CINtec PLUS Cytology Kit

CINtec PLUS Cytology Kit 605-100 06889565001 PRZEZNACZENIE 100 Rysunek 1. Komórka nabłonka szyjki macicy wykazująca ekspresję białka p16 INK4a (brązowe zabarwienie cytoplazmy) i białka Ki-67 (czerwone zabarwienie jądrowe) Zestaw CINtec PLUS Cytology Kit jest testem immunocytochemicznym do jednoczesnego wykrywania jakościowego białek p16 INK4a i Ki-67 w preparatach z badania cytologicznego szyjki macicy. Wskazane jest stosowanie go do wspomagania diagnostyki zaawansowanych zmian śródbłonkowych szyjki macicy u kobiet z populacji badanej i w podgrupach pacjentek z wynikiem cytologii ASC-US (atypowe komórki nabłonka płaskiego o nieokreślonej istotności klinicznej) lub LSIL (śródnabłonkowe zmiany dysplastyczne małego stopnia), lub z dodatnimi wynikami badań na obecność wirusa HPV wysokiego ryzyka. Wyniki testów mogą być interpretowane wyłącznie przez osoby wykwalifikowane, w połączeniu z historią choroby pacjentki i innymi przeprowadzonymi badaniami diagnostycznymi. Produkt jest przeznaczony do stosowania w diagnostyce in vitro (IVD). PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIA W komórkach eukariotycznych kontrola postępu cyklu komórkowego jest regulowana za pomocą złożonego systemu kontrolowanej ekspresji i modyfikacji potranslacyjnych białek odpowiedzialnych za regulację cyklu komórkowego. Białko p16 INK4a odgrywa bardzo istotną rolę w mechanizmie regulacji cyklu komórkowego u eukariontów. Stanowi element kontroli przejścia komórki z fazy G1 do S za pośrednictwem białka retinoblastoma (prb) i hamuje postęp cyklu komórkowego w procesie różnicowania się komórek. Białko p16 INK4a przeciwdziała więc podziałom komórek podczas postępu prawidłowego cyklu komórkowego. W ostatecznie zróżnicowanych komórkach nabłonka ekspresja białka p16 INK4a jest obniżona do poziomu zwykle niewykrywalnego metodami immunocytochemii [1]. Białko Ki-67 jest związane z namnażaniem komórek i może zostać wykryte wyłącznie w jądrach komórek namnażających się. Szczegółowe analizy cyklu komórkowego wykazały, że antygen białka Ki-67 jest obecny na wykrywalnym poziomie we wszystkich proliferacjach komórek (a także podczas mitozy), natomiast nie wykrywano jego ekspresji w komórkach w stanie spoczynku lub w fazie G0 [2]. Komórki, w których dochodzi do nadekspresji białka p16 INK4a mogą namnażać się aktywnie tylko, gdy ich mechanizmy regulacji cyklu komórkowego zostały zakłócone, tak więc jednoczesna ekspresja w tej samej komórce zarówno markera podziału komórkowego białka p16 INK4a, jak i markera namnażania się komórek, Ki-67, nie powinna być możliwa w warunkach fizjologicznych. Tym samym współistniejąca ekspresja białek p16 INK4a i Ki-67 w określonych komórkach może stanowić wskaźnik zaburzenia mechanizmów kontroli cyklu komórkowego w tychże komórkach. W przypadkach neoplazji szyjki macicy wykazano znaczącą nadekspresję białka p16 INK4a, która stanowi konsekwencję utraty funkcji prb, wywołanej onkoproteiną E7 różnych typów ludzkiego papillomawirusa (HR-HPV) wysokiego ryzyka [3;4]. Ponieważ czynnik E7 jest niezbędny do wytworzenia i utrzymania złośliwego fenotypu w związanych z HPV zmianach przedrakowych i rakowych, nadekspresja białka p16 INK4a jest bezpośrednio związana z onkogenną aktywnością różnych typów wirusa HR-HPV i stanowi proponowany zamienny marker infekcji onkogennym wirusem HPV [1;5]. Podczas licznych badań analizowano i wykazywano użyteczność kliniczną barwienia immunohistochemicznego [1;3;5;7;8;4;9;10] i immunocytochemicznego [5;11;12] próbek pobranych z szyjki macicy w celu wykrycia białka p16 INK4a. Łączna interpretacja preparatów barwionych w celu wykrycia białka p16 INK4a znacznie zwiększa spójność oceny prowadzonej przez różnych badaczy i dokładność diagnostyczną przy wykrywaniu zmian na poziomie CIN2 lub bardziej zaawansowanych w próbkach tkanki szyjki macicy, co zostało potwierdzone w różnych badaniach [6;10;12]. Wykazano, że barwienie immunocytochemiczne próbek pobranych z szyjki macicy pod kątem obecności białka p16 INK4a stanowi wartościowe narzędzie wspomagające klasyfikowanie przypadków, które uzyskały w badaniu cytologicznym wyniki ASC-US lub LSIL na poziomie czułości umożliwiającym stwierdzenie zmian CIN2 lub wyższego stopnia, podobnym do testów HPV, lecz o znacznie wyższej swoistości [12]. Ponadto wykrywanie białka p16 INK4a w próbkach cytologicznych może stanowić cenny marker wspomagający klasyfikację przypadków, w których wykryto infekcję HR-HPV w badaniach przesiewowych raka szyjki macicy [11;13]. Praktycznie we wszystkich przypadkach zmian śródnabłonkowych szyjki macicy wysokiego stopnia (tj. CIN2, CIN3 i wyższych) stwierdza się nadekspresję białka p16 INK4a [3;6;8]. Jako że wysoki odsetek komórek nabłonkowych w obrębie zmian CIN również aktywnie się dzieli, wykrycie komórek nabłonkowych szyjki macicy, w których dochodzi do jednoczesnej ekspresji białek p16 INK4a i Ki-67 może być wskaźnikiem statusu komórek po transformacji nowotworowej. Podsumowując, podejście bazujące na ocenie próbek cytologicznych pod kątem obecności poszczególnych komórek nabłonkowych z dodatnim wynikiem barwienia dla obu omawianych białek, p16 INK4a i Ki-67, jest metodą na wykrywanie zmian przednowotworowych i nowotworowych o dużej czułości i swoistości [14;15;16;17;18;19;20;21]. ZASADY POSTĘPOWANIA Zestaw CINtec PLUS Cytology Kit zawiera odczynniki do jednoczesnego immunocytochemicznego wykrywania białek p16 INK4a i Ki-67 w próbkach cytologicznych uzyskanych z szyjki macicy. Białka są wykrywane przy użyciu gotowej do użycia mieszaniny pierwszorzędowych przeciwciał monoklonalnych, w której skład wchodzi monoklonalne przeciwciało mysie skierowane przeciwko ludzkiemu białku p16 INK4a (klon E6H4 ) oraz pierwszorzędowe rekombinowane przeciwciało królicze skierowane przeciwko ludzkiemu białku Ki-67 (klon 274-11 AC3). Po zakończeniu kondycjonowania komórek, po inhibicji endogennej aktywności peroksydazy oraz po inkubacji z mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych podczas analizy wykorzystywane są dwa gotowe do użycia systemy detekcji zoptymalizowane do użytku w próbkach cytologicznych pobranych z szyjki macicy: kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko antygenom mysim związane kowalencyjnie z haptenami HQ (hapten zastrzeżony) oraz przeciwciało trzeciorzędowe skoniugowane z peroksydazą chrzanową (HRP), skierowane przeciwko haptenowi HP i zoptymalizowane do detekcji monoklonalnego przeciwciała mysiego, klon E6H4; kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko antygenom króliczym związane kowalencyjnie z haptenami NP (hapten zastrzeżony) oraz przeciwciało trzeciorzędowe skoniugowane z fosfatazą alkaliczną (AP), skierowane przeciwko haptenowi NP i zoptymalizowane do detekcji rekombinowanego przeciwciała króliczego, klon 274-11 AC3. Reakcja barwna polega na konwersji chromogenu DAB (tetrachlorowodorek 3,3 - diaminobenzydyny) z użyciem peroksydazy chrzanowej (HRP) oraz na konwersji barwnika Fast Red z użyciem fosfatazy alkalicznej (AP) z fosforanem naftolu, co powoduje powstanie brązowego osadu w miejscu występowania antygenu p16 INK4a i czerwonego osadu w miejscu występowania antygenu Ki-67. Po przeprowadzeniu automatycznego barwienia kontrastowego i barwienia barwnikiem niebieskim wykonywana jest dwuetapowa procedura zatapiania. Najpierw preparat jest zatapiany przy użyciu wodnego środka do zatapiania. Następnie preparat należy przykryć szkiełkiem nakrywkowym w postaci środka do trwałego zatapiania. Wyniki barwienia należy oceniać pod mikroskopem świetlnym. 2016-02-04 1 / 8 1012838PL Rev D

Komórka Osad DAB Rysunek 2. Detekcja ludzkiego białka p16 INK4a Czerwony osad HQ Linker Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko p16 E6H4 HQ HQ Docelowy antygen H2O2 DAB HRP Multimer Fosforan naftolu Fast Red CINtec PLUS Red Naphthol Phosphate zawiera fosforan naftolu (<1%) ze środkiem konserwującym ProClin 300. CINtec PLUS Fast Red zawiera barwnik Fast Red (<1%) w buforze octanowym z dodatkiem środka konserwującego ProClin 300. CINtec PLUS DAB Peroxidase Inhibitor zawiera roztwór nadtlenku wodoru (<5%). CINtec PLUS DAB anti-mouse HQ Linker zawiera kozie przeciwciało znakowane HQ i skierowane przeciwko IgG mysim (<40 µg/ml; HQ jest zastrzeżonym haptenem związanym kowalencyjnie z przeciwciałem kozim) w buforze zawierającym białko z dodatkiem środka konserwującego ProClin 300. CINtec PLUS DAB HRP Multimer zawiera monoklonalne mysie przeciwciała trzeciorzędowe HRP znakowane anty-hq (<10 µg/ml) w buforze zawierającym białko z dodatkiem środka konserwującego ProClin 300. CINtec PLUS DAB zawiera tetrachlorowodorek 3,3 - diaminobenzydyny (<1%) w zastrzeżonym roztworze stabilizującym z dodatkiem zastrzeżonego środka konserwującego. NP Linker Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko Ki-67 274-11 AC3 NP NP AP Multimer CINtec PLUS DAB H2O2 zawiera roztwór nadtlenku wodoru (<1%) w buforze fosforanowym. ODTWARZANIE, MIESZANIE, ROZCIEŃCZANIE, MIARECZKOWANIE Zestaw CINtec PLUS Cytology Kit jest zoptymalizowany pod kątem użycia w automatach do barwienia VENTANA BenchMark GX, XT i ULTRA. Nie jest wymagane odtwarzanie, mieszanie, rozcieńczanie ani miareczkowanie odczynników z zestawu. Stosowanie innych niż zalecane metod utrwalania i dalszego przetwarzania próbek cytologicznych pobranych z szyjki macicy może powodować znaczną zmienność wyników, przez co konieczne jest regularne przeprowadzanie wewnętrznej kontroli jakości. Więcej informacji na temat kontroli zawiera sekcja Kontrola jakości. Komórka Rysunek 3. Detekcja ludzkiego białka Ki-67 DOSTARCZANE ODCZYNNIKI Jeden zestaw CINtec PLUS Cytology Kit zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 100 testów. Docelowy antygen CINtec PLUS Primary Antibody Cocktail (p16/ki-67) zawiera mieszaninę mysich przeciwciał monoklonalnych, klon E6H4, skierowanych przeciwko ludzkiemu białku p16ink4a, oraz króliczych pierwszorzędowych przeciwciał rekombinowanych, klon 274-11 AC3, skierowanych przeciwko ludzkiemu białku Ki67 (łączna ilość przeciwciał <5 µg/ml) w buforze zawierającym białko z dodatkiem środka konserwującego ProClin 300. CINtec PLUS Red anti-rabbit NP Linker zawiera kozie przeciwciało znakowane NP i skierowane przeciwko IgG króliczym (<10 µg/ml; NP jest zastrzeżonym haptenem związanym kowalencyjnie z przeciwciałem kozim) w buforze zawierającym białko z dodatkiem środka konserwującego ProClin 300. CINtec PLUS Red AP Multimer zawiera monoklonalne mysie przeciwciała skierowane przeciwko przeciwciałom trzeciorzędowym AP znakowanym NP (<20 µg/ml) w buforze zawierającym białko z dodatkiem środka konserwującego ProClin 300. WYMAGANE MATERIAŁY NIEDOŁĄCZONE DO ZESTAWU Wymienione niżej odczynniki i materiały potrzebne do wykonania odczynu nie są dostarczane z zestawem CINtec PLUS Cytology Kit. Nie wszystkie produkty przedstawione na ulotce dołączonej do opakowania są dostępne we wszystkich rejonach geograficznych. Należy skonsultować się z lokalnym przedstawicielem odpowiedzialnym za wsparcie techniczne. 1. Odpowiednie kontrole (opcjonalne, informacje zawiera sekcja Kontrola jakości) 2. HematoxylinCounterstain (Barwienie kontrastowe) 3. Odczynnik Bluing 4. Reaction Buffer Concentrate (10X) 5. Cell Conditioning Solutions (CC1/ ULTRA CC1) 6. Cell Conditioning Solutions (CC2/ ULTRA CC2), wymagane w aparacie, ale nieużywane 7. EZ Prep Concentrate (10X), wymagane w aparacie, ale nieużywane 8. SSC Concentrate (10X), wymagany w aparacie, ale nieużywany 9. Liquid Coverslip (LCS/ ULTRA LCS) 10. Denaturowany etanol do odczynników (czystość 95%) 11. VENTANA BenchMark GX, XT lub ULTRA (automat do barwienia preparatów) 12. Zalecane są szkiełka mikroskopowe SuperFrost PLUS (Thermo Fisher Scientific) do rozmazów tradycyjnych 13. Szkiełka mikroskopowe ThinPrep Arcless lub szkiełka mikroskopowe ThinPrep FOR SPECIAL PROCESSING (nr kat. firmy Hologic: 70126-002) 14. Szkiełka BD SurePath PreCoat (wchodzą w skład zestawu SurePath GYN) 15. Wodny środek do zatapiania CC/Mount (nr kat. firmy Diagnostic BioSystems: K 002; nr kat. firmy Sigma-Aldrich: C9368) 16. Opcjonalnie: Suszarka umożliwiająca utrzymanie temperatury 60 C ± 5 C 2016-02-04 2 / 8 1012838PL Rev D

