PRACE ORYGINALNE. Wstêp Badania naukowe nad przewlek³¹ bia-

PRACE ORYGINALNE Tomasz SACHA Kajetana FORYCIARZ Izabela FLOREK agdalena ZAWADA Sylwia CZEKALSKA Dorota CWYNAR El bieta PÊCEK Aleksander B. SKOTNICKI Katedra i Klinika Hematologii Collegium edicum UJ w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab.med Aleksander B. Skotnicki utacje punktowe domeny kinazy ABL jako przyczyna opornoœci na leczenie chorych na przewlek³¹ bia³aczkê szpikow¹ inhibitorami kinaz tyrozynowych. Doœwiadczenia Kliniki Hematologii CUJ w Krakowie ABL domain kinase point mutations as a cause of resistance to therapy of patients with chronic myeloid leukemia with tyrosine kinase inhibitors. Single center experience Dodatkowe s³owa kluczowe: przewlek³a bia³aczka szpikowa mutacje punktowe ABL leczenie inhibitorami kinaz tyrozynowych opornoœæ Additional key words: chronic myeloid leukemia ABL point mutations therapy with tyrosine kinase inhibitors resistance Wprowadzenie do terapii przewlek³ej bia³aczki szpikowej (PBSz) inhibitorów kinaz tyrozynowych (TKI) bardzo istotnie poprawi³o wyniki leczenia i rokowanie chorych na PBSz. imo bardzo du ej skutecznoœci TKI, u pewnej grupy chorych pojawia siê opornoœæ na powy sze leczenie, które po kilku latach mo e dotyczyæ nawet 40% pacjentów. Istnieje wiele mechanizmów opornoœci na leczenie TKI. Jednym z nich wykrywanym technikami biologii molekularnej jest wystêpowanie mutacji punktowych domeny kinazy ABL. Celem badania by³o przeprowadzenie analizy obecnoœci mutacji u chorych opornych na leczenie TKI. utacje genu ABL wykryto u 19 (,6%) pacjentów opornych na leczenie TKI. W czterech przypadkach z wykryt¹ mutacj¹ ABL dosz³o do progresji choroby do fazy kryzy. Badanie mutacji genu ABL pomaga u czêœci chorych na PBSz w znalezieniu przyczyny opornoœci na leczenie TKI. Introduction of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the therapy of chronic myeloid leukemia have been significantly improved the results of the treatment and prognosis of CL patients. Despite of high efficacy of TKIs therapy, resistance is developing in substantial percentage of patients, which accounts for up to 40% after several years of treatment. There are several identified mechanisms of resistance to TKIs. The presence of ABL kinase domain point mutation, which could be detected by molecular methods is one of them. The aim of the study was to screen CL patients resistant to TKI therapy for the presence of ABL point mutation. ABL mutation was detected in 19 (,6%) patients. In four cases with detected mutation the disease has progressed to blast crisis. Investigation of ABL mutation occurrence can help in finding the cause of resistance to TKI therapy in some patients suffering from CL. Adres do korespondencji: Tomasz Sacha Katedra i Klinika Hematologii Collegium edicum UJ w Krakowie ul. Kopernika 17, -501 Kraków, Polska Tel.: +48 12 424 76 00; Fax +48 12 424 74 26; e-mail: sachatom@gmail.com Wstêp Badania naukowe nad