Edyta Simońska 1, Janusz Gumprecht 1, Helena Sławska 2, Anna Oslizlo 2, Władysław Grzeszczak 1 PRACA ORYGINALNA 1 Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Diabetologii i Nefrologii Śląskiej Akademii Medycznej w Zabrzu, 2 Katedra i Klinika Ginekologii i Położnictwa Śląskiej Akademii Medycznej w Zabrzu Związek polimorfizmu genu kodującego substrat-1 receptora insuliny z obniżeniem urodzeniowej masy ciała donoszonych noworodków doniesienia wstępne Relationship between the polymorphism in insulin receptor substrat-1 and the reduction birth weight in newborns at term preliminary communication Abstract Background. The mutation of the IRS-1 gene is one of the genetic risk factor which is suspected of inducing an insulin resistance or predisposing to type 2 diabetes. The Gly972Arg polymorphism in insulin receptor substrate-1 is associated with a significant impairment of insulin signaling and may induce abnormalities in pancreatic beta-cells. That polymorphism could also influence IGF-1 function. A reduction in IGF-1 insulin signaling and also in insulin secretion may contribute to the reduced birth weight. The purpose of this study was analyze whether this polymorphism is associated with decreased birth weight. Material and methods. We studied 100 newborn children with adequate gestational age (38 42 weeks), whose mother had no disorders. The genomic DNA was extracted from umbilical cord blood leukocytes by standard techniques. The product of amplification was digested with the restriction enzyme. The next stage was run in agarose gel and visualization in UV. The newborn were divided in three groups: 1 homozygote GG, 2 homozygote AA, 3 heterozygote GA. Results. Genotype frequencies were: GG 84%, GA 15%, AA 1%. The data showed that birth weight was significantly lower in the newborn with the IRS-1 Gly972Arg compared with control group (3161.75 g ± 380.86 vs. 3427.92 g ± 468.86). The birth length and head circumference were also lower in the newborns with that polymorphism (54.38 cm ± 3.13 vs. 52.69 cm ± 2.91 and 34.08 cm ± ± 1.47 vs. 33.63 cm ± 0.81). There were not significant difference between groups in gestational ages, mother ages, mother height and BMI. The multifactorial analysis showed the significant, independent influence of that polymorphism on birth weight. The results suggest that the genotype Gly972Arg leads to decreasing birth weight, length and head circumference in children born in adequate gestational age. The occurrence of this polymorphism is significant, independent risk factor of lower birth weight. key words: IRS-1, Gly972Arg, birth weight, type 2 diabetes Wstęp Adres do korespondencji: prof. dr hab. med. Janusz Gumprecht Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Diabetologii i Nefrologii Śl. AM ul. 3 Maja 13/15, 41 800 Zabrze tel.: +49 (32) 271 25 11, faks: +48 (32) 271 46 17 e-mail: jgumprecht@slam.katowice.pl Diabetologia Doświadczalna i Kliniczna 2004, 4, 6, 451 455 Copyright 2004 Via Medica, ISSN 1643 3165 W ostatnich latach coraz większą uwagę zwraca się na predyspozycje genetyczne do rozwoju cukrzycy. Szybki rozwój technik biologii molekularnej, stosującej coraz bardziej wysublimowane metody analizy DNA w badaniu patogenezy chorób człowieka, stwarza nowe możliwości oceny genetycznego uwarunkowania różnych chorób. Dość dobrze udokumentowano związek zarówno cukrzycy typu 1, jak i typu 2 z podłożem genetycz- www.ddk.viamedica.pl 451
