Determinacja losu komórek i udział białek powierzchniowych w powstawaniu pierwotnej endodermy w przedimplantacyjnym zarodku myszy

Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii Katarzyna Filimonow Nr albumu: 257 340 Determinacja losu komórek i udział białek powierzchniowych w powstawaniu pierwotnej endodermy w przedimplantacyjnym zarodku myszy Rozprawa doktorska w zakresie nauk biologicznych dyscyplinie biologii Praca wykonana pod kierunkiem Prof. dr. hab. Marka Maleszewskiego i dr Anety Suwińskiej Zakład Embriologii Warszawa, styczeń 2015

Oświadczenie kierującego pracą Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie stopnia doktora nauk biologicznych w zakresie biologii. Data Podpis kierującego pracą Oświadczenie autora pracy Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza rozprawa doktorska została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami. Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem stopnia doktora w innej jednostce. Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną. Data Podpis autora pracy 2

Podziękowania Jak to napisał mój przyjaciel, strona podziękowań poprzedzająca rozprawę jeśli nie jest najważniejszą stroną pracy, to na pewno jest stroną najczęściej odwiedzaną i czytaną. Dlatego poświęcam jej więcej uwagi niż kilka zdań, w których zazwyczaj staramy się zawrzeć słowa wdzięczności i uznania dla osób nam bliskich i wspierających nasze zmagania z prozą dnia codziennego w życiu naukowca. Wymienię ważne dla mnie osoby w kolejności ich pojawiania się na mojej drodze. Ewie Borsuk dziękuję za pokazanie mi jak fascynującą dziedziną nauki jest embriologia, za cierpliwość i wsparcie w pierwszym roku mojej przygody z zarodkami myszy, przede wszystkim zaś za wprowadzenie mnie w świat mikromanipulacji. Markowi Maleszewskiemu wdzięczna jestem za przyjęcie mnie do zespołu i opiekę przez łącznie dziewięć lat, co pozwoliło mi rozwinąć skrzydła w embriologii. Anecie Suwińskiej za wsparcie, gotowość do rozmowy, dyskusji i pomocy, za wzięcie pod swoją opiekę i wspólne pokonywanie problemów. Berenice Płusie wdzięczna jestem za przyjęcie mnie do swojej rodziny, zarówno tej naukowej i jak prywatnej, za odświeżenie mojego spojrzenia nie tylko na rozwój zarodka myszy, ale i na naukę sensu stricto. Annie M. Ciemerych-Litwienienko dziękuję za gotowość do pomocy i chwili rozmowy, pomimo permanentnego braku czasu i odłączania się od naszego zespołu. Niezapomnianym doświadczeniem pozostanie dla mnie także współpraca z Prof. Andrzejem K. Tarkowskim. Niezłomny w dążeniu do celu, dbający o zespół i pokonujący coraz to nowe granice Profesor pozostanie dla mnie wzorem i autorytetem w mojej dalszej drodze naukowej. Miałam przyjemność współpracować z wieloma osobami, ale wspólna praca z dwiema z nich w szczególności pozostanie w mojej pamięci. Dziękuję Maćkowi Meglickiemu i Néstorowi Saiz za wspólną pracę, w czasie której zażyłym dyskusjom naukowym nieodłącznie towarzyszyło kreatywne myślenie i salwy śmiechu. Moim zdaniem jest to najlepszy sposób na pracę, nie tylko naukową. W tę atmosferę pracy wpisuje się także czas spędzony przeze mnie w pokoju 239 z Kasią Szczepańską, Magdą Krupą i Anią Ajduk, dzięki którym mogłam 3

rozwiać wiele wątpliwości, poczuć się częścią embriologicznej rodziny, a także cieszyć się pracą codzienną. Za serdeczną atmosferę pracy i wszelką pomoc dziękuję także pozostałym pracownikom i doktorantom Zakładu Embriologii oraz pracownikom Zwierzętarni Wydziału Biologii, a w szczególności Małgosi Jędrzejczyk-Baranowskiej i dr Katarzynie Kisiel. Wszystkim tym osobom bardzo dziękuję za wkład w mój rozwój, nie tylko jako młodego naukowca. Pragnę także podziękować za udaną współpracą studentom z którymi miałam przyjemność prowadzić badania Karolinie Jodkowskiej, Katarzynie Świtoń i Błażejowi Krupie. Najlepsze zawsze zostawiam na koniec, nie inaczej postępuję tym razem. Na końcu pragnę podziękować moim przyjaciołom i mojej rodzinie, przede wszystkim za jej wyrozumiałość i wsparcie. Obecność w moim życiu Agnieszki, Asi i jej rodziny, Piotra, Pauliny zwanej Kozą, a także Blanki i Maćka daje mi ogromną radość i energię. Szczególnie podziękowania składam Cioci Oli, która doskonale rozumie życie biologa, prowadzącego eksperymenty i nierzadko spędzającego dni wolne od pracy na badaniach. Ciocia jako pierwszy recenzent moich prac, za co bardzo jestem jej wdzięczna, dzielnie w tym celu poznawała najdrobniejsze szczegóły rozwoju zarodka myszy. Największe jednak podziękowania składam moim Rodzicom: za to kim jestem i za to, że mimo początkowych wątpliwości co do studiowania biologii pozwolili mi iść wybraną przeze mnie drogą i wspierają mnie w tej drodze do dziś. 4

Słowa kluczowe Pierwotna endoderma, epiblast, kadheryna E (Cdh1), Pecam-1, segregacja komórek ICM, przemiana nabłonowo-mezenchymatyczna. Tytuł pracy w języku angielskim Determination of cell differentation and involvement of cell surface proteins in the formation of primitive endoderm in the preimplantation mouse embryo. 5

Streszczenie W czasie rozwoju przedimplantacyjnego zarodka myszy powstają trzy linie komórkowe: trofektoderma (TE), epiblast (Epi) i pierwotna endoderma (PE). W dalszym rozwoju zarodka linia TE bierze udział w tworzeniu zarodkowej części łożyska i umożliwia implantację zarodka w macicy. Z linii Epi powstają wszystkie tkanki ciała płodu i większość błon płodowych, a komórki linii PE biorą udział w tworzeniu błony płodowej pęcherzyka żółtkowego. Komórki PE pełnią też rolę w ustalaniu osi przodo-tylnej zarodka w stadium cylindra zarodkowego. Pierwszy etap różnicowania komórkowego zachodzi w zarodku 16-komórkowym, w którym powstają komórki wewnętrzne i zewnętrzne. W dalszym rozwoju, w trakcie powstawania blastocysty, komórki zewnętrzne zarodka różnicują w pierwszą pozazarodkową linię komórkową TE. W tym czasie w zarodku powstaje jama, która spycha komórki wewnętrzne w jeden koniec, gdzie tworzą one węzeł zarodkowy (ICM). Na tym etapie rozwoju zarodka komórki ICM zachowują pluripotencję. Nie są one jednakowe, bowiem ICM tworzą komórki prekursorowe Epi i PE, ułożone mozaikowo i różniące się ekspresją genów specyficznych dla tych dwóch linii. Tuż przed implantacją zarodka dochodzi do segregacji komórek Epi i PE. PE tworzy się jako pojedyncza warstwa komórek na zwróconej do jamy blastocysty powierzchni ICM, natomiast Epi zbudowany jest z komórek, które leżą pomiędzy PE i TE. W ten sposób dochodzi do kolejnego etapu różnicowania, w wyniku którego w obrębie węzła zarodkowego powstaje linia pluripotentna Epi i druga po TE linia pozazarodkowa PE. W pierwszym etapie moich badań podjęłam się sprawdzenia, kiedy ostatecznie determinowany jest los komórek ICM. Wykorzystując technikę filmowania poklatkowego sprawdziłam w węzłach zarodkowych wyizolowanych z wczesnych oraz późnych blastocyst, kiedy komórki ICM tracą plastyczność rozwojową. Wykazałam, że ostateczna decyzja o różnicowaniu komórek prekursorowych Epi podejmowana jest stopniowo, przy czym większość komórek tej linii ulega determinacji do stadium 4,5-dniowej blastocysty. W tym czasie jednak pojedyncze komórki PE, a także pojedyncze komórki Epi pozostają niezdeterminowane w tworzeniu tych linii i aż do końca 5. dnia rozwoju mogą ulec przeprogramowaniu. 6

W drugiej części moich badań sprawdzałam, czy białka powierzchniowe komórek ICM regulują różnicowanie PE. Badania te przeprowadziłam z wykorzystaniem zarodkowych komórek macierzystych (komórki ES), będących modelem komórek ICM. Wiadomo, że działanie kwasu retinowego (RA) w określonym stężeniu powoduje różnicowanie tych komórek w kierunku PE. Tak zróżnicowane komórki wstrzykiwałam do zarodka myszy w stadium blastocysty i stwierdziłam, że ich komórki potomne lokalizowały się wyłącznie w PE, podczas gdy niezróżnicowane komórki ES wbudowywały się tylko w Epi. Zaobserwowałam, że białka adhezyjne kadheryna E i Pecam-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule) zanikają we wczesnych etapach różnicowania komórek ES w kierunku PE. Dlatego podjęłam próbę określenia czy białka te regulują powstawanie PE w blastocyście. Wiadomo, że we wczesnych blastocystach Pecam-1 wykrywane jest we wszystkich komórkach ICM, a po wyodrębnieniu warstw Epi i PE jego obecność ograniczona jest tylko do komórek Epi. Sprawdziłam, czy brak Pecam-1 w komórkach ES spowoduje preferencyjne tworzenie przez nie PE w blastocyście. Wykorzystując sirna przeciwko Pecam-1 obniżyłam ilość tego białka w komórkach ES, które następnie wstrzykiwałam do zarodków 8-komórkowych oraz do blastocyst. Stwierdziłam, że tak zmodyfikowane komórki ES nie różnicują w kierunku PE, ale podobnie jak niezmodyfikowane komórki kontrolne, integrują się z Epi. Oznacza to, że brak białka Pecam-1 nie sprzyja różnicowaniu komórek ES w PE. Podjęłam się także zbadania lokalizacji kadheryny E w komórkach blastocysty oraz sprawdzenia jej roli w tworzeniu PE. Wykazałam, że we wczesnych blastocystach poziom kadheryny E pomiędzy komórkami prekursorowymi PE oraz EPI jest podobny. Natomiast w późnych blastocystach pomiędzy komórkami PE jest mniej kadheryny E niż pomiędzy komórkami EPI. Wykazałam, że w komórkach PE, które znajdują się na powierzchni ICM, lokalizacja kadheryny E jest spolaryzowana brak jej w apikalnej części błony, a jest obecna w jej części bocznej i podstawnej. Dodatkowo, zaobserwowałam jądrową lokalizację kadheryny E w komórkach PE, co może mieć znaczenie w ochronie komórek tej linii przed apoptozą. Wykazałam, że po segregacji komórek ICM, ilość mrna kadheryny E w komórkach linii PE jest mniejsza niż w komórkach Epi. Zatem poziom kadheryny E podczas segregacji komórek ICM jest regulowany na poziomie transkrypcji. Zbadałam również wpływ obniżenia poziomu kadheryny E (przy użyciu dsrna) na kierunek różnicowania blastomerów. Nie zaobserwowałam jednak preferencyjnej lokalizacji 7

komórek wywodzących się z blastomerów z obniżoną ilością kadheryny E. Wchodzą one w skład wszystkich trzech linii komórkowych blastocysty, z tylko nieco większą częstością do linii TE, niż dzieje się to w przypadku blastomerów z normalnym poziomem kadheryny E. Wynik ten może sugerować, że zmiany poziomu kadheryny E nie są bezpośrednio odpowiedzialne za różnicowanie PE. Sprawdziłam także, że w moim układzie doświadczalnym brak kadheryny E nie był kompensowany ekspresją kadheryny N. Obniżona ilość kadheryny E, przy jednoczesnej obecności kadheryny N, wimentyny oraz białka Snail są cechami procesu EMT (ang. epithelial mesenchymal transition). Tuż po implantacji blastocysty PE rozprzestrzenia się po wewnętrznej stronie TE. Dlatego też sugeruje się, że w powstawanie PE zaangażowany jest proces EMT. Zaobserwowałam, że wimentyna nie jest obecna we wczesnych blastocystach, ale pojawia się w komórkach PE w późnych blastocystach, w stadium okołoimplantacyjnym. Po implantacji, 5,5 dnia rozwoju nie stwierdziłam już obecności wimentyny w zarodkach. Kadheryny N nie zaobserwowałam w żadnym z badanych przeze mnie stadiów rozwoju zarodka. Wykazałam natomiast, że zarówno we wczesnych, jak i późnych blastocystach w jądrach komórkowych komórek ICM obecny jest czynnik transkrypcyjny Snail, będący inhibitorem ekspresji kadheryny E. Jego obecność, w połączeniu z wykrytym przeze mnie obniżeniem ilości kadheryny E między komórkami ICM oraz obecnością wimentyny w komórkach PE wskazywać może, że w komórkach tej linii może zachodzić proces przemiany nabłonkowo-mezenchymalna (EMT) lub proces do niej podobny. Abstract During mouse embryogenesis three cell lineages are specified before implantation: trophectoderm (TE), primitive endoderm (PE) and epiblast (Epi). Epi gives rise to all the tissues of the embryo proper and to most of fetal membranes, PE develops into the endoderm layer of the yolk sac, and TE develops into the embryonic part of the placenta. The first cell lineage formation event occurs already in the 16-cell stage embryo, and distinguishes two cell types: inner cells, which are precursors of ICM (inner cell mass), and outer cells, which are precursors of TE. Later in the development, when the blastocyst is formed, outer cells become TE and inner cells exhibit mutually exclusive salt and pepper 8

expression of transcription markers specific for Epi and PE. Just before implantation segregation of these two lineages occurs. PE cells, as a monolayer congregate on the surface of ICM and Epi becomes encapsulated by PE and TE cells. It still remains uncertain what factors are responsible for the establishment of this segregation but it has been suggested that adhesion or/and cell polarization are crucial in this process. First I carried out experiments to examine when the fate of ICM cells is determined. Time-lapse movies allowed me to analyse when cells of ICMs isolated from early and late blastocysts lose plasticity and cannot change their fate anymore. I showed that determination of the cell fate in ICM takes place gradually and most of cells are determined till E4.5. But at this stage of development there are still some single Epi and PE cells which are not determined in their fate and are able to reprogram till stage E5.0. Next I examined which adhesion proteins are involved in cell differentiation into PE. Pluripotent cell lineages of the mouse embryo (ICM and Epi cells) can be the source of embryonic stem cells (ES cells), which are used in this experiment as a model of differentiation of ICM cells in mouse embryogenesis. In vitro ES cells in a medium supplemented with retinoic acid (RA) differentiate into PE. I observed that differentiated cells injected into the mouse embryo localise only in PE. I found that E-cadherin and Pecam-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule) disappeared from cell surface of ES cells differentiating into PE during in vitro culture in the presence of RA. Therefore, I decided to check out whether these proteins are involved in the differentiation of PE. In the early blastocyst Pecam-1 is observed in all ICM cells, but after segregation of Epi and PE the presence of this protein is restricted only to Epi. Using sirna I have downregulated Pecam-1 in ES cells, which were then injected into an 8-cell embryo or into blastocyst. I observed that cells in which Pecam-1 was downregulated localised in Epi, similarly to control ES cells which have not been treated with RA. This result shows that downregulation of Pecam-1 is not sufficient to instruct ES cells to form PE. Next I analysed the localisation of E-cadherin in blastocyst and role of this protein in PE differentiation. I showed that in the early blastocyst the level of E-cadherin in the contact zone between PE cells is similar as between Epi cells. In the late blastocyst the level of this protein between PE cells is at least two times lower than between Epi cells. Moreover, after 9

segregation of PE and Epi, E-cadherin localization becomes polarized in PE cells it disappears from the apical domain of the cell membrane and is present in the basal and lateral domains. I also noticed the nuclear localization of E-cadherin in PE cells, which can be connected to the known anti-apoptotic function of E-cadherin. Moreover I showed that the amount of mrna for E-cadherin is similar in Epi and PE precursors but after their segregation there is much more E-cadherin mrna in Epi cells than in PE cells. It means that mechanisms which regulate transcription are involved in control of the amount of E-cadherin during the formation of Epi and PE. I examined whether dsrna-mediated downregulation of E-cadherin may influence the differentiation of blastomeres. To this end I injected dsrna against E-cadherin into a single blastomere of the 8-cell stage embryo and subsequently followed its fate. However, I did not observe a preferential localisation of progeny of blastomeres in which E-cadherin was downregulated. This result suggest that while during formation of PE the level of E- cadherin is lowered in its cells, the downregulation of E-cadherin in the blastomere is not sufficient to impose the PE fate on its descendants. I found that in blastomeres in which E- cadherin was downregulated this deficit was not compensated by the expression of N- cadherin. Decrease of the level of E-cadherin is characteristic for epithelial mesenchymal transition (EMT) process. In cells that undergo this process N-cadherin, Snail and vimentin proteins are upregulated. In mouse blastocyst just after implantation, the PE cells start migration underside of TE, and it has been suggested that EMT is required for this migration. I therefore examined whether EMT proteins are present during the formation and development of PE. I found that vimentin, which is absent in E3.5 embryos, appears in E4.5 blastocysts in PE cells and disappears again after implantation at E5.5. I found that neither N- cadherin protein nor its mrna is present in the preimplantation and perimplantaton mouse embryo. In embryos at E3.5 and E4.5, Snail protein localised in the nuclei of ICM cells. Together with the observed lowered level of E-cadherin between the PE cells, these results may indicate that the EMT process or EMT-like process may occur during PE formation. 10

Spis treści I WSTĘP 14 1. RYS HISTORYCZNY 14 2. PRZEDIMPLANTACYJNY ROZWÓJ ZARODKOWY MYSZY 14 3. POWSTAWANIE TE I ICM W PRZEDIMPLANTACYJNYM ZARODKU MYSZY 18 3.1. CZYNNIKI TRANSKRYPCYJNE BIORĄCE UDZIAŁ W POWSTAWANIU TE 18 4. POWSTANIE PIERWOTNEJ ENDODERMY I EPIBLASTU W WĘŹLE ZARODKOWYM BLASTOCYSTY 20 4.1. TWORZENIE KOMÓREK PREKURSOROWYCH PE I EPI 21 4.2. SEGREGACJA KOMÓREK LINII PE I EPI 27 4.3. DETERMINACJA RÓŻNICOWANIA KOMÓREK PE I EPI 29 4.4. POLARYZACJA KOMÓREK PE 30 4.5. UDZIAŁ BIAŁEK POWIERZCHNIOWYCH W POWSTAWANIU PIERWOTNEJ ENDODERMY 32 4.6. POLARYZACJA VERSUS ADHEZJA W POWSTAWANIU PIERWOTNEJ ENDODERMY 34 5. CZY W KOMÓRKACH PE ZACHODZI PROCES PRZEMIANY NABŁONKOWO-MEZENCHYMALNEJ (EMT)? 35 II CELE PRACY 37 III MATERIAŁY I METODY 38 1. MATERIAŁ BIOLOGICZNY 38 2. PROCEDURY 39 2.1. UZYSKIWANIE I HODOWLA ZARODKÓW MYSZY 39 2.2. IZOLACJA I HODOWLA WĘZŁÓW ZARODKOWYCH 40 2.3. HODOWLA ZARODKOWYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH (KOMÓREK ES) 41 2.4. RÓŻNICOWANIE KOMÓREK ES W OBECNOŚCI KWASU RETINOWEGO (RA) 42 2.5. OBNIŻENIE EKSPRESJI GENU PECAM-1 W ZARODKOWYCH KOMÓRKACH MACIERZYSTYCH 42 2.6. WPROWADZANIE KOMÓREK ES DO ZARODKÓW 43 2.7. WYKRYWANIE BIAŁEK W ZARODKACH, WĘZŁACH ZARODKOWYCH I KOMÓRKACH ES METODĄ IMMUNOFLUORESCENCJI POŚREDNIEJ 44 2.7.1. Utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne zarodków i węzłów zarodkowych 46 2.7.2 Utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne zarodkowych komórek macierzystych 46 2.8. UZYSKANIE RNA DO INIEKCJI ZARODKÓW 47 2.8.1. Znacznikowy mrna 47 2.8.2. Dwuniciowy RNA (dsrna) 48 2.9. INIEKCJA DSRNA ORAZ MRNA DO BLASTOMERÓW 8-KOMÓRKOWYCH ZARODKÓW MYSZY 49 2.10. BADANIE POZIOMU EKSPRESJI GENÓW METODĄ RT - QPCR W KOMÓRKACH ES I BLASTOMERACH 49 2.11. POMIAR WZGLĘDNEJ ILOŚCI KADHERYNY E W ZARODKACH MYSZY 52 2.12. FILMOWANIE ZARODKÓW I WĘZŁÓW ZARODKOWYCH 54 11