przewlek³¹ bia- ³aczk¹ szpikow¹ (PBSz) tocz¹ce siê na przestrzeni ostatnich 50. lat dostarczy³y podstawy do opracowania nowoczesnego i niezwykle skutecznego leczenia farmakologicznego wykorzystuj¹cego inhibitory kinaz tyrozynowych (TKI). Specyficzne zablokowanie nadmiernie aktywnej kinazy tyrozynowej bcr/ abl kodowanej przez gen BCR/ABL powstaj¹cy wskutek wzajemnej wymiany ramion d³ugich chromosomów 9 i 22 pary doprowadza do ca³kowitej remisji hematologicznej i cytogenetycznej u znacznej wiêkszoœci, a wiêkszej remisji molekularnej u znacz¹cego odsetka chorych., który jest pierwszym zarejestrowanym TKI sta³ siê lekiem pierwszego wyboru w leczeniu PBSz w fazie przewlek³ej. imo swojej du ej skutecznoœci, w pierwszym roku leczenia, którego wyniki analizowano w ramach badania IRIS ok. 30% pacjentów nie uzyska³o ca³kowitej remisji cytogenetycznej (CCgR) [26]. Dodatkowo, w ci¹gu pierwszych 5 lat terapii u ok. 10% chorych odnotowano nawrót choroby, z czego u 10% pacjentów wyst¹pi³ on po uprzednim osi¹gniêciu CCgR [9]. Powy sze dane wskazuj¹ na wystêpowanie opornoœci komórek zawieraj¹cych gen BCR/ABL na leczenie imatynibem, co potwierdza równie zjawisko wykrywania u wiêkszoœci chorych osi¹gaj¹cych CCgR choroby resztkowej metodami biologii molekularnej [19], jak równie pojawianie siê nawrotów choroby po osi¹gniêciu ca³kowitej remisji molekularnej (ColR) trwaj¹cej nawet dwa lata. [29]. Istnieje wiele przyczyn powstawania opornoœci na leczenie imatynibem i innymi inhibitorami kinaz tyrozynowych. Czêœæ z nich zosta³a zidentyfikowana podczas badañ in vitro; nale ¹ do nich amplifikacja genu BCR/ABL [8, 14, ], 253

zwiêkszenie iloœci bia³ka bcr/abl bez amplifikacji genu BCR/ABL [], obecnoœæ uœpionych komórek progenitorowych CD34+ z chromosomem Ph niewra liwych na dzia³anie TKI [14], a tak e wzrost ekspresji glikoproteiny opornoœci wielolekowej (Pgp-1) [24] oraz zwiêkszone stê enie kwaœnej a-1- glikoproteiny (AGP) w surowicy krwi [13]. Do mechanizmów opornoœci wykrywanych u pacjentów nieodpowiadaj¹cych optymalnie na leczenie lub trac¹cych uzyskan¹ odpowiedÿ nale ¹: wystêpowanie mutacji domeny ABL kinazy tyrozynowej BCR/ABL, genomowa amplifikacja lub nadmierna ekspresja genu BCR/ABL i ewolucja klonalna z dodatkowymi zaburzeniami genetycznymi. Celem niniejszej pracy by³o zastosowanie opracowanej metody wykrywania mutacji genu BCR/ABL [11] i przebadanie grupy chorych na PBSz wykazuj¹cych opornoœæ na leczenie inhibitorami kinaz tyrozynowych, pozostaj¹cych w opiece Kliniki Hematologii CUJ w Krakowie. Tabela I Charakterystyka mutacji punktowych domeny ABL wykrytych u chorych na PBSz z przynajmniej nieoptymaln¹ odpowiedzi¹ na leczenie TKI wg. kryteriów ELN. ABL domain point mutation characteristics detected in patients with CL with suboptimal response or resistant to TKI therapy according to ELN criteria. ateria³ i metody Grupê badan¹ stanowi³o chorych na przewlek³¹ bia³aczkê szpikow¹, (25 kobiet i 35 mê czyzn) leczonych inhibitorami kinaz