17. Ksylen (klasy histologicznej) 18. Woda dejonizowana lub destylowana 19. Szkiełka nakrywkowe i środek do zatapiania na bazie ksylenu lub metoda zakrywania preparatów folią z tworzywa sztucznego w celu zamknięcia preparatu tkankowego 20. Mikroskop świetlny 21. Łagodny detergent do mycia naczyń PRZECHOWYWANIE Przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Ten zestaw odczynników może być używany niezwłocznie po wyjęciu z chłodziarki. W celu zapewnienia właściwego podawania i stabilności odczynnika, po każdym użyciu należy założyć zatyczkę i niezwłocznie umieścić dyspensery w lodówce w pozycji pionowej. W przypadku zestawu CINtec PLUS Cytology Kit obowiązuje data ważności. Prawidłowo przechowywane odczynniki pozostają stabilne do daty określonej na etykiecie. Nie należy stosować produktu po przekroczeniu okresu przydatności do użytku stosownego dla zalecanej metody przechowywania. Nie istnieją widoczne objawy wskazujące na utratę stabilności produktu; dlatego równocześnie z badaniem właściwych próbek należy wykonywać kontrole dodatnie. W razie stwierdzenia objawów niestabilności odczynnika należy niezwłocznie skontaktować się z lokalnym przedstawicielem pomocy technicznej. OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI 1. Do stosowania w diagnostyce in vitro (IVD). 2. Wyłącznie do użytku profesjonalnego. 3. Nie stosować produktu, jeśli opakowanie któregoś z elementów jest uszkodzone. Jeśli opakowanie lub elementy noszą ślady uszkodzeń, prosimy niezwłocznie powiadomić lokalnego przedstawiciela pomocy technicznej. 4. Odczynniki zostały optymalnie rozcieńczone i dalsze rozcieńczanie może doprowadzić do zaniku barwienia antygenów. W przypadku zmian któregokolwiek z parametrów konieczne jest przeprowadzenie walidacji przez użytkownika. 5. W produkcie zastosowano środek konserwujący ProClin 300. Został on sklasyfikowany jako drażniący i w wyniku kontaktu ze skórą może wywołać sensytyzację. Podczas pracy z produktem należy stosować uzasadnione środki ostrożności. Unikać kontaktu odczynników z oczami, skórą i błonami śluzowymi. Stosować odzież i rękawice ochronne. Listę dyspenserów zawierających ten środek konserwujący zamieszczono w sekcji Dostarczane odczynniki. 6. Materiały pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego należy traktować jak materiały niebezpieczne biologicznie i utylizować z zachowaniem właściwych środków ostrożności. 7. Podczas pracy z odczynnikiem należy zachować uzasadnione środki ostrożności. Unikać kontaktu odczynników z oczami, skórą i błonami śluzowymi. Unikać wdychania odczynników. W przypadku kontaktu z materiałami podejrzewanymi o rakotwórczość lub toksyczność należy nosić jednorazowe rękawice i odpowiednią odzież ochronną. 8. W przypadku kontaktu z wrażliwymi miejscami spłukiwać obfitą ilością wody. 9. Unikać skażenia mikrobiologicznego odczynników. Może ono powodować nieprawidłowe wyniki. 10. W celu uzyskania informacji na temat zalecanej metody utylizacji produktu należy skontaktować się z władzami lokalnymi i/lub krajowymi. 11. Dodatkowe informacje na temat bezpieczeństwa można znaleźć w Karcie charakterystyki produktu oraz w Przewodniku po symbolach i zwrotach dotyczących zagrożeń na stronie www.ventana.com. 12. Podczas posługiwania się utrwalonymi lub jeszcze nieutrwalonymi próbkami cytologicznymi i usuwania ich, jak również posługiwania się wszelkimi materiałami mającymi z nimi kontakt i usuwania ich, należy ściśle przestrzegać zasad bezpieczeństwa pracy z potencjalnie zakaźnym materiałem i odnośnych przepisów dotyczących utylizacji takich materiałów. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Należy prawidłowo obchodzić się z próbkami cytologicznymi, by zachować je do wykonania procedur immunocytochemicznych. Wobec wszystkich preparatów należy stosować standardowe metody obróbki komórek. W celu uniknięcia elementów, które mogą zasłaniać sygnał, np. takich jak krew i śluz, oraz w celu zapewnienia zgodności próbki z wytycznymi Bethesda Guidelines lekarze powinni stosować zalecane techniki pobierania próbek [22;23]. Opisane poniżej metody przygotowania preparatów są odpowiednie do stosowania z zestawem CINtec PLUS Cytology Kit: Preparaty ThinPrep (Hologic Inc.) przygotowane w aparacie ThinPrep 2000/5000 Processor (Hologic Inc.) przy użyciu szkiełek mikroskopowych ThinPrep Arcless lub szkiełka mikroskopowe ThinPrep FOR SPECIAL PROCESSING (nr kat. firmy Hologic: 70126-002) zgodnie z zaleceniami producenta; Preparaty BD SurePath (BD Diagnostics Tripath) przygotowane zgodnie z zaleceniami producenta; Preparaty przygotowane ręcznie (preparaty z rozmazami tradycyjnymi). Zalecane jest przeprowadzanie odpowiednich kontroli jednocześnie z barwieniem próbek pochodzących od pacjentów (dodatkowe informacje zawiera sekcja Kontrola jakości). Przygotowanie próbki ThinPrep Próbka cytologiczna w roztworze PreservCyt przeznaczona do barwienia immunocytochemicznego z użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit może być przechowywana w temperaturze od 4 C do 30 C i należy ją poddać testom w ciągu 6 tygodni od pobrania. Szkiełka mikroskopowe ThinPrep Arcless lub szkiełka mikroskopowe ThinPrep FOR SPECIAL PROCESSING (nr zamówienia firmy Hologic: 70126-002) są wymagane do barwienia immunocytochemicznego przy użyciu zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w automatach do barwienia VENTANA Benchmark GX, XT i ULTRA. Przygotowanie próbki ThinPrep przy użyciu aparatu ThinPrep 2000 Processor Preparaty ThinPrep (Hologic Inc.) przygotowuje się w aparacie ThinPrep 2000 Processor (Hologic Inc.) zgodnie z instrukcją producenta. Po zakończeniu sekwencji w aparacie ThinPrep 2000 Processor przetwarzany preparat znajduje się we fiolce do utrwalania, która zawiera roztwór etanolu do odczynników o stężeniu 95%. Zachowując ostrożność, należy wyjąć fiolkę z uchwytu, w którym spoczywa w kąpieli utrwalającej w aparacie ThinPrep 2000 Processor, a następnie przenieść przetwarzany preparat z fiolki do pojemnika na preparaty, który zawiera roztwór etanolu do odczynników o stężeniu 95%. Preparat należy inkubować w etanolu przez czas od minimum 15 do maksimum 60 minut. Roztwór etanolu we fiolce do utrwalania i pojemniku na preparaty należy zmieniać każdorazowo po przygotowaniu 20 preparatów. Po zakończeniu inkubacji należy wyjąć preparat z pojemnika z etanolem i pozostawić go do wyschnięcia ułożony na płasko na poziomej powierzchni, przez co najmniej 60 minut. Wysuszone preparaty można przechowywać w temperaturze pokojowej, należy je chronić przed światłem i wybarwić przy użyciu zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w ciągu 3 dni od przygotowania. Przygotowanie próbki ThinPrep przy użyciu aparatu ThinPrep 5000 Processor Preparaty ThinPrep (Hologic Inc.) przygotowuje się w aparacie ThinPrep 5000 Processor (Hologic Inc.) zgodnie z instrukcją producenta. Po zakończeniu sekwencji w