IV WYNIKI 56 1. OKREŚLENIE STADIUM, W KTÓRYM ZACHODZI DETERMINACJA LOSU KOMÓREK PE I EPI 56 1.1. POWSTAWANIE WARSTWY PE W ICM WYIZOLOWANYCH Z WCZESNYCH, 3,5-DNIOWYCH BLASTOCYST MYSZY 58 1.2. POWSTAWANIE WARSTWY PE W ICM WYIZOLOWANYCH Z PÓŹNYCH, 4,5-DNIOWYCH BLASTOCYST MYSZY 61 2. UDZIAŁ BIAŁEK ADHEZYJNYCH W RÓŻNICOWANIU KOMÓREK ES W KIERUNKU PE 63 2.1. ZANIKANIE BIAŁEK ADHEZYJNYCH KADHERYNY E I PECAM-1 W CZASIE RÓŻNICOWANIA 63 KOMÓREK ES W KIERUNKU PE 63 2.2. LOKALIZACJA KOMÓREK ES ZRÓŻNICOWANYCH W KIERUNKU PE POD WPŁYWEM RA PO ICH WSTRZYKNIĘCIU DO ZARODKA MYSZY 66 3. WPŁYW ZMIANY POZIOMU EKSPRESJI GENU PECAM-1 NA LOS KOMÓREK ES W BLASTOCYŚCIE 69 3.1. OCENA WYDAJNOŚCI I EFEKTYWNOŚCI TRANSFEKCJI KOMÓREK ES SIRNA SKIEROWANYM PRZECIWKO TRANSKRYPTOM PECAM-1 70 3.2. LOKALIZACJA W ZARODKU KOMÓREK ES Z OBNIŻONĄ EKSPRESJĄ GENU PECAM-1 74 4. UDZIAŁ KADHERYNY E W TWORZENIU PE 76 4.1. LOKALIZACJA KADHERYNY E W STADIUM OKOŁOIMPLANTACYJNYM ZARODKA MYSZY 77 4.2. ZALEŻNOŚĆ POMIĘDZY POLARYZACJĄ KOMÓREK ICM A ICH LOKALIZACJĄ I RÓŻNICOWANIEM 81 4.3. WZGLĘDNA ILOŚĆ MRNA KODUJĄCEGO KADHERYNĘ E W KOMÓRKACH PE I EPI PRZED I PO SEGREGACJI 86 4.4. WPŁYW OBNIŻENIA ILOŚCI KADHERYNY E NA RÓŻNICOWANIE BLASTOMERÓW ZARODKA MYSZY 88 5. WYKRYWANIE BIAŁEK SPECYFICZNYCH DLA PRZEMIANY NABŁONKOWO MEZENCHYMALNEJ (EMT) W KOMÓRKACH LINII PE 93 V. DYSKUSJA 96 1. DETERMINACJA LOSU KOMÓREK ICM 97 1.1. KOMÓRKI ICM Z 3,5-DNIOWEGO ZARODKA CHARAKTERYZUJĄ SIĘ DUŻĄ PLASTYCZNOŚCIĄ 100 1.2. WIĘKSZOŚĆ KOMÓREK EPI Z 4,5-DNIOWYCH BLASTOCYST JEST ZDETERMINOWANA 100 2. UDZIAŁ BIAŁEK POWIERZCHNIOWYCH W POWSTAWANIU PE 104 2.1. PECAM1 ORAZ KADHERYNA E ZANIKAJĄ WE WCZESNYCH ETAPACH RÓŻNICOWANIA KOMÓREK ES W KIERUNKU PE 104 2.2. OBNIŻENIE ILOŚCI BIAŁKA PECAM-1 NIE WPŁYWA NA SEGREGACJĘ ANI NA RÓŻNICOWANIE KOMÓREK ES 107 2.3. KOMÓRKI PE I EPI RÓŻNIĄ SIĘ ILOŚCIĄ KADHERYNY E 107 2.4. LOKALIZACJA KADHERYNY E W JĄDRACH KOMÓREK LINII PE 110 2.5. POLARYZACJA KOMÓREK PE JEST EFEKTEM ICH POWIERZCHNIOWEJ LOKALIZACJI W ICM 112 2.6. OBNIŻENIE ILOŚCI KADHERYNY E W BLASTOMERACH BRUZDKUJĄCEGO ZARODKA NIE WPŁYWA NA KIERUNEK ICH RÓŻNICOWANIA 115 2.7. W KOMÓRKACH PE MOŻE ZACHODZIĆ PROCES PRZYPOMINAJĄCY EMT 116 3. PODSUMOWANIE 119 LITERATURA 121 12

SUPLEMENT 133 S1. LICZBA KOMÓREK POTOMNYCH WSTRZYKNIĘTYCH KOMÓREK ES NIEZRÓŻNICOWANYCH I ZRÓŻNICOWANYCH RA, W LINIACH EPI, PE I TE 133 S2. WZGLĘDNA ILOŚĆ MRNA KODUJĄCEGO PECAM-1 134 S3. PORÓWNANIE WZGLĘDNEJ ILOŚCI KADHERYNY E W ZARODKACH KONTROLNYCH, ICM-PE I ICM-EPI 134 S4. KONTROLA POZYTYWNA PRZECIWCIAŁA SKIEROWANEGO PRZECIWKO KADHERYNIE N 137 S5. ANALIZA STATYSTYCZNA LOSU KOMÓREK Z OBNIŻONĄ ILOŚCIĄ KADHERYNY E 137 S6. WZGLĘDNA ILOŚĆ MRNA KODUJĄCEGO KADHERYNĘ N W BLASTOMERACH Z OBNIŻONĄ ILOŚCIĄ KADHERYNY E ORAZ W BLASTOMERACH KONTROLNYCH 141 13

I Wstęp 1. Rys historyczny Badania nad rozwojem zarodkowym zwierząt sięgają czasów starożytności, kiedy to Arystoteles zasugerował, że organizm kolejnego pokolenia rozwija się de novo z homogennego materiału jest to tzw. teoria epigenezy. Nowoczesne badania embriologiczne rozpoczęły się w drugiej połowie XVIII wieku, kiedy Caspar Friedrich Wolff potwierdził słuszność tej teorii, przedstawiając stopniowe powstawanie jelita w zarodku kury. W XIX wieku Karl Ernst von Baer opisał oocyt (w tym także ludzki), zygotę, blastocystę oraz listki zarodkowe. Był on również twórcą embriologii porównawczej wykazując, że zarodki zwierząt kręgowych należących do różnych gromad są do siebie podobne we wczesnym rozwoju poimplantacyjnym. Zarówno Wolffa jak i v. Baera uważa się za ojców współczesnej embriologii. 2. Przedimplantacyjny rozwój zarodkowy myszy Mysz domową (Mus musculus) wykorzystuje się jako organizm modelowy w badaniach nad rozwojem przedimplantacyjnym zarodków ssaków. Mysz jest gatunkiem powszechnie stosowanym ze względu na niskie koszty utrzymania hodowli, krótki okres ciąży, krótki czas osiągania dojrzałości płciowej, a także ze względu na liczne mioty (10 15 młodych). W wyniku zapłodnienia w górnym odcinku jajowodu myszy powstaje jednokomórkowy zarodek zygota. W trakcie przemieszczania się zarodka przez jajowód w kierunku macicy zachodzą w nim pierwsze etapy rozwoju przedimplantacyjnego. W tym czasie ma miejsce szereg podziałów mitotycznych zwanych bruzdkowaniem, które u ssaków są całkowite i niesynchroniczne. Trzeciego dnia rozwoju, gdy zarodek osiąga stadium 8-komórkowe, zachodzi kompakcja. W blastomerach dochodzi wówczas do szeregu zmian, w których biorą udział białka cytoszkieletu oraz powierzchniowe białka adhezyjne. Kompakcja polega na zmianie sposobu kontaktu między komórkami wyjściowo luźno połączone ze sobą blastomery zaczynają ściśle do siebie przylegać w związku z powstaniem najpierw połączeń ścisłych, a w następnej kolejności połączeń desmosomalnych (Collins i Fleming, 1995 oraz ryc. 1). 14

Kompakcji towarzyszy polaryzacja blastomerów, w wyniku której w każdym blastomerze zarodka 8-komórkowego można wyróżnić domenę szczytową (apikalną), wyeksponowaną na powierzchnię oraz domenę spodnio-boczną, którą blastomer kontaktuje się z siostrzanymi komórkami (Johnson i Ziomek, 1981). Do domeny szczytowej każdego z blastomerów migrują białka: apkc (ang. atypical protein kinase C ), Par6 (ang. partitioning defective) (Collins i Fleming, 1995; Plusa i wsp., 2005b; Vinot i wsp., 2005), aktyna zaangażowana w tworzenie mikrokosmków oraz ezryna, która je stabilizuje (Dard i wsp., 2001; Yamanaka i wsp., 2006) (ryc. 1). Zaobserwowano, że tuż przed implantacją zarodka w macicy do apkc oraz Par6 dołącza się białko Par3, dzięki czemu powstaje kompleks PAR-aPKC. Kompleks ten okazał się silnie konserwowany ewolucyjnie. Jego udział w polaryzacji komórek różnego typu stwierdzono u wielu organizmów (Suzuki i Ohno, 2006). W domenie spodnio-bocznej blastomerów kompaktnego zarodka myszy gromadzi się kompleks zbudowany z transbłonowej kadheryny E (Cdh1 cadherin 1) i oddziałujących z jej domeną cytoplazmatyczną α- i β-katenin (De Vries i wsp., 2004) (ryc. 1). Białka te tworzą płytki przylegania (ang. adherens junctions), dzięki którym blastomery ściśle stykają się ze sobą w kompaktnym zarodku (Collins i Fleming, 1995). Po utworzeniu płytek przylegania pomiędzy blastomerami tworzone są następnie połączenia ścisłe, które powstają na granicy części szczytowej i bocznej błon komórkowych. W ich powstanie zaangażowane są białka: zonula occludens (ZO-1 oraz ZO-2), okludyna, cingulina i Rab13 oraz znajdujący się w szczytowej części błony kompleks polaryzacyjny Par3/Par6/aPKC (Plusa i wsp., 2005b; Vinot i wsp., 2005) (ryc. 1). W około 32-komórkowym zarodku, jako ostatnie, powstają połączenia desmosomalne. Połączenia te zbudowane są z białek takich jak desmogleiny, desmokoliny, a także desmoplakiny i plakoglobiny, które odpowiedzialne są za oddziaływania z filamentami pośrednimi (Fleming i wsp., 1994; Collins i Fleming, 1995). Wszystkie blastomery zarodka 8-komórkowego ułożone są tak, że mają kontakt ze środowiskiem zewnętrznym. Po przejściu od stadium 8-komórkowego do stadium 16-komórkowego część blastomerów znajduje się na powierzchni zarodka, a pozostałe wewnątrz. W tym czasie, trzeciego dnia rozwoju, zarodek przechodzi z jajowodu do macicy. W stadium 32-komórkowym zachodzi kawitacja. Polega ona na wytworzeniu się jamy w wyniku powstania różnicy stężeń jonów między środowiskiem a przestrzenią 15

Ryc. 1 Wzór rozmieszczenia białek adhezyjnych w zarodku myszy od stadium 8-komórkowego do stadium blastocysty. międzykomórkową (Borland i wsp., 1977; McLaren i Smith, 1977; Watson, 1992). W wyniku aktywności pompy sodowo-potasowej o charakterze ATP-azy (ang. adenosine triphosphatase) w komórkach zewnętrznych powstaje wysokie stężenie jonów Na +, K +, Ca 2+ i Mg 2+. Za zwiększone stężenie jonów Na +, H +, HCO 3 - i Cl - odpowiedzialne są także inne białka regulujące aktywną wymianę jonów. W wyniku powstania różnicy stężeń jonów do zarodka pompowana jest woda, która gromadzi się w jednej bądź kilku, łączących się później, jamkach. Ułatwiona dyfuzja wody przez komórki zewnętrzne możliwa jest dzięki białkom z rodziny akwaporyn (Watson, 1992). Kawitacja powoduje, że komórki wewnętrzne, tworzące tzw. węzeł zarodkowy (ICM, ang. inner cell mass) spychane są przez tworzącą się jamę w jeden koniec zarodka, który przybiera formę pęcherzyka wypełnionego płynem. Jego ścianę buduje warstwa ściśle połączonych ze sobą komórek zewnętrznych, tworzących trofektodermę (TE). Komórki TE, które pozostają w kontakcie z ICM nazywamy trofektodermą biegunową, a pozostałe komórki TE trofektodermą ścienną. Zarodek zawierający jamę powstałą w wyniku kawitacji nazywamy blastocystą (ryc. 2). Stadium to, przypadające na czwarty dzień rozwoju przedimplantacyjnego zarodka myszy (pomiędzy 3,25 a 3,5-dniem rozwoju), określa się mianem wczesnej blastocysty. W tym czasie zarodek zbudowany jest z około 64 komórek. W pierwszej połowie piątego dnia rozwoju zarodek zawiera już ponad 100 komórek i nosi wówczas nazwę późnej blastocysty. W tym stadium zachodzi jego implantacja, czyli zagnieżdżenie w ścianie macicy (ryc. 2). 16

W okresie okołoimplantacyjnym w ICM blastocysty wyodrębnia się część stricte zarodkowa epiblast (Epi) oraz linia pozazarodkowa pierwotna endoderma (PE). W dalszym rozwoju zarodka z TE rozwinie się zarodkowa część łożyska i tzw. komórki olbrzymie, z PE endoderma pęcherzyka żółtkowego, zaś z Epi powstanie ciało płodu i większość błon płodowych omocznia, owodnia oraz mezoderma kosmówki i pęcherzyka żółtkowego (Rossant i Tam, 2009). Ryc. 2. Schemat przedimplantacyjnego rozwoju zarodka myszy. Fotografie: Maleszewski i współpracownicy (2007) oraz niepublikowane A. Suwińskiej i K. Filimonow. 17

3. Powstawanie TE i ICM w przedimplantacyjnym zarodku myszy Od stadium 8-komórkowego blastomery mogą dzielić się symetrycznie lub asymetrycznie. Gdy płaszczyzna podziału blastomeru jest prostopadła do powierzchni zarodka, zachodzi podział symetryczny, w wyniku którego powstają dwie spolaryzowane komórki zewnętrzne, z których każda dziedziczy domenę szczytową. W podziale asymetrycznym natomiast płaszczyzna podziału blastomeru jest równoległa do powierzchni zarodka, co skutkuje powstaniem jednej spolaryzowanej komórki zewnętrznej, dziedziczącej domenę szczytową oraz jednej niespolaryzowanej komórki wewnętrznej, pozbawionej tej domeny (Yamanaka i wsp., 2006). Oba typy podziałów zachodzą w trakcie dwóch rund podziałowych: przy przejściu ze stadium 8- do 16-komórkowego (8 16) i ze stadium 16- do 32-komórkowego (16 32) (Johnson i Ziomek, 1981; Fleming, 1987; Sutherland i wsp., 1990; Yamanaka i wsp., 2010; Krupa i wsp., 2014). Według niektórych autorów podziały asymetryczne zachodzą także w stadium 32-komórkowym (32 64) (Morris i wsp., 2010). Pierwsze badania nad mechanizmem powstawania TE i ICM w zarodku myszy prowadzone były w latach 60. ubiegłego wieku. Hipoteza inside outside zaproponowana wówczas przez Tarkowskiego i Wróblewską (Tarkowski i Wróblewska, 1967) zakładała, że pozycja komórek zewnętrzna bądź wewnętrzna decyduje o ich losie w dalszym rozwoju. Według tego modelu komórki znajdujące się na zewnątrz zarodka tworzą trofektodermę, a komórki wewnętrzne węzeł zarodkowy. Hipoteza ta została uzupełniona przez Johnsona i Ziomek na podstawie wyników ich prac nad kompakcją i związaną z nią polaryzacją blastomerów (Ziomek i Johnson, 1980; Johnson i Ziomek, 1981). Według Johnsona i Ziomek, dziedziczenie domeny szczytowej związane jest z różnicowaniem komórki w kierunku TE. Natomiast komórki wewnętrzne, które nie posiadają domeny szczytowej, nie są spolaryzowane i w konsekwencji tworzą ICM. 3.1. Czynniki transkrypcyjne biorące udział w powstawaniu TE Kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym determinującym powstanie TE jest Cdx2 (ang. Caudal type homeobox 2) (James i wsp., 1994; Beck i wsp., 1995). W zarodkach pozbawionych funkcjonalnego genu cdx2 w komórkach zewnętrznych nie dochodzi do obniżenia ekspresji genu pluripotencji oct4, który najpierw jest aktywny we wszystkich blastomerach, a następnie ulega wyciszeniu w tworzących się komórkach linii TE i PE. Brak 18

aktywnej formy genu cdx2 powoduje, że zarodki ulegają kompakcji i kawitacji, ale nie są w stanie utrzymać jamy blastocysty, zapadają się, nie ulegają implantacji i ostatecznie obumierają (Strumpf i wsp., 2005; Wu i wsp., 2010). Kodujący to białko mrna powstaje już w trakcie oogenezy i jest obecny w owulowanym oocycie (Jedrusik i wsp., 2010). Według niektórych autorów to właśnie ten matczyny mrna kodujący Cdx2 jest konieczny dla procesu kompakcji i kawitacji oraz początkowych etapów różnicowania komórek zewnętrznych w kierunku TE (Jedrusik i wsp., 2010). W stadium 8-komórkowym dochodzi do wzmocnienia ekspresji genu cdx2, a powstały zarodkowy mrna lokalizuje się pod korteksem w szczytowej części błony komórkowej blastomerów i jest dziedziczony przez komórki zewnętrzne. Co więcej, w stadium 8-komórkowym widoczne są już różnice w ilości mrna Cdx2 pomiędzy poszczególnymi blastomerami, co miałoby decydować o sposobie podziału blastomerów i determinować losy ich komórek potomnych (Jedrusik i wsp., 2010). Wyniki te, uzyskane w zespole Żernickiej-Goetz pozostają jednak w sprzeczności z rezultatami innego zespołu, który wykazał, że przy braku matczynego mrna kodującego Cdx2 zarodki ulegają zarówno kompakcji jak i kawitacji, tyle tylko że później, niż te mające jedynie matczyny mrna, ale nie posiadające zarodkowego mrna (Wu i wsp., 2010). Rola matczynego mrna cdx2 w tworzeniu TE została podważona także przez inny zespół. Według tej grupy, matczyny mrna kodujący Cdx2 nie jest potrzebny dla wytworzenia TE, a o kierunku rozwoju blastomerów decydują różnice w poziomie zarodkowego Cdx2, zależne od położenia blastomerów w zarodku (Ralston i Rossant, 2008). Według niektórych autorów białko Cdx2 jest obecne w jądrach blastomerów już od stadium 8-komórkowego (Dietrich i Hiiragi, 2007; Ralston i Rossant, 2008; Jedrusik i wsp., 2008, 2010), a według innych dopiero od stadium 16-komórkowego zarodka (Strumpf i wsp., 2005; Suwińska i wsp., 2008). Stwierdzono, że białko to jest obecne zarówno w blastomerach wewnętrznych, jak i zewnętrznych, przy czym w niektórych blastomerach jest go więcej niż w innych, niezależnie od ich lokalizacji w zarodku. W dalszym rozwoju dochodzi do zdecydowanego zwiększenia ilości tego białka w blastomerach zewnętrznych (Ralston i Rossant, 2008; Jedrusik i wsp., 2010). Od stadium 32-komórkowego obecność Cdx2 ograniczona jest wyłącznie do komórek zewnętrznych (Strumpf i wsp., 2005). Ekspresja genu cdx2 w komórkach zewnętrznych jest zależna od polarności tych blastomerów, przede wszystkim od obecności w domenie szczytowej białek Nf2 (neurofibromina 2) i angiomiotyny 19