tyrozynowych w Klinice Hematologii UJC w Krakowie w latach 2000-2010 przez okres przynajmniej 3 miesiêcy z suboptymaln¹ odpowiedzi¹ na leczenie TKI lub wykazuj¹cych opornoœæ definiowan¹ wed³ug zaleceñ ekspertów European Leukemia Net (ELN) [2]. Œredni wiek pacjentów wynosi³ 48,9 roku (21-84). Œredni czas przyjmowania TKI wynosi³ 26 miesiêcy. Do badania kwalifikowano tak e pacjentów, u których dosz³o do 10. krotnego wzrostu (o 1 logarytm) iloœci transkryptu genu BCR/ABL w badaniu RQ-PCR. Analizowano materia³ pochodz¹cy z krwi obwodowej pobranej w chwili stwierdzenia opornoœci na leczenie. W momencie badania mutacji genu BCR/ABL pacjentów pozostawa³o w fazie przewlek³ej (90%), 1 w fazie akceleracji (1,6%) i 5 w fazie kryzy (8,3%). W chwili badania 49 pacjentów (81,6%) otrzymywa³o imatynib, 10 (16,6%) dazatynib i 2 osoby (3,3%) nilotynib. Pobranie krwi do analizy, izolacjê RNA z krwi obwodowej, ³añcuchow¹ reakcjê poprzedzon¹ odwrotn¹ transkrypcj¹ (RT-PCR) oraz iloœciow¹ ³añcuchow¹ reakcjê polimerazy w czasie rzeczywistym (RQ-PCR) przeprowadzono wed³ug metodyki opisanej wczeœniej []. Produkt reakcji PCR (po 5 ml z 1 ml buforu obci¹ aj¹cego) oceniano po rozdziale elektroforetycznym w 2% elu agarozowym wzglêdem standardu masowego. Otrzymane produkty oczyszczano przy pomocy zestawu Qiagen/ Roche wed³ug zamieszczonego w nim protoko³u. Produkty PCR wycinano z elu i dodatkowo oczyszczano w przypadku obecnoœci zanieczyszczeñ lub pojawienia siê niespecyficznych pr¹ ków w elektroforezie. Produkty przechowywano w temperaturze 4 C, do czasu wykonania reakcji PCR sekwencyjnej [5,]. PCR sekwencyjna i sekwencjonowanie. Badaniu technik¹ sekwencjonowania poddawano tylko próbki, których Ct (treshhold cycle) dla genu ABL zawiera³ siê pomiêdzy 20-. Przy liczbie cykli <20 nie uzyskiwano produktu PCR lub by³ on zbyt s³abej jakoœci. Powy ej cyklu czu³oœæ reakcji PCR znacznie spada, uznano ponadto, e uzyskany w przebiegu takiej reakcji produkt jest niemiarodajny, a jego dalsze badanie móg³by przynieœæ fa³szywe wyniki. Do reakcji sekwencjonowania u ywano 2-4 µl produktu PCR oraz starterów wykorzystywanych wczeœniej do reakcji wewnêtrznej PCR i prowadzono j¹ w kierunku sensownym i antysensownym. ieszaninê reakcyjn¹ BigDye version 3.1 rozmra- ano na lodzie bez dostêpu œwiat³a. Dla ka dego starte- Lp Inicja³ y WIek P³eæ Typ opornoœci 1 B.K. 2 B.. 53 K Nie 3 G.A. 61 K i 4 J.S. 62 5 K.. uzyskano R 6 K.A. Utrata 7 K.S. 8.. 41, 9.J. 69 K Utrata 10.A. 32 K Nie 11 P.W. 35 12 P.H. 59 K 13 S.J. 14 S.R. 15 T.J. 84 16 T.E. 17 W.A. 61 K Nie Utrata CCgR Utrata 18 W.L. Utrata CCgR 19 W.D. 25 Typ mutacji E255V T5I A9T Q252H V299L Q252H F359I T5I G250E F1L R220H (D241D) L4 V9A F7L H6R G250E T5I E2K Wykryta podczas leczenia utacja z regionup-loop (Tak / Nie) Oporna klinicznie na N N T N Nilotynib, N T N T N N, T N Wra liwoœæ in vitro na TKI (wg Baccarani 2009),,,,, N I matynib, Brak danych N N N N N IFN alfa T, N Brak danych Nilotynib,, Nilotynib 2 T. Sacha i wsp.