aparacie ThinPrep 5000 Processor przetwarzane preparaty znajdują się w podajniku, który jest zanurzony w roztworze etanolu do odczynników o stężeniu 95% z dodatkiem kąpieli utrwalającej. Należy ostrożnie wyjąć kąpiel utrwalającą z aparatu ThinPrep 5000 Processor, a następnie inkubować preparaty dodatkowo przez czas od minimum 15 do maksimum 60 minut. Roztwór etanolu we fiolce do utrwalania i pojemniku na preparaty należy zmieniać po każdym cyklu. Po zakończeniu inkubacji należy wyjąć preparaty z pojemnika z etanolem i pozostawić je do wyschnięcia ułożone na płasko na poziomej powierzchni, przez co najmniej 60 minut. Wysuszone preparaty można przechowywać w temperaturze pokojowej, należy je chronić przed światłem i wybarwić przy użyciu zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w ciągu 3 dni od przygotowania. Przed rozpoczęciem barwienia immunocytochemicznego przy użyciu zestawu CINtec PLUS Cytology Kit należy zdjąć oryginalną etykietę używaną w aparacie ThinPrep 5000 Processor i nałożyć etykietę, która będzie używana przez aparat do barwienia VENTANA BenchMark GX, XT lub BenchMark ULTRA. Przygotowanie próbki BD SurePath Próbka cytologiczna w płynie SurePath Preservative Fluid, przeznaczona do barwienia immunocytochemicznego z użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit, może być przechowywana przez maksymalnie 4 tygodnie w temperaturze pokojowej (od 15 C do 30 C) lub przez 6 miesięcy w lodówce, w temperaturze od 2 C do 10 C. Przygotowanie próbki BD SurePath bezpośrednio po zakończeniu obróbki preparatu cytologicznego Po utworzeniu wzbogaconego peletu komórkowego w celu przygotowania preparatu cytologicznego do barwienia pelet można niezwłocznie wykorzystać w celu przygotowania drugiego preparatu do bawienia z użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit. Należy zgodnie z zaleceniami producenta użyć opcji Slide Preparation [opcja 2] na potrzeby 2016-02-04 3 / 8 1012838PL Rev D

przygotowania próbek GYN w aparacie PrepStain. Objętość odtwarzanej zawiesiny należy zmienić na 0 ml w opcji menu Change Sample/Stain Parameters. Przygotowanie próbki BD SurePath z utrwalonego peletu komórkowego Wzbogacone pelety komórkowe mogą być utrwalane. W tym celu należy dodać do probówki z próbką około 2 ml płynu SurePath Preservative Fluid i zamknąć ją nakrętką w celu przechowywania (szczegółowe informacje zawierają instrukcje wydane przez producenta). Od daty pobrania próbki, pelety komórkowe, które zostały ponownie zawieszone w płynie konserwującym, mogą być przechowywane przez maksymalnie 4 tygodnie w temperaturze pokojowej (od 15 C do 30 C) lub przez 6 miesięcy w lodówce w temperaturze od 2 C do 10 C. W celu obróbki preparatu przeznaczonego do testów z użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit najpierw należy umieścić próbkę w temperaturze pokojowej na 60 minut. Proces wzbogacania GYN należy rozpocząć od drugiego wirowania i przeprowadzić pozostałe czynności przygotowania wstępnego, według instrukcji producenta, dotyczącej ponownego przetwarzania utrwalonego peletu komórkowego. Należy zgodnie z zaleceniami producenta użyć opcji Slide Preparation [opcja 2] na potrzeby przygotowania próbek GYN w aparacie PrepStain. W przypadku każdej z przedstawionych powyżej opcji przygotowania, podajnik preparatów należy wyjąć z aparatu do barwienia PrepStain po zakończeniu etapu przenoszenia próbek. Odwrócić podajnik w celu zlania płynu. Do każdej komory sedymentacyjnej odmierzyć pipetą 2 ml roztworu etanolu do odczynników o stężeniu 95% i natychmiast zlać płyn. Opłukać drugi raz za pomocą 2 ml roztworu etanolu do odczynników o stężeniu 95% i inkubować przez 10 minut. Zlać płyn drugi raz, odwracając podajnik. Wyjąć komory sedymentacyjne z preparatów i pozostawić preparaty do wyschnięcia ułożone na płasko na poziomej powierzchni, przez co najmniej 60 minut. Wysuszone preparaty można przechowywać w temperaturze pokojowej, należy je chronić przed światłem i wybarwić przy użyciu zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w ciągu 3 dni od przygotowania. Przygotowanie rozmazu tradycyjnego Rozmazy tradycyjne należy utrwalać odczynnikiem do utrwalania w aerozolu zawierającym glikol polietylenowy (np. Safetex Cytology Fixative, Andwin Scientific) bezpośrednio po pobraniu próbki. Preparaty w formie rozmazów tradycyjnych utrwalonych odczynnikiem w aerozolu można przechowywać w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem i wybarwić przy użyciu zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w ciągu 7 dni od przygotowania. Przed załadowaniem preparatów do aparatów do barwienia VENTANA BenchMark GX, XT i ULTRA nie są wymagane żadne dodatkowe etapy przygotowania wstępnego. PROCEDURA BARWIENIA Zestaw CINtec PLUS Cytology Kit został opracowany w celu stosowania w automatach do barwienia VENTANA BenchMark GX, XT i ULTRA wraz z odczynnikami pomocniczymi i akcesoriami firmy VENTANA. Opis zalecanego protokołu barwienia zawierają Tabele 1, 2 i 3. Zestaw CINtec PLUS Cytology Kit został zoptymalizowany z parametrami przedstawionymi w Tabelach 1, 2 i 3; mimo to użytkownik jest zobowiązany do walidacji wyników uzyskanych z zastosowaniem tego zestawu. Parametry protokołów zautomatyzowanych mogą być wyświetlane, drukowane i edytowane zgodnie z informacjami zawartymi w Instrukcji obsługi każdego urządzenia. Tabela 1. Zalecany protokół barwienia preparatów ThinPrep, SurePath i z rozmazami tradycyjnymi w automacie VENTANA BenchMark GX przy użyciu odczynników Hematoxylin (Nr kat. 760-2021) i Bluing Reagent (Nr kat. 760-2037). Procedura barwienia Opcje do GX CINtec PLUS Cytology Sposób przygotowania próbki ThinPrep SurePath Tradycyjny ThinPrep Wybrano Nie wybrano Nie wybrano SurePath Nie wybrano Wybrano Nie wybrano Inne Nie wybrano Nie wybrano Wybrano Kondycjonowanie komórek odczynnikiem opcjonalnym 16 min Czas inkub. przeciw. 16 min 20 min 16 min Czas inkub. HQ Linker 12 min 16 min 12 min Czas inkub. HRP Multimer Inc 6 min 8 min 8 min Czas inkub. NP Linker 8 min 16 min 8 min Czas inkub. AP Multimer 8 min 8 min 8 min Barwienie negatywne Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Barwienie negatywne Bluing 4 min Bluing 4 min Bluing 4 min Tabela 2. Zalecany protokół barwienia preparatów ThinPrep, SurePath i z rozmazami tradycyjnymi w automacie VENTANA BenchMark XT przy użyciu odczynników Hematoxylin(Nr kat. 760-2021) i Bluing (Nr kat. 760-2037). Procedura barwienia Opcje do XT CINtec PLUS Cytology Sposób przygotowania próbki ThinPrep SurePath Tradycyjny ThinPrep Wybrano Nie wybrano Nie wybrano SurePath Nie wybrano Wybrano Nie wybrano Inne Nie wybrano Nie wybrano Wybrano Kondycjonowanie komórek odczynnikiem opcjonalnym 16 min Czas inkub. przeciw. 16 min 20 min 16 min Czas inkub. HQ Linker 12 min 16 min 12 min Czas inkub. HRP Multimer Inc 8 min 8 min 8 min Czas inkub. NP Linker 8 min 16 min 8 min Czas inkub. AP Multimer 8 min 8 min 8 min Barwienie negatywne Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Barwienie negatywne Bluing 4 min Bluing 4 min Bluing 4 min 2016-02-04 4 / 8 1012838PL Rev D