(Ralston i Rossant, 2008; Nishioka i wsp., 2009; Leung i Zernicka-Goetz, 2013; Manzanares i Rodriguez, 2013; Anani i wsp., 2014; Hirate i Sasaki, 2014). Sądzić można także, że białko Cdx2 wpływa na polaryzację blastomerów zarówno poprzez wzmocnienie ekspresji genu apkc, jak i na szczytową lokalizację białka apkc. Wykazano bowiem, że wstrzyknięcie egzogennego mrna dla Cdx2 zwiększa ilość białka apkc w warstwie kortykalnej blastomerów zewnętrznych (Jedrusik i wsp., 2008). Ekspresja genu cdx2 jest regulowana przez szlak przekaźnictwa komórkowego Hippo (Nishioka i wsp., 2008, 2009; Ralston i wsp., 2010; Cockburn i wsp., 2013; Hirate i wsp., 2013; Lorthongpanich i wsp., 2013; Anani i wsp., 2014). W regulacji szlaku Hippo biorą udział: białko Tead4 (ang. TEA domain family member 4), kinazy Lats1 oraz Lats2 (ang. Large tumor suppresor homolog 1/2) oraz białko Yap (ang. Yes-associated protein), które jest koaktywatorem białka Tead4, a także angiomotyna i Nf2 (Nishioka i wsp., 2008; Cockburn i wsp., 2013; Hirate i wsp., 2013; Anani i wsp., 2014). W spolaryzowanych komórkach zewnętrznych w wyniku związania angiomiotyny z aktyną, szlak Hippo jest nieaktywny, czego konsekwencją jest ekspresja genu cdx2. W blastomerach wewnętrznych, które są niespolaryzowane angiomotyna, związana z Nf2, aktyną i kadheryną E w połączeniach ścisłych, powoduje poprzez kinazy Lats aktywację szlaku Hippo, który prowadzi do zahamowania ekspresji genu cdx2. 4. Powstanie pierwotnej endodermy i epiblastu w węźle zarodkowym blastocysty Drugą, po linii TE, pozazarodkową linią komórkową w zarodku jest PE. W późnej blastocyście, tuż przed jej implantacją w macicy, komórki PE znajdują się na powierzchni węzła zarodkowego, tworząc jednokomórkową warstwę, która odizolowuje zlokalizowane wewnątrz komórki Epi od jamy blastocysty. W komórkach PE i w komórkach Epi ekspresji ulegają odmienne, charakterystyczne dla tych linii geny. W komórkach PE zachodzi ekspresja genów z rodziny Gata (gata4 i gata6; ang. GATA binding protein), genów z rodziny Sox (sox 7 i 17; ang. SRY-box containing gene) oraz genu kodującego receptor Pdgfα pdgfrα (ang. platelet derived growth factor receptor alpha) i genu kodującego receptor Fgf4 fgfr2 (ang. fibroblast growth factor receptor 2). Natomiast w komórkach Epi aktywne transkrypcyjnie są 20

geny: nanog, fgf4 (ang. fibroblast growth factor 4), sox2 (Morrisey i wsp., 1998; Plusa i wsp., 2008; Artus i wsp., 2011). Powstanie linii Epi i PE można podzielić na trzy etapy (Frankenberg i wsp., 2011). W pierwszym z nich we wszystkich komórkach ICM około 32-komórkowej blastocysty współwystępują białka charakterystyczne zarówno dla linii Epi, jak i linii PE. W drugim etapie, gdy blastocysta liczy około 64 komórki, część komórek wchodzących w skład ICM charakteryzuje się ekspresją genów charakterystycznych dla linii Epi, a pozostałe dla linii PE. Wykluczającej się ekspresji genów linii Epi i PE towarzyszy powstanie komórek prekursorowych obu linii, wymieszanych w obrębie ICM według wzoru sól-pieprz. W blastocyście posiadającej powyżej 100 komórek zachodzi trzeci etap, związany z wyodrębnieniem się dwóch osobnych warstw ICM: powierzchniowej PE i zlokalizowanego wewnątrz Epi, a także z indukcją ekspresji późnych markerów obu linii (Frankenberg i wsp., 2011). 4.1. Tworzenie komórek prekursorowych PE i Epi Pierwsza hipoteza próbująca wyjaśnić mechanizm powstawania PE i Epi została zaproponowana w latach 70. ubiegłego wieku. Według tej hipotezy węzeł zarodkowy we wczesnej blastocyście stanowi homogenną populację komórek, a o kierunku ich różnicowania decydowałoby ich położenie w ICM. Blastomery znajdujące się na powierzchni węzła zarodkowego miałyby różnicować w kierunku PE, zaś pozostałe blastomery, znajdujące się w głębi, tworzyłyby epiblast. Model ten powstał na podstawie obserwacji różnicowania zarodkowych komórek macierzystych (komórek ES, ang. embryonic stem cells), będących modelem in vitro komórek ICM. Gdy tworzono z tych komórek agregaty, zwane kulami zarodkowymi, zaobserwowano na ich powierzchni powstawanie warstwy komórek pierwotnej endodermy (Martin i Evans, 1975; Becker i wsp., 1992; Murray i Edgar, 2001; Yamanaka i wsp., 2010). Na podstawie dalszych badań zasugerowano jednak, że komórki w obrębie ICM stanowią populację heterogenną (Chisholm i Houliston, 1987), co w późniejszych badaniach potwierdzono na poziomie molekularnym tylko niektóre komórki ICM posiadały w jądrze komórkowym czynnik transkrypcyjny Gata6, specyficzny dla PE (Koutsourakis i wsp., 1999; Rossant i wsp., 2003). Ostatecznie hipoteza o heterogenności komórek ICM została 21

potwierdzona dopiero w 2006 roku, kiedy wykazano w nich zróżnicowaną ekspresję markerów linii Epi i PE. Część komórek charakteryzowała się ekspresją genu nanog (marker komórek Epi), a pozostałe ekspresją genu gata6 (marker komórek PE) (Chazaud i wsp., 2006). Śledzenie losu pojedynczych wyznakowanych komórek ICM wczesnej (ok. 64- komórkowej) blastocysty, a także śledzenie losu pojedynczych komórek uzyskanych z wczesnych blastocyst i wprowadzanych mikrochirurgicznie do innej blastocysty znajdującej się w tym samym stadium pozwoliło stwierdzić, że dane komórki ICM wczesnej blastocysty tworzą preferencyjnie tylko jedną z linii komórkowych: Epi bądź PE (Chazaud i wsp., 2006). Potwierdzeniem tych obserwacji były wyniki analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach ICM. W badaniach tych także zaobserwowano dwie odrębne populacje komórek. Jedna z nich charakteryzowała się ekspresją genów specyficznych dla PE, m.in.: gata4, gata6, sox17, fgfr2, pdgfrα. Natomiast w drugiej populacji komórek zaobserwowano ekspresję genów, takich jak: nanog, fgf4, sox2, charakterystycznych dla Epi (Kurimoto i wsp., 2006). Na podstawie tych wyników postawiono hipotezę, że ICM 64-komórkowej blastocysty stanowi heterogenną populację komórek prekursorowych Epi i PE, które początkowo są ze sobą przemieszane, a następnie ulegają segregacji, tworząc odrębne warstwy. O ostatecznym kierunku ich różnicowania decydowałaby więc ekspresja czynników transkrypcyjnych specyficznych dla PE i Epi. Czynnik transkrypcyjny Gata6 jest wykrywany w zarodku najwcześniej, bo już w niektórych blastomerach zarodka 4-komórkowego (Kang i wsp., 2013). Z kolei białko Gata4 pojawia się w komórkach różnicujących w kierunku PE dopiero w stadium 64-komórkowej blastocysty (Artus i wsp., 2011) i jego pojawienie się wymaga wcześniejszej obecności Gata6. Doświadczenia wykorzystujące zarodki pozbawione genów gata4 i gata6 wykazały, że brak jednego z białek Gata w blastocyście może być kompensowany przez inne białka z tej rodziny i przejawia się fenotypowo dopiero w rozwoju poimplantacyjnym. Takie zarodki obumierają pomiędzy siódmym a ósmym dniem rozwoju w wyniku nieprawidłowo wykształconej endodermy (Morrisey i wsp., 1998; Koutsourakis i wsp., 1999). Gen sox17 ulega intensywnej ekspresji w czasie przejścia zarodka ze stadium 16- do 32-komórkowego, natomiast białko kodowane przez ten gen obecne jest w stadium wczesnej blastocysty, kiedy to komórki prekursorowe Epi i PE ułożone są mozaikowo. Drugie białko z tej rodziny Sox7, obecne jest 22

w komórkach PE dopiero gdy znajdą się one na powierzchni ICM (Plusa i wsp., 2008; Artus i wsp., 2011). Oprócz czynników transkrypcyjnych z rodziny Gata (Gata4 i Gata6) oraz Sox (Sox17 i Sox7) (Plusa i wsp., 2008; Artus i wsp., 2011), które są markerami PE, w błonie komórkowej komórek prekursorowych PE obecny jest receptor α dla czynnika Pdgf (PdgfRα). Celem sprawdzenia, w jakie procesy zaangażowany jest PdgfRα, stworzono zarodki pozbawione prawidłowej kopii jego genu. W zarodkach tych stwierdzono nie tylko zdecydowane zmniejszenie liczby komórek PE, ale także zwiększoną liczbę komórek Epi. Brak opisywanego receptora powodował, że komórki PE nie podejmowały charakterystycznej dla nich po implantacji migracji po wewnętrznej powierzchni trofektodermy ściennej, za to w tym miejscu lokalizowała się część komórek Epi. Na podstawie tych obserwacji stwierdzono, że PdgfRα odgrywa rolę w regulacji stosunku liczby komórek Epi i PE, a także w kontroli późniejszej migracji komórek PE (Artus i wsp., 2010). Wykazano, że ekspresja genów sox17 i gata4 zależna jest od wcześniejszej obecności w komórkach Epi białek Nanog i Oct4. Zatem białka te posiadają podwójną rolę są niezbędne dla powstania zarówno linii Epi, jak i linii PE. Białko Nanog obecne jest w zarodku myszy od stadium 8-komórkowego (Dietrich i Hiiragi, 2007). W komórkach prekursorowych Epi powoduje ono zablokowanie ekspresji genu gata6. Natomiast ekspresja genu gata6 w komórkach prekursorowych PE jest ściśle zależna od białka Nanog. Stwierdzono, że zarodki myszy pozbawionych funkcjonalnego genu nanog mają prawidłowo wykształcone TE i ICM, ale zaburzony jest w nich proces wyodrębniania PE (Messerschmidt i Kemler, 2010; Frankenberg i wsp., 2011). Wśród komórek ICM pojawiają się komórki syntetyzujące białko Gata6, ale nie dochodzi w nich do dalszego różnicowania w linię PE z powodu braku ekspresji pozostałych genów specyficznych dla późnej pierwotnej endodermy: gata4, sox17 oraz pdgfrα (Frankenberg i wsp., 2011). Zaobserwowano także, że w zarodkach pozbawionych genu nanog może dojść do wytworzenia PE, jeżeli w hodowli obecny jest egzogenny FGF4 (Frankenberg i wsp., 2011). Sugeruje to, że Nanog wpływa na różnicowanie komórek pierwotnej endodermy poprzez szlak FGF/MAP kinazy (ang. mitogen-activated protein kinase). W powstawaniu pierwotnej endodermy podwójną rolę pełni nie tylko Nanog, ale również Oct4. Obecność tego białka stwierdzono już w oocycie, a następnie w jądrach 23

blastomerów podczas bruzdkowania. We w pełni wyrośniętej blastocyście obecność Oct4 ogranicza się do ICM, a następnie tylko do komórek Epi. Białko Oct4 jest uznawane za czynnik pluripotencji, ale w ostatnim czasie wykazano, że białko to jest także niezbędne do różnicowania komórek PE. W zarodkach pozbawionych aktywnego genu oct4 stwierdzono obecność komórek mających białka Nanog oraz Gata6, ale z tych komórek prekursorowych nie powstawały następnie dojrzałe komórki Epi oraz PE. Okazało się, że podtrzymanie ekspresji genu gata6 oraz aktywacja ekspresji genów dojrzałej PE: pdgfrα, sox17, gata4 oraz sox7 w komórkach prekursorowych PE wymaga obecności Oct4. Sprawdzono, czy aktywacja transkrypcji genów charakterystycznych dla komórek PE w zarodkach Oct4 -/- może być zaindukowana egzogennym FGF4. Zaobserwowano aktywację ekspresji genów markerowych PE, jednak nie była ona na wystarczająco wysokim poziomie, aby doszło do różnicowania komórek w kierunku tej linii. Na podstawie wyników tych doświadczeń stwierdzono, że w odróżnieniu od Nanog, Oct4 reguluje różnicowanie komórek PE poniżej szlaku FGF/MAP kinazy, opisanego poniżej. Co więcej, nawet obecność funkcjonalnego epiblastu nie spowodowała ekspresji genów linii PE w zarodkach Oct4 -/-. W ten sposób wykazano, że Oct4 kontroluje ekspresję genów linii PE w sposób autonomiczny (Frum i wsp., 2013). Niewyjaśnione jak dotąd pozostaje pytanie, co powoduje, że w wyjściowo homogennej populacji komórek zachodzą zmiany w ekspresji genów, które prowadzą do powstania komórek prekursorowych Epi i PE. Nichols i współpracownicy (2009) oraz Yamanaka i współpracownicy (2010) pokazali, że znaczący wpływ na powstanie komórek prekursorowych PE i Epi ma szlak FGF/MAP kinazy. Zaobserwowano, że traktowanie zarodków egzogennym czynnikiem FGF4 powoduje różnicowanie wszystkich komórek węzła zarodkowego w kierunku PE. Z kolei obecność specyficznych inhibitorów szlaku FGF/MAP kinazy skutkuje różnicowaniem wszystkich komórek ICM w kierunku Epi (Nichols i wsp., 2009; Yamanaka i wsp., 2010). Nadal jednak pozostaje niejasne, jakie czynniki inicjują kaskadę sygnałów kierującą komórki ICM na drogę różnicowania w jedną bądź drugą linię. W szlaku FGF/MAP kinazy białko FGF4 wiąże się ze swoim receptorem - FgfR2, znajdującym się w błonie komórkowej. Receptor ten, mający charakter kinazy tyrozynowej (RTK ang. receptor tyrosine kinase), w wyniku połączenia z FGF4 uruchamia kaskadę sygnałową zależną od kinazy MAP (Chazaud i wsp., 2006). W 64-komórkowej blastocyście FGF4 jest produkowany przez komórki prekursorowe Epi (Guo i wsp., 2010). Komórki 24

prekursorowe PE mają natomiast na swojej powierzchni receptor FgfR2, dzięki któremu, poprzez białko Grb2 (ang. growth factor receptor-bound protein 2), dochodzi do aktywacji ścieżki kinazy MAP (Pawson i Scott, 1997). Ponieważ komórki Epi mają niski poziom FgfR2, nie są kompetentne do autokrynnej odpowiedzi na sygnał FGF4 i nie różnicują w kierunku PE. Przy braku aktywacji kinazy MAP uruchamiana jest w nich ekspresja genu nanog markera Epi, a hamowana ekspresja genu gata6 markera PE. Najwcześniejszą zatem różnicą pomiędzy dwiema populacjami komórek węzła zarodkowego wydaje się być odmienna wrażliwość na sygnalizację poprzez szlak przekaźnictwa zależnego od FGF4 i kinazy MAP. Źródło tej odmiennej wrażliwości nie zostało dotychczas poznane. Wiadomo, że wewnętrzne komórki tworzące ostatecznie ICM blastocysty powstają w wyniku dwóch następujących po sobie podziałów asymetrycznych blastomerów: przy przejściu ze stadium 8- do 16-komórkowego oraz ze stadium 16- do 32-komórkowego. Chisholm i Houliston (1987) zasugerowali związek tych dwóch rund podziałowych z powstawaniem odrębnych populacji komórek, będących prekursorami PE oraz Epi. Według ich hipotezy, komórki wewnętrzne powstałe w pierwszej rundzie podziałów asymetrycznych (8 16) miałyby tworzyć Epi, natomiast komórki wewnętrzne wywodzące się z drugiej rundy (16 32) tworzyłyby PE. Stwierdzono bowiem, że te dwie populacje komórek, powstające w innym czasie, różnią się ilością cytokeratyny EndoA wchodzącej w skład filamentów cytokeratynowych. Blastomery pochodzące z czwartego podziału bruzdkowania (8 16), czyli pierwszej rundy podziałów asymetrycznych, mają mniej cytokeratyny Endo-A, a blastomery pochodzące z drugiej (16 32) mają jej więcej (Chisholm i Houliston, 1987). Próbując zweryfikować tę hipotezę zespół Żernickiej-Goetz (Morris i wsp., 2010) rejestrował rozwijające się zarodki, wykorzystując technikę filmowania poklatkowego. W ten sposób potwierdzono zależność kierunku różnicowania komórek ICM w PE lub Epi od ich pochodzenia z różnych rund asymetrycznych podziałów blastomerów zarodka. W tym samym czasie grupa Rossant (Yamanaka i wsp., 2010) przeprowadziła podobne doświadczenie, polegające na obserwacji i śledzeniu losu pojedynczego, wyznakowanego blastomeru w 8-komórkowym zarodku. Zarodki, które miały wyznakowane komórki ICM pochodzące jedynie z pierwszej bądź tylko z drugiej rundy podziałowej poddano osobno transferowi do samic biorczyń i ich izolacji w stadium 5,5- oraz 6,5-dniowym. Nie zaobserwowano znaczących różnic w losie wyznakowanych komórek, czyli związku pomiędzy 25

rundą podziałową, podczas której powstały blastomery wewnętrzne, a kierunkiem ich różnicowania. Tworzyły one tkanki pochodne zarówno linii Epi, jak i linii PE. Wyniki uzyskane przez nasz zespół (Krupa i wsp., 2014) ograniczają hipotezę o korelacji rundy podziałów asymetrycznych i kierunku różnicowania komórek ICM tylko do pewnych szczególnych przypadków. W pracy Krupy i współpracowników po raz pierwszy zwrócono uwagę na znaczenie liczby komórek wewnętrznych powstających w obu rundach podziałów (8 16 i 16 32) dla determinacji ich losów. Zaobserwowano, że korelacja między rundą podziałową a kierunkiem różnicowania komórek istnieje jedynie wtedy, jeśli w pierwszej rundzie powstaje odpowiednio dużo komórek wewnętrznych (Krupa i wsp., 2014). Wykazano ponadto, że blastomery pochodzące z pierwszej (8 16) i drugiej (16 32) rundy podziałów asymetrycznych różnią się poziomem ekspresji genów związanych ze szlakiem FGF/MAP kinazy: fgf4 i FgfR2 (Krupa i wsp., 2014). Różnice te nie determinują jednak losu rozwojowego tych komórek, gdyż i jedne i drugie mogą tworzyć zarówno Epi, jak i PE jeżeli w pierwszej rundzie podziałów asymetrycznych powstanie mało komórek wewnętrznych. Stwierdzono też, że różnice pomiędzy blastomerami wewnętrznymi zarodka, dotyczące poziomu FGF4 i FgfR2, poprzedzają różnice w ekspresji genów nanog i gata6. Dodatkowo wykazano, że kierunek różnicowania komórek wewnętrznych z pierwszej i drugiej rundy podziałowej w obrębie węzła zarodkowego zależy od liczby komórek powstałych w tych rundach. Na podstawie tych wyników oraz analizy ilości mrna kodującego FGF4 i FgfR2 zaproponowano, że jeżeli w rundzie pierwszej (8 16) powstaje mało komórek wewnętrznych, ilość produkowanego przez nie czynnika FGF4 jest zbyt mała, aby zaindukować różnicowanie komórek w kierunku PE. W konsekwencji wszystkie komórki z pierwszej rundy tworzą Epi. W takiej sytuacji komórki wewnętrzne powstałe w drugiej rundzie (16 32) tworzą linię PE, niejako kompensując brak komórek tej linii w ICM. Jeżeli natomiast w pierwszej rundzie powstaje dużo komórek wewnętrznych, to ilość czynnika FGF4 jest wystarczająca aby pobudzić receptory fgfr2 i skierować część komórek na drogę różnicowania w PE (Krupa i wsp., 2014). Opisana regulacja różnicowania komórek w węźle zarodkowym pod wpływem szlaku FGF/MAP kinazy (Nichols i wsp., 2009; Yamanaka i wsp., 2010) oraz fakt, że odmienna wrażliwość na czynnik FGF4 jest pierwszą widoczną różnicą pomiędzy komórkami ICM (Guo i wsp., 2010; Krupa i wsp., 2014) sprawiły, że to właśnie ten szlak typowano jako mechanizm 26

inicjujący powstanie komórek prekursorowych Epi i PE. W celu potwierdzenia tej hipotezy stworzono zarodki mające mutacje w genach szlaku FGF/MAP kinazy: Fgf4 (Feldman i wsp., 1995; Wilder i wsp., 1997; Kang i wsp., 2013), FgfR2 (Arman i wsp., 1998) oraz Grb2 (Chazaud i wsp., 2006). Wszystkie wymienione mutacje dawały ten sam fenotyp w obrębie węzła zarodkowego powstawały komórki prekursorowe Epi i PE, ale tylko te pierwsze rozwijały się dalej tworząc Epi, natomiast prekursory PE zanikały i nie dochodziło do powstania tej linii. Na podstawie wyników tych doświadczeń stwierdzono, że szlak FGF/MAP kinazy nie jest pierwszym czynnikiem, który różnicuje komórki ICM, lecz jest on niezbędny w dalszych etapach różnicowania komórek prekursorowych PE (Kang i wsp., 2013). 4.2. Segregacja komórek linii PE i Epi Komórki prekursorowe PE i Epi, początkowo ułożone mozaikowo w obrębie ICM, ulegają następnie segregacji (Chazaud i wsp., 2006; Plusa i wsp., 2008; Guo i wsp., 2010; Yamanaka i wsp., 2010; Frankenberg i wsp., 2011; Kang i wsp., 2013). W efekcie w zarodkach 4,5-dniowych (liczących powyżej 120 komórek), tuż przed implantacją, komórki obu tych linii tworzą dwie odrębne warstwy. Tezę mozaikowego ułożenia komórek PE i Epi oraz segregacji tych komórek ostatecznie potwierdził zespół, który obserwował rozwój zarodków mających wyznakowane komórki prekursorowe PE (Plusa i wsp., 2008). W komórkach tych ekspresji ulegał transgen kodujący białko fuzyjne składające się z histonu H2B połączonego z białkiem zielonej fluorescencji (GFP, ang. green fluorescent protein), znajdujący się pod kontrolą promotora PdgfRα markera komórek linii PE. Dzięki temu możliwe było śledzenie tworzących się zarówno komórek prekursorowych PE, jak i komórek tej warstwy w pełni ukształtowanej. Wyniki tych doświadczeń nie tylko potwierdziły wyjściowe mozaikowe ułożenie komórek PE i Epi w ICM (układ sól i pieprz ), ale pokazały także, że po osiągnięciu pozycji na powierzchni ICM komórki PE pozostają w tej lokalizacji, niejako odczytując swoją właściwą pozycję. Obserwacja ta potwierdza przypuszczenie, że pozycja komórek na powierzchni węzła zarodkowego także ma znaczenie w trakcie powstawania PE (Plusa i wsp., 2008). Wykazano też, że za pozostanie komórek PE na powierzchni ICM odpowiada białko Dab2 (ang. disabled homolog 2) (Yang i wsp., 2002). Białko to jest obecne w wielu typach nabłonków, uczestniczy w endocytozie, a także wraz z integryną β bierze udział w procesie 27

