby z salmonelozą L = 53 Osoby z boreliozą L = 30 Osoby z chorobą Gravesa-Basedowa L = 60 Krwiodawcy L = 200 Liczba i (odsetek) próbek surowicy z przeciwciałami dla: Somatycznych antygenów pałeczek Yersinia Wydzielniczych białek Yop IgA IgA IgA IgG IgM IgG IgM IgA IgG IgM IgG IgM 7 8 3 12 3 5 2 7 (13,2) (15,1) (5,7) (22,6) (5,7) (9,4) (3,8) (13,2) 3 4 3 6 2 2 2 3 (10,0) (13,3) (10,0) (20,0) (2,6) (6,7) (2,6) (10,0) 2 3 2 5 5 5 3 9 (3,3) (5,0) (3,3) (8,3) (8,3) (8,3) (5,0) (15,0) 20 (10,0) 27 (13,5) 17 (8,5) 41 (20,5) 12 (6,0) 18 (9,0) 10 (5,0) 23 (11,5) W celu wykazania, czy przeciwciała dla somatycznych antygenów i białek wydzielniczych Yop występowały w surowicy osób z salmonellozą, boreliozą i nadczynnością tarczycy znamiennie częściej niż w populacji osób klinicznie zdrowych badaniom poddano również próbki surowicy uzyskane od 200 krwiodawców. Statystyczna analiza istotności różnic między wynikami oznaczeń poziomu przeciwciał wykazała jednak, że przeciwciała dla somatycznych antygenów pałeczek Yersinia oraz dla białek wydzielniczych Yop wykrywano z podobną częstością u badanych osób chorych jak i zdrowych (p>0,05).
Nr 1 Humoralna odpowiedź w jersiniozie 33 DYSKUSJA Reakcje krzyżowe pojawiające się w serodiagnostyce jersiniozy były szczegółowo badane przez wielu autorów. Granfors (9) przebadała odczynem ELISA 423 próbki surowicy uzyskane od osób z jersiniozą. Jako antygen w tych badaniach zastosowała zawiesinę całych komórek Y. enterocolitica z grupy O3 inaktywowanych formaliną oraz komórek Y. enterocolitica O9 i Y. pseudotuberculosis I inaktywowanych przez ogrzewanie. Autorka wykazała, że przeciwciała skierowane dla antygenu O3 Y. enterocolitica reagowały również z antygenem O9 Y. enterocolitica. Również wyniki badań przeprowadzone przez Bitzan i wsp. (3) wykazały występowanie w odczynie ELISA przy użyciu antygenu komórkowego i LPS licznych reakcji krzyżowych pomiędzy pałeczkami Y. enterocolitica O3 i O9. Reakcje te były jednak na tyle słabe, że w 95% nie powodowały problemów z właściwą interpretacją wyników. W prezentowanych badaniach również wykazano występowanie licznych reakcji krzyżowych pomiędzy surowicami immunizowanych królików jak i surowic osób, od których udało się izolować pałeczki Y. enterocolitica a somatycznymi antygenami pałeczek Yersinia należącymi do różnych grup serologicznych. Najsilniejsze krzyżowe reakcje zaobserwowano pomiędzy surowicami królików immunizowanych zawiesiną pałeczek Y. enterocolitica O3 a antygenem somatycznym O9 i O5,27 oraz pomiędzy surowicą królików immunizowanych pałeczkami O9 a antygenem somatycznym O3 i O5,27. Występowanie krzyżowych reakcji pomiędzy przeciwciałami dla antygenu O3 Y. enterocolitica a somatycznymi antygenami pałeczek Y. enterocolitica O5,27 i O9 wykazano również na przykładzie surowicy uzyskanej od osoby chorej, od której izolowano pałeczki Y. enterocolitica O3. Przeprowadzone badania pozwoliły stwierdzić, że przygotowane preparaty somatycznych antygenów pałeczek Y. enterocolitica O3, O8, O9, O5,27 oraz Y. pseudotuberculosis I swoiście reagują z przeciwciałami dla tych antygenów, natomiast obserwowane reakcje z przeciwciałami dla antygenów heterologicznych mają charakter nieswoisty, gdyż mogą być usuwane po absorpcji tych przeciwciał masą bakteryjną pałeczek należących do różnych grup serologicznych. Jak wykazały