W CENTRALNY OŚRODEK BADAŃ JAKOŚCI W DIAGNOSTYCE MIKROBIOLOGICZNEJ 01-793 Warszawa, ul. Rydygiera 8 bud. 20A, tel./fax (22) 841 58 34; Księgowość-Kadry tel. (22) 841 00 90 fax. (22) 851 52 06 NIP 5212314007 REGON 012629651 www.polmikro.edu.pl e-mail: sprawdzian@polmicro.edu.pl; sekretariat@polmicro.edu.pl OŚR.ZM.416.7.2015.1.14.KB Warszawa, 15.10.2015 r. Dotyczy: IV tury Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej POLMICRO 2015 edycja ogólna Szanowni Państwo Zakończono czwartą turę sprawdzianu POLMICRO 2015 edycji ogólnej. W ramach IV tury sprawdzianu wszystkie laboratoria otrzymały pięć preparatów mikroskopowych opisanych jako A, B, C, D i E. Preparaty A i B były preparatami z dodatnich hodowli krwi na podłożu bulionowym (tzw. dodatnich butelek), a preparaty C, D i E były wykonane z jednorodnych hodowli bakteryjnych na podłożu krwawym. Preparaty zostały utrwalone 98% alkoholem etylowym. Zadaniem laboratoriów było zabarwienie preparatów B, C, D i E metodą Grama, z wyjątkiem preparatu A, który był już zabarwiony w COBJwDM i gotowy do oglądania, oraz ocena wszystkich preparatów pod mikroskopem. Na potrzeby IV tury przygotowano 24 różne zestawy preparatów. Materiały kontrolne rozesłano do 453 laboratoriów, odpowiedzi udzieliło 449 uczestników (99,1%). INTERPRETACJA PREPARATÓW MIKROSKOPOWYCH BARWIONYCH METODĄ GRAMA Preparat A ziarenkowce Gram-dodatnie Prawidłową interpretację preparatu A podało 335 z 449 laboratoriów, tj. 74,61%. Preparat A przygotowany został z dwóch dodatnich hodowli krwi, w których stwierdzono obecność ziarenkowców Gram-dodatnich. Laboratoria zostały losowo podzielone na dwie grupy: Grupa I dla preparatu A: Dwieście dwadzieścia siedem (50,6%) laboratoriów otrzymało na szkiełku A preparat z dodatniej hodowli krwi z wykorzystaniem szczepu Streptococcus pneumoniae PM-247. W preparacie widoczne były ziarenkowce Gram-dodatnie (zdjęcie 1 i 2), można było także dostrzec charakterystyczne dwoinki o układzie płomyków. Prawidłową odpowiedź obecne ziarenkowce Gram-dodatnie zaznaczyło 157 z 227 laboratoriów (69,8%). Siedemdziesiąt laboratoriów (30,8%) nieprawidłowo zinterpretowało preparat A: - sześćdziesiąt sześć (29,1%) laboratoriów oceniło, że w preparacie znajdują się ziarenkowce Gram-ujemne, - trzy ośrodki podały, że w preparacie widoczne są pałeczki Gram-ujemne, - jedno laboratorium podało, że w preparacie widoczna jest flora mieszana składająca się z ziarenkowców Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Grupa II dla preparatu A: Dwieście dwadzieścia dwa (49,6%) laboratoria otrzymały rozmaz dodatniej kropli krwi zawierający szczep Staphylococcus aureus PM-248 (zdjęcia 3 i 4). Sto sześćdziesiąt osiem z 222 ośrodków (75,23%) prawidłowo podało, że w preparacie widoczne są ziarenkowce Gram-dodatnie. Pięćdziesiąt (22,5%) ośrodków błędnie określiło znajdujące się w preparacie drobnoustroje jako ziarenkowce Gram-ujemne, dwa laboratoria jako pałeczki Gram-ujemne, a kolejne dwa podały, że w preparacie widoczne są zarówno ziarenkowce Gram-dodatnie jak i Gram-ujemne.