ra u ytego do wewnêtrznej reakcji PCR sporz¹dzano oddzieln¹ mieszaninê reakcyjn¹ o sk³adzie: 5x Buffer w objêtoœci 1µl, mieszaninê reakcyjn¹ Big Dye 3 Sequencing w objêtoœci 4 µl i starter w objêtoœci 3,2 µl. Do tak przygotowanych mieszanin reakcyjnych (w objêtoœci 18 µl ka da) ze starterem sensownym (F) i antysensownym (R) dodawano 2-4 µl oczyszczonego produktu PCR i stosuj¹c profil temperatur zawarty w tab.1 prowadzono PCR sekwencyjn¹. Po jej zakoñczeniu produkt reakcji oczyszczano przy u yciu BigDyeÒ XTerminatorÔ Purification Kit wg zaleceñ producenta. 2. godzinn¹ elektroforezê sekwencyjn¹ w elu poliakrylamidowym (POP- 6T Polymer Applied Biosystems) 2-10 µl oczyszczonego produktu prowadzono przy u yciu analizatora genetycznego AbiPrism 0. Otrzymany w jej wyniku elektroforegram zawiera³ sekwencje nukleotydów, które porównywano z sekwencjami referencyjnymi w bazach genowych (nr sekwencji: 14752, X16416, U07563) oraz analizowano stosuj¹c program FinchTV. Jeœli mutacjê genu BCR/ABL wykrywano po raz pierwszy u badanego pacjenta wówczas zgodnie z zaleceniami [5] ca³¹ procedurê powtarzano u ywaj¹c odrêbnej próbki krwi lub odrêbnego RNA w celu wyeliminowania pomy³ki [3, 20]. Po potwierdzeniu obecnoœci mutacji wydawano wynik zawieraj¹cy informacje dotycz¹ce rodzaju mutacji, zamiany nukleotydu i aminokwasu, odsetka zmutowanego allelu oraz czy dana mutacja wystêpuje w pêtli P. Wobec istotnych ograniczeñ w interpretacji klinicznej wyników prowadzonych in vitro badañ nad profilem wra - liwoœci okreœlonych mutacji na stosowane w leczeniu TKI nie zamieszczano takiej informacji w wydawanych wynikach co jest zgodne z rekomendacjami ELN [2]. Wyniki utacje genu BCR/ABL wykryto u 19 (,6%) pacjentów (6 kobiet i 13 mê czyzn). Œrednia wieku chorych z wykryt¹ mutacj¹ wynosi³a 50 lat (od 25-84). 14 pacjentów w chwili badania otrzymywa³o imatynib, 4 dazatynib, a 1 interferon alfa po odstawieniu dazatynibu spowodowanym utrat¹ ca³kowitej odpowiedzi hematologicznej (). utacje wykryto u 15 z (27,7%) chorych w fazie przewlek³ej i u 4 z 5 chorych w fazie kryzy. Charakterystykê wykrytych mutacji punktowych domeny kinazy ABL zestawiono w tabeli I. Najczêstsz¹ przyczyn¹ badania obecnoœci mutacji genu BCR/ABL by³o nieuzyskanie lub utrata ca³kowitej odpowiedzi cytogenetycznej (CCgR) zarówno w grupie pacjentów, u których mutacjê wykryto (u 12 spoœród 19 chorych), jak i u pacjentów bez mutacji (u 27 spoœród 41 chorych). Œrednia wieku pacjentów bez mutacji wynosi³a 48,4 lat (od 21-80). Rzadziej powodem badania by³a utrata ca³kowitej odpowiedzi hematologicznej (w grupie z wykryt¹ mutacj¹ u 4 z 19, w grupie bez mutacji u 3 z 41) i nieuzyskanie wiêkszej remisji molekularnej (w grupie z mutacj¹ u 2 z 19, w grupie bez mutacji u 5 z 41 chorych). Wykryto 22 mutacje. utacje czêœciej wystêpowa³y u chorych z opornoœci¹ pierwotn¹ i wtórn¹ (u 10 i 9 chorych odpowiednio) ni z odpowiedzi¹ suboptymaln¹ (w 2 przypadkach z 19) Do najczêœciej wykrywanych mutacji nale a³y: (wykryto 4) i T5I (wykryto 3). U 3 chorych wykryto po 2 mutacje. U 5 chorych wykryto mutacje nale ¹ce do regionu P-loop (E255V, Q252H, G250E); u 2 z tych pacjentów dosz³o do progresji choroby