przeprowadzone badania poziom wykrywanych przeciwciał dla antygenu homologicznego różnił się jednak zasadniczo od poziomu przeciwciał dla somatycznych antygenów uzyskanych z pałeczek Y. enterocolitica należących do innych grup serologicznych. W praktyce laboratoryjnej mamy jednak do czynienia z różnymi próbkami surowicy, które nie zawsze wykazują takie zróżnicowanie poziomu przeciwciał. W przypadku bardzo intensywnej odpowiedzi humoralnej, poziom przeciwciał reagujących krzyżowo z somatycznymi antygenami pałeczek z innych grup jest również wysoki, czasami wielokrotnie przekraczający miano diagnostycznie znamienne. W takich przypadkach, jedyną możliwością potwierdzenia swoistości wykrywanych przeciwciał jest wykonywanie za każdym razem absorpcji badanych surowic zawiesinami drobnoustrojów należącymi do odpowiednich grup serologicznych. Niestety, z powodu pracochłonności i dodatkowych kosztów, absorpcja taka może być wykonywana jedynie w wybranych przypadkach. Z punktu widzenia przydatności uzyskanych wyników serologicznych badań w praktyce lekarskiej, uzyskanie współreakcji pomiędzy przeciwciałami obecnymi w badanej próbce surowicy a somatycznymi antygenami pałeczek Y. enterocolitica z grup serologicznych O3, O9 czy O5,27, uznawanymi za patogenne dla człowieka, nie stanowi większego problemu
34 W. Rastawicki Nr 1 diagnostycznego. Pałeczki należące do tych grup wywołują podobne objawy kliniczne i charakteryzują się identyczną lekowrażliwością. Znacznie poważniejszy problem diagnostyczny stanowią reakcje krzyżowe pomiędzy przeciwciałami dla niepatogennych pałeczek Y. enterocolitica O5 a somatycznymi antygenami pałeczek z grupy O5,27. Pałeczki z grupy O5, należące do biotypu 1A, izolowane są ze środowiska naturalnego człowieka i mogą być przyczyną zaburzeń żołądkowo-jelitowych u ludzi. Według Kałużewskiego i wsp. (13) zakażenie wód naturalnych drobnoustrojami Y. enterocolitica O5 jest przyczyną częstego wykrywania przeciwciał dla tych pałeczek w próbkach osób klinicznie zdrowych. W przeprowadzonych badaniach u 53 osób z serologicznie i/lub bakteriologicznie potwierdzoną salmonelozą przeciwciała dla somatycznych antygenów pałeczek Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis w mianie diagnostycznie znamiennym wykrywano prawie dwukrotnie częściej niż przeciwciała dla białek wydzielniczych Yop. Mogłoby to świadczyć o podobieństwie antygenowym lipopolisacharydów pałeczek Yersinia i Salmonella. Dowodzą również o tym wcześniej przeprowadzone badania u osób z reaktywnym zapaleniem stawów, u których często wykrywano obecność przeciwciał reagujących z somatycznym antygenem pałeczek należących do tych dwóch rodzajów drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae (17). Występowanie krzyżowych reakcji wśród drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae może być spowodowane między innymi podobieństwem w budowie ich lipopolisacharydów. Jak wykazały badania przeprowadzone przy użyciu oczyszczonych frakcji LPS i przeciwciał monoklonalnych około 1/3 wszystkich przeciwciał powstających dla LPS jest skierowana dla lipidu A. Ponieważ lipid A pałeczek Yersinia podobny jest do lipidu występującego u różnych pałeczek jelitowych, przeciwciała dla drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae reagują krzyżowo z antygenem LPS pałeczek Yersinia. Reakcje krzyżowe