Tabela 3. Zalecany protokół barwienia preparatów ThinPrep, SurePath i z rozmazami tradycyjnymi w automacie VENTANA BenchMark ULTRA przy użyciu odczynników Hematoxylin (Nr kat. 760-2021) i Bluing Reagent (Nr kat. 760-2037). Procedura barwienia Opcje do U CINtec PLUS Cytology Sposób przygotowania próbki ThinPrep SurePath Tradycyjny ThinPrep Wybrano Nie wybrano Nie wybrano SurePath Nie wybrano Wybrano Nie wybrano Inne Nie wybrano Nie wybrano Wybrano Kondycjonowanie komórek odczynnikiem opcjonalnym 16 min Czas inkub. przeciw. 16 min 16 min 16 min Czas inkub. HQ Linker 12 min 16 min 12 min Czas inkub. HRP Multimer Inc 8 min 8 min 8 min Czas inkub. NP Linker 8 min 16 min 8 min Czas inkub. AP Multimer 8 min 8 min 8 min Barwienie negatywne Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Barwienie negatywne Bluing 4 min Bluing 4 min Bluing 4 min Sposób użycia automatów do barwienia preparatów BenchMark GX, XT i ULTRA 1. Nałożyć etykietę z kodem kreskowym odpowiadającym protokołowi, który ma być przeprowadzony. 2. Załadować dyspensery zestawu CINtec PLUS Cytology Kit oraz niezbędne odczynniki pomocnicze do tacy na odczynniki i umieścić tacę w automacie do barwienia. 3. Sprawdzić płyny i opróżnić zbiornik na zlewki. 4. Załadować preparaty do automatu do barwienia. 5. Rozpocząć wykonywanie barwienia. 6. Po zakończeniu serii wyjąć preparaty z automatu. PROCEDURA PRZETWARZANIA KOŃCOWEGO ZATAPIANIE I PRZYKRYWANIE SZKIEŁKIEM NAKRYWKOWYM Aby utrzymać optymalną czułość i zapobiec zanikaniu chromogenów, wymagana jest dwuetapowa procedura zatapiania. Wyjąć preparaty z aparatu do barwienia VENTANA BenchMark GX, XT lub ULTRA i delikatnie wstrząsnąć, a następnie spłukiwać preparaty wodą z kranu, dejonizowaną lub destylowaną i łagodnym detergentem do mycia naczyń aż do całkowitego usunięcia roztworu Liquid Coverslip z preparatów. UWAGA: Nie należy dopuścić do tego, aby woda uderzała bezpośrednio w preparaty. Woda powinna przepływać pod minimalnym ciśnieniem. Następnie preparaty zostaną zatopione podczas dwuetapowej procedury. Wymagane jest wykonanie poniższych kroków w przedstawionej kolejności: 1. Wodny środek do zatapiania: Inkubować preparaty w wodzie destylowanej lub dejonizowanej przez przynajmniej 1 minutę. Preparaty, które nie będą nakrywane szkiełkiem nakrywkowym, powinny pozostawać w wodzie destylowanej lub dejonizowanej podczas nakładania wodnego środka do zatapiania CC/Mount na inne preparaty. Wyjąć pojedynczy preparat z wody destylowanej lub dejonizowanej i ostrożnie wytrzeć tylną stronę preparatu ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody. Nie zlewać ani nie wycierać wody z przodu preparatu (strona z próbką). Trzymając szkiełko pod niewielkim kątem, nałożyć 4 6 kropli wodnego środka do zatapiania CC/Mount (nr kat. firmy Diagnostic BioSystems: K 002; nr kat. firmy Sigma-Aldrich: C9368) na każdy preparat ThinPrep lub SurePath i 8 kropel na preparaty z rozmazami tradycyjnymi. Nie doprowadzać do powstawania pęcherzyków powietrza. Można zapobiec tworzeniu się małych pęcherzyków powietrza, nanosząc pierwszą kroplę odczynnika CC/Mount na ręcznik papierowy i dopiero kolejną na powierzchnię przygotowania próbki na preparacie. Delikatnie przechylać szkiełko w różne strony do uzyskania cienkiej warstwy środka do zatapiania na całej powierzchni przygotowania próbki (nie nakładać szkiełka ani filmu nakrywkowego na tym etapie); sprawdzić wzrokowo, czy środek do zatapiania został równomiernie rozprowadzony. Usunąć nadmiar wodnego środka do zatapiania CC/Mount z tyłu i krawędzi szkiełka. W razie potrzeby użyć wilgotnego ręcznika papierowego. Umieścić szkiełka w pozycji poziomej do suszenia: a) Inkubować preparaty ThinPrep lub SurePath w temperaturze 37 60 C przez godzinę lub w temperaturze pokojowej przez całą noc; b) Inkubować preparaty z rozmazami tradycyjnymi w temperaturze 37 przez 4 godziny, w temperaturze 60 przez godzinę lub w temperaturze pokojowej przez całą noc. 2. Nanoszenie szkiełek nakrywkowych tradycyjnych lub pod postacią filmu. Po całkowitym wysuszeniu wodnego środka do zatapiania CC/Mount należy w razie potrzeby doprowadzić preparaty do temperatury pokojowej. Inkubować preparaty w ksylenie przez przynajmniej 1 minutę i nie dłużej niż 20 minut. Następnie szkiełka należy nakryć za pomocą środka do zatapiania na bazie ksylenu lub za pomocą odpowiedniego filmu na bazie ksylenu. UWAGA: Nie wolno odwadniać preparatów w roztworach alkoholu o rosnących stężeniach przed nałożeniem szkiełek nakrywkowych tradycyjnych lub pod postacią filmu. Odczekać aż środek do zatapiania na bazie ksylenu wyschnie w temperaturze pokojowej. UWAGA: Aby ograniczyć zanikanie sygnału, należy przechowywać preparaty w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem. KONTROLA JAKOŚCI Stosowanie innych niż zalecane metod utrwalania i dalszego przetwarzania próbek cytologicznych pobranych z szyjki macicy może powodować znaczną zmienność wyników. Nieprawidłowe działanie produktu wynikające z niewłaściwego posługiwania się nim lub niestabilności odczynników może nie dawać jednoznacznych oznak. Dlatego należy wykonywać próby kontrolne równolegle z odczynami na próbkach od pacjentów. Kontrola dodatnia Jako kontrole dodatnie należy stosować próbki przetworzone w taki sam sposób, jak próbki tkanek pacjentek. Wynik dodatniej kontroli potwierdza właściwe przygotowanie próbek i prawidłową technikę barwienia. Podczas każdej serii barwienia należy wykonać jedną kontrolę dodatnią. Znane kontrole dodatnie powinny być stosowane wyłącznie w celu monitorowania jakości przetwarzanych preparatów i odczynników testowych, a nie jako pomoc w diagnozowaniu próbek