Zdjęcie 1 i 2. Rozmaz kropli krwi barwiony metodą Grama - ziarenkowce Gram-dodatnie (S. pneumoniae). Zdjęcie 3 i 4. Rozmaz kropli krwi barwiony metodą Grama - ziarenkowce Gram-dodatnie (S. aureus). Komentarz do preparatu A. Kluczowym dla właściwej interpretacji preparatu z krwi jest wybór miejsca oceny preparatu. Rozmaz kropli krwi ma różną grubość na całej swojej długości, w związku z tym przenikanie barwnika do elementów morfotycznych i komórek drobnoustrojów oraz jego wypłukiwanie w kolejnych etapach barwienia metodą Grama może być różne. Preparatu nie powinno się oglądać na jego brzegach, gdyż w miejscach, gdzie preparat jest bardzo gruby, barwnik gromadzi się między komórkami i tło preparatu (krwinki czerwone), jak i drobnoustroje przyjmują granatowe zabarwienie, natomiast w cienkich miejscach preparatu odbarwienie jest silniejsze, co stwarza trudności w ocenie preparatów. Interpretacja preparatów z dodatnich posiewów krwi jest bardzo trudna i wymaga doświadczenia. Na obejrzenie pojedynczego preparatu powinno się poświęcić 15-20 minut i ocenić przynajmniej 100 pól widzenia. Preparat B bakterie Gram-ujemne (pałeczki Gram-ujemne lub ziarenkowce Gram-ujemne) Prawidłową interpretację preparatu B podało 305 z 449 laboratoriów, tj. 67,93%. Preparat B przygotowany został z dwóch dodatnich hodowli krwi, w których stwierdzono obecność bakterii Gram-ujemnych. Laboratoria zostały losowo podzielone na dwie grupy: Grupa I dla preparatu B: Dwieście dwadzieścia osiem (50,8%) laboratoriów otrzymało zestaw zawierający w preparacie B (rozmaz krwi) pałeczki Gram-ujemne (szczep Escherichia coli PM-249) (zdjęcie 5 i 6). Preparat został oceniony poprawnie przez 156 spośród 228 laboratoriów (68,4%). Siedemdziesiąt dwa (31,6%) ośrodki błędnie oceniły obraz mikroskopowy: Strona 2 z 7
- trzydzieści (13,2%) laboratoriów podało, że w preparacie znajdują się ziarenkowce Gram-dodatnie, - trzynaście (5,7%) stwierdziło, że w preparacie znajdują się ziarenkowce Gram-ujemne, - siedem (3,1%) laboratoriów wskazało na laseczki Gram-dodatnie, - dwadzieścia (8,8%) ośrodków oceniło, że są to pałeczki Gram-dodatnie, - jedno laboratorium stwierdziło obecność flory mieszanej ziarenkowców i pałeczek Gram-ujemnych, - a jedno laboratorium nie podało interpretacji dla tego preparatu. Zdjęcie 5 i 6. Rozmaz kropli krwi barwiony metodą Grama - pałeczki Gram-ujemne (E.coli). Grupa II dla preparatu B: Dwieście dwadzieścia jeden (49,2%) ośrodków otrzymało rozmaz dodatniej kropli krwi zawierający ziarenkowce Gram-ujemne Neisseria meningitidis PM-250 (zdjęcie 7 i 8). Sto czterdzieści dziewięć z grupy 221 laboratoriów (67,4%) prawidłowo zinterpretowało preparat B. Błędna interpretacja preparatu była udziałem 72 laboratoriów: - pięćdziesiąt cztery (24,4%) ośrodki błędnie podały, że w preparacie znajdują się ziarenkowce Gram-dodatnie, - dwa laboratoria stwierdziły obecność flory mieszanej (ziarenkowce Gram-ujemne i Gram-dodatnie), - piętnaście (6,8%) laboratoriów niepoprawnie oceniło morfologię kolonii bakteryjnych kwalifikując obecne w preparacie drobnoustroje jako pałeczki Gram-ujemne, - jedno laboratorium nie podało interpretacji tego preparatu. Zdjęcie 7 i 8. Rozmaz kropli krwi barwiony metodą Grama - ziarenkowce Gram-ujemne (N. meningitidis). Strona 3 z 7