do fazy kryzy, u kolejnych 2 do utraty, 1 osoba utraci³a R. Progresji do kryzy uleg³o 3 pacjentów z grupy bez mutacji oraz 7 chorych z grupy z wykryt¹ mutacj¹; w 2 przy- Tabela II Przyczyny badania obecnoœci mutacji punktowych domeny ABL u chorych na PBSz z co najmniej nieoptymalnym wynikiem leczenia wg kryteriów ELN; pacjenci bez wykrytej mutacji. Indications for testing of ABL domain point mutation occurrence in patients with CL with suboptimal response or resistant to TKI therapy according to ELN criteria; patients with no detected mutation. L.p. Inicja³y pacjenta Wiek pacjenta P³eæ Badanie podczas leczenia 1 BI K 2 B K 3 CT K 4 DR 5 DB 63 6 FK 24 Nilotynib 7 F 22 8 FZ 21 9 GJ 10 GP 11 GG 67 K 12 HJ K Nilotynib 13 JS 14 J 69 K 15 KC 74 16 KD 42 K 17 KR 18 K 19 K 42 20 KK 33 21 LS 65 22 C 23 Z K 24 R 25 A 75 26 NJ 27 N PH 59 K 29 PE 53 K 30 PT 68 K PJ 55 K 32 SA 52 K 33 SW K 34 T 65 35 WB K 36 WB K W 72 K WK 80 WH 56 K 40 WP 34 41 ZB 51 K Przyczyna badania Utrata Nie uzyskano Utrata Progresja do akceleracji padkach by³y to mutacje z regionu pêtli P (Q252H i E255V), u pozosta³ych by³y to: T5I,, A9T, V299L, R220H(D241D) i F7L. Brak wra liwoœci klinicznej na stosowany w leczeniu drugiego rzutu dazatynib potwierdzi³ siê w przypadku mutacji T5I, F7L i V299L. 255

Omówienie Wystêpowanie mutacji punktowych domeny kinazy ABL jest jedn¹ z istotnych przyczyn opornoœci przewlek³ej bia³aczki szpikowej na leczenie inhibitorami kinaz tyrozynowych. Jak dot¹d u pacjentów opornych na leczenie TKI wykryto ponad 100 ró nych mutacji odpowiedzialnych za zmianê pojedynczych aminokwasów w domenie kinazy BCR/ABL [1,16,20,25,17,,32]. Ich wyst¹pienie mo e mieæ powa ne skutki biologiczne, które obejmuj¹ upoœledzenie funkcji kinazy BCR/ABL wywo³uj¹ce œmieræ komórki, upoœledzenie przy³¹czania imatinibu do kinazy przy zachowanym wi¹zaniu ATP co wiedzie do wznowienia dzia³ania kinazy i selekcji klonalnej zmutowanych komórek, upoœledzenie przy³¹czania imatinibu i ATP co zmniejsza aktywnoœæ kinazy i zwiêksza szansê przetrwania komórek opornych na TKI oraz zmianê konformacji pêtli aktywacyjnej kinazy wywo³uj¹c¹ niewra liwoœæ na jej hamowanie przez TKI [17]. utacje grupuj¹ siê w 4 regionach domeny kinazy ABL. Doœæ czêsto dotycz¹ miejsca wi¹zania ATP - tzw pêtli - P (P-loop) - bardzo konserwatywnego regionu, w którym dochodzi do wi¹zania grup fosforanowych [6,7,17,,30]. Wyst¹pienie mutacji kinazy ABL rzadziej bywa przyczyn¹ opornoœci pierwotnej [34] - wystêpuj¹cej od pocz¹tku leczenia TKI, lub we wczesnych stadiach PBSz; choæ mutacje bywaj¹ wykrywane tak e u pacjentów jeszcze przed wdro eniem TKI [32]. W póÿniejszych stadiach choroby mutacje pojawiaj¹ siê czêœciej [35]. Czêstotliwoœæ wystêpowania mutacji kinazy ABL u chorych na PBSz opornych na leczenie TKI waha siê w szerokich granicach od 27-90% i zale y w g³ównej mierze od fazy choroby, ale równie od metodologii badania i przyjêtych wskazañ do wykonania analizy mutacji [7,12,18, 20,23,32]. Najrzadziej mutacje wykrywane s¹ w fazie przewlek³ej choroby - u 27% chorych w badaniach grupy GIEA [34], u 36% w innym badaniu [22], ich czêstoœæ roœnie wraz ze stanem zaawansowania choroby i mo e wynieœæ np. 75% w kryzie [34] Czêstotliwoœæ wystêpowania mutacji genu BCR/ABL w badanej grupie pacjentów by³a porównywalna z innymi raportami [4, 5,23,34,35,36]. 