pomiędzy przeciwciałami dla drobnoustrojów nie należących do rodziny Enterobacteriaceae a antygenami pałeczek Yersinia były szczegółowo analizowane przez Rawlins i wsp. (19). Najczęściej, bo aż w 45%, nieswoiste reakcje występowały pomiędzy białkami Yop a immunoglobulinami M dla antygenów B. burgdorferi. Według autorów, tak liczne reakcje krzyżowe spowodowane są podobieństwem antygenowym pomiędzy białkami OspC i Fla B. burgdorferi i białkiem YopD pałeczek Yersinia. W piśmiennictwie spotkać się można również z innymi doniesieniami dotyczącymi występowania reakcji krzyżowych pomiędzy antygenami pałeczek Yersinia a przeciwciałami dla Borrelia burgdorferi. W badaniach prowadzonych przez Sobieszczańską i Przondo-Mordarską (22) u 66,6% badanych osób z objawami reaktywnego zapalenia stawów wykryto przeciwciała dla B. burgdorferi. U 10% osób z tej grupy wykryto przeciwciała dla pałeczek Yersinia odczynem aglutynacji probówkowej. Występujące reakcje krzyżowe, według tych autorek, spowodowane są podobieństwem antygenowym białka o masie 60 kda B. burgdorferi do białek pałeczek Yersinia. W badaniach własnych, przeprowadzonych na etapie optymalizacji parametrów odczynu ELISA, poszukiwano przeciwciał dla somatycznych antygenów pałeczek Yersinia jak i dla białek Yop u osób z tularemią, chlamydiozą, bartonelozą, mykoplazmozą i krzuścem. U osób tych przeciwciała dla antygenów pałeczek Yersinia wykrywano sporadycznie (dane nieopublikowane). W prezentowanej pracy swoistych przeciwciał dla antygenów pałeczek Yersinia poszukiwano odczynem ELISA u 30 osób z boreliozą. W próbkach surowicy uzyskanych od tych osób potwierdzono we wcześniejszych rutynowych badaniach wysoki poziom przeciwciał dla B. burgdorferi. U osób z boreliozą przeciwciała dla somatycznych
Nr 1 Humoralna odpowiedź w jersiniozie 35 antygenów pałeczek Yersinia stwierdzano u 20% osób natomiast przeciwciała dla białek Yop u 10%. Ponieważ przeciwciał tych nie wykrywano u osób z boreliozą statystycznie istotnie częściej niż u osób zdrowych trudno jednoznacznie stwierdzić czy wyniki te były spowodowane reakcjami krzyżowymi czy też osoby z boreliozą miały przeciwciała swoiste dla antygenów pałeczek Yersinia. Częste występowanie przeciwciał dla pałeczek Yersinia zaobserwowano również u osób z nadczynnością tarczycy, występującą zwłaszcza w chorobie Gravesa-Basedowa (1, 2, 6) Zjawisko to jest prawdopodobnie spowodowane reakcjami krzyżowymi pomiędzy swoistymi przeciwciałami dla pałeczek Y. enterocolitica i epitelialnymi komórkami tarczycy. Wykazano również, że w błonie zewnętrznej ściany komórkowej pałeczek Y. enterocolitica znajdują się dwa białka o masie cząsteczkowej 5,5 kda i 8 kda posiadające epitopy identyczne do tych znajdujących się w receptorach TSHR tkanki tarczycowej dla tyreotropiny, które reagowały z immunoglobulinami osób chorych na chorobę Graves`a (11). Ostatnio, Gangi i wsp. (8) sklonowali lipoproteinę pałeczek Y. enterocolitica, która podana myszom indukowała powstawanie u nich przeciwciał reagujących krzyżowo w odczynie westernimmunoblotting z receptorami TSHR. W przedstawionych badaniach własnych nie potwierdzono tak częstego jak w badaniach innych autorów występowania przeciwciał dla antygenów pałeczek Yersinia u osób z chorobą Gravesa-Basedowa pomimo, że do badań przeznaczono grupę 60 osób z dobrze udokumentowaną klinicznie