Preparaty C, D, E pałeczki Gram-dodatnie/ laseczki Gram-dodatnie/pałeczki Gram-ujemne Każdy uczestnik sprawdzianu otrzymał wszystkie trzy preparaty wykonane z jednorodnych hodowli bakteryjnych, ale w zależności od zestawu były one oznaczone różnymi nazwami C, D lub E. Do przygotowania wykorzystano zawiesiny w soli fizjologicznej trzech szczepów kontrolnych: Corynebacterium diphteriae PM-251, Bacillus subtilis PM-252 i Capnocytophaga canimorsus PM-253. Corynebacterium diphteriae PM-251 Prawidłową interpretację preparatu zawierającego zawiesinę szczepu Corynebacterium diphteriae PM- 251 podało 399 z 449 laboratoriów, tj. 88,87%. Wszystkie laboratoria otrzymały preparat z hodowli Corynebacterium diphteriae na podłożu krwawym (zdjęcia 9 i 10). W preparacie widoczne były pałeczki Gram-dodatnie ułożone charakterystycznie w palisady (komórki ułożone równolegle) oraz przypominające litery X, V, Y (tzw. pismo klinowe). Układ ten jest charakterystyczny dla maczugowców i ma związek z podziałem komórki. Komórki maczugowców barwią się nierównomiernie w metodzie Grama, co jest związane z obecnością metachromatycznych ziarnistości materiałów zapasowych (wolutyna, ziarnistości Ernsta-Babesa). Preparat Gram-dodatnich pałeczek Corynebacterium diphteriae dla 156 laboratoriów przygotowano jako preparat C, dla 146 jako D, a dla 147 jako E. Pięćdziesiąt (11,1%) ośrodków nieprawidłowo oceniło drobnoustroje widoczne pod mikroskopem: - dwadzieścia dziewięć laboratoriów podało, że są to pałeczki Gram-ujemne, - trzynaście ziarenkowce Gram-dodatnie, - dwa ośrodki ziarenkowce Gram-ujemne, - trzy laseczki Gram-dodatnie, - jedno laboratorium stwierdziło obecność hodowli mieszanej (ziarenkowce i pałeczki Gram-dodatnie), - dwa laboratoria nie podały interpretacji dla tego preparatu. Zdjęcie 9 i 10. Pałeczki Gram-dodatnie (hodowla Corynebacterium diphteriae) Bacillus subtilis PM-252 Prawidłową interpretację preparatu zawierającego zawiesinę szczepu Bacillus subtilis PM-252 podało 400 z 449 laboratoriów, tj. 98,2%. Wszystkie laboratoria otrzymały także preparat z hodowli Bacillus subtilis na podłożu krwawym: 147 laboratoriów otrzymało preparat oznaczony literą C, 154 - D a 148 - E. Bacillus subtilis jest Gram-dodatnią laseczką (zdjęcie 11 i 12). Przetrwalniki wytwarzane przez Bacillus subtilis są owalne i położone centralnie w komórce, a w preparatach barwionych metodą Grama nie barwią się (wyglądają jak puste miejsca w komórce). Strona 4 z 7