88% pacjentów w chwili badania pozostawa³a w fazie przewlek³ej choroby i w tej grupie opornoœæ na leczenie wi¹za³a siê w wiêkszoœci z innym mechanizmami ni wyst¹pienie mutacji kinazy ABL, któr¹ wykryto u ok. % chorych. W fazie kryzy natomiast mutacje wykryto u 4 z 5 badanych chorych. Obie obserwacje potwierdzaj¹ ogólnie akceptowane opinie, e mutacje kinazy ABL rzadko wystêpuj¹ we wczesnych stadiach choroby i na pocz¹tku leczenia TKI oraz e ich czêstoœæ pojawiania siê wzrasta w miarê narastania opornoœci na leczenie [3,4,22,33,36]. Typ pojawiaj¹cej siê mutacji mo e determinowaæ przebieg dalszego leczenia. Wykrycie mutacji T5I odpowiedzialnej za ca³kowit¹ niewra liwoœæ komórek ze zmutowanym genem na leczenie dostêpnymi dotychczas TKI jest równoznaczne z koniecznoœci¹ kwalifikacji pacjenta do alogenicznej transplantacji szpiku [2] lub w razie niemo - noœci jej przeprowadzenia do leczenia eksperymentalnego w ramach badañ klinicznych. Spoœród 3. pacjentów z mutacj¹ T5I 2. skierowano do alogenicznego przeszczepienia szpiku; u trzeciego pacjenta istnia³y przeciwwskazania do tej procedury; dosz³o do rozwoju kryzy i zgonu. W badanej grupie u 5 chorych wykryto mutacje nale ¹ce do regionu P-loop, których wyst¹pienie wi¹zane jest z gorszym prze- yciem [10] i dlatego wed³ug niektórych opinii ich wykrycie mo e stanowiæ obok mutacji T5I wskazanie do alogenicznej transplantacji szpiku. U 2 spoœród tych 5 chorych dosz³o do rozwoju kryzy zakoñczonej zgonem, u dalszych 2 do utraty, jeden pacjent utraci³ R. Powy - sze obserwacje mog¹ potwierdzaæ dotychczasowe doniesienia o niekorzystnym rokowaniu pacjentów, u których wykryto mutacje z tej grupy [10]. Wykonane badania pozwoli³y wykryæ mutacje punktowe domeny kinazy ABL jako prawdopodobn¹ przyczynê opornoœci PBSz na leczenie inhibitorem kinazy tyrozynowej u czêœci chorych w przewlek³ej fazie choroby i u wiêkszoœci chorych w fazie kryzy. Okreœlenie typu mutacji ma bardzo istotne znaczenie i pomaga w podjêciu decyzji o modyfikacji dalszego leczenia, mo e te stanowiæ wskazówkê do rozwa- enia przeprowadzenia alogenicznej transplantacji szpiku. Badanie mutacji genu BCR/ ABL jest bardzo cenn¹ metod¹ diagnostyczn¹ umo liwiaj¹c¹ poprawê skutecznoœci leczenia przewlek³ej bia³aczki szpikowej. Piœmiennictwo 1. Azam., Latek R.R., Daley G.Q.: echanisms of autoinhibition and STI-1/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell 2003, 112, 8. 2. Baccarani. Cortes J., Pane F., et al.: Chronic yeloid Leukemia: An Update of Concepts and anagement Recommendations of European Leukemia- Net. J. Clin. Oncol. 2009, 27, 41. 3. Branford S., Rudzki Z., Parkinson I., et al.: Realtime quantitative PCR analysis can be used as a primary screen to identify patients with CL treated with imatinib who have BCR-ABL kinase domain mutations. Blood 2004, 104, 2926. 4. Branford S., Rudzki Z., Walsh S., et al.: High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI1) resistance. Blood 2002, 99, 3472. 