i laboratoryjnie nadczynnością tarczycy. Wydaje się, że obserwowane w badaniach własnych i innych autorów różnice w częstości wykrywania przeciwciał dla antygenów Yersinia u osób z chorobą Gravesa-Basedowa mogą wynikać między innymi z przyjmowanego kryterium uznawania wyników badań za dodatnie. W. Rastawicki HUMORAL RESPONSE TO SELECTED ANTIGENS OF YERSINIA ENTEROCOLITICA AND YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS IN THE COURSE OF YERSINIOSIS IN HUMANS. IV. SPECIFICITY OF ANTIGENS SUMMARY The specificity of the lipopolisacharydes and released proteins (Yop) of Yersinia was tested using the sera of rabbits immunised with pathogenic and non-pathogenic strain of Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis as well as selected sera of patients. The results of this study showed a crossreactions between the different serotypes of Y. enterocolitica with the strongest reactions between the pathogenic serotypes O:3 and O:9 and pathogenic serotype O:5,27 and non-pathogenic serotype O:5. Sera positive for B. burgdorferi and from patients with Graves disease showed a slight cross-reactivity with Yop proteins of Yersinia. However, the higher cross-reactivity was observed between the LPS of Yersinia and Salmonella spp. Due to the evidence of cross-reactivity the results of serological investigations should be interpreted with caution. PIŚMIENNICTWO 1. Arscott P, Rosen ED, Koenig RJ i inni. Immunoreactivity to Yersinia enterocolitica antigens in patients with autoimmune thyroid disease. J Clin Endocrinol Metab 1992; 75: 295-300.
36 W. Rastawicki Nr 1 2. Bech K, Larsen JH, Hansen JM, Nerup J. Yersinia enterocolitica infection and thyroid disorders. Lancet 1974 ii: 951-2. 3. Bitzan M, Häck HJ, Mauff G. Yersinia enterocolitica serodiagnosis: a dual role of specific IgA. Evaluation of microagglutination and ELISA. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A] 1987; 267: 194-205. 4. Burnens AP, Frey A, Nicolet J. Association between clinical presentation, biogroups and virulence attributes of Yersinia enterocolitica strains in human diarrhoeal disease. Epidemiol Infect 1996; 116: 27-34. 5. Chart H, Cheasty T, Cope D i inni. The serological relationship between Yersinia enterocolitica O9 and Escherichia coli O157 using sera from patients with yersiniosis and haemolytic uraemic syndrome. Epidemiol Infect 1991; 107: 349-56. 6. Corapcioglu D, Tonyukuk V, Kiyan M i inni. Relationship between thyroid autoimmunity and Yersinia enterocolitica antibodies. Thyroid 2002; 12: 613-7. 7. Corbel MJ. The relationship between the protective and cross-reacting antigens of Brucella spp., Yersinia enterocolitica O:9 and Salmonella serotypes of Kauffman-White group N. Contrib Microbiol Immunol 1979; 5: 50-63. 8. Gangi E, Kapatral V, El-Azami i inni. Characterization of a recombinant Yersinia enterocolitica lipoprotein; implications for its role in autoimmune response against thyrotropin receptor. Autoimmunity 2004; 37: 515-20. 9 Granfors K. Measurement of immunoglobulin M (IgM), IgG, and IgA antibodies against Yersinia enterocolitica by enzyme-linked immunosorbent assay: persistence of serum antibodies during disease. J Clin Microbiol 1979; 9: 336-41 10. Heesemann J, Gross U, Schmidt N, Laufs R Immunochemical analysis of plasmid-encoded proteins released by enteropathogenic Yersinia sp. Grown in calcium-deficient media. Infect Immun 1986; 54: 561-7. 