Laboratoria nie miały większych problemów z oceną tego preparatu. Tylko osiem z 449 ośrodków (1,8%) udzieliło nieprawidłowej odpowiedzi określając widoczne w preparacie laseczki Gram dodatnie jako: - pałeczki Gram-dodatnie pięć laboratoriów, - pałeczki Gram-ujemne dwa laboratoria, - brak odpowiedzi jedno laboratorium. Zdjęcie 11 i 12. Przetrwalnikujące laseczki Gram-dodatnie (hodowla Bacillus subtilis) Capnocytophaga canimorsus PM-253 Prawidłową interpretację preparatu zawierającego zawiesinę szczepu Bacillus subtilis PM-252 podało 421 z 449 laboratoriów, tj. 93,77%. Wszyscy uczestnicy Sprawdzianu otrzymali preparat z hodowli Capnocytophaga canimorsus (146 ośrodków jako preparat C, 149-D i 154-E). Z preparatem z hodowli tego drobnoustroju laboratoria biorące udział w Sprawdzianie miały możliwość zetknąć się podczas II tury POLMICRO 2014. Capnocytophaga spp. w preparacie mikroskopowym z hodowli (72 h) na podłożu krwawym barwionym metodą Grama widoczne są zarówno jako Gram-ujemne, wydłużone, cienkie, ostro zakończone (wrzecionowate) pałeczki młoda hodowla, jak i drobne pleomorficzne Gram-ujemne komórki pochodzące ze starszej hodowli (zdjęcie 13 i 14). Tylko 28 (6,24%) laboratoriów błędnie oceniło ten preparat. Spośród tych laboratoriów dziewiętnaście podało, że w preparacie znajdują się pałeczki Gram-dodatnie, cztery ośrodki zakwalifikowały widoczne drobnoustroje jako laseczki Gram-dodatnie, dwa stwierdziły obecność hodowli mieszanej (pałeczki Gram-dodatnie i Gramujemne), kolejne dwa laboratoria podały interpretację: ziarenkowce Gram-dodatnie jedno, a ziarenkowce Gramujemne drugie. Jeno laboratorium nie oceniło tego preparatu. Zdjęcie 13 i 14. Pałeczki Gram-ujemne (hodowla Capnocytophaga canimorsus) Strona 5 z 7
Wnioski: Preparaty z krwi okazały się najbardziej dyskusyjne w ocenie. Problematyczna była zarówno interpretacja koloru komórek bakteryjnych barwionych metodą Grama, jak i ocena kształtu komórek bakteryjnych w preparatach bezpośrednich z krwi. Szczególnie istotny przy ocenie rozmazów z kropli krwi jest wybór właściwego miejsca do oceny morfologii komórki bakteryjnej i zabarwienia komórek bakterii. Nie odnotowano różnicy w interpretacji między preparatami zabarwionymi w COBJwDM (preparat A), a preparatami zabarwionymi w laboratorium (preparat B). Połowa laboratoriów w preparacie B otrzymała pałeczki Gram-ujemne, a połowa ziarenkowce Gramujemne. Stopień trudności oceny preparatów był podobny i nie odnotowano znaczących różnić w interpretacji między laboratoriami dla dwóch typów preparatów. Preparaty z jednorodnych hodowli bakteryjnych na podłożu stałym nie przysporzyły laboratoriom większych problemów interpretacyjnych Najłatwiejszy w ocenie okazał się preparat z hodowli Bacillus subtilis (najmniejsza liczba błędnych odpowiedzi). Najwięcej nieprawidłowości odnotowano w ocenie preparatu z hodowli Corynebacterium diphteriae, w tym przypadku najwięcej błędów dotyczyło oceny barwienia Grama, a nie morfologii komórek bakterii. Ocena preparatów pochodzących z materiałów klinicznych jest bardzo ważnym elementem pierwszego etapu diagnostyki mikrobiologicznej, przeprowadzona tura sprawdzianu wykazała, że istnieje potrzeba doskonalenia tego obszaru badawczego oraz przeprowadzania kontroli tego etapu diagnostyki, podstawowej umiejętności jaką jest ocena bezpośredniego preparatu mikroskopowego. W kilku przypadkach negatywna ocena Sprawdzianu związana jest z porozumiewaniem się Laboratoriów między sobą i przekazywaniem informacji dotyczących wyników. Laboratoria te