5. Branford S., Hughes T.: Detection of BCR-ABL muatations and resistance to imatinib mesylate. ethods ol. ed. 2006, 125, 93. 6. von Bubnoff N., Schneller F., Peschel C. et al.: BCR-ABL gene mutations in relation to clinical resistance of Philadelphia-chromosome positive leukaemia to STI-1: a prospective study. Lancet 2002, 359, 487. 7. Corbin A.S., La Rosee P., Stoffregen E.P. et al.: Several Bcr-Abl kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib. Blood 2003, 101, 11. 8. le Coutre P., Tassi E., Varella-Garcia. et al.: Induction of resistance to the Abelson inhibitor STI1 in human leukemic cells through gene amplification. Blood 2000, 95, 1758. 9. Druker B.J., Guilhot F., O'Brien S. et al.: Long-term benefits of imatinib (I) for patients newly diagnosed with chronic myelogenous leukemia in chronic phase (CL-CP): The 5-year update from the IRIS study. J. Clin. Oncol. 2006, 24, 6506 10. Ernst T., Erben P., uller.c., et al.: Dynamics of BCR-ABL mutated clones prior to hematologic or cytogenetic resistance to imatinib. Haematologica 2008, 93,186. 11. Florek I., Sacha T., Zawada., i wsp.: Opracowanie i wdro enie bezpoœredniego sekwencjonowania jako metody analizy mutacji genu ABL u chorych na przewlek³¹ bia³aczkê szpikow¹ oporn¹ na leczenie inhibitorami kinaz tyrozynowych. Przegl. Lek 2010. W druku. 12. Gambacorti-Passerini C., Barni R., le Coutre P. et al.: Role of a1acid glycoprotein in the in vivo resistance of humanbcr-abl+ leukemic cells to the Abl inhibitor STI1. J. Natl. Cancer Inst. 2000, 92, 1641. 13. Gambacorti-Passerini C.B., Gunby R.H., Piazza R. et al.: olecular mechanisms of resistance to imatinib in Philadelphia-chromosome-positive leukaemias. Lancet Oncology 2003, 4, 75. 14. Gorre.E., ohammed., Ellwood-Yen K. et al.: BCR-ABL point mutations isolated from patients with STI1-resistant chronic myeloid leukemia remain sensitive to inhibitors of the BCR-ABL chaperone heat shock protein 90. Blood 2002, 100, 3041. 15. Graham S.., Jorgensen H.G., Allan E. et al.: Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI1 in vitro. Blood 2002, 99, 9. 16. Hantschel O., Nagar B., Guettler S., et al.: A myristoyl/phosphotyrosine switch regulates c-abl. Cell 2003, 112, 845. 17. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A.S., et al.: olecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib STI 1 therapy. Leukemia 2002, 16, 2190. 18. Hochhaus A., La Rosee P.: Imatinib therapy in chronic myelogenous leukemia: strategies to avoid and overcome resistance. Leukemia 2004, 18, 1321. 19. Hughes T.P., Kaeda J., Branford S. et al.: Frequency of major molecular responses to imatinib or interferon alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia. N. Engl. J. ed. 2003, 349, 1423. 20. Hughes T., Deininger., Hochhaus A. et al.: onitoring CL patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006, 108,. 21. Hughes T., Branford S.: olecular monitoring of BCR-ABL as a guide to clinical management in chronic myeloid leukaemia. Blood Reviews 2006, 20, 29. 22. Jabbour E., Kantarjian H., Jones D., et al.: Frequency and clinical significance of BCR-ABL mutations in patients with chronic myeloid leukemia treated with imatinib mesylate. Leukemia 2006, 20, 1767. 