EMT (przemiana nabłonkowo mezenchymalna, ang. epithelial mesenchymal transition) (Yang i wsp., 2002). Zbadano rozwój zarodków pozbawionych funkcjonalnej formy tego genu i stwierdzono, że brak Dab2 uniemożliwia segregację komórek w obrębie ICM (Yang i wsp., 2002). Do niedawna nie wiadomo było jednak, jaki charakter ma ruch komórek w trakcie segregacji czynny czy bierny. Aby sprawdzić, czy przemieszczanie się komórek w obrębie ICM zależy od mikrotubul czy cytoszkieletu aktynowego hodowano zarodki w obecności czynników zaburzających ich organizację, czyli odpowiednio: nokodazolu i cytochalazyny. Depolimeryzacja mikrotubul pod wpływem nokodazolu nie wpłynęła na zachowanie komórek ICM, natomiast depolimeryzacja mikrofilamentów aktynowych wywołana działaniem cytochalazyny spowodowała zdecydowane ograniczenie migracji komórek w ICM. Wyniki tych doświadczeń sugerują, że komórki PE aktywnie zmieniają swoje położenie w obrębie ICM w sposób zależny od cytoszkieletu aktynowego (Meilhac i wsp., 2009). W segregację komórek PE na powierzchnię ICM zaangażowana jest także apoptoza. W niektórych zarodkach zauważono bowiem komórki prekursorowe PE, które nie ulegały segregacji na powierzchnię, tylko pozostawały w głębi węzła zarodkowego. Komórki te następnie były eliminowane na drodze apoptozy. Istnieje zatem mechanizm, który kontroluje właściwą docelową lokalizację komórek prekursorowych pierwotnej endodermy. W sytuacji, gdy komórka znajdzie się w niewłaściwej pozycji, jest ona kierowana na drogę apoptozy (Plusa i wsp., 2008; Meilhac i wsp., 2009; Frankenberg i wsp., 2011). Wykazano też, że czynnik PDGF (ang. platelet-derived growth factor) jest odpowiedzialny za ochronę komórek PE przed apoptozą, wtedy gdy są one wymieszane z komórkami Epi. Brak ekspresji genu pdgf powoduje, że w czasie segregacji komórek ICM (w okresie od 3,5 do 4,5-dnia rozwoju) komórki PE licznie ulegają apoptozie, w którą zaangażowana jest kaspaza-3. W konsekwencji liczba komórek tej linii jest drastycznie obniżona (Artus i wsp., 2013). Co więcej, zahamowanie aktywności kaspazy-3 w zarodkach nieposiadających genu pdgf spowodowało, że komórki PE przeżywały (Artus i wsp., 2013). Jednak mechanizm indukujący apoptozę w komórkach PE pozostających wewnątrz ICM po segregacji PE i Epi pozostaje nadal nieznany. 28

4.3. Determinacja różnicowania komórek PE i Epi W trakcie różnicowania komórek ICM na PE i Epi stopniowo zachodzi determinacja ich losu, rozumiana jako utrata zdolności do zmiany kierunku różnicowania. Handyside (1978) badał determinację losu komórek ICM: warstwa komórek prekursorowych TE usuwana była z morul oraz z wczesnych blastocyst. Komórki wewnętrzne morul oraz w większości przypadków komórki ICM blastocyst z małą jamą odtwarzały warstwę TE poprzez różnicowanie komórek w kierunku tej linii. Natomiast nieliczne ICM z blastocyst z małą jamą (wczesne blastocysty) oraz wszystkie ICM pochodzące z blastocyst zawierających dużą jamę (późne blastocysty) nie były w stanie odtworzyć warstwy TE. Na podstawie tych wyników sądzono, że zdolność komórek wewnętrznych zarodka do utworzenia linii TE zanika krótko po kawitacji zarodka (Handyside, 1978), choć inne grupy badawcze nie obserwowały odtwarzania warstwy TE już w ICM wyizolowanych z wczesnych blastocyst (Rossant, 1975; Dziadek, 1979; Gardner, 1985). Opublikowane kilka lat temu wyniki doświadczeń Szczepańskiej i współpracowników (Szczepanska i wsp., 2011) wskazują, że determinacja komórek ICM zachodzi jeszcze przed stadium wczesnej blastocysty. Komórki te nie są już w stanie odtworzyć warstwy TE, a obserwowana przez innych autorów warstwa TE na powierzchni wyizolowanych ICM pochodzi jedynie z komórek tej linii, które uniknęły lizy w trakcie usuwania TE. Nie wiadomo również, kiedy dokładnie zachodzi determinacja komórek PE i Epi w obrębie ICM ani jaki jest jej mechanizm. W przeprowadzonych do tej pory badaniach wykazano, że komórki prekursorowe PE i Epi mogą ulec przeprogramowaniu w wyniku modulowania szlaku FGF/MAP kinazy (Yamanaka i wsp., 2010). Zmiana różnicowania komórek PE i Epi pod wpływem tego szlaku może jednak zachodzić tylko we wczesnym etapie tworzenia tych linii. Komórki prekursorowe Epi ulegały przeprogramowaniu w kierunku PE tylko jeśli od 3,25- do 3,75- dnia rozwoju (stadium około 64-komórkowe) obecny był w pożywce egzogenny czynnik FGF4. Analogicznie, w tym samym okresie możliwe było przeprogramowanie komórek prekursorowych PE w kierunku Epi (Yamanaka i wsp., 2010). Tę plastyczność komórek ICM potwierdzono również w pracy, w której do morul wstrzykiwano pojedyncze komórki ICM, uzyskane z zarodków w różnych stadiach rozwoju, od wczesnej do późnej blastocysty (Grabarek i wsp., 2012). Zdolność do różnicowania we wszystkie 3 linie komórkowe (TE, Epi i PE) po iniekcji do zarodka-biorcy zachowywały 29

komórki ICM aż do stadium liczącego ponad 100 komórek. Jednak im bardziej zaawansowane było stadium, z którego uzyskiwano komórki PE i Epi, tym zdolności do przeprogramowania się były mniejsze. Ostatecznie, jeśli wstrzykiwane komórki pochodziły z zarodków znajdujących się tuż przed implantacją, liczących ponad 120 komórek, komórki zarówno linii PE, jak i Epi po wstrzyknięciu do blastocysty integrowały się tylko we właściwej sobie warstwie komórek ICM. Wyniki te potwierdziły wcześniejsze obserwacje wskazujące, że pojedyncze komórki PE oraz Epi, wyizolowane z 4,5-dniowej blastocysty i wstrzyknięte do wczesnej blastocysty nie są już w stanie wejść w skład innej linii komórkowej niż ta, z której się wywodzą (Gardner i Rossant, 1979). Ostateczne potwierdzenie momentu determinacji komórek PE i Epi wymaga jednakże obserwacji przeprowadzonych na nienaruszonych ICM. 4.4. Polaryzacja komórek PE Po osiągnięciu powierzchniowej pozycji w ICM komórki PE ulegają polaryzacji (Yang i wsp., 2002; Gerbe i wsp., 2008). Białkiem, które pojawia się w domenie szczytowej komórek PE, po osiągnięciu przez nie lokalizacji na powierzchni ICM, jest Lrp2 (ang. low-density lipoprotein receptor-related protein), zwane inaczej megaliną (Yang i wsp., 2002; Gerbe i wsp., 2008). Brak Lrp2 fenotypowo objawia w zarodku myszy dopiero w późnym rozwoju poimplantacyjnym (Willnow i wsp., 1996), zatem białko to nie jest konieczne do powstawania i różnicowania linii PE. Białko Lrp2 zgromadzone jest wokół jądra komórkowego w niektórych komórkach prekursorowych PE już we wczesnej blastocyście od stadium 32-komórkowego (Gerbe i wsp., 2008). Wraz z dalszym rozwojem blastocysty rośnie liczba komórek PE, w których obecne jest to białko. Zaobserwowano, że gdy komórki osiągają powierzchnię ICM, to Lrp2 migruje do rejonu kortykalnego cytoplazmy w ich szczytowej części. W dojrzałej blastocyście w stadium okołoimplantacyjnym (4,5-dnia rozwoju) prawie wszystkie komórki PE są już wysegregowane na powierzchni ICM i mają białko Lrp2 zlokalizowane w szczytowej części błony komórkowej. W sekwencji promotora genu lrp2 oraz w sekwencji pobliskiego intronu znaleziono rejon wskazujący na możliwość regulacji ekspresji tego genu przez białka z rodziny Gata oraz Sox, które są białkami charakterystycznymi dla linii PE (Gerbe i wsp., 2008). W komórkach PE zarodka myszy białko Lrp2 współwystępuje z Dab2. Co więcej, w tym samym czasie w komórkach PE obecny jest mrna kodujący kubulinę oraz białko 30

amnionless (Gerbe i wsp., 2008). Lrp2, Dab2, kubulina i amnionless tworzą kompleks białek, biorący udział w endocytozie. Na tej podstawie sugeruje się, że polaryzacja komórek PE związana jest z endocytozą, która może być powiązana z reorganizacją błon komórek tej linii (Maurer i Cooper, 2005; Gerbe i wsp., 2008). W polaryzacji komórek PE bierze udział także apkc (Saiz i wsp., 2013). Do tej pory badania nad udziałem tego białka koncentrowały się na jego roli w powstawaniu TE (Plusa i wsp., 2005b; Cockburn i Rossant, 2010). W komórkach prekursorowych PE dochodzi do zwiększenia ilości tej kinazy, a następnie, gdy komórki PE i Epi są już wysegregowane, lokalizuje się ona w szczytowym rejonie warstwy kortykalnej. W zarodkach poddanych działaniu inhibitora tej kinazy obecne były komórki charakteryzujące się wczesnymi markerami linii PE PdgfRα, Gata6 oraz Sox17, ale w czasie dalszego rozwoju tych zarodków nie zaobserwowano aktywacji ekspresji genu gata4, późnego markera linii PE. Saiz i współpracownicy (2013) wykazali, że apkc ma dwojaką funkcję w powstawaniu PE w przedimplantacyjnym zarodku myszy. Po pierwsze, dzięki wywoływaniu polaryzacji odpowiada ono za pozostawanie komórek tej linii na powierzchni ICM. Po drugie, wpływa ono na wzór ekspresji genów w komórkach PE, ponieważ po zahamowaniu aktywności apkc komórki PE nie eksprymowały białka Gata4 markera dojrzałej PE. Gdy komórki PE i Epi tworzą dwie odrębne warstwy, powstaje pomiędzy nimi błona podstawna zbudowana z lamininy, kolagenu IV, fibronektyny, nidogenu i perlekanu (Smyth i wsp., 1999; Li i wsp., 2001; Gersdorff i wsp., 2005; Liu i wsp., 2009). Sugeruje się, że w powstanie tej błony mogą być zaangażowane białka Sox7 i/lub Sox17 (Niimi i wsp., 2004; Shirai i wsp., 2005; Niakan i wsp., 2010). W wyniku opisanych powyżej procesów powstaje dojrzała blastocysta, zdolna do implantacji w macicy. Dochodzi tam do rozpuszczenia otaczającej zarodek glikoproteinowej osłonki przejrzystej, dzięki czemu komórki trofektodermy mogą bezpośrednio zetknąć się ze śluzówką macicy i wejść z nią w interakcję prowadzącą do implantacji. W okresie okołoimplantacyjnym komórki pierwotnej endodermy proliferują i warstwa ta rozprzestrzenia się po wewnętrznej powierzchni trofektodermy w kierunku bieguna abembrionalnego (położonego po przeciwnej stronie w stosunku do ICM), w całości ją podścielając. Komórki endodermy, które pozostały na powierzchni węzła zarodkowego nazywamy endodermą proksymalną, a komórki wyścielające jamę blastocysty po 31

wewnętrznej stronie TE tworzą endodermę dystalną. Pomiędzy endodermą dystalną a TE powstaje błona Reicherta. W jej tworzeniu bierze udział laminina, wydzielana przez komórki endodermy dystalnej (Hogan i wsp., 1980; Inoué i wsp., 1983). 4.5. Udział białek powierzchniowych w powstawaniu pierwotnej endodermy W ostatnim czasie coraz więcej uwagi poświęca się roli białek powierzchniowych w różnicowaniu komórek wczesnego zarodka, w tym w powstawaniu linii PE. Oprócz receptorów dla czynników parakrynowych, takich jak wspomniany przeze mnie receptor Fgf4, w segregacji komórek prekursorowych PE oraz Epi, znaczenie mogą mieć również białka adhezyjne (Plusa i wsp., 2008). W połowie ubiegłego wieku Townes i Holfreter (1955) badając komórki endodermy, mezodermy i ektodermy zarodków płazów wykazali, że w agregatach utworzonych przez komórki różniące się właściwościami adhezyjnymi, komórki charakteryzujące się silniejszą adhezją tworzą skupiska wewnątrz agregatu, a komórki mające słabsze właściwości adhezyjne pozostają na jego powierzchni. Uprawnione jest wobec tego przypuszczenie, że różnice we właściwościach adhezyjnych komórek mogą odgrywać ważną rolę podczas segregacji komórek ICM w zarodku myszy, w trakcie której komórki PE lokalizują się na powierzchni węzła, a komórki Epi pozostają w jego wnętrzu. Kadheryna E (Cdh1, ang. Cadherin 1) jest zapewne najlepiej poznanym oraz najpowszechniej występującym białkiem adhezyjnym. Należy do nadrodziny kadheryn, wapniowozależnych białek adhezyjnych, które uczestniczą w oddziaływaniach pomiędzy komórkami różnych typów (van Roy i Berx, 2008). Są to białka transbłonowe, zdolne do rozpoznania kadheryn tego samego rodzaju i do tworzenia z nimi połączeń (połączenia homotypiczne), a zarazem zdolne do tworzenia połączeń z kadherynami innych typów (połączenia heterotypiczne). Kadheryny mają dwie konserwowane ewolucyjnie domeny wewnątrzkomórkowe: JMD (ang. juxtamembrane domain) i CBD (ang. catenin-binding domain) (ryc. 3). Domena CBD kadheryny E poprzez wiązanie z α- i β-kateniną związana jest z aktyną, łącząc w ten sposób szkielet aktynowy w korteksie z błoną komórkową (McCrea i wsp., 1991). Natomiast domena JMD wiąże się z kateniną p120 (Reynolds i wsp., 1994), co chroni ją przed degradacją regulowaną poprzez ubikwitynizację (Hartsock i Nelson, 2012) (ryc. 3). Białko p120 przez wiązanie z białkami z rodziny kadheryn wzmacnia adhezję komórek (Anastasiadis i Reynolds, 2000; Oas i wsp., 2013). 32

Ryc. 3. Kadheryna E budowa oraz powiązanie z innymi białkami (schemat na podstawie Serra i Chetty, 2008). EC domena zewnątrzkomórkowa (ang. extracellular domain), JMD (ang. juxtamembrane domain), CBD (ang. catenin-binding domain). W zarodku myszy kadheryna E odpowiedzialna jest za kompakcję (Ziomek i Johnson, 1980; Collins i Fleming, 1995; Stephenson i wsp., 2010). Przed zajściem tego procesu kadheryna E jest równomiernie rozmieszczona w błonach blastomerów zarodka 8-komórkowego, a w trakcie kompakcji przemieszcza się do części spodnio-bocznej. Brak kadheryny E powoduje, że nie zachodzi ani kompakcja ani polaryzacja blastomerów, w związku z czym białka domeny szczytowej (np. Par3, Par6, ezryna, apkc i aktyna) rozmieszczone są równomiernie na całej powierzchni blastomerów (Stephenson i wsp., 2010). Kadheryna E jest też niezbędna do prawidłowego funkcjonowania trofektodermy, gdyż bierze udział w tworzeniu połączeń ścisłych, które powstają na styku błon dwóch komórek TE. Dzięki temu środowisko jamy blastocysty jest szczelnie zamknięte, co jest warunkiem niezbędnym do zajścia kawitacji (Stephenson i wsp., 2010). Rola kadheryny E w dalszych etapach przedimplantacyjnego rozwoju zarodka myszy, takich jak różnicowanie oraz segregacja komórek PE oraz Epi nie była do tej pory badana. Jednym z białek powierzchniowych, którego obecność odróżnia komórki PE od komórek Epi jest płytkowo-śródbłonkowe białko adhezyjne Pecam-1 (ang. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1, CD31) należące do nadrodziny immunoglobulin. Białko to bierze udział w organizacji filamentów pośrednich, w regulacji apoptozy, a także 33

w wiązaniu ze sobą komórek śródbłonka. Opisano także jego rolę w przyleganiu leukocytów do śródbłonka naczyń krwionośnych, gdy w czasie reakcji zapalnej przedostają się one z naczyń krwionośnych do tkanek (Ilan i Madri, 2003). Wykazano, że Pecam-1 aktywuje integryny, pośrednicząc w ten sposób w przyleganiu leukocytów do komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (Piali i wsp., 1995). We wczesnej, 3,5-dniowej blastocyście myszy białko to jest zlokalizowane na powierzchni wszystkich komórek ICM. Natomiast po segregacji komórek PE oraz Epi białko to obecne jest tylko na powierzchni komórek Epi (Robson i wsp., 2001). Możliwe jest, że Pecam-1 obecny w błonie komórek Epi bierze udział w aktywacji znajdujących się w błonie PE integryn, które są niezbędne dla prawidłowego rozwoju tej linii (Stephens i wsp., 1995; Liu i wsp., 2009). Nie zostało to jednak do tej pory potwierdzone. Nie wiadomo również, czy zanik białka Pecam-1 w komórkach PE jest warunkiem koniecznym do utworzenia tej linii. Białka powierzchniowe zapewniają także równomierne ułożenie komórek PE w integralną, jednokomórkową warstwę na powierzchni ICM. Za proces ten odpowiada integryna αβ1. Zarodki pozbawione funkcjonalnej kopii genu kodującego to białko implantowały się w macicy, ale krótko potem ulegały resorpcji (Fässler i Meyer, 1995; Stephens i wsp., 1995). Okazało się, że przyczyną obumierania tych zarodków był brak prawidłowo utworzonej PE. Komórki PE w takich zarodkach nie różnicowały prawidłowo: ulegały segregacji, ale zamiast tworzyć jednokomórkową warstwę na powierzchni węzła zarodkowego tworzyły skupiska. Co więcej, brak integryny αβ1 spowodował cytoplazmatyczną lokalizację czynnika Gata4 (Liu i wsp., 2009). Na podstawie tych wyników wysunięto hipotezę, że po segregacji komórki PE zmieniają typ adhezji z kadheryno-zależnej na integryno-zależną (Liu i wsp., 2009; Moore i wsp., 2014b). 4.6. Polaryzacja versus adhezja w powstawaniu pierwotnej endodermy Badania nad powstawaniem PE w zarodku wskazują na udział białek powierzchniowych w regulacji segregacji i różnicowania komórek tej linii. Wiadomo, że takie białka jak Dab2 (Yang i wsp., 2002) lub apkc (Saiz i wsp., 2013) odpowiadają za segregację komórek tej linii na powierzchnię ICM. Nie jest jednak jasne, czy komórki prekursorowe PE i Epi rzeczywiście charakteryzują się odmiennymi właściwościami adhezyjnymi oraz czy segregacja tych komórek zachodzi właśnie dzięki tym różnicom. 34