11. Heyman P, Harrison LC, Robins-Browne R. Thyrotropin (TSH) binding sites on Yersinia enterocolitica recognized by immunoglobulins from humans with Grave`s disease. Clin Exp Immunol 1986; 64: 249-54. 12. Kałużewski S. Przeciwciała dla antygenu wspólnego pałeczkom Enterobacteriaceae (CA Kunina) w surowicach ludzkich. Med Dośw Mikrobiol 1974; 26: 27-43. 13.. Kałużewski S, Połowniak-Pracka H, Szych J, Zaleska M. Występowanie i poziom przeciwciał dla O antygenów Y. enterocolitica wykrywanych u wybranych grup ludzi odczynem hemaglutynacji biernej. Med Dośw Mikrobiol 1985; 37: 147-64. 14.. Navarro A, Eslava C, Hernandez U i inni. Antibody responses to Escherichia coli O157 and other lipopolysaccharides in healthy children and adults. Clin Diagn Lab Immunol 2003; 10: 797-801. 15. Nielsen K, Smith P, Widdison J i inni. Serological relationship between cattle exposed to Brucella abortus, Yersinia enterocolitica O:9 and Escherichia coli O157:H7. Vet Microbiol 2004; 20: 25-30. 16. Paerregaard A, Espersen F, Hoiby N. Cross-reactions between Yersinia enterocolitica serogroup O:3 and other serogroups of the same species, as well as thirty-four other bacterial species. APMIS 1988; 96: 315-24. 17. Rastawicki W, Jagielski M, Gierczyński R i inni. Udział pałeczek z rodzaju Salmonella i Yersinia w patogenezie zapalenia stawów ze szczególnym uwzględnieniem spondyloartropatii i reumatoidalnego zapalenia stawów. II. Występowanie przeciwciał dla pałeczek Salmonella i Yersinia w surowicy i płynie stawowym osób z zapaleniem stawów. Med Dośw Mikrobiol 2005; 57: 143-51. 18. Rastawicki W, Kałużewski S, Jagielski M, Gierczyński R. Porównanie przydatności testu ELISA opracowanego we własnym zakresie i komercyjnego testu ELISA firmy Mikrogen do serologicznej
Nr 1 Humoralna odpowiedź w jersiniozie 37 diagnostyki zakażeń wywoływanych przez pałeczki z rodzaju Yersinia. Med. Dośw Mikrobiol 2001; 53: 357-62. 19. Rawlins ML, Gerstner C, Hill HR, Litwin CM. Evaluation of a Western Blot Method for the detection of Yersinia antibodies: evidence of serological cross-reactivity between Yersinia outer membrane proteins and Borrelia burgdorferi. Clin Diagn Lab Immunol 2005; 12: 1269-74. 20. Schlesinger M, Pollack S, Vardy PA. Cross-antigenicity between Yersinia and Rickettsia. Isr J Med Sci 1979; 15: 612-3. 21. Schoerner C, Wartenberg K, Röllinghoff M. Differentiation of serological responses to Yersinia enterocolitica serotype O9 and Brucella species by immunoblot or enzyme-linked immunosorbent assay using whole bacteria and Yersinia outer membrane proteins. J Clin Microbiol 1990; 28: 1570-4. 22. Sobieszczańska B, Przondo-Mordarska A. Cross-reactivity between Borrelia burgdorferi and arthrogenic bacteria in sera from patients with reactive arthritis. Rocz Akad Med Białymst 1996; 41: 90-5. 23. Thomas LV, Gross RJ, Cheasty T i inni. Antigenic relationships among type strains of Yersinia enterocolitica and those of Escherichia coli, Salmonella spp., and Shigella spp. J Clin Microbiol 1983; 17: 109-11. 24. Velin D, Rauss K. Antigenic relationship between Morganella morganii and Yersinia enterocolitica. Acta Microbiol Acad Sci Hungr 1976; 23: 83-7. Otrzymano: 4 II 2008 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie e-mail: wrastawicki@pzh.gov.pl