23. Lowenberg B.: inimal residual disease in chronic myeloid leukemia. N. Engl. J. ed. 2003, 349, 19. 24. ahon F.X., Deininger.V., Schultheis B. et al.: Selection and characterization of BCR-ABL positive cell lines with differential sensitivity to the tyrosine kinase inhibitor STI 1: diverse mechanisms of resistance. Blood 2000, 96, 1070. 25. Nagar B., Bornmann W.G., Pellicena P. et al.: Crystal structures of the kinase domain of c-abl in complex with the small molecule inhibitors PD1755 and imatinib (STI-1). Cancer Research 2002, 62, 4236. 26. O'Brien S.G., Guilhot F., Larson R.A., et al.: Imatinib compared with interferon and low dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia. N. Engl. J. ed. 2003, 348, 994. 27. Quintas-Cardama A. Gibbons D.L., Kantarjian H. et al.: utational analysis of chronic myeloid leukemia (CL) clones reveals heightened BCR- ABL1 genetic instability and wild-type BCR-ABL1 exhaustion in patients failing sequential imatinib and dasatinib therapy. Blood 2007, 110, 6a-a.. Roche-Lestienne C., Soenen-Comu V., Grardel- Duflos N. et al.: Several types of mutations of the Abl gene can be found in chronic myeloid leukemia patients resistant to STI1, and they pre-exist to the onset of treatment. Blood 2002, 100, 1014. 29. Rousselot P., Huguet F., Rea D., et al.: Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood 2007, 109, 58. 30. Sacha T., Hochhaus A., Hanfstein B. et al.: ABLkinase domain point mutation as a cause of imatinib (STI 1) resistance in CL patient who progress to myeloid blast crisis. Leukemia Res. 2003, 27, 1163.. Schindler T., Bornmann W., Pellicena P. et al.: 256 T. Sacha i wsp.

Structural mechanism for STI-1 inhibition of Abelson tyrosine kinase. Science 2000, 9, 19. 32. Shah N.P., Nicoll J.., Nagar B. et al.: ultiple BCR- ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI1) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell 2002, 2, 117. 33. Soverini S., artinelli G., Amabile. et al.: Denaturing-HPLC-based assay for detection of ABL mutations in chronic myeloid leukemia patients resistant to imatinib. Clin. Chem. 2004, 50, 1205. 34. Soverini S., Colarossi S., Gnani A., et al.: Contribution of ABL kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients: By the GIEA working party on chronic myeloid leukemia. Clin. Cancer Res. 2006, 12, 74. 35. Soverini S., artinelli G., Rosti G., et al.: ABL mutations in late chronic phase chronic myeloid leukemia patients with upfront cytogenetic resistance to imatinib are associated with a greater likelihood of progression to blast crisis and shorter survival: a study by the GIEA Working Party on Chronic yeloid Leukemia. J. Clin. Oncol. 2005, 23, 4100. 36. Wei Y., Hardling., Olsson B. et al.: Not all imatinib resistance in CL are BCR-ABL kinase domain mutations. Ann. Hematol. 2006, 85, 841. Weisberg E., Griffin J.D.: echanism of resistance to the Abl tyrosine kinase inhibitor STI 1 in BCR/ ABL -transformed hematopoietic cell lines. Blood 2000, 95, 3498.. Witt., Szczepañski T., Dawidowska.: Hematologia molekularna: patogeneza, patomechanizmy i metody badawcze. Oœrodek Wydawnictw Naukowych, Poznañ 2009, 275. 2