Wskazuje się, że w segregacji komórek w obrębie ICM znaczenie może mieć ich odmienna zdolność do polaryzacji. Wyniki badań prowadzonych z użyciem kul zarodkowych prowadzą do wniosku, że to polaryzacja komórek ES może mieć znaczenie w ich powierzchniowej lokalizacji. Jeżeli kule zarodkowe były tworzone z wykorzystaniem komórek ES pozbawionych funkcjonalnej kopii genu kodującego kadherynę E oraz komórek ES typu dzikiego, to komórki ES pozbawione kadheryny, mające zmniejszone właściwości adhezyjne, znajdowały się w agregatach w warstwie zewnętrznej, a komórki posiadające kadherynę zajmowały pozycję wewnętrzną. Jednak jeżeli komórki pozbawione kadheryny E agregowano z komórkami ES zróżnicowanymi przy użyciu kwasu retinowego (RA) w kierunku pierwotnej endodermy, to komórki zróżnicowane tworzyły zewnętrzną warstwę kul zarodkowych (Moore i wsp., 2009). Autorzy tłumaczą, że w tym przypadku powodem tworzenia linii PE przez komórki zróżnicowane, a nie komórki pozbawione kadheryny, jest odmienna kompetencja obu typów komórek do polaryzacji. Wykazano, że segregacja komórek PE i Epi zależy od polaryzacji komórek PE, czyli nierównomiernego rozmieszczenia takich białek, jak: apkc (Saiz i wsp., 2013), Lrp2 i Dab2 (Gerbe i wsp., 2008), ale zależność ta nie wyklucza wpływu zmian właściwości adhezyjnych na segregację komórek w obrębie ICM. 5. Czy w komórkach PE zachodzi proces przemiany nabłonkowomezenchymalnej (EMT)? Po implantacji blastocysty komórki PE migrują po wewnętrznej stronie TE dystalnej (Sobotta, 1911). Wykazano, że migracja ta jest zależna od utworzenia błony podstawnej między komórkami PE i Epi oraz od prawidłowego wykształcenia jednokomórkowej warstwy przez komórki PE (Yang i wsp., 2007b; Liu i wsp., 2009; Moore i wsp., 2014b). W tym czasie obserwuje się zmniejszenie właściwości adhezyjnych i zwiększenie właściwości migracyjnych komórek PE. Dodatkowo, biorąc pod uwagę obecność w komórkach PE białka Dab2 (Yang i wsp., 2002) oraz mrna kodującego białko Snail (Veltmaat i wsp., 2000) sugeruje się, że w komórkach tej linii zachodzi proces przemiany nabłonkowo mezenchymalnej (EMT ang. epithelial mesenchymal transition) (Verheijen i Defize, 1999; Veltmaat i wsp., 2000; Paca i wsp., 2012). Dotychczas wyróżniono trzy typy procesu EMT (Zeisberg i Neilson, 2009): 35

1) mezenchymalny, który polega na przekształceniu pierwotnych komórek nabłonkowych w komórki mezenchymalne w czasie gastrulacji. Ten typ EMT zachodzi też w czasie neurulacji, kiedy komórki grzebienia nerwowego nabywają charakter mezenchymalny i rozpoczynają migrację; 2) fibroblastowy, w którym komórki nabłonkowe bądź komórki nabłonkowe naczyń krwionośnych tworzą fibroblasty; 3) metastatyczny, który zachodzi w nabłonkowych komórkach nowotworowych. Proces ten prowadzi do odłączenia się komórki nowotworowej od nabłonka i w konsekwencji jej migracji. Po procesie odwrotnym do EMT, czyli MET, komórka ta może osiedlić się w innym miejscu organizmu, rozpoczynając tworzenie nowego guza (tzw. przerzutu). Nie wykazano jednoznacznie, aby proces EMT zachodził w komórkach PE, ale też szczegółowe badania w tym kierunku nie były dotąd prowadzone. 36

II Cele pracy Podczas ostatniej dekady nastąpił ogromny postęp w badaniach nad wyjaśnieniem molekularnych mechanizmów powstawania pierwszych linii komórkowych (TE, PE i Epi) w przedimplantacyjnym rozwoju zarodkowym myszy. Jednak wiele kwestii, zwłaszcza dotyczących różnicowania komórek w obrębie węzła zarodkowego blastocysty nadal pozostaje niewyjaśnionych. Mimo, iż wiadomo, że komórki PE i Epi różnią się właściwościami adhezyjnymi, nieznana jest do tej pory rola białek adhezyjnych w wyodrębnianiu się linii tych komórek. Nie do końca znany jest również moment, w którym komórki ICM tracą zdolność do różnicowania w odmienne linie komórkowe i ich los zostaje ostatecznie i nieodwracalnie zdeterminowany. W niniejszej rozprawie starałam się określić, kiedy w zarodku myszy zachodzi ostateczna determinacja losu komórek węzła zarodkowego blastocysty, z których powstają linie PE i Epi. Podjęłam się także zbadania udziału wybranych białek adhezyjnych w powstawaniu tych linii. Przeprowadzając badania postawiłam sobie następujące cele: 1. Określenie, kiedy w zarodku myszy ukierunkowanie różnicowania komórek linii PE i Epi staje się nieodwracalne oraz sprawdzenie, czy ta ostateczna decyzja rozwojowa dotycząca losu komórek ICM skorelowana jest czasowo z segregacją tych komórek do odrębnych linii w późnej blastocyście. 2. Stwierdzenie, czy białka adhezyjne Pecam-1 oraz kadheryna E biorą udział w różnicowaniu i segregacji komórek w ICM. 3. Sprawdzenie, czy zmiany właściwości adhezyjnych komórek zachodzące w trakcie różnicowania i formowania się PE mają charakter przemiany nabłonkowo mezenchymalnej (proces EMT). Doświadczenia, których wyniki przedstawiam w tej rozprawie wykonywane były w Zakładzie Embriologii Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego oraz na Wydziale Nauk o Życiu Uniwersytetu w Manchesterze w grupie dr Bereniki Płusy. 37

III Materiały i metody Doświadczenia, które były wykonywane w Uniwersytecie Warszawskim, uzyskały pozytywną opinię I Lokalnej Komisji Etycznej w Warszawie (uchwały numer 1038/2009, 382/2011 oraz 545/2014). Doświadczenia przeprowadzone w Uniwersytecie w Manchesterze były zgodne z Aktem 1986 Procedur Naukowych Głównego Urzędu do Spraw Zwierząt w Wielkiej Brytanii. Wszystkie odczynniki do hodowli komórek ES, jeżeli nie opisano inaczej, pochodziły z firmy Gibco. Pozostałe odczynniki, jeżeli nie zaznaczono inaczej, pochodziły z firmy Sigma Aldrich, Polska. 1. Materiał biologiczny Zarodki myszy uzyskiwałam od samic krytych albo w naturalnym cyklu rujowym albo po stymulacji dojrzewania pęcherzyków jajnikowych i owulacji przez podanie egzogennych hormonów. Samice i samce były dojrzałymi płciowo osobnikami hodowanymi w cyklu dobowym składającym się z 14-godzinnego dnia i 10-godzinnej nocy. W badaniach wykorzystałam zarodki myszy uzyskane w wyniku krzyżowania różnych szczepów myszy: - samców i samic pokolenia F 1 krzyżówki dwóch szczepów wsobnych C57BI/6Tar i CBA/Tar; - samców i samic szczepu CD1; - samców linii PdgfRα H2B:EGFP i samic szczepu CD1 lub F1. U myszy z linii PdgfRα H2B:EGFP ulega ekspresji gen białka fuzyjnego składającego się z histonu H2B połączonego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (EGFP enhanced green fluorescent protein) pod kontrolą endogennego promotora genu PdgfRα (Hamilton i wsp., 2003; Plusa i wsp., 2008). Dzięki temu fluorescencję wykrywa się w zarodku jedynie w komórkach pierwotnej endodermy. Wiek samic szczepu F 1 wynosił od 2 do 7 miesięcy, wiek samic szczepu CD1 wynosił od 2 do 6 miesięcy, natomiast wiek samców szczepów: F 1 i CD1 oraz linii transgenicznej PdgfRα wynosił od 3 do 12 miesięcy. 38

Do doświadczeń wykorzystałam zarodkowe komórki macierzyste (komórki ES) linii H2BGFP (Hadjantonakis i Papaioannou, 2004), po ich szóstym lub siódmym pasażu. Komórki te zostały udostępnione przez dr Kat Hadjantonakis z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center w Nowym Jorku. Komórki tej linii charakteryzują się konstytutywną ekspresją białka fuzyjnego histonu H2B z białkiem GFP, w związku z tym ich jądra komórkowe charakteryzuje zielony sygnał fluorescencji. 2. Procedury 2.1. Uzyskiwanie i hodowla zarodków myszy Hodowle zarodków prowadziłam na plastikowych szalkach o średnicy 35 mm (Becton- Dickinson), w kroplach pożywki KSOM (Millipore) (Erbach i wsp., 1994) pod parafiną, w temperaturze 37,5 C, w atmosferze 5% CO 2 w powietrzu. Gdy zarodki znajdowały się poza inkubatorem, utrzymywane były w pożywce M2 [pożywka M16 zbuforowana HEPES (Fulton i Whittingham, 1978) wzbogaconej albuminą z surowicy bydlęcej BSA; ang. bovine serum albumin, frakcja V, 4 mg/ml]. Zarówno w Zakładzie Embriologii WB UW, jak i na Wydziale Nauk o Życiu UM pożywka M2 była sporządzana własnoręcznie. Do badań wykorzystywałam zarodki myszy w różnych stadiach rozwoju. Samice owulujące spontanicznie łączyłam z samcami w godzinach popołudniowych, a następnego dnia rano sprawdzałam obecność czopów pochwowych, świadczących o pokryciu samic. Wiek izolowanych zarodków liczyłam od godziny wyznaczającej połowę okresu nocy w cyklu dobowym hodowanych zwierząt (godzina 24.00). Samice zabijano przez przerwanie rdzenia kręgowego, według raportu z 2001 roku: Zalecenia dotyczące eutanazji zwierząt laboratoryjnych. Zarodki 8-komórkowe uzyskiwałam poprzez przepłukanie pożywką M2 wyizolowanych jajowodów oraz cieśni pomiędzy jajowodem i macicą, po około 58 godzinach od pokrycia samic. Wiek pozostałych zarodków w momencie izolacji podałam w opisie ich stadium, i tak np. określenie stadium 3,5-dniowe oznacza, że zarodki były izolowane w połowie czwartego dnia rozwoju. Zarodki 3,5-dniowe i 4,5-dniowe, określane w pracy odpowiednio jako wczesne i późne blastocysty, uzyskiwałam poprzez przepłukanie macicy pożywką M2. Zarodki 5,5-dniowe oraz 6,5-dniowe (stadium cylindra zarodkowego) uzyskałam poprzez izolację z macicy tkanki doczesnej otaczającej każdy implantowany 39

zarodek. Po rozcięciu doczesnej, wyłuskiwałam igłą preparacyjną zarodek, który znajdował się w około 1/3 długości tej tkanki od strony mezometrialnej. Stymulacja hormonalna samic polegała na podaniu dootrzewnowo roztworu serogonadotropiny źrebnych klaczy (PMSG, Folligon, Intervet; 10 jednostek/mysz), a następnie, po 47 51 godzinach, roztworu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hcg, Choluron, Intervet; 10 jednostek/mysz). Następnie samice łączyłam z samcami, a w kilka godzin później lub następnego dnia rano stwierdzałam pokrycie samic, sprawdzając obecność czopów pochwowych. Wiek zarodków uzyskanych po stymulacji hormonalnej samic liczyłam od momentu podania samicy hormonu hcg. Zarodki 8-komórkowe izolowałam po upływie 64 72 godzin od podania hcg, poprzez przepłukanie pożywką M2 jajowodu oraz cieśni pomiędzy jajowodem a macicą. Wczesne blastocysty (odpowiadające stadium 3,5-dniowemu) izolowałam po upływie 92 94 godzin od podania hcg poprzez płukanie macicy. Niektóre doświadczenia wymagały innego sposobu uzyskania późnych blastocyst (4,5-dniowych) niż wyżej opisałam. Blastocysty te uzyskałam poprzez 24-godzinną hodowlę in vitro wczesnych blastocyst. W celu uzyskania zarodków mających jedynie komórki PE (ICM-PE) bądź jedynie komórki Epi (ICM-Epi) w obrębie ICM modulowałam aktywność ścieżki sygnałowej FGF/MAP kinazy (ang. fibroblast growth factor/ mitogen activated protein kinase) w zarodkach od stadium 8-komórkowego do stadium późnej blastocysty (72 godziny hodowli). Zarodki uzyskiwałam od samic F 1 stymulowanych do owulacji hormonalnie i pokrytych przez samce tej samej krzyżówki. Blokując kaskadę sygnałową FGF/MAP kinazy poprzez hodowlę zarodków w pożywce KSOM zawierającej kombinację inhibitorów: receptora FGFR2 (PD173074, 100nM, Stemgent) oraz kinazy MEK (PD0325901, 500nM, Stemgent) uzyskiwałam zarodki, których węzły zarodkowe składały się wyłącznie z komórek Epi. Z kolei poprzez hodowlę zarodków 8-komórkowych w obecności egzogennego czynnika FGF4 (500ng/ml, w pożywce KSOM, R&D System) i heparyny (1µg/ml) uzyskiwałam zarodki z ICM zawierającym wyłącznie komórki PE (Yamanaka i wsp., 2010). 2.2. Izolacja i hodowla węzłów zarodkowych Węzły zarodkowe izolowałam z blastocyst uzyskanych od owulujących spontanicznie samic szczepu CD1 pokrytych przez samce linii transgenicznej PdgfRα. Ponieważ samce tej 40

linii są heterozygotyczne pod względem obecności transgenu, do doświadczeń wybierałam tylko te zarodki, które charakteryzowały się sygnałem fluorescencji w komórkach PE. Do uzyskania węzłów zarodkowych wykorzystywałam zarodki w stadium wczesnej blastocysty (3,5-dnia rozwoju) oraz w stadium późnej blastocysty (4,5-dnia rozwoju), które otrzymałam po 24-godzinnej hodowli wczesnych blastocyst. Izolację węzłów zarodkowych przeprowadzałam metodą immunochirurgii (Solter i Knowles, 1975). Osłonki przejrzyste z zarodków usuwałam z wykorzystaniem kwaśnego roztworu Tyrode a o ph 2,5 (Nicolson i wsp., 1975). Jako źródło przeciwciał skierowanych przeciwko komórkom mysim stosowałam surowicę skierowaną przeciwko mysim limfocytom. Surowicę tę przed użyciem inkubowałam przez 30 minut w temperaturze 56 C w celu inaktywacji własnego dopełniacza. Zarodki inkubowałam przez 30 minut w 25% roztworze surowicy w pożywce M2. Następnie umieszczałam zarodki na 15 minut w 20% roztworze dopełniacza w pożywce M2. Zabieg ten prowadził do lizy zewnętrznych komórek zarodka (komórek trofektodermy), które usuwałam mechanicznie przez pipetowanie. Wyizolowane węzły zarodkowe były następnie hodowane w pożywce KSOM. Rozwój wyizolowanych węzłów zarodkowych rejestrowałam w czasie 24-godzinnej hodowli techniką filmów poklatkowych przy użyciu mikroskopu konfokalnego (podrozdział 2.7). Hodowlę węzłów zarodkowych prowadziłam na plastikowych szalkach ze szklanym dnem (Mat-Tek, P35G-1,5-20-C) w kroplach pożywki KSOM, pod parafiną, w temperaturze 37,5 C i atmosferze 5% CO 2 w powietrzu. Następnie węzły zarodkowe po 24-godzinnej hodowli utrwalałam i poddawałam znakowaniu białek metodą immunofluorescencji pośredniej (podrozdział 2.7). 2.3. Hodowla zarodkowych komórek macierzystych (komórek ES) Zarodkowe komórki macierzyste hodowałam na warstwie odżywczej mysich fibroblastów zarodkowych (MEF ang. mouse embryonic fibroblasts) inaktywowanych mitomycyną, wysianych na warstwę 0,2% żelatyny. Do hodowli używałam pożywkę Knockout DMEM (ang. knockout Dulbecco s Modified Eagle s Medium) wzbogaconą bydlęcą surowicą płodową FBS (ang. Foetal Bovine Serum) w stężeniu 15% z dodatkiem aminokwasów (ang. nonessential amino-acids, 0,1 mm), L-glutaminy (2 mm), β-merkaptoetanolu (0,1 mm, Sigma), penicyliny (5000 jednostek/ml), streptomycyny (5000 g/ml) oraz mysiego czynnika 41

przeciwbiałaczkowego LIF (ang. Leukaemia Inhibitory Factor) w stężeniu 1000 jednostek/ml (ESGRO, Chemicon International). Pożywkę w hodowli zmieniałam co 24 godziny. Hodowle prowadziłam w temperaturze 37 C, w atmosferze 5% CO 2 w powietrzu. Komórki MEF uzyskałam z 13,5-dniowych zarodków myszy F 1, według procedury opisanej przez Robertson (1997). Zarodki po izolacji oczyszczałam z błon płodowych, dekapitowałam i usuwałam z nich organy wewnętrzne. Tak uzyskane powłoki ciała cięłam na drobne fragmenty w 0,25% roztworze trypsyny w PBS zawierającym 1 mm EDTA i inkubowałam je w tym samym roztworze przez 30 minut w standardowych warunkach hodowlanych. Następnie enzym neutralizowałam pożywką DMEM (stężenie glukozy: 4,5 g/l) zawierającą 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS) i antybiotyki: penicylinę (5000 jednostek/ml) i streptomycynę (5000 g/ml). Tkanki dezagregowałam przez intensywne pipetowanie, a zawiesinę komórek uzyskaną z jednego zarodka hodowałam w butelce o powierzchni 75 cm 2 (Becton-Dickinson) w opisanej powyżej pożywce DMEM z FBS i antybiotykami. Po trzecim pasażu komórki inaktywowałam mitomycyną (10 µg/ml) przez 2 godziny, a następnie zamrażałam w pożywce DMEM zawierającej 15% FBS i 10% DMSO. Porcje komórek MEF przechowywałam w ciekłym azocie. 2.4. Różnicowanie komórek ES w obecności kwasu retinowego (RA) Różnicowanie zarodkowych komórek macierzystych w kierunku PE rozpoczynałam drugiego dnia po ich pasażowaniu. Dzień ten określałam jako dzień 0. W tym celu zmieniałam standardową pożywkę do hodowli komórek ES na pożywkę pozbawioną czynnika LIF i zawierającą kwas retinowy (RA) w stężeniu 1 µm (Moore i wsp., 2009). Hodowlę prowadziłam dalej przez siedem dni, zmieniając pożywkę co 48 godzin. Jeżeli komórki po hodowli były wykorzystywane do iniekcji, to zawieszałam je w pożywce bez RA. Podyktowane to było faktem, że czynnik ten jest światłoczuły, a iniekcję przeprowadzałam w świetle dziennym. 2.5. Obniżenie ekspresji genu pecam-1 w zarodkowych komórkach macierzystych Doświadczenia polegające na obniżeniu poziomu ekspresji genu pecam-1 wykonywałam wykorzystując komórki ES. Sprawdziłam działanie trzech komercyjnie dostępnych cząsteczek sirna (ang. short interference RNA) skierowanych przeciwko mrna 42

kodującemu Pecam-1 (oznaczone jako: s71464, s71465, s71466, Ambion), wprowadzając je do komórek ES metodą transfekcji. Spośród nich wybrałam jedną (s71464) na podstawie wydajności transfekcji, efektywności obniżenia ilości mrna kodującego Pecam-1 w komórkach oraz skuteczności obniżenia poziomu tego białka w błonie komórek. W trzecim dniu po wysianiu komórek przeprowadzałam transfekcję z użyciem lipofektaminy 2000 (Life Technologies). Do przeprowadzenia transfekcji przygotowałam dwa roztwory: roztwór sirna ze znacznikiem fluorescencyjnym Block-it w pożywce nkdmem + LIF, roztwór lipofektaminy w pożywce nkdmem + LIF. Przygotowane roztwory inkubowałam 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym mieszałam je w stosunku 1:1 i tak otrzymaną mieszaninę inkubowałam przez kolejne 15 minut. Mieszaninę dodawałam do zawiesiny komórek ES w stosunku 1:4. Komórki zawieszałam w pożywce do hodowli komórek ES pozbawionej penicyliny i streptomycyny. Końcowe stężenie sirna wynosiło: 5 nm, 10 nm lub 20 nm, a stężenie Block-it 40 nm. Końcowe stężenie lipofektaminy wynosiło 40 µg/ml. Stężenie LIF w pożywce nkdmem wykorzystanej do uzyskania roztworów sirna oraz lipofektaminy było równe 1000 jednostek/ml. 24 godziny po transfekcji zmieniałam podłoże na pożywkę do hodowli komórek ES. Kontrolę stanowiły komórki transfekowane niespecyficznym sirna (ang. scrambled sirna, które dalej będzie nazywane ns sirna) o stężeniu końcowym 10 nm oraz komórki ES traktowane wyłącznie lipofektaminą. Wykorzystany do transfekcji znacznik fluorescencyjny Block-it obecny był w komórkach, które uległy transfekcji. Dzięki temu mogłam policzyć kolonie powstałe z tych komórek, czyli oszacować efektywność transfekcji. Do liczenia kolonii wykorzystałam zdjęcia zrobione 24 godziny po transfekcji za pomocą mikroskopu konfokalnego (5 pól widzenia, obiektyw 20x). Względną ilość transkryptów genu pecam-1 w transfekowanych komórkach określiłam metodą RT-qPCR, po dwóch, czterech i sześciu dniach od transfekcji. 2.6. Wprowadzanie komórek ES do zarodków Komórki ES zróżnicowane pod wpływem RA oraz komórki ES transfekowane sirna wprowadzałam mikrochirurgicznie do zarodków w stadium 8-komórkowym oraz do 43

wczesnych lub późnych blastocyst. W tym celu komórki ES odklejałam od podłoża poprzez kilkuminutową inkubację w roztworze trypsyny (roztwór 0,25%-owy w PBS z 1 mm EDTA, Gibco). Objętość roztworu trypsyny była dobierana do objętości naczynia hodowlanego tak, aby dno naczynia było całkowicie pokryte cienką warstwą roztworu. Następnie neutralizowałam działanie enzymu, dodając pożywkę hodowlaną. Zawiesinę komórek zbierałam, a komórki osadzałam przez wirowanie (400 x g, 5 minut), po czym zawieszałam je w tej samej pożywce i przechowywałam w temperaturze 4 C (aby zapobiec ich sklejaniu się) do czasu przeprowadzenia mikromanipulacji. Dla przeprowadzenia iniekcji komórek ES do zarodków 400 µl zawiesiny tych komórek przenosiłam na wieczko plastikowej szalki o średnicy 35 mm (Becton-Dickinson) i pokrywałam warstwą parafiny. Następnie przenosiłam zarodki do tej kropli i w niej wykonywałam iniekcje komórek ES. Komórki ES wstrzykiwałam do zarodków przy użyciu pipet iniekcyjnych z ostrym zakończeniem (rozmiar 42, BM100T-15, BioMedicalInstruments). Mikroiniekcje przeprowadzałam z użyciem mikroskopu Diaphot 300 i mikromanipulatorów Leitz oraz podłączonych do nich pomp CellTram (Eppendorf). Zarodki w czasie iniekcji przytrzymywałam własnoręcznie wykonaną pipetą ze szkła borokrzemowego. Wprowadzałam po 10 komórek ES pod osłonkę przejrzystą zarodków 8-komórkowych lub do jamy zarodków w stadium wczesnej i późnej blastocysty, uzyskanych od samic F 1 stymulowanych do owulacji hormonalnie. Późne blastocysty uzyskałam po 24-godzinnej hodowli wczesnych blastocyst. Co godzinę zmieniałam porcję komórek ES z zawiesiny przetrzymywanej w temperaturze 4 C. Jeśli zarodki 8-komórkowe rozpoczynały kompakcję, poddawałam je inkubacji w pożywce M2 pozbawionej jonów Ca 2+ i Mg 2+ z dodatkiem EGTA (0,2 mg/ml), przez 10 minut. Powodowało to rozluźnienie połączeń między blastomerami zarodka (Tarkowski i Wróblewska, 1967). 2.7. Wykrywanie białek w zarodkach, węzłach zarodkowych i komórkach ES metodą immunofluorescencji pośredniej Do wykrywania obecności i lokalizacji białek w badanym materiale stosowałam metodę immunofluorescencji pośredniej. W metodzie tej wykorzystywałam przeciwciała I-rzędowe i II-rzędowe wyszczególnione w tabeli I. 44