pochodzących od pacjentek. Jeżeli nie uzyska się dodatniego odczynu w kontrolach dodatnich, należy uznać, że wyniki próbek badanych są nieważne. Kontrola ujemna Szereg różnych typów komórek obecnych w reprezentatywnych próbkach cytologicznych pobranych z szyjki macicy, znanych z braku ekspresji antygenów p16 INK4a i Ki-67 (np. komórki powierzchniowe), może służyć za wewnętrzną kontrolę ujemną do wykrywania zabarwienia tła. Weryfikacja odczynu Przed pierwszym użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w procedurze diagnostycznej użytkownik powinien sprawdzić działanie zestawu na preparatach kontroli dodatniej i ujemnej o znanej charakterystyce działania. INTERPRETACJA WYBARWIENIA/OCZEKIWANE WYNIKI Podczas procedur barwienia z użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit powstają dwa barwne produkty reakcji: brązowy osad w miejscach występowania antygenu p16 INK4a i czerwony osad w miejscach występowania antygenu Ki-67. Brązowy odczyn komórek (cytoplazmatyczny i/lub jądrowy) wskazuje na nadekspresję p16 INK4a. Czerwony odczyn komórek (jądrowy) oznacza ekspresję Ki-67. Komórki z dodatnim odczynem dla obu antygenów wykazują brązowe zabarwienie cytoplazmy i zwykle wyraźne czerwone 2016-02-04 5 / 8 1012838PL Rev D

zabarwienie jąder. Przed przystąpieniem do interpretacji wyników wykwalifikowany patolog/specjalista cytolog z doświadczeniem w procedurach immunocytochemicznych i przeszkoleniem w zakresie interpretacji preparatów barwionych zestawem CINtec PLUS Cytology Kit powinien dokonać oceny kontroli (jeśli były używane). Wyniki testów mogą być interpretowane wyłącznie przez osoby wykwalifikowane, w połączeniu z historią choroby pacjentki i innymi przeprowadzonymi badaniami diagnostycznymi. Podczas interpretacji preparatów cytologicznych szyjki macicy barwionych z użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit należy oceniać preparaty pod kątem obecności komórek nabłonkowych szyjki macicy, wykazujących zarówno brązowe zabarwienie cytoplazmy, jak i czerwone zabarwienie jąder, co wskazuje na jednoczesną ekspresję białek p16 INK4a i Ki-67. Podczas raportowania wyników testu CINtec PLUS Cytology Kit podobnie jak w przypadku raportowania wyników cytologii próbki należy ocenić pod względem kryterium odpowiedniości zgodnie z wytycznymi Bethesda Guidelines 2001 lub TBS [23]. Dodatni wynik badania Obecność przynajmniej jednej komórki nabłonka szyjki macicy ze współlokalizacją swoistego brązowego zabarwienia cytoplazmy oraz swoistego czerwonego zabarwienia jądra w barwieniu immunocytochemicznym należy interpretować jako dodatni wynik testu CINtec PLUS Cytology. Ujemny wynik badania Jeśli nie stwierdzi się obecności ani jednej komórki nabłonka szyjki macicy z jednoczesnym brązowym zabarwieniem cytoplazmy oraz czerwonym zabarwieniem jądra w barwieniu immunocytochemicznym wynik testu CINtec PLUS Cytology należy interpretować jako ujemny. Obecność komórek nabłonka szyjki macicy wykazujących immunoreaktywność dla jednego, ale nie obydwu markerów (na przykład tylko brązowy odczyn oznaczający ekspresję p16 INK4a lub tylko czerwony odczyn oznaczający ekspresję Ki-67) nie jest traktowana jako dodatni wynik testu z użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit. OGRANICZENIA 1. Wyłącznie do użytku profesjonalnego. Do przeprowadzania procedur immunocytochemicznych wymagane są specjalne szkolenia. 2. Szkiełka mikroskopowe wybarwione przy użyciu zestawu CINtec PLUS Cytology Kit powinny być oceniane wyłącznie przez wykwalifikowanego specjalistę przeszkolonego w zakresie interpretowania wyników tych testów. 3. Interpretacja kliniczna jakiegokolwiek dodatniego lub ujemnego odczynu musi być prowadzona w kontekście obrazu klinicznego i kryteriów cytologicznych. 4. Interpretacja wyników barwienia CINtec PLUS Cytology Kit jest zależna od intensywności i jakości barwienia wykonanego przy użyciu odczynnika do barwienia kontrastowego z hematoksyliną. Stosowanie innych niż zalecane odczynników i czasów inkubacji wymaga weryfikacji przez klienta, ponieważ nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe może utrudniać prawidłową interpretację wyników. 5. Preparaty z rozmazami tradycyjnymi przeznaczone do barwienia z użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit należy przygotowywać przy użyciu szkiełek mikroskopowych SuperFrost PLUS (Thermo Fisher Scientific) i odczynnika do utrwalania w aerozolu Safetex Cytology Fixative (Andwin Scientific), który zawiera glikol polietylenowy. Odstępstwo od zalecanej metody przygotowania wymaga weryfikacji przez klienta. 6. Nie zaleca się stosowania aparatu ThinPrep 3000 Processor do przygotowywania próbek ThinPrep, ponieważ procedura utrwalania na tym instrumencie obejmuje użycie aerozolu, co może powodować znaczną utratę komórek z preparatów, które będą wybarwiane przy użyciu zestawu CINtec PLUS Cytology Kit. 7. Szkiełka mikroskopowe ThinPrep Arcless lub szkiełka mikroskopowe ThinPrep FOR SPECIAL PROCESSING (nr zamówienia firmy Hologic: 70126-002) są wymagane do przygotowania próbek do barwienia immunocytochemicznego ThinPrep przy użyciu zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w automatach do barwienia VENTANA BenchMark GX, XT i ULTRA. Szkiełka mikroskopowe ThinPrep z nadrukami do badań screeningowych mogą prowadzić do niespójnych wyników barwienia. 8. Producent dostarcza przeciwciała/ odczynniki, przeznaczone do stosowania zgodnie z niniejszymi instrukcjami, w rozcieńczeniu optymalnym do badań immunocytochemicznych na przygotowanych preparatach do cienkowarstwowej cytologii na podłożu płynnym (LBC) lub preparatach z rozmazami tradycyjnymi. Jakakolwiek niezgodność z zalecanymi procedurami testu może spowodować, że podane oczekiwane wartości wyników utracą ważność. Należy stosować właściwe próby kontrolne i notować ich wyniki w dokumentacji. Użytkownicy, którzy nie postępują zgodnie z zalecanymi procedurami testowymi, muszą przyjąć odpowiedzialność za interpretację wyników pacjentek w zmienionych warunkach. ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW 1. Jeśli dyspenser odczynnika nie dozuje płynu, należy sprawdzić, czy w komorze napełniania wstępnego lub na menisku nie ma obcych substancji lub cząstek, takich jak włókna lub osady. Jeżeli dyspenser jest zablokowany, nie należy go używać i należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielem serwisu. W przeciwnym razie należy ponownie napełnić wstępnie dyspenser. W tym celu skierować dyspenser do zbiornika na zlewki, zdjąć nasadkę dyszy i nacisnąć dyspenser od góry. 2. Jeżeli kontrola dodatnia charakteryzuje się słabszym barwieniem niż oczekiwano, należy sprawdzić, czy wybrany protokół jest zgodny z określonym typem próbki; np. preparaty cytologiczne SurePath wymagają dłuższego czasu kondycjonowania komórek niż preparaty ThinPrep lub preparaty z rozmazami tradycyjnymi. Ponadto należy sprawdzić, czy wszystkie cylindry dyspensera są wolne od zanieczyszczeń. 3. Jeżeli wynik kontroli dodatniej jest negatywny, należy sprawdzić, czy preparat ma odpowiednią etykietę z kodem kreskowym. Jeśli preparat jest oznakowany właściwą etykietą, należy sprawdzić, czy wszystkie cylindry dyspensera są wolne od zanieczyszczeń. 4. Jeśli widoczne jest wzmocnione barwienie tła, należy skrócić czasy inkubacji w protokołach barwienia. Ponadto należy się upewnić, że płyn Reaction Buffer został poprawnie przygotowany. 5. W przypadku słabego wybarwienia należy wydłużyć czasy inkubacji w protokołach barwienia. W przypadku preparatów z rozmazem tradycyjnym możliwe jest również dostosowanie czasu inkubacji podczas kondycjonowania komórek. 6. Czerwony osad, który wskazuje ekspresję białka Ki-67, jest rozpuszczalny w alkoholu. Jeśli barwienie Ki67 jest słabe lub niewidoczne, należy wykluczyć z procedur hematoksylinę zawierającą alkohol i należy postępować zgodnie z zalecaną procedurą przetwarzania końcowego, według instrukcji przedstawionych w sekcji Procedura przetwarzania końcowego zatapianie i przykrywanie szkiełkiem nakrywkowym. 7. Jeśli próbki są zmywane ze szkiełek, należy zadbać o to, aby próbki były przygotowywane zgodnie z procedurą Przygotowywanie próbki oraz należy się upewnić, że użyto zalecanych szkiełek mikroskopowych. 8. Aby dowiedzieć się, jakie środki zaradcze podjąć, należy przeczytać rozdział Procedura barwienia lub Instrukcję obsługi urządzenia albo skontaktować się z lokalnym przedstawicielem serwisu. CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA Działanie zestawu CINtec PLUS Cytology Kit zostało ocenione pod względem swoistości analitycznej, odtwarzalności i zgodności, tak jak opisano to w następnej sekcji. Swoistość analityczna Swoistość analityczną zestawu CINtec PLUS Cytology Kit badano poprzez inhibicję przeciwciał pierwszorzędowych (klony E6H4 i 274-11 AC3) odpowiednimi peptydami swoistymi dla danych epitopów. Preparaty do cytologii cienkowarstwowej na podłożu płynnym (LBC) z linii komórkowej wykazującej nadekspresję obu antygenów wykorzystano do oceny wpływu inhibicji konkretnymi peptydami na odczyn uzyskiwany przy użyciu obu przeciwciał. Wiązanie przeciwciał z peptydami swoistymi dla ich epitopów powodowało inhibicję przeciwciał objawiającą się odczynem słabszym niż w przypadku barwienia bez inhibicji peptydami. Ponadto żadne z przeciwciał nie poddawało się inhibicji peptydem swoistym dla epitopu drugiego przeciwciała, co oznacza, że nieswoiste peptydy nie będą powodowały inhibicji w procesie barwienia tymi przeciwciałami. Odtwarzalność Przeprowadzono badania odtwarzalności wyników uzyskiwanych za pomocą zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w celu wykazania: odtwarzalności wyników uzyskiwanych za pomocą zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w obrębie jednej partii; Odtwarzalności w obrębie jednej lub kilku serii w aparatach VENTANA BenchMark GX, XT i ULTRA; Odtwarzalności w obrębie jednej platformy barwienia w aparatach VENTANA BenchMark GX, XT i ULTRA; Odtwarzalności między platformami barwienia w aparatach VENTANA BenchMark GX, XT i ULTRA. Wyniki wszystkich badań spełniły ustalone kryteria dopuszczenia. 2016-02-04 6 / 8 1012838PL Rev D

Badania zgodności Działanie zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w automatach do barwienia preparatów VENTANA BenchMark GX, XT i ULTRA oceniono poprzez porównanie z zestawem Roche mtm CINtec PLUS Kit (produkt referencyjny, Roche mtm laboratories AG, Mannheim), który wcześniej wykazał wysoką czułość i swoistość w testach na obecność zmian przedrakowych i rakowych w próbkach cytologicznych z szyjki macicy, a w szczególności w wykrywaniu próbek z komórkami nabłonka wykazujących podwójny odczyn dodatni zarówno w kierunku p16 INK4a, jak i Ki-67 [14;15;16;17;18;19;20;21]. Badania zgodności prowadzono przy użyciu próbek od pacjentek z populacji, dla której zestaw jest przeznaczony. Do badań zgodności wykorzystano próbki, dla których uzyskiwano wyniki badań cytologicznych NILM (negatywny pod względem śródnabłonkowej neoplazji i raka), ASC-US, LSIL i HSIL, i które przygotowywane zostały przy użyciu każdej z metod sporządzania preparatów cytologicznych z szyjki macicy: ThinPrep (Hologic Inc.), BD SurePath (BD Diagnostics Tripath) i preparaty z rozmazami tradycyjnymi. W przypadku preparatów LBC z każdej próbki od pacjentki przygotowywano dwa preparaty. W przypadku rozmazów tradycyjnych przygotowywano dwa preparaty od tej samej pacjentki pobierane w trakcie jednej wizyty, rozdzielając pobrany materiał między dwa preparaty ( technika próbki dzielonej ). Jeden preparat testowano z użyciem zestawu CINtec PLUS Cytology Kit w aparacie VENTANA BenchMark, a drugi barwiono za pomocą produktu referencyjnego. Algorytm odczytu preparatów LBC: Każdy preparat był odczytywany przez dwóch wykwalifikowanych specjalistów. Jeśli zgadzali się co do wyniku, to wynik ten był uznawany za finalny dla danego preparatu. W razie braku zgody co do wyniku trzeci specjalista dokonywał odczytu dodatkowego, a wynik większościowy był uznawany za finalny dla danego preparatu. Algorytm odczytu preparatów z rozmazami tradycyjnymi: Każdy preparat był odczytywany przez dwóch wykwalifikowanych specjalistów. Jeśli obaj wskazali na wynik dodatni, to dla preparatu jako finalny przyjmowano wynik dodatni. W razie braku zgody co do wyniku preparat był odczytywany przez panel złożony przez trzech specjalistów, a uzgodniony przez nich wynik przyjmowano za finalny dla preparatu. Jeśli obaj wskazali na wynik ujemny, to preparat odczytywał trzeci specjalista w celu potwierdzenia tego wyniku. Jeśli trzeci specjalista potwierdził wynik ujemny, to za finalny dla preparatu przyjmowano wynik ujemny. Jeśli trzeci specjalista wskazał wynik dodatni, preparat kierowano do przeglądu przez panel specjalistów, a uzgodniony przez nich wynik przyjmowano jako ostateczny dla preparatu. Zgodność wyników badania podano jako wartości procentowe zgodności wyników dodatnich (PPA) i zgodności wyników ujemnych (NPA) pomiędzy zestawem CINtec PLUS Cytology Kit w automacie do barwienia VENTANA BenchMark a produktem referencyjnym. Tabela 4. Zgodność wyników badania między zestawem CINtec PLUS Cytology Kit a produktem referencyjnym: preparaty cytologiczne z materiału z szyjki macicy przygotowane metodą ThinPrep. Zestaw CINtec PLUS Cytology Kit (n) Produkt referencyjny (N) + - + 140 25-17 147 Razem 157 172 PPA (n/n) (95-proc. przedział ufności) = 140/157 x 100% = 89,2% (83,3-93,1%) NPA (n/n) (95-proc. przedział ufności) = 147/172 x 100% = 85,5% (79,4-90,0%) Tabela 5. Zgodność wyników testu między zestawem CINtec PLUS Cytology Kit a produktem referencyjnym przy badaniu preparatów cytologicznych z szyjki macicy SurePath. Zestaw CINtec PLUS Cytology Kit (n) Produkt referencyjny (N) + - + 56 3-9 108 Razem 65 111 PPA (n/n) (95-proc. przedział ufności) = 56/65 x 100% = 86,2% (75,7-92,5%) NPA (n/n) (95-proc. przedział ufności) = 108/111 x 100% = 97,3% (92,4-99,1%) Tabela 6. Zgodność wyników testu między zestawem CINtec PLUS Cytology Kit a produktem referencyjnym przy badaniu preparatów z cytologicznymi rozmazami tradycyjnymi z szyjki macicy. Zestaw CINtec PLUS Cytology Kit (n) Produkt referencyjny (N) + - + 98 17-20 72 Razem 118 89 PPA (n/n) (95-proc. przedział ufności) = 98/118 x 100% = 83,1% (75,3-88,8%) NPA (n/n) (95-proc. przedział ufności) = 72/89 x 100% = 80,9% (71,5-87,7%) PIŚMIENNICTWO 1. Wentzensen N, von Knebel Doeberitz M. Biomarkers in cervical cancer screening. Dis Markers. 2007;23:315-30. 2. Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 2000;182:311-22. 3. Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, et al. Overexpression of p16 INK4a as a specific marker for dysplasia and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer 2001;92:276-84. 4. Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, et al. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions. Am J Pathol. 1998;153:1741-8. 5. Cuschieri K, Wentzensen N. Human papillomavirus mrna and p16 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17:2536-45. 6. Bergeron C, Ordi J, Schmidt D, et al. Conjunctive p16 INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2010;133:395-406. 7. Del Pino M, Garcia S, Fusté V, et al. Value of p16 INK4a as a marker of progression/ regression in cervical intraepithelial neoplasia grade 1. Am J Obstet Gynecol. 2009; 201(5):488. 8. Ordi J, Garcia S, del Pino M, et al. p16 INK4a immunostaining identifies occult CIN lesions in HPV-positive women. Int J Gynecol Pathol. 2008;28:90-7. 9. Wang SS, Trunk M, Schiffman M, et al. Validation of p16 INK4a as a marker of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a populationbased cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004;13:1355-60. 10. Galgano MT, Castle PE, Atkins KA, et al. Using biomarkers as objective standards in the diagnosis of cervical biopsies. Am J Surg Pathol. 2010;8:1077-87. 11. Carozzi F, Confortini M, Dalla Palma P, et al. Use of p16 INK4a over-expression to increase the specificity of human papillomavirus testing: a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial. Lancet Oncol. 2008;9:937-45. 2016-02-04 7 / 8 1012838PL Rev D

12. Denton K, Bergeron C, Klement P, et al. The sensitivity and specificity of p16 INK4a Cytology versus HPV Testing for Detecting High-Grade Cervical Disease in the Triage of ASC-US and LSIL Pap Cytology Results. Am J Clin Pathol. 2010;134:12-21. 13. Carozzi F, Gillio-Tos A, Confortini M, et al. Risk of high-grade cervical intraepithelial neoplasia during follow-up in HPV-positive women according to baseline p16- INK4a results: a prospective analysis of a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial. Lancet Oncol. 2013;14(2):168-76. 14. Ikenberg H, Bergeron C, Schmidt D, et al., PALMS study group (2013). Screening for Cervical Cancer Precursors with p16/ki-67 Dual-stained Cytology: Results of the PALMS Study. J Natl Cancer Inst. 2013;105(20):1550-7. 15. Schmidt D, Bergeron C, Denton KJ, et al. p16/ki-67 Dual-stain cytology in the triage of ASCUS and LSIL Papanicolaou cytology: Results from the European Equivocal or Mildly Abnormal Pap Cytology Study (EEMAPS). Cancer Cytopathol. 2011;119(3):158-66. 16. Petry KU, Schmidt D, Scherbring S, et al. Triaging Pap cytology negative, HPV positive cervical cancer screening results with p16/ki-67 Dual-stained cytology. Gynecol Oncol. 2011;121(3):505-09. 17. Ravarino A, Nemolato S, Macciocu E, et al. CINtec PLUS immunocytochemistry as a tool for the cytologic diagnosis of glandular lesions of the cervix uteri. Am J Clin Pathol. 2012;138(5):652-56. 18. Singh M, Mockler D, Akalin A, et al. Immunocytochemical colocalization of p16( INK4a ) and Ki-67 predicts CIN2/3 and AIS/adenocarcinoma. Cancer Cytopathol. 2012;120(1):26-34. 19. Waldstrøm M, Christensen RK, Ornskov D. Evaluation of p16 INK4a /Ki-67 dual stain in comparison with an mrna human papillomavirus test on liquid-based cytology samples with low-grade squamous intraepithelial lesion. Cancer Cytopathol. 2013;121(3):136-45. 20. Wentzensen N, Schwartz L, Zuna RE, et al. Performance of p16/ki-67 immunostaining to detect cervical cancer precursors in a colposcopy referral population. Clin Cancer Res. 2012;18(15):4154-62. 21. Killeen JL, Dye T, Grace C, et al. Improved Abnormal Pap Smear Triage Using Cervical Cancer Biomarkers. J Low Genit Tract Dis. 2013 Jun 11. [Epub ahead of print] 22. Birdsong G., Husain M., Faison T, et al. Cervicovaginal Cytology Based on the Papanicolaou Technique; Approved Guideline- Third Edition. CLSI document GP15- A3. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2008. 23. Solomon D, Davey D, Kurman R, et al. The 2001 Bethesda system. Terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA. 2002;287:2114-9. WŁASNOŚĆ INTELEKTUALNA BENCHMARK, CINtec, VENTANA oraz logo VENTANA są znakami towarowymi firmy Roche. Pozostałe znaki towarowe stanowią własność odnośnych właścicieli. 2013 Ventana Medical Systems, Inc. DANE TELEADRESOWE Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D-68305 Mannheim Germany www.ventana.com 2016-02-04 8 / 8 1012838PL Rev D