Diabetologia Doświadczalna i Kliniczna rok 2004, tom 4, nr 6 nym. Wciąż poszukuje się genów-kandydatów oraz przeprowadza się analizę odcinków DNA zawierających badane geny w celu poszukiwania podłoża genetycznego samej choroby oraz towarzyszących jej powikłań naczyniowych o typie mikro- i makroangiopatii. Badania te mają na celu m.in. określenie przyczyny insulinooporności, a także patogenezy niedoboru insuliny wynikającej z zaburzeń czynności komórki b wysp trzustki. Czynniki te, oprócz wpływu na upośledzenie wydzielania insuliny lub/i rozwój insulinooporności, mogą również zmieniać wewnątrzmaciczny wzrost płodu oraz tolerancję glukozy w dorosłym życiu człowieka [1]. Jednym z takich czynników jest gen glukokinazy. Stwierdzono bowiem, iż mutacje w jego obrębie powodują redukcję urodzeniowej masy ciała i wpływają na wydzielanie insuliny u płodu, a ostatecznie prowadzą do rozwoju cukrzycy typu MODY 2 [2]. Zmniejszenie urodzeniowej masy ciała, które powodują niekorzystne warunki wewnątrzmaciczne lub specyficzna podatność genetyczna, wiąże się z występowaniem insulinooporności i ryzykiem rozwoju cukrzycy typu 2 [3, 4]. Innym czynnikiem genetycznym mogącym powodować insulinooporność lub przyczyniać się do rozwoju cukrzycy typu 2 jest mutacja genu dla substratu-1 receptora insuliny (IRS-1, insulin receptor substrate 1). Opisuje się ponad 10 polimorfizmów genu dla IRS-1, a wśród nich najbardziej powszechny glyæ972æarg. Zmiana ta jest wynikiem zastąpienia guaniny przez adeninę w łańcuchu DNA (GGGÆAGG). Polimorfizm ten występuje u osób z cechami insulinooporności związanymi lub niezwiązanymi z cukrzycą typu 2 oraz powoduje nieprawidłowości w obrębie wysp trzustkowych, takie jak: zmiana wydzielania insuliny, mniejsza zawartość insuliny w ziarnistościach oraz występowanie większej liczby niedojrzałych ziarnistości wydzielniczych [5]. Powyższy polimorfizm badano u chorych na cukrzycę typu 2, a także w populacji osób zdrowych należących do różnych grup etnicznych. W przypadku jego obecności stwierdzono większą zachorowalność na cukrzycę typu 2 niż u osób z grupy kontrolnej [6 10]. Substrat-1 receptora insuliny jest również substratem dla receptora insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-1, insulin-like growth factor), polimorfizm Gly972Arg powoduje nieprawidłowe działanie IGF-1 oraz zmniejszenie natężenia sygnału insuliny i obniżenie jej sekrecji. W rezultacie prowadzi to do redukcji urodzeniowej masy ciała u noworodków, u których polimorfizm ten występuje. Cel pracy Celem pracy była ocena, czy istnieje związek między obecnością polimorfizmu gly972arg genu dla IRS-1 a zmniejszeniem urodzeniowej masy ciała. Materiał i metody Badaniem objęto 100 zdrowych noworodków, urodzonych między 38. a 42. tygodniem ciąży przez zdrowe matki w Klinice Ginekologii i Położnictwa w Zabrzu. Matki noworodków włączonych do badania nie chorowały na nadciśnienie tętnicze, cukrzycę ciężarnych, nie stwierdzono u nich upośledzonej tolerancji glukozy, nie były otyłe [przed ciążą wskaźnik masy ciała (BMI, body mass index) wynosił u nich poniżej 30]. Kobiety nie paliły tytoniu podczas ciąży. Bezpośrednio po urodzeniu od noworodków pobierano 10 ml krwi pępowinowej na EDTA. Pozostałe dane, takie jak płeć, masa ciała, długość ciała oraz obwód głowy noworodków, zebrano na podstawie dokumentacji medycznej po narodzinach dzieci. Z krwi pępowinowej izolowano DNA, a następnie namnażano fragment 198 par zasad obejmujący polimorficzne miejsce, korzystając z metody polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR, polymerase