Tabela I. Przeciwciała I-rzędowe i skierowane przeciwko nim przeciwciała II-rzędowe. Wykrywane białko Przeciwciało I-rzędowe Stężenie Przeciwciało/a drugorzędowe (1:200) Cdx2 Mysie IgG (Biogenex/MU392a-UC) 1:100 Gata4 Królicze (Santa Cruz sc-9053) 1:100 Gata4 Kozie (Santa Cruz sc-1237) 1:100 Kadheryna E Szczurze (Takara M107) 1:500 Kadheryna E Mysie klon 4A2C7 (Zymed 18-0223) 1:100 Królicze (BD Transduction Laboratories Kadheryna N 610920) 1:50 Oct4 Mysie (Santa Cruz sc-5279) 1:100 Pecam-1 Szczurze (Becton Dickinson 550274) 1:50 Snail Królicze (Santa-Cruz (H-130) sc-28199) 1:100 Sox17 Kozie (R&D System NL1924R) 1:200 Wimentyna Królicze (Cell signaling 5741) 1:100 Ośle przeciwko IgG myszy, skoniugowane z fluorochromem TRITC (Jackson Immuo Research, 115-025-068) Kozie przeciwko IgG królika, skoniugowane z Alexa 633 (Life Technologies, A21071) Ośle przeciwko IgG kozy, skoniugowane z Alexa 647, (Life Technologies, 21447) Kozie przeciwko IgG szczura, skoniugowane z Alexa 633 (Life Technologies, A21071) Kozie przeciwko IgG myszy, skoniugowane z Alexa 633 (Life Technologies, A-21050) Ośle przeciwko IgG królika, skoniugowane z fluorochromem TRITC (Jackson Immuo Research, 115-025-068) Ośle przeciwko IgG myszy, skoniugowane z fluorochromem TRITC (Jackson Immuo Research, 115-025-068) Kozie przeciwko IgG szczura, skoniugowane z Alexa 633 (Life Technologies, A21071) Ośle przeciwko IgG królika, skoniugowane z Alexa 594, (Life Technologies, a 11012) Ośle przeciwko IgG kozy skoniugowane z Alexa 488 (Life Technologies, a 11055) Ośle przeciwko IgG królika, skoniugowane z Alexa 594, (Life Technologies, a 11012) Aktynę wykrywałam falloidyną skoniugowaną z fluoresceiną (Sigma, P5282). Do obserwacji i rejestracji wyznakowanego materiału używałam mikroskopów konfokalnych: Axiovert 100M (Zeiss), FluoView FV1000 (Olympus), a także Nikon A1R 45

(Nikon), odpowiednio z oprogramowaniem: Carl Zeiss Laser Scanning System LSM 510 (Zeiss), FluoView v2.1 (Olympus) i NIS Elements AR (Nikon). 2.7.1. Utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne zarodków i węzłów zarodkowych Zarodki oraz węzły zarodkowe blastocyst utrwalałam przez 30 minut w 4%-owym roztworze paraformaldehydu (PFA) w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+. Następnie przeprowadzałam permeabilizację błon komórkowych poprzez 30-minutową inkubację zarodków w 0,5%-owym roztworze Triton X-100 w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+. Blokowanie miejsc niespecyficznego wiązania przeciwciał wykonywałam umieszczając zarodki na noc w 3% roztworze albuminy (BSA ang. bovine albumin serum) w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ (roztwór do blokowania). Następnie zarodki inkubowałam przez noc w temperaturze 4 C w roztworze do blokowania zawierającym odpowiednie przeciwciało I-rzędowe (Tabela I). Po trzykrotnym płukaniu zarodków w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ (po 10 minut każde) wykonywałam znakowanie przeciwciałem II-rzędowym rozcieńczonym w buforze do blokowania (90 minut w temperaturze pokojowej). Po tej inkubacji zarodki ponownie płukałam w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ i umieszczałam na szalce ze szklanym dnem, w roztworze wybranego znacznika fluorescencyjnego wiążącego się z DNA (DRAQ, jodek propidyny, chromomycyna). 2.7.2 Utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne zarodkowych komórek macierzystych Komórki ES utrwalałam 10 minut w 4%-owym roztworze PFA w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+. Następnie błony komórkowe komórek ES permeabilizowałam przez 10 minut w 0,5%-owym roztworze Triton X-100 w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+, po czym przeprowadzałam blokowanie miejsc niespecyficznego wiązania przeciwciał w 3% roztworze BSA w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+, przez noc w temperaturze 4 C. Komórki inkubowałam przez noc w roztworze odpowiedniego przeciwciała I-rzędowego (Tabela I), rozcieńczonego w roztworze do blokowania, w wilgotnej komorze, w temperaturze 4 C. Po trzykrotnym płukaniu w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ (każde po 10 minut) komórki umieszczałam w roztworze do blokowania zawierającym przeciwciało II-rzędowe na 90 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Po kolejnym płukaniu w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ barwiłam jądra komórkowe, zamykając preparaty przy użyciu odczynnika Dako 46

(Dako Fluorescent Mounting Medium) z DRAQ bądź odczynnika Citi Fluor (Glycerol/PBS AF1, Citifluor LTD) z jodkiem propidyny. W celu wykrycia białka Pecam-1 komórki utrwalałam w 2,5%-owym roztworze PFA przez 15 minut. Blokowanie miejsc niespecyficznego wiązania przeciwciała wykonywałam umieszczając komórki na 20 minut w 0,6%-owym roztworze BSA z dodatkiem 0,01% Tween 20 (Bio-Rad) w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+. Komórki inkubowałam w roztworze przeciwciała I-rzędowego przez 60 minut w wilgotnej komorze, po czym trzykrotnie po 10 minut płukałam PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+. Następnie komórki inkubowałam przez 90 minut w roztworze odpowiedniego przeciwciała II-rzędowego, w wilgotnej komorze. Przeciwciało I-rzędowe i II-rzędowe rozcieńczałam w 10%-owym roztworze FBS w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+. Po trzykrotnym płukaniu komórek w PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ zamykałam je na szkiełku podstawowym z odczynnikiem Citi Fluor z jodkiem propidyny. PBS wykorzystany do tej procedury był wzbogacony PVP (poliwinyloporylidon, 3 mg/ml). Do jednoczesnego wyznakowania dwóch białek zarodki, węzły zarodkowe i komórki ES inkubowałam w mieszaninie przeciwciał I-rzędowych skierowanych przeciwko tym białkom, a następnie w mieszaninie odpowiednich przeciwciał II-rzędowych. 2.8. Uzyskanie RNA do iniekcji zarodków 2.8.1. Znacznikowy mrna Znacznikowy mrna kodujący histon H2B sprzężony z białkiem GFP uzyskałam przez reakcję transkrypcji in vitro przeprowadzoną za pomocą zestawu mmessage mmachine SP6 Transcritpion Kit (Ambion). Jako matrycy do transkrypcji używałam plazmid CS2H2BGFP, stworzony przez Raphaela Thureta (Uniwersytet w Manchesterze) z wykorzystaniem plazmidu CS2. Plazmid przecinałam enzymem restrykcyjnym Not I (Roche lub Vivantis) poprzez inkubację przez 10 12 godzin w mieszaninie reakcyjnej, przygotowanej zgodnie ze wskazówkami producenta enzymów. Przecięty plazmid oczyszczałam metodą fenol/chloroform/pentanol z precypitacją alkoholem etylowym i octanem amonowym. Transkrypcję in vitro przeprowadzałam przez dwie godziny w temperaturze 37 C, według wskazówek producenta, z dodatkiem 0,5 µl inhibitora RNaz w mieszaninie reakcyjnej. Uzyskany mrna oczyszczałam metodą fenol/chloroform/pentanol i precypitowałam 47

propan-2-olem. Otrzymany osad mrna rozpuszczałam w H 2 O pozbawionej RNaz i przechowywałam w temperaturze -20 C. 2.8.2. Dwuniciowy RNA (dsrna) Uzyskałam dwie różne sekwencje dsrna (ang. double stranded RNA). Do uzyskania jednej z nich, skierowanej przeciwko transkryptom kadheryny E, wykorzystałam plazmid CS2EcadHA. Druga sekwencja (kontrolna) skierowana była przeciwko transkryptom białka fluorescencyjnego Cherry. Otrzymałam ją wykorzystując plazmid CS2H2BCherry. Plazmid CS2EcadHA został stworzony przez Nitina Subherwala (Uniwersytet w Manchesterze), a plazmid CS2H2BCherry przez Raphaela Thureta (Uniwersytet w Manchesterze). W celu uzyskania dwuniciowego RNA skierowanego przeciwko transkryptom kadheryny E bądź białka Cherry namnożyłam fragmenty DNA specyficzne dla tych białek przy pomocy łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR, ang. polimerase chain reaction), wykorzystując jako matrycę wymienione wyżej plazmidy. Startery, które wykorzystałam do tej reakcji, posiadały na początku sekwencję promotora T7: Kadheryna E S: 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGA CTGCTGCTCCTACTGTTTCT 3 AS: 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGA GAACACCAACAGAGAGTCGT 3 Cherry: S: 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGA CCGACTACTTGAAGCTGTCCTT 3 AS: 5 TAATACGACTCACTATAGGGAGA GTTCCACGATGGTGTAGTCCTC 3 Reakcję PCR przeprowadziłam przy użyciu polimerazy Taq, buforu Q, buforu x10 i nukleotydów, zgodnie ze wskazówkami producenta (Qiagen). Łańcuchowa reakcja polimerazy przebiegała według parametrów opisanych w tabeli II. Tabela II. Parametry reakcji PCR przeprowadzonej w celu amplifikacji fragmentów DNA specyficznych dla kadheryny E oraz białka Cherry. 2 min. 94 C dlaczego x5 x 25 15s 94 C 30s 55 C lub 48 C odpowiednio w reakcji dla kadheryny E bądź Cherry 45s 72 C 15s 94 C 30s 60 C lub 62 C odpowiednio w reakcji dla kadheryny E bądź Cherry 45s 72 C 5 min. 72 C 48

W uzyskanym DNA sekwencje dla fragmentu kadheryny E bądź dla fragmentu białka Cherry poprzedzone były sekwencją promotora T7. Następnie przeprowadziłam transkrypcję in vitro tych sekwencji przy użyciu zestawu mmessage mmachine T7 Transcritpion Kit zawierającego polimerazę T7. Reakcja została zakończona powolnym chłodzeniem mieszaniny reakcyjnej w celu połączenia nici RNA w dwuniciowe cząsteczki. Uzyskany dwuniciowy RNA oczyściłam metodą fenol/chloroform/pentanol i precypitowałam propan-2-olem. Roztwór dsrna w H 2 O pozbawionej RNaz przechowywałam w temperaturze -20 C. 2.9. Iniekcja dsrna oraz mrna do blastomerów 8-komórkowych zarodków myszy W doświadczeniach mających na celu obniżenie ilości kadheryny E wykorzystywałam zarodki pochodzące od owulujących spontanicznie samic CD1 lub F 1 po pokryciu przez samce tych samych szczepów. Uzyskane przeze mnie dsrna i/lub mrna wprowadzałam metodą mikroiniekcji do jednego blastomeru zarodka 8-komórkowego. Iniekcje prowadziłam przy użyciu mikroskopu odwróconego i mikromanipulatorów TransferMan (Eppendorf). Do manipulatora, w którym zainstalowana była własnoręcznie wykonana borokrzemowa pipeta trzymająca, przyłączona była pompka CellTram (Eppendorf). Do drugiego mikromanipulatora, do którego zainstalowana była pipeta iniekcyjna, przyłączona była pompa FemtoJet (Eppendorf). Pipety iniekcyjne uzyskiwałam tuż przed iniekcją z kapilar z filamentem o średnicy zewnętrznej 1,0 mm i średnicy wewnętrznej 0,78 mm (Harvard Apparatus) za pomocą wyciągarki Flaming/Brown Micropipette Puller P-97 (Sutter Instruments Co.). Po iniekcji dsrna zarodki hodowałam w warunkach opisanych w podrozdziale 2.1 i rejestrowałam ich rozwój metodą filmowania poklatkowego przez 52 54 godzin. 2.10. Badanie poziomu ekspresji genów metodą RT - qpcr w komórkach ES i blastomerach Komórki ES odklejałam od podłoża według opisu zawartego w podrozdziale 2.3 i dwukrotnie inkubowałam w temperaturze 37 C po 20 minut na szalkach pokrytych 0,2% żelatyną w celu eliminacji komórek MEF z zawiesiny. Następnie umieszczałam około 8 000 49

komórek ES w 100 µl buforu do lizy (Dynabeads 2,8 µm mrna DIRECT MicroKit, Life Technologies) i zamrażałam w temperaturze -80 C. Pojedyncze blastomery uzyskiwałam poprzez dezagregację węzłów zarodkowych bądź całych zarodków na pojedyncze komórki. Osłonki przejrzyste usuwałam z zarodków poprzez ich inkubację w kwaśnym roztworze Tyrode a (ph 2,5) (Nicolson i wsp., 1975). W celu dezagregacji zarodków bądź węzłów zarodkowych inkubowałam je przez 5 minut w roztworze pronazy (0,5% w PBS, Calbiochem), a następnie przez 10 15 minut w pożywce M2 bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ z dodatkiem EGTA (0,2 mg/ml, Sigma), po czym intensywnie pipetowałam. Pary lub grupy komórek, które nadal ściśle do siebie przylegały, rozdzielałam szklaną igłą na warstwie agaru w pożywce M2. W celu określenia względnej ilości mrna kodującego kadherynę E w komórkach PE i Epi izolowałam pojedyncze blastomery z wczesnych i późnych blastocyst. Późne blastocysty uzyskiwałam po 24-godzinnej hodowli wczesnych blastocyst. Zarodki uzyskiwałam z samic F 1 owulujących spontanicznie i pokrytych przez samce linii transgenicznej PdgfRα. W celu rozróżnienia komórek PE (charakteryzujących się zielonym sygnałem jądrowym) od komórek Epi (komórki pozbawione sygnału fluorescencyjnego) uzyskane pojedyncze komórki selekcjonowałam pod mikroskopem fluorescencyjnym Axiovert 135 (Zeiss) (ryc. 5). Następnie w 20 µl buforu do lizy lizowałam po trzy komórki PE i po trzy komórki Epi z każdego zarodka. Lizaty poddałam analizie RT-qPCR, przy użyciu dwóch genów referencyjnych: β-aktyny i GAPDH (dehydrogezana aldehydu 3-fosfoglicerynowego, ang. glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). Komórki Epi Komórka PE a a b b Pdgfrα Ryc. 5. Komórki po dezagregacji ICM wczesnej blastocysty. Fot. a i a przedstawiają trzy blastomery Epi, z których dwa lizują, a środkowy blastomer pozostał żywy. Fot. b i b przedstawiają jeden blastomer PE, charakteryzujący się zielonym sygnałem fluorescencji świadczącym o aktywności transkrypcyjnej genu pdgfrα. 50

W podobny sposób określałam w jakim stopniu stosowane przeze mnie dsrna obniżyło względną ilości mrna kodującego kadherynę E. W zarodkach 8-komórkowych pochodzących od owulujących spontanicznie samic F 1 pokrytych przez samce F 1 do jednego blastomeru wstrzykiwałam dsrna wraz ze znacznikowym mrna. Zarodki hodowałam do następnego dnia i poddawałam dezagregacji. Uzyskana mieszanina pojedynczych komórek zawierała wyznakowane komórki potomne nastrzykniętego blastomeru oraz komórki pochodzące z nienastrzykniętych blastomerów. Następnie z 5 zarodków wybrałam po jednej komórce potomnej pochodzącej od komórek nastrzykniętych oraz po jednej komórce potomnej wywodzącej się z komórek nienastrzykniętych i zebrałam komórki z każdej grupy w jednej próbce. Zebrane komórki lizowałam w 20 µl buforu do lizy. Lizaty komórek ES bądź blastomerów, których uzyskanie opisałam powyżej, zamrażałam w temperaturze -80 C. Do izolacji RNA wykorzystałam zestaw Dynabeads 2,8 µm mrna DIRECT MicroKit, zgodnie ze wskazówkami producenta. Po rozmrożeniu lizaty wytrząsałam przez 30 minut w temperaturze pokojowej z kulkami magnetycznymi Dynabeads połączonymi z oligo(dt) 25 w celu ich hybrydazacji z mrna. Kulki Dynabeads razem ze związanym mrna były izolowane za pomocą magnesu. W celu oddysocjowania mrna od kulek Dynabeads przeprowadziłam ich 10-minutową inkubację w 10 µl H 2 O depc. Uzyskany mrna wykorzystywałam do reakcji odwrotnej transkrypcji. Reakcję odwrotnej transkrypcji poprzedzała inkubacja mrna z 0,5 µg oligo(dt) 12-18 w temperaturze 70 C przez 10 minut w termocyklerze T100 Thermal Cycler (Bio-rad). Mieszaninę mrna i oligo(dt) 12-18 uzupełniałam o pozostałe składniki reakcji RT tak, aby ich stężenia końcowe wynosiły: 1xbufor RT, 10 mm DTT, 0,5 mm dntp mix oraz 40 jednostek inhibitora RNaz i 200 jednostek transkryptazy Superscript II. Reakcję prowadziłam w termocyklerze T100, Bio-Rad, w objętości 20 µl, przez 50 minut w temperaturze 42 C, kończąc ją 15-minutową inkubacją w temperaturze 70 C w celu dezaktywacji polimerazy. Reakcję qpcr (ang. quantitative polymerase chain reaction) w czasie rzeczywistym prowadziłam w maszynie OneStep Real-Time PCR (Applied Biosystems), wykorzystując startery (sondy) Taqman Gene Expression Assay (Life Technologies) specyficzne dla badanych genów (Tabela III), w buforze Taqman Gene Expression Master Mix (Life 51