nie podejrzewały, że otrzymały różne zestawy preparatów. Standaryzacja badania i kontrola jakości: Z każdego rodzaju preparatów przygotowanych w ramach IV tury POLMICRO pobrano serię kontrolną, która stanowiła 19,6% (n=450) prób badanych. Każdy preparat z serii kontrolnej został zabarwiony, a następnie oceniony pod mikroskopem - barwienie metodą Grama oraz morfologia kolonii. Granica wykrywalności dla preparatów z hodowli krwi została ustalona na 10 8 cfu/ml, natomiast z preparatów z hodowli bakteryjnych na 10 5 cfu/ml. Preparaty wysłane do Laboratoriów w ramach tej tury Sprawdzianu zostały przygotowane z zawiesin o gęstości 4MF (preparaty A, B) oraz 0,5MF (preparaty C, D, E). KRYTERIA PRZYZNANIA OCENY POZYTYWNEJ/OCENY NEGATYWNEJ WSKAŹNIK Z (Z-SCORE) W IV turze sprawdzianu POLMICRO 2015 maksymalna liczba punktów X wynosiła 10. Odchylenie standardowe wynosiło σ=0,99 i zostało obliczone na podstawie wyników 358 laboratoriów, tych które uzyskały powyżej 60% punktów z maksymalnej liczby punktów w sprawdzianie (> 6 pkt.). Aby otrzymać ocenę pozytywną należało uzyskać 8 pkt. z 10 pkt. możliwych. Średnia liczba punktów zdobytych przez uczestników wynosiła 8,4 pkt., natomiast średnia wartość wskaźnika z obliczona dla laboratoriów biorących udział w niniejszej turze sprawdzianu była równa 1,58. 358 (79,7%) laboratoriów otrzymało z < 3: o 209 laboratoriów (46,5%) otrzymało wskaźnik z 2, co oznacza uzyskanie bardzo dobrych wyników w IV turze Sprawdzianu. Laboratoria te prawidłowo oceniły wszystkie preparaty i uzyskały maksymalną liczbę punktów. Strona 6 z 7
o w przypadku 149 (33,2%) uczestników wynik Sprawdzianu był wątpliwy - (2,0 < z <3,0), ale zgodnie z kryteriami oceny, wg wskaźnika z, laboratoria te otrzymują ocenę pozytywną. Laboratoria te podały błędną interpretację dla jednego preparatu, przy czym najwięcej nieprawidłowych odpowiedzi dotyczyło preparatu A (n=63) i preparatu B (n=62). Dla tych laboratoriów uzyskany wynik jest sygnałem ostrzegawczym i jednocześnie wskazaniem elementów, które laboratorium powinno doskonalić. wskaźnik z 3,0 równoznaczny z otrzymaniem oceny negatywnej uzyskało 91 (20,3%) laboratoriów. Tabela 1. Wartość wskaźnika z dla laboratoriów biorących udział w IV turze POLMICRO 2015 Pozytywny wynik IV tury sprawdzianu POLMICRO 2015 uzyskało trzysta pięćdziesiąt osiem (79,7%) laboratoriów biorących udział w programie. Laboratoriom tym gratulujemy, a wszystkich uczestników zachęcamy do udziału w kolejnych turach sprawdzianu, życząc powodzenia. Reklamacje, uwagi i spostrzeżenia prosimy kierować drogą elektroniczną na adres e-mailowy: sprawdzian@polmicro.edu.pl, w nieprzekraczalnym terminie dwóch tygodni od ukazania się wyników. Informujemy, iż w ramach ujednolicania adresów pocztowych obowiązujące adresy mailowe do Ośrodka znajdują się na stronie internetowej www.polmicro.edu.pl w zakładce kontakt. Opracowanie: Karolina Bosacka, mgr anal. med. Elżbieta Stefaniuk, dr n. med. Ewa Młodzińska, mgr biol. /-/ Prof. dr hab. med. Waleria Hryniewicz Dyrektor Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej Strona 7 z 7