chain reaction), po czym produkt PCR trawiono enzymem Eco 881 (Aval). Enzym ten rozpoznawał sekwencję 5...CØ(C/T)CG(A/G)G...3. Kolejnym etapem była elektroforeza produktów trawienia na żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny i wizualizacja w świetle UV. Długość prążków szacowano, wykorzystując wzorzec, jakim był DNA molecular weigth marker XIII firmy Roche. Obliczenia statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu statystycznego SPSS for Windows Student Version wersja 6.0.1 oraz programu Microsoft Excel 2000. Badane noworodki podzielono według genotypów na 3 grupy: GA, AA, GG. W celu weryfikacji hipotez o jednakowym rozkładzie poszczególnych cech we wszystkich grupach noworodków przeprowadzono test zgodności Kołmogorowa-Smirnowa. Obliczone wyniki podano w postaci średniej ± odchylenie standardowe (SD, standard deviation). W analizie genotypów badanego polimorfizmu zastosowano test istotności U. Przeprowadzono również analizę wieloczynnikową, uwzględniając badany polimorfizm, wiek matki, masę ciała i wzrost matki, wskaźnik masy ciała matki oraz płeć noworodków. Jako istotną statystycznie przyjęto wartość p < 0,05. Wyniki Charakterystykę kliniczną badanej grupy przedstawiono w tabeli 1. W tabeli 2 wyszczególniono podgrupy noworodków, podzielone według genotypów: podgrupa 1 GG i podgrupa 2 GA z AA łącznie. Częstość poszczególnych genotypów była następująca: GG 84%, AA 1%, GA 15%. Uzyskane wyniki były podobne do wcześniejszych, pochodzących z populacji kontrolnych: Wielkiej Brytanii [9,11], Danii [12], Finlandii [13] i Stanów Zjednoczonych [14]. 452 www.ddk.viamedica.pl
Edyta Simońska i wsp. Polimorfizm IRS-1 a urodzeniowa masa ciała u donoszonych noworodków Tabela 1. Ogólna charakterystyka badanej grupy Table 1. Characteristics of the study population Grupa badana n = 100 Wiek matki 26,99 ± 4,69* Masa ciała matki przed ciążą [kg] 59,79 ± 9,85 Wzrost matki [cm] 1,66 ± 0,06 Wskaźnik masy ciała przed ciążą 21,79 ± 3,41 Tydzień ciąży 39,12 ± 0,88 Kolejność ciąży 1,94 ± 1,41 Płeć noworodka M/K 56/44 Masa noworodka [g] 3385 ± 464,65 Długość ciała noworodka [cm] 54,11 ± 3,15 Obwód głowy noworodka [cm] 34,01 ± 1,40 *X ± SD Wykazano, iż urodzeniowa masa ciała była istotnie niższa w grupie noworodków nosicieli allelu A (genotyp GA i AA) i wynosiła 3161,75 g ± 380,86; w grupie kontrolnej (genotyp GG): 3427,92 g ± 468,86. Podobny związek badanego polimorfizmu wykazano, porównując długość ciała noworodków (54,38 cm ± 3,13 vs. 52,69 cm ± 2,91) oraz obwód głowy (34,08 cm ± 1,47 vs. 33,63 cm ± 0,81). Nie stwierdzono istotnych różnic pod względem wieku ciążowego, wieku i wzrostu matek, BMI w obu podgrupach. Porównując masę ciała matek przez ciążą, wykazano, że średnia masa w grupie matek, których dzieci były nosicielami allelu A (genotypy GA i AA), była niższa i wynosiła 57,69 kg ± 7,43 w porównaniu z 60,19 kg ± 10,24 w grupie kontrolnej. Różnica ta była bliska istotności statystycznej i wynosiła p = 0,06. W analizie wieloczynnikowej, uwzględniając badany polimorfizm, wiek matki, masę ciała, jej wzrost i BMI oraz płeć noworodków, wykazano istotny, niezależny wpływ nosicielstwa allelu A (genotypy GA i AA) badanego polimorfizmu Gly972Arg na masę ciała noworodków przy urodzeniu. Dyskusja Substrat-1 receptora insuliny jest białkiem, którego gen zlokalizowany jest na chromosomie 2q 36. Stanowi on główny cel dla zaktywowanego receptora insuliny. Jego fosforylacja inicjuje reakcje wewnątrzkomórkowe, prowadzące do przemian metabolicznych, charakterystycznych dla działania insuliny oraz dla procesów komórkowych, które pobudzają mitogenezę [15, 16]. Obecność polimorfizmu Gly972Arg prowadzi do zaburzenia ścieżki sygnałowej insuliny, obniżenia jej sekrecji i rozwoju obwodowej insulinooporności. Znaczenie IRS-1 badano u myszy z wyłączonym genem dla IRS-1 (knockout gene IRS-1 mice). Stwierdzono, iż rozwinęła się u nich nieprawidłowa tolerancja glukozy, nastąpiło obniżenie wychwytu glukozy stymulowanego insuliną oraz o 50% zmniejszył się wewnątrzmaciczny wzrostu płodu [17]. Wyniki niniejszego badania wskazują, iż obecność allelu A badanego polimorfizmu, prowadząca do redukcji masy ciała przy urodzeniu, długości ciała i obwodu głowy, wynika ze zmiany czynności IRS-1. Ponadto, IRS-1, będąc substratem dla IGF-1, powoduje zmianę jego działania i również może przyczyniać się do zmniejszenia urodzeniowej masy ciała, obserwowanej u dzieci z allelem A. Na podstawie przeprowadzonej w 2003 roku metaanalizy, obejmującej wszystkie dostępne dane dotyczące opisywanego polimorfizmu wykazano, że nosicielstwo allelu A wariantu genu dla IRS-1 zwiększa aż o 25% ryzyko rozwoju cukrzycy typu 2 w porównaniu z grupą kontrolną, w której nie było nosicieli tego allelu [18]. Badania te sugerują, iż powyższą zmianę sekwencji można traktować jako czynnik ryzyka, predysponujący do wystąpienia cukrzycy typu 2. W ostatnich latach Mason i wsp. przeprowadzili podobne badania wśród populacji noworodków Wielkiej Brytanii [19], podobnie Rasmussen i wsp. populacji młodych Duńczyków [4]. Nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy między obecnością 972Arg wariantu genu IRS-1 a zmniejszeniem urodzeniowej masy ciała. Z kolei z badania noworodków populacji brazylijskiej wynika, że obecność polimorfizmu Gly972Arg genu dla IRS-1 wiąże się z niższą urodzeniową masą ciała w porównaniu z grupą kontrolną [20]. Prawdopodobnie wynika to z upośledzenia wewnątrzmacicznego wzrostu płodu spowodowanego działaniem insuliny Tabela 2. Podział na poszczególne podgrupy według genotypów Table 2. Distribution to particular subgroups according to genotypes Genotyp IRS-1 Genotyp IRS-1 p GG GA i AA n 84 16 Płeć M/K 45/39 11/5 Masa noworodka [g] 3427,92 ± 468,86* 3161,75 ± 380,86 0,00 Długość ciała noworodka [cm] 54,38 ± 3,13 52,69 ± 2,91 0,01 Obwód głowy noworodka [cm] 34,08 ± 1,47 33,63 ± 0,81 0,02 *X ± SD; IRS-1 (insulin receptor substrate 1) substrat-1 receptora insuliny www.ddk.viamedica.pl 453
Diabetologia Doświadczalna i Kliniczna rok 2004, tom 4, nr 6 jako mediatora. Na uwagę zasługuje fakt, że chociaż wzrost płodu zależy od czynników genetycznych, to mogą go zmieniać liczne czynniki środowiskowe głównie matczyne. W niniejszym badaniu, podobnie jak w badaniu populacji Brazylijczyków, wykluczono potencjalne czynniki matczyne modyfikujące masę urodzeniową, ponadto w badaniach nie uczestniczyły noworodki urodzone przedwcześnie i po terminie. W populacji angielskiej i duńskiej nie wyłączono z badań matek chorujących na nadciśnienie tętnicze, palących tytoń podczas ciąży oraz kobiet z zaburzeniami gospodarki węglowodanowej. Zatem nie wyeliminowano istotnych czynników matczynych, zmieniających wzrost płodu. Podsumowując, wyniki niniejszej pracy potwierdzają fakt, iż genetycznie uwarunkowana insulinooporność i zmniejszone wydzielanie insuliny prowadzą do zależnego od insuliny, nieprawidłowego wewnątrzmacicznego wzrostu płodu. Wnioski Istnieje związek między obecnością polimorfizmu gly972arg genu kodującego IRS-1 a istotną statystycznie niższą urodzeniową masą ciała, długością ciała oraz obwodem głowy noworodków. Obecność badanego polimorfizmu Gly972Arg jest istotnym, niezależnym czynnikiem ryzyka niższej urodzeniowej masy ciała. Streszczenie Wstęp. Przypuszcza się, że jednym z czynników genetycznych, które mogą powodować insulinooporność lub przyczyniać się do rozwoju cukrzycy typu 2, jest mutacja genu dla substratu-1 receptora insuliny (IRS-1). Polimorfizm Gly972Arg genu dla IRS-1 występuje u osób z cechami insulinooporności związanymi lub niezwiązanymi z cukrzycą typu 2 oraz powoduje nieprawidłowości w obrębie wysp trzustkowych. Ponadto wpływa na nieprawidłowe działanie insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-1) oraz zmniejszenie natężenia sygnału insuliny i obniżenie jej sekrecji, co w rezultacie może prowadzić do redukcji urodzeniowej masy ciała u noworodków. Celem pracy była ocena, czy istnieje związek między obecnością polimorfizmu Gly972Arg genu dla IRS-1 a zmniejszeniem urodzeniowej masy ciała. Materiał i metody. Badaniem objęto 100 zdrowych noworodków, urodzonych między 38. a 42. tygodniem ciąży przez zdrowe matki. Po urodzeniu od noworodków pobierano 10 ml krwi pępowinowej, z której izolowano DNA, a następnie namnażano fragment obejmujący polimorficzne miejsce, stosując metodę polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR). Kolejnym etapem była elektroforeza produktów trawienia na żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny i wizualizacja w świetle UV. Badane noworodki podzielono według genotypów na 3 grupy: GA, AA, GG. Wyniki. Częstość poszczególnych genotypów była następująca: GG 84%, AA 1%, GA 15%. Wykazano, iż urodzeniowa masa ciała była istotnie niższa w grupie noworodków nosicieli allelu A i wynosiła 3161,75 g ± 380,86; w grupie kontrolnej: 3427,92 g ± 468,86. Porównując długość ciała noworodków (54,38 cm ± 3,13 vs. 52,69 cm ± 2,91) oraz obwód głowy (34,08 cm ± 1,47 vs. 33,63 cm ± 0,81), uzyskano podobną zależność (p < 0,05). Nie wykazano istotnych różnic pod względem wieku ciążowego, wieku i wzrostu matek, wskaźnika masy ciała (BMI) w obu podgrupach. Wnioski. W analizie wieloczynnikowej wykazano istotny, niezależny wpływ nosicielstwa allelu A badanego polimorfizmu Gly972Arg na urodzeniową masę ciała noworodków. Istnieje związek między obecnością badanego polimorfizmu genu dla IRS-1 a istotnie statystyczną niższą urodzeniową masą ciała, długością ciała oraz obwodem głowy noworodków. Występowanie badanego polimorfizmu jest istotnym, niezależnym czynnikiem ryzyka niższej urodzeniowej masy ciała. słowa kluczowe: IRS-1, Gly972Arg, urodzeniowa masa ciała, cukrzyca typu 2 Piśmiennictwo 1. Lithell H.O., McKeigue P.M., Berglund L., Mohsen R., Lithell U.B., Leon D.A. Relation of size at birth to non-insulin dependent diabetes and insulin concentrations in men aged 50 60 years. Br. Med. J. 1996; 312: 406 410. 2. Hattersley A.T., Tooke J.E. The fetal insulin hypothesis: an alternative explanation of the association of low birth weight with diabetes and vascular disease. Lancet 1999; 353: 1789 1792. 3. Hales C.N., Barker D.J.P., Clark P.M.S. i wsp. Fetal and infant growth and impaired glucose tolerant at age 64. Br. Med. J. 1991; 303: 1019 1022. 4. Rasmussen S.K., Urhammer S.A., Hansen T. Variability of the insulin receptor substrate-1, hepatocyte nuclear factor-1 a (HNF-1 a), HNF-4 a, and HNF-6 genes and size at birth in a population-based sample of young Danish subject. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000; 85: 2951 2952. 5. Marchetti P., Lupi R., Federici M. i wsp. Insulin secretory function is impaired in isolated human islets carrying the GlyÆ972ÆArg IRS-1 polymorphism. Diabetes 2002; 51: 1419 1424. 6. Almind K., Bjørbaek C., Vestergaard H., Hansen T., Echwald S., Pedersen O. Amino acid polymorphisms of insulin receptor substrate-1 in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Lancet 1993; 342: 828 832. 7. Imai Y., Fusco A., Suzuki Y. Variant sequences of insulin receptor substrate-1 in patient with non-insulin-dependent diabetes mellitus. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1994; 79: 1655 1658. 8. Hitman G.A., Hawrami K., McCarthy M.I. i wsp. Insulin receptor substrate-1 gene mutations in NIDDM, implications for the study of polygenic disease. Diabetologia 1995; 38: 481 486. 9. Zhang Y., Wat N., Stratton I.M. i wsp. UKPDS 19: Heterogeneity in NIDDM: separate contributions of IRS-1 and a-3 adrenergic receptor mutations to insulin resistance and obesity respectively with no evidence for glycogen synthase gene mutations. Diabetologia 1996; 39: 1505 1511. 10. Ura S., Araki E., Kishikawa H. i wsp. Molecular scanning of the insulin receptor subtrate-1 (IRS-1) gene in Japanese patients with NIDDM: identification of five novel polymorphisms. Diabetologia 1996; 39: 600 608. 454 www.ddk.viamedica.pl
Edyta Simońska i wsp. Polimorfizm IRS-1 a urodzeniowa masa ciała u donoszonych noworodków 11. Almind K., Inoue G., Pederson O., Kahn R. A common amino acid polymorphism in insulin receptor substrat-1 causes impaired insulin signaling. J. Clin. Invest. 1996; 97: 2569 2575. 12. Hribal M.L., Federici M., Porzio O. The GlyÆ972ÆArg amino acid polymorphism in insulin receptor substrat-1 affects glucose metabolism in skeletal muscle cells. J. Clin. Endocrinol. Metabol. 2000; 85: 2004 2013. 13. Reichelt A.J., Spichler E.R., Branchtein L., Nucci L.B., Franco L.J., Schmidt M.I. Fasting plasma glucose is useful test for the detection of gestional diabetes. Diabetes Care 1998; 21: 1246 1249. 14. World Health Organization Prevention of Diabetes Mellitus: Report of WHO Study Group. World Health Organization, Geneva 1994. 15. Saad M.J.A., Araki E., Miralpeix M., Rothenberg P.L., White M.F., Kahn C.R. Regulation of insulin receptor substrat-1 in liver and muscle of animal models of insulin resistance. J. Clin. Invest. 1992; 90: 1839 1849. 16. Defronzo R.A. Pathogenesis of type 2 diabetes: metabolic and molecular implications for identifying diabetes gene. Diabetes Rev. 1997; 5: 177 269. 17. Tamemoto H., Kadowaki T., Tobe K. i wsp. Insulin resistance and growth retardation in mice lacking insulin receptor substrat-1. Nature 1994; 372: 182 186. 18. Jellema A., Zeegers M.P.A., Feskens E.J.M., Dagnelie P.C., Mensink R.P. Gly972Arg variant in the insulin receptor substrate-1 gene and association with type 2 diabetes: a metaanalysis of 27 studies. Diabetologia 2003; 46: 990 995. 19. Mason S., Ong K.K.L., Pembrey M.E. The ALSPAC Study Team, Woods K.A., Dunger D.B. The Gly972Arg variant in insulin receptor substrate-1 is not associated with birth weight in contemporary English children. Diabetologia 2000; 43: 1201 1203. 20. Bezerra R., De Casto V., Sales T. i wsp. The Gly972Arg polymorphism in insulin receptor substrate-1 is associated with decreased birth weight in a population-based sample of Brazilian newborns. Diabetes Care 2002; 25: 550 553. www.ddk.viamedica.pl 455