Technologies), w objętości 10 µl. Reakcję prowadziłam w 50 cyklach: 95 C przez 15 sekund oraz 60 C przez 1 minutę. Podczas analizy poziomu ekspresji genów w blastomerach, ze względu na znikomą ilość wyizolowanego mrna, reakcję qpcr poprzedzała preamplifikacja. Prowadziłam ją wykorzystując zestaw Taqman PreAmp Master Mix (Life Technologies) i mieszaninę sond specyficznych dla wybranych genów (rozcieńczenie: 0,2 x każda sonda, Tabela III), w osiemnastu cyklach: 95 C przez 15 sekund oraz 60 C przez 4 minuty. Analizę otrzymanych danych przeprowadziłam za pomocą programu StepOne Software 2.2 i Excel Microsoft Office 2010. Do analizy i przedstawienia wyników wykorzystałam metodę 2 - CT (Livak i Schmittgen, 2001), odnosząc poziom ekspresji badanych genów w poszczególnych próbkach do poziomu uzyskanego dla genu aktyny, służącego jako gen referencyjny. Jeśli analizę przeprowadzałam na podstawie dwóch genów referencyjnych (β-aktyny i GAPDH), to na podstawie poziomu ich ekspresji obliczałam ich średnią geometryczną (Vandesompele i wsp., 2002). Tabela III. Zestawy starterów do reakcji odwrotnej transkrypcji oraz reakcji qpcr w czasie rzeczywistym. Gen Startery Taqman (sonda) - numer katalogowy Β-Aktyna GAPDH Kadheryna E Kadheryna N Pecam-1 Mm01205647_g1 Mm99999915_m1 Mm01247357_m1 Mm001162497_m1 Mm00476702_m1 2.11. Pomiar względnej ilości kadheryny E w zarodkach myszy W celu określenia względnej ilości kadheryny E w komórkach linii Epi, PE i TE w zarodkach 3,5- oraz 4,5-dniowych przeprowadziłam pomiar intensywności fluorescencji w błonach komórek tych linii w zarodkach, w których wyznakowałam kadherynę E metodą immunofluorescencji pośredniej. Pomiarów tych dokonałam za pomocą programu Image Java, wykorzystując zdjęcia wykonane przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Ze względu na 52

atenuację sygnału (coraz słabszy sygnał na detektorze z coraz głębszych warstw materiału), która ma miejsce w mikroskopii konfokalnej, pomiary dla wszystkich trzech linii komórkowych wykonałam na tym samym skrawku, na którym widoczne były dobrze komórki wszystkich trzech linii zarodka: TE, PE i Epi. Do analizy wybrałam tylko dwa stadia rozwojowe: wczesne (3,5-dniowe; Ryc. 6a) i późne (4,5-dniowe, Ryc. 6b) blastocysty. W zarodkach 3,5-dniowych pomiary wykonałam prowadząc pięć linii przechodzących prostopadle przez styk błon komórkowych pomiędzy dwiema sąsiednimi komórkami Epi, dwiema komórkami PE i dwiema komórkami TE. Natomiast w zarodkach 4,5-dniowych na jednym skrawku przeprowadzałam po dwa pomiary dla każdej linii komórkowej poprzez wyznaczenie pięciu linii przez miejsca styku błon komórkowych (Ryc. 6). a b Ryc. 6. Schemat prowadzenia pomiarów względnej ilości kadheryny E pomiędzy komórkami TE, pomiędzy komórkami Epi i pomiędzy komórkami PE w zarodkach 3,5-dniowych (a) oraz 4,5-dniowych (b). Kolorem zielonym schematycznie zaznaczono komórki PE. W zarodkach 4,5-dniowych dwa pomiary uzyskane dla tej samej linii komórkowej traktowałam niezależnie. Z tak uzyskanych pięciu pomiarów dla każdego styku błon komórkowych wyliczyłam średnią, a następnie dla każdego zarodka obliczyłam ilorazy: Epi/PE, Epi/TE i PE/TE. Ze względu na fakt, że dla ilorazów krzywa rozkładu normalnego posiada wydłużony lewy ogon, wartość wymienionych ilorazów pomiarów w każdym zarodku poddałam logarytmowaniu. Na podstawie tych wyników obliczyłam dla zarodków 53

3,5- oraz 4,5-dniowych 95%-owe przedziały ufności dla ilorazów. Następnie uzyskane wartości poddałam odlogarytmowaniu. Dla porównania wartości ilorazu Epi/PE pomiędzy zarodkami 3,5- oraz 4,5-dniowymi porównałam ze sobą 95%-owe przedziały ufności ilorazów Epi/PE w obu badanych stadiach zarodków. Porównanie to polegało na obliczeniu 95%-owego przedziału ufności dla różnicy średnich ilorazów Epi/PE pomiędzy zarodkami 3,5- a 4,5-dniowymi. Obliczenie to przeprowadziłam za pomocą odwróconego testu t-studenta, przy czym aby wyeliminować problem założenia równości wariancji populacyjnych, wykorzystałam metodę Satterthwaite a (Ruxton, 2006). Do tego obliczenia zastosowano program komputerowy Statistica. Opisana powyżej analiza statystyczna została opracowana przez dr Tomasza Wyszomirskiego (Wyszomirski, niepublikowane). Analogiczną procedurę zastosowałam porównując wartości ilorazów pomiędzy komórkami znajdującymi się w głębi ICM, na powierzchni ICM czy komórkach TE, porównując zarodki kontrolne oraz zarodki ICM-PE oraz ICM-Epi. Jeżeli intensywność fluorescencji była mierzona w zarodkach po iniekcji dsrna i/lub mrna, to analogicznie ze stosu zdjęć wykonanych przy użyciu mikroskopu konfokalnego wybierałam jeden skrawek, na którym widoczne obok siebie były dwie komórki potomne nastrzykniętego blastomeru oraz dwie komórki potomne jednego z nienastrzykniętych blastomerów. Intensywność fluorescencji mierzyłam rysując pięć linii w miejscu styku pomiędzy komórkami potomnymi komórek nastrzykniętych jak i pomiędzy komórkami potomnymi komórek nienastrzykniętych. Następnie obliczyłam 95%-owe przedziały ufności dla ilorazu względnej ilości kadheryny E pomiędzy komórkami pochodzącymi od nastrzykniętych blastomerów i komórkami pochodzącymi od nienastrzykniętych blastomerów. W celu porównania grupy dsrna z grupami kontrolnymi obliczyłam 95%-owe przedziały ufności dla różnicy średnich opisanych ilorazów uzyskanych dla każdej z grup. 2.12. Filmowanie zarodków i węzłów zarodkowych Do filmowania zarodków i węzłów zarodkowych blastocyst użyłam mikroskopu konfokalnego odwróconego Nikon A1R, wyposażonego w inkubator firmy Okolab. Całe zarodki filmowałam przez 48 do 50 godzin, a węzły przez 24 godziny, uzyskując co 20 minut stosy skrawków optycznych. Odległość między skrawkami optycznymi wynosiła 3,5 µm dla 54

zarodków i 2,5 µm dla węzłów zarodkowych. Skrawki optyczne rejestrowałam przy użyciu skanera Galvano, obiektywu 20x, przy rozdzielczości detektora 512 oraz przy powiększeniu cyfrowym 4. Analizę filmów poklatkowych, wraz ze śledzeniem losów pojedynczych komórek, przeprowadzałam przy użyciu programu Imaris (Bitplane). 55

IV Wyniki 1. Określenie stadium, w którym zachodzi determinacja losu komórek PE i Epi Linie komórek PE i Epi wyodrębniają się w ICM blastocysty myszy w okresie okołoimplantacyjnym. Postanowiłam sprawdzić, w którym momencie rozwoju w zarodku myszy dochodzi do ostatecznego i nieodwracalnego różnicowania komórek w kierunku tych dwóch linii. W tym celu obserwowałam powstawanie warstwy PE w węzłach zarodkowych wyizolowanych z blastocyst w dwóch różnych stadiach rozwoju (3,5- oraz 4-5-dniowym). W zarodkach 3,5-dniowych, określonych jako wczesne blastocysty, komórki PE i Epi ułożone były mozaikowo w obrębie ICM, a w zarodkach 4,5-dniowych (późne blastocysty) komórki tych linii były już wysegregowane do odpowiednich kompartmentów (ryc. 7). a a a Wczesna blastocysta b b b Późna blastocysta jądra komórkowe komórki PE Pdgfrα + Ryc. 7. Ułożenie komórek ICM we wczesnych oraz późnych blastocystach. We wczesnych blastocystach komórki PE i Epi ułożone są mozaikowo, według wzoru sól-pieprz, natomiast w późnych blastocystach komórki PE położone są na powierzchni ICM, a komórki Epi w jego głębi. Jądra komórkowe zostały wybarwione chromomycyną. Skala 20 µm. Wyizolowane węzły zarodkowe hodowałam in vitro i po 24-godzinnej hodowli immunocytochemicznie badałam w nich rozmieszczenie komórek PE i Epi, identyfikując je na podstawie odpowiednio obecności lub braku białka Gata4. Zaobserwowałam, że na powierzchni ICM pochodzących zarówno z wczesnych (ryc. 8) jak i późnych (ryc. 9) blastocyst 56

wytworzyła się warstwa PE, która otaczała cały węzeł. Wśród dwudziestu siedmiu uzyskanych węzłów zarodkowych, na powierzchni ośmiu obecne były także pojedyncze komórki TE (w 2 ICM pochodzących z wczesnych blastocyst i w 6 pochodzących z późnych blastocyst), które jednak nie były zdolne do odtworzenia warstwy TE. ICM tuż po izolacji ICM po 24 godz. hodowli a a Gr up a do ś wi b b ac Iz zal ol na a cj a IC jądra komórkowe Gata4 Oct4 a b nałożenie eee nałożenie Ryc. 8. Węzły zarodkowe wyizolowane z wczesnych blastocyst, tuż po izolacji (a-a ) i po 24 godzinach hodowli (b-b ). Jądra komórkowe zostały wybarwione DRAQ 5. Skala 20 µm. a a a nałożenie Kontrola ICM tuż po izolacji b b b nałożenie ICM po 24 godz. hodowli jądra komórkowe Gata4 Oct4 Ryc. 9. Węzły zarodkowe wyizolowane z późnych blastocyst, tuż po izolacji (a-a ) oraz po 24 godzinach hodowli (b-b ). Jądra komórkowe zostały wybarwione DRAQ 5. Skala 20 µm. 57

W celu określenia jakie jest źródło ostatecznej PE w izolowanych węzłach zarodkowych postanowiłam prześledzić losy komórek tworzących tę warstwę, filmując izolowane ICM techniką zdjęć poklatkowych w czasie hodowli in vitro. Przykładowy film ilustrujący rozwój ICM wyizolowanego z wczesnej blastocysty został dołączony do elektronicznej wersji niniejszej rozprawy. Śledzenie losu komórek PE było możliwe dzięki wykorzystaniu zarodków myszy linii transgenicznej PdgfRα-GFP, w których komórki PE oraz ich prekursory charakteryzują się zielonym sygnałem fluorescencyjnym w jądrze komórkowym. Po hodowli utrwaliłam ICM i wyznakowałam w nich białko Gata4. Znakowanie to potwierdziło przynależność wszystkich komórek, w których zachodziła ekspresja GFP (dalej nazywanych komórkami PdgfRα + ) do linii PE. Policzyłam także liczbę komórek PE i Epi w uzyskanych ICM. Stwierdziłam, że po 24-godzinnej hodowli ICM pochodzące zarówno z wczesnych (n=17), jak i z późnych blastocyst (n=10) miały bardzo zbliżoną liczbą komórek PE i Epi (Tabela IV). Tabela IV. Wartość średnia liczby komórek Epi i PE w badanych ICM. Typ ICM Liczba komórek Epi PE ogółem w ICM Wczesne blastocysty ICM po 24 godz. hodowli, wyizolowane z wczesnych blastocyst Liczba ICM n=17 ICM po 24 godz. hodowli, wyizolowane z późnych blastocyst Liczba ICM n=10 14,8±8,7 12,6±3,3 27,4±8,1 Późne blastocysty 15,8±3,6 11,8±4,4 27,6±2,9 1.1. Powstawanie warstwy PE w ICM wyizolowanych z wczesnych, 3,5-dniowych blastocyst myszy Postanowiłam sprawdzić, czy w tworzeniu PE otaczającej węzły zarodkowe izolowane z wczesnych blastocyst wzięły udział jedynie komórki pre-pe eksprymujące PdgfRα w momencie izolacji ICM czy również komórki pre-epi (PdgfRα - ), które po usunięciu trofektodermy i wyeksponowaniu na środowisko zewnętrzne uległy przeprogramowaniu w kierunku PE. 58

Ostateczna PE Komórki PdgfRα + pozostające na powierzchni ICM (44%) a Komórki PdgfRα + znajdujące się w głębi ICM (5%) Komórki PdgfRα - znajdujące się w głębi ICM, różnicujące w PE (16%) b Komórki PdgfRα - znajdujące się na powierzchni ICM, różnicujące w PE (35%) c Ryc. 10. Pochodzenie komórek warstwy ostatecznej PE w węzłach zarodkowych wyizolowanych z wczesnych, 3,5-dniowych blastocyst myszy. Liczba analizowanych ICM: 17, liczba analizowanych komórek: 148. a, b i c różnica istotna statystycznie w porównaniu z ICM wyizolowanymi z późnych blastocyst (p< 0,05, test T-Studenta). Zaobserwowałam, że komórki PE tworzące w trakcie hodowli jednokomórkową warstwę na powierzchni ICM, zwaną dalej ostateczną PE, pochodziły z czterech rodzajów komórek obecnych w ICM w czasie izolacji. Komórki te różniły się położeniem w ICM oraz ekspresją markera PE. Udział komórek w poszczególnych grupach przedstawiłam na ryc.10. Pierwszą grupę stanowiły komórki eksprymujące PdgfRα przez cały okres hodowli (komórki pre-pe), które od początku znajdowały się na powierzchni wyizolowanego węzła zarodkowego. Komórki te stanowiły 44% wszystkich komórek obecnych w ostatecznej PE. Drugą grupę tworzyły komórki syntetyzujące PdgfRα już w momencie izolacji ICM, ale które wtedy znajdowały się w jego głębi, a w czasie hodowli zmieniły lokalizację na powierzchniową. Stanowiły one 5% komórek tworzących ostateczną warstwę PE. W pozostałych komórkach budujących ostateczną PE na początku hodowli ekspresja genu pdgfrα nie zachodziła (komórki pre-epi), ale do indukcji jego ekspresji doszło w czasie hodowli izolowanego ICM. Można zatem sądzić, że w trakcie hodowli komórki te uległy przeprogramowaniu w kierunku PE. Wśród tych komórek 16% stanowiły takie, które 59

wyjściowo znajdowały się w głębi ICM, a w czasie hodowli zmieniały lokalizację na powierzchniową. Ostatnią grupę, stanowiącą 35% komórek ostatecznej PE, tworzyły również komórki nieeksprymujące PdgfRα na początku hodowli, ale znajdujące się wtedy na powierzchni ICM. Komórki te indukowały ekspresję genu pdgfrα w trakcie hodowli i utrzymywały powierzchniową pozycję, wchodząc w skład ostatecznej PE. Następnie prześledziłam w filmowanych poklatkowo izolowanych ICM los wszystkich komórek syntetyzujących PdgfRα od początku hodowli. Na ryc. 11 przedstawiłam los komórek PdgfRα +. Ponad połowa z nich (56%) znajdowała się wtedy na powierzchni węzła zarodkowego i weszła ostatecznie w skład PE. W głębi ICM znajdowało się wyjściowo 7% komórek PdgfRα +. W trakcie hodowli zmieniły one lokalizację na powierzchniową, również wchodząc w skład ostatecznej PE. Kolejne 6% komórek wykazujących wyjściowo ekspresję PdgfRα znajdowało się wewnątrz ICM tuż po jego izolacji, ale w czasie hodowli uległo przeprogramowaniu w kierunku Epi, co przejawiało się stopniową utratą ekspresji PdgfRα. Pozostałe 31% komórek, które na początku hodowli miały fenotyp PdgfRα +, uległo apoptozie. Los komórek PdgfRα + Komórki PdgfRα + pozostające na powierzchni ICM (56%) Komórki PdgfRα + znajdujące się w głębi ICM (7%) d Komórki PdgfRα + różnicujące w Epi (6%) Komórki PdgfRα + ulegające apoptozie (31%) Ryc. 11. Los komórek PdgfRα + w węzłach zarodkowych wyizolowanych z wczesnych, 3,5- dniowych blastocyst myszy. Liczba analizowanych ICM: 17, liczba analizowanych komórek: 115. d różnica istotna statystycznie w porównaniu z ICM wyizolowanymi z późnych blastocyst (p<0,05, test T-Studenta). Na podstawie przedstawionych wyników stwierdziłam, że źródłem komórek budujących ostateczną PE w węzłach wyizolowanych z wczesnych, 3,5-dniowych blastocyst są zarówno komórki pre-pe, jak i pre-epi, które uległy przeprogramowaniu w kierunku PE. 60

Porównując uzyskane wyniki z wynikami dla ICM z późnych blastocyst użyłam testu T- studenta przeprowadzonego na podstawie frakcji, rozumianych jako iloraz liczby komórek w jednej z czterech badanych grup komórek oraz liczby wszystkich komórek, zależnie od analizy: tworzących ostateczną PE bądź wszystkich komórek PdgfRα +. 1.2. Powstawanie warstwy PE w ICM wyizolowanych z późnych, 4,5-dniowych blastocyst myszy. Aby określić, jak długo komórki ICM zachowują plastyczność, postanowiłam zbadać, czy warstwa PE otaczająca wyizolowany ICM pochodzący z późnej blastocysty jest odtwarzana z komórek PE obecnych wyjściowo na fragmencie jego powierzchni czy z komórek Epi, zdolnych do zmiany kierunku różnicowania. Zaobserwowałam, że w tworzeniu warstwy ostatecznej PE w węzłach zarodkowych wyizolowanych z późnych, 4,5-dniowych blastocyst obecne były komórki wywodzące się z takich samych grup, różniących się wyjściowym położeniem i fenotypem, jak stwierdziłam w przypadku ostatecznej PE w ICM wyizolowanych z wczesnych blastocyst. Jednak w ICM pochodzących z późnych blastocyst udział tych grup w tworzeniu ostatecznej PE był zdecydowanie odmienny, niż w ICM izolowanych z wczesnych blastocyst. Udział poszczególnych grup komórek w tworzeniu ostatecznej PE w ICM wyizolowanych z późnych blastocyst przedstawiłam na ryc. 12. Stwierdziłam, że aż 93% ostatecznej PE tworzyły komórki eksprymujące PdgfRα już na początku hodowli, które wyjściowo znajdowały się na powierzchni ICM. Komórki PdgfRα +, które w momencie izolacji znajdowały się w głębi ICM, a następnie w trakcie hodowli zmieniły lokalizację na powierzchniową, stanowiły zaledwie 1% komórek tworzących ostateczną PE. Była to jedna, najprawdopodobniej nieprzesortowana komórka PE. Zaobserwowałam także komórki, które podejmowały ekspresję PdgfRα w trakcie hodowli, a zatem ulegały przeprogramowaniu z Epi w PE. W ICM wyizolowanych z późnych blastocyst komórki te były nieliczne w porównaniu do ICM pochodzących z wczesnych blastocyst (51% vs 6%). Co więcej, żadna z tych komórek nie była położona w głębi ICM na początku hodowli (0%), ale wszystkie już wtedy znajdowały się na jego powierzchni (6%). Komórki takie obserwowałam w 6 z 10 obserwowanych ICM. 61

Ostateczna PE Komórki PdgfRα + pozostające na powierzchni ICM (93%) a Komórki PdgfRα + znajdujące się w głębi ICM (1%) Komórki PdgfRα - znajdujące się w głębi ICM, różnicujące w PE (0%) b Komórki PdgfRα - znajdujące się na powierzchni ICM, różnicujące w PE (6%) c Ryc. 12. Pochodzenie komórek warstwy ostatecznej PE w węzłach zarodkowych wyizolowanych z późnych, 4,5-dniowych blastocyst myszy. Liczba analizowanych ICM: 10, liczba analizowanych komórek: 124. a, b i c różnica istotna statystycznie w porównaniu z ICM wyizolowanymi z wczesnych blastocyst (p<0,05; test T-Studenta). Los komórek PdgfRα + w ICM wyizolowanych z późnych blastocyst przedstawiłam na ryc. 13. Zaobserwowałam, że aż 65% komórek, które tuż po izolacji ICM wykazywały ekspresję markera PE PdgfRα, znajdowało się na powierzchni ICM już w momencie izolacji i pozostało w tej lokalizacji przez cały okres hodowli, tworząc ostateczną PE. Wszystkie pozostałe komórki, w których ekspresja genu PdgfRα zachodziła od początku, znajdowały się w głębi ICM. I tak spośród komórek PdgfRα + : 1% komórek zmienił lokalizację na powierzchniową i wszedł w skład ostatecznej PE, 10% komórek uległo przeprogramowaniu w kierunku Epi, natomiast 24% komórek uległo apoptozie. Częstość występowania komórek PdgfRα +, które na początku hodowli znajdowały się w głębi ICM, a następnie uległy segregacji na powierzchnię istotnie zmniejszyła się w ICM pochodzących z późnych blastocyst w porównaniu z ICM z wczesnych blastocyst. 62

Na podstawie przedstawionych wyników stwierdziłam, że w ICM pochodzących z późnych blastocyst proces segregacji komórek PE i Epi jest już zakończony i większość komórek obu linii wydaje się być zdeterminowana w swoim losie. Jednak nadal obecne są pojedyncze komórki, które mogą ulec przeprogramowaniu. Los komórek PdgfRα Komórki PdgfRα + pozostające na powierzchni ICM (65%) Komórki PdgfRα + znajdujące się w głębi ICM (1%) d Komórki PdgfRα + różnicujące w Epi (10%) Komórki PdgfRα + ulegające apoptozie (24%) Ryc. 13. Los komórek PdgfRα + w węzłach zarodkowych wyizolowanych z późnych, 4,5- dniowych blastocyst myszy. Liczba analizowanych ICM: 10, liczba analizowanych komórek: 178. d różnica istotna statystycznie w porównaniu z ICM wyizolowanymi z wczesnych blastocyst (p<0,05, test T-Studenta). 2. Udział białek adhezyjnych w różnicowaniu komórek ES w kierunku PE 2.1. Zanikanie białek adhezyjnych kadheryny E i Pecam-1 w czasie różnicowania komórek ES w kierunku PE Hodowla komórek ES w obecności kwasu retinowego (RA) w ściśle określonym stężeniu indukuje ich różnicowanie w kierunku PE (Moore i wsp., 2009). Wykorzystując tę metodę sprawdziłam, czy różnicowaniu komórek ES w PE towarzyszy zmiana związana z lokalizacją białek powierzchniowych: kadheryny E i Pecam-1. Wraz z różnicowaniem komórek pod wpływem RA widoczna była zmiana morfologii kolonii tych komórek w hodowli. Kolonie komórek niezróżnicowanych były owalne, wypukłe 63

i opalizujące, i nie można było w nich wyróżnić pojedynczych komórek (ryc. 14, fot. a a ). Hodowla komórek w obecności RA spowodowała stopniowe wypłaszczanie kolonii, w których komórki tworzyły ostatecznie jednokomórkową, zwartą warstwę. Zróżnicowane komórki przyjmowały kształt wrzecionowaty (ryc. 14, fot. b b ). Dzień 1 Dzień 2 Dzień 3 Dzień 4 Dzień 7 Komórki niezróżnicowane a a a a a Komórki różnicujące b b b b b Ryc. 14. Morfologia kolonii komórek ES niezróżnicowanych oraz poddanych różnicowaniu pod wpływem RA. Zdjęcia przedstawiają kolonie komórek 1., 2., 3., 4. oraz 7. dnia hodowli. Skala 50 µm. W celu określenia tempa różnicowania komórek ES pod wpływem RA wyznakowałam w utrwalonych komórkach markery linii PE i Epi od pierwszego do czwartego oraz siódmego dnia hodowli. Zaobserwowałam, że czasie 7-dniowej hodowli zachodzi stopniowe zanikanie markera pluripotencji białka Oct4 i pojawianie się markera PE białka Gata4. W komórkach niezróżnicowanych białko Oct4 było obecne w jądrach przez cały okres hodowli (ryc. 15, fot. a a ). Natomiast w komórkach poddanych różnicowaniu RA białko Oct4 było obecne we wszystkich komórkach tylko w pierwszym i drugim dniu hodowli (ryc. 15, fot. b i b ). Trzeciego dnia Oct4 wykryłam tylko w niektórych komórkach, a od czwartego dnia nie obserwowałam już jego obecności w jądrach komórkowych (ryc. 15, fot. b i b ). W niezróżnicowanych komórkach nie wykryłam obecności białka Gata4 (ryc. 15, fot. c c ). Z kolei w komórkach traktowanych RA białko to pojawiało się już od trzeciego dnia, a siódmego dnia było ono obecne już we wszystkich komórkach (ryc. 15, fot. d d ). 64

Komórki niezróżnicowane Dzień 1 Dzień 2 Dzień 3 Dzień 4 Dzień 7 a a a a a Komórki różnicujące b b b b b Komórki niezróżnicowane Oct4 Jądra komórkowe c c c c c Komórki różnicujące d d d d d Gata4 Jądra komórkowe Ryc. 15. Lokalizacja białek Oct4 (a-a i b-b ) oraz Gata4 (c-c i d-d ) w komórkach ES niezróżnicowanych oraz poddanych różnicowaniu pod wpływem RA. Zdjęcia przedstawiają kolonie komórek 1., 2., 3., 4. oraz 7. dnia hodowli. Jądra komórkowe wybarwione DRAQ 5. Skala 50 µm. Następnie postanowiłam zbadać, czy różnicowaniu komórek ES pod wpływem RA w kierunku PE towarzyszą zmiany w obecności i/lub lokalizacji kadheryny E i Pecam-1. W tym celu przeanalizowałam współwystępowanie tych białek powierzchniowych oraz markera PE Gata4 w trakcie 7-dniowej hodowli komórek ES w obecności RA. Kontrolę stanowiły komórki niezróżnicowane, hodowane w standardowej pożywce do hodowli komórek ES. Stwierdziłam, że zarówno kadheryna E, jak i Pecam-1 były obecne na powierzchni niezróżnicowanych komórek ES przez cały okres 7-dniowej hodowli w pożywce bez RA (ryc. 16, fot. a - a i c - c ). Na powierzchni komórek poddanych działaniu RA białka te występowały przez pierwsze dwa dni (ryc. 16, fot. b - b i d - d ). Trzeciego dnia hodowli 65

w obecności RA kadherynę E i Pecam-1 wykryłam już tylko na powierzchni nielicznych komórek ES (ryc. 16, fot. a i b ), a czwartego i siódmego dnia nie stwierdziłam ich obecności w ogóle (ryc. 16, b b i d d ). Nie zaobserwowałam współwystępowania badanych białek z Gata4. Stwierdziłam, że Gata4 pojawia się tylko w komórkach, w których nieobecne już były badane białka adhezyjne. Komórki niezróżnicowane Dzień 1 Dzień 2 Dzień 3 Dzień 4 Dzień 7 a a a a a Komórki różnicujące b b b b b Pecam-1 Gata4 Jądra komórkowe c c c c c Komórki niezróżnicowane Komórki różnicujące d d d d d Kadheryna E Gata4 Jądra komórkowe Ryc. 16. Lokalizacja Pecam-1, kadheryny E i markera PE - Gata4 w komórkach poddanych różnicowaniu kwasem retinowym. Zdjęcia przedstawiają kolonie komórek 1., 2., 3., 4. oraz 7. dnia hodowli. Fot. b i d strzałkami białymi zaznaczono komórki posiadające Pecam-1 lub kadherynę E, a strzałkami żółtymi komórki syntetyzujące Gata4. Jądra komórkowe zostały wybarwione DRAQ 5. Skala 50 µm. 2.2. Lokalizacja komórek ES zróżnicowanych w kierunku PE pod wpływem RA po ich wstrzyknięciu do zarodka myszy Wiadomo, że niezróżnicowane komórki ES po wstrzyknięciu do zarodka lokalizują się prawie wyłącznie w Epi (Beddington i Robertson, 1989). Chciałam sprawdzić, czy różnicowanie pod wpływem RA sprawi, że komórki te będą się preferencyjnie 66

lokalizowały w PE zarodka. W tym celu, po 7-dniowej hodowli w obecności RA zróżnicowane komórki wstrzykiwałam do zarodków myszy w trzech różnych stadiach rozwoju: 8-komórkowym, wczesnej blastocysty (z niewysegregowanymi komórkami PE i Epi) oraz późnej blastocysty (z wysegregowanymi komórkami PE i Epi). Kontrolę stanowiły niezróżnicowane komórki ES wstrzykiwane do zarodków znajdujących się w tych samych stadiach rozwoju. Zarodki 8-komórkowe były następnie hodowane in vitro przez 72 godziny, a wczesne i późne blastocysty przez 48 godzin. Uzyskane po hodowli zarodki analizowałam pod względem lokalizacji komórek potomnych wstrzykniętych komórek ES w liniach komórkowych blastocyst. Ich identyfikacja w zarodkach była możliwa dzięki zielonemu sygnałowi fluorescencji obecnemu w jądrach komórek ES (linia H2B-GFP). Analizie poddałam wydajność inkorporacji wstrzykiwanych komórek, rozumianą jako udział komórek żywych wbudowanych do zarodka w stosunku do wszystkich komórek, które były wprowadzone do każdego zarodka (tabela V). Komórki niezróżnicowane i zróżnicowane ze zbliżoną wydajnością integrowały się w blastocystach, zarówno wczesnych jak i późnych (odpowiednio 34,5% i 31,6% oraz 20,1% i 26,0%). W przypadku, gdy biorcą były zarodki 8-komórkowe, niezróżnicowane komórki ES inkorporowały się ze znacznie większą częstością, niż komórki zróżnicowane (odpowiednio 75% i 21,4%). Liczbę komórek potomnych wstrzykniętych do zarodków komórek ES przedstawiłam w suplemencie (Rozdział S1, Tabela S1). Tabela V. Częstość integracji komórek niezróżnicowanych oraz zróżnicowanych po wstrzyknięciu do 8-komórkowych zarodków, wczesnych oraz późnych blastocyst. Częstość integracji komórek do zarodka Typ komórek Zarodki 8- Stadium zarodka Wczesne Późne komórkowe blastocysty blastocysty Komórki niezróżnicowane Komórki zróżnicowane RA 75,0% a 34,5% 20,1% 21,4% a 31,6% 26,0% a-wyniki istotnie różniące się statystycznie p<0,05, test T-Studenta 67

Przynależność komórek do linii PE i TE określiłam na podstawie obecności markerów tych linii Gata4 i Cdx2. Komórki, które nie posiadały żadnego z tych białek i znajdowały się w głębi ICM uznałam za komórki Epi. Lokalizację zróżnicowanych i niezróżnicowanych komórek w poszczególnych liniach: Epi, PE i TE przedstawiłam na wykresie 1 i ryc. 17. Los niezróżnicowanych komórek ES po wstrzyknięciu do zarodków Zarodki biorcy: Los zróżnicowanych RA komórek ES po wstrzyknięciu do zarodków Zarodki biorcy: Wykres 1. Los komórek ES niezróżnicowanych oraz zróżnicowanych poprzez hodowlę w obecności RA. Komórki wstrzykiwane były do zarodków 8- komórkowych oraz do wczesnych i późnych blastocyst. 68

Stwierdziłam, że zgodnie z danymi literaturowymi wszystkie komórki potomne niezróżnicowanych komórek ES, które integrowały się z zarodkiem, lokalizowały się w Epi niezależnie od stadium zarodka, do którego były wprowadzane. Natomiast komórki potomne komórek ES, które różnicowały wcześniej pod wpływem RA, wchodziły wyłącznie w skład PE. Taką specyficzną lokalizację obserwowałam niezależnie od stadium zarodka, do którego wstrzykiwałam zróżnicowane komórki ES. Podsumowując, hodowla komórek ES w obecności RA powoduje ich różnicowanie i zmianę losu tych komórek po wprowadzeniu do zarodka biorcy. Komórki niezróżnicowane Liczba zarodków - 24, Liczba komórek H2B-GFP - 224 a a a Komórki zróżnicowane Liczba zarodków - 29 Liczba komórek H2B-GFP - 269 b b b Cdx2 Gata4 Komórki ES (H2B-GFP) Ryc. 17. Lokalizacja komórek ES niezróżnicowanych i zróżnicowanych pod wpływem RA po iniekcji do wczesnych blastocyst. Jądra komórkowe wybarwione DRAQ 5. Skala 20 µm. 3. Wpływ zmiany poziomu ekspresji genu pecam-1 na los komórek ES w blastocyście Wiadomo, że białko Pecam-1 jest obecne we wszystkich komórkach ICM wczesnej blastocysty, ale w trakcie powstawania PE i Epi jego obecność zostaje ograniczona tylko do komórek Epi (Robson i wsp., 2001). O udziale Pecam-1 w różnicowaniu komórek zarodka może świadczyć również jego zanikanie, które zaobserwowałam we wczesnych etapach różnicowania komórek ES w PE pod wypływem RA (opisane powyżej w podrozdziale 2.1). Dlatego też postanowiłam sprawdzić, czy obniżenie ilości tego białka poprzez zaburzenie ekspresji jego genu przy pomocy krótkoniciowego interferującego RNA (sirna), wpłynie na 69

morfologię oraz różnicowanie komórek ES, a także na ich los po wstrzyknięciu do zarodka biorcy. Metodą transfekcji do komórek ES wprowadziłam sirna skierowany przeciwko transkryptom kodującym białko Pecam-1 (sirna Pecam-1). Ponieważ razem z sirna wprowadzany był znacznik fluorescencyjny Block-it, komórki, które uległy transfekcji, charakteryzowały się sygnałem fluorescencyjnym, który był obecny także w tworzonych przez nie koloniach. 3.1. Ocena wydajności i efektywności transfekcji komórek ES sirna skierowanym przeciwko transkryptom Pecam-1 Analizie poddałam trzy różne, dostępne komercyjnie, cząsteczki sirna skierowane przeciwko transkryptom Pecam-1. Wyboru jednej z nich dokonałam na podstawie wydajności transfekcji oraz efektywności obniżenia ekspresji genu pecam-1 na poziomie mrna i na poziomie białka. Wydajność transfekcji została wyrażona jako udział kolonii komórek wykazujących sygnał fluorescencji po 24 godzinach hodowli w stosunku do wszystkich powstałych kolonii. Kontrolę w tym doświadczeniu stanowiły komórki poddane działaniu mieszaniny odczynników stosowanych do transfekcji, bez dodatku sirna oraz bez znacznika fluorescencyjnego. Uzyskane wyniki przedstawiłam na wykresie 2. Wykres 2. Wydajność transfekcji dla trzech rodzajów sirna skierowanych przeciwko transkryptom Pecam-1 w komórkach ES. 70

Wykazałam, że rodzaj sirna oraz różne jego stężenia w stosowanym zakresie nie miały znaczącego wpływu na wydajność transfekcji, która wynosiła od 89% dla sirna-1 w stężeniu 20 nm do 98% w przypadku sirna-2 w stężeniach 10 nm i 20 nm (wykres 2). Ocenę efektywności obniżenia ekspresji genu pecam-1 na poziomie mrna w komórkach ES transfekowanych sirna przeprowadziłam za pomocą metody qpcr w czasie rzeczywistym. Poziom mrna dla Pecam-1 w komórkach po transfekcji sirna Pecam-1 w różnych stężeniach w stosunku do kontroli, którą były komórki nietransfekowane, został przedstawiony na wykresie 3. Względną ilość transkryptów Pecam-1 przedstawiłam w suplemencie (Rozdział S2, tabela S1). Wykres 3. Efektywność obniżenia ekspresji genu Pecam-1 mierzona na poziomie mrna. Efektywność obniżenia ekspresji genu Pecam-1 została wyrażona w procentach względem ilości mrna w komórkach grupy kontrolnej, do których nie wprowadzałam sirna. Zaobserwowałam, że przy użyciu cząsteczek sirna-1 oraz sirna-3 poziom mrna Pecam-1 we wszystkich stężeniach był obniżony w podobnym stopniu i wynosił od 32% do 41% poziomu tego mrna w komórkach kontrolnych. Natomiast sirna-2 okazało się mniej skuteczne w wyciszaniu ekspresji genu pecam-1. Następnie określiłam efektywność obniżenia ekspresji genu pecam-1 na poziomie białka, które przy pomocy specyficznego przeciwciała wykrywałam w koloniach komórek poddanych transfekcji sirna (ryc. 18). Procentowy udział kolonii, w których komórki miały 71

w błonie białko Pecam-1 w ilości pozwalającej na stwierdzenie jego obecności tą metodą przedstawiłam na wykresie 4. Wykres 4. Procentowy udział kolonii komórek posiadających białko Pecam-1 po transfekcji komórek ES. Okazało się, że najmniej kolonii komórek mających białko Pecam-1 otrzymałam po transfekcji komórek ES sirna-1 w stężeniu 5 nm i 10 nm (odpowiednio 9% i 14%). W oparciu o powyższe wyniki, do dalszych doświadczeń użyłam cząsteczki sirna-1 w stężeniu 10 nm, gdyż w wyniku jej działania uzyskałam wysoką efektywność obniżenia ekspresji genu pecam-1 zarówno na poziomie mrna, jak i na poziomie białka. W celu wykluczenia niespecyficznego działania wybranej cząsteczki sirna, jako dodatkową kontrolę przeprowadziłam transfekcję komórek ES z wykorzystaniem niespecyficznego sirna (ns sirna Pecam-1; ang. Scrambled sirna) w stężeniu 10 nm. Nie stwierdziłam różnicy w poziomie mrna dla Pecam-1 oraz w udziale kolonii komórek posiadających białko Pecam-1 w porównaniu z kontrolą. Przykładowe zdjęcia kolonii komórek z grupy kontrolnej, grupy transfekowanej niespecyficznym sirna oraz grupy doświadczalnej przedstawiłam na ryc. 18. 72

a a a Kontrola b b b ns sirna sirna Pecam-1 c c c Pecam-1 Komórki ES (H2B-GFP) Ryc. 18. Występowanie białka Pecam-1 w komórkach niepoddanych transfekcji (kontrola), poddanych transfekcji niespecyficznym sirna (ns sirna) oraz poddanych transfekcji sirna Pecam-1. Skala 20 µm. Wiedząc już, która cząsteczka sirna najefektywniej obniża poziom białka Pecam-1, określiłam w jakim czasie po transfekcji efekt działania tego sirna w komórkach ES jest najsilniejszy. W tym celu wykonałam na podstawie jednego doświadczenia analizę względnej ilości mrna kodującego białko Pecam-1 metodą PCR w czasie rzeczywistym po dwóch, czterech oraz sześciu dniach od przeprowadzenia transfekcji. Na wykresie 5. przedstawiłam względną ilość mrna kodującego białko Pecam-1 w komórkach ES po upływie różnego czasu od transfekcji. Stwierdziłam, że poziom mrna Pecam-1 jest najniższy po dwóch dniach od transfekcji sirna (o 67% względem grupy kontrolnej, o 62% względem grupy ns sirna), następnie rośnie już od czwartego dnia (obniżenie o 54% względem grupy kontrolnej i o 60% względem grupy ns sirna), a po sześciu dniach od transfekcji jest na poziomie podobnym do ilości tego mrna w komórkach obu grup kontrolnych. W obu grupach kontrolnych: komórkach niemodyfikowanych oraz komórkach poddanych transfekcji niespecyficznym sirna, względna ilość badanego mrna w czasie doświadczenia nie ulegała zmianom. 73

Wykres 5. Względna ilość mrna kodująca białka Pecam-1 w komórkach kontrolnych, transfekowanych niespecyficznym sirna (ns sirna) i transfekowanych sirna Pecam-1, po dwóch, czterech i sześciu dniach od transfekcji. 3.2. Lokalizacja w zarodku komórek ES z obniżoną ekspresją genu pecam-1 W celu zbadania wpływu obniżenia ekspresji genu pecam-1 w komórkach ES na ich lokalizację w blastocyście, komórki ES transfekowane sirna Pecam-1 wstrzykiwałam do zarodków znajdujących się w stadium 8-komórkowym i w stadium wczesnej blastocysty. Zarodki 8-komórkowe hodowałam 72 godziny, a blastocysty 48 godzin od mikroiniekcji. Następnie zarodki utrwalałam i określałam w nich lokalizację komórek potomnych pochodzących od wstrzykniętych komórek ES. Przynależność komórek do linii Epi, PE oraz TE określałam na podstawie wykrywania białek Gata4 oraz Cdx2, podobnie jak opisałam w podrozdziale 2.2. Kontrolą w tym doświadczeniu były komórki ES poddane transfekcji niespecyficznym sirna oraz komórki traktowane mieszaniną odczynników stosowanych do transfekcji, bez dodatku sirna oraz znacznika fluorescencyjnego. Takie komórki były także wstrzykiwane do zarodków i badane pod względem ich lokalizacji w liniach komórkowych powstających blastocyst. Niezależnie od stadium zarodka biorcy komórki obu grup kontrolnych, czyli niezmodyfikowane komórki ES oraz komórki transfekowane ns sirna lokalizowały się tylko w Epi (wykres 6). Komórki ES z obniżoną ilością białka Pecam-1, podobnie jak komórki 74

kontrolne także lokalizowały się w Epi pod warstwą PE zarówno po wstrzyknięciu ich do zarodków 8-komórkowych, jak i do wczesnych blastocyst. Przykładowe zdjęcia zarodków przedstawiłam na ryc. 19. Zmniejszenie ekspresji genu pecam-1 nie wpłynęło zatem na lokalizację komórek ES i ich komórek potomnych po wstrzyknięciu do zarodka. Kontrola Niespecyficzne sirna sirna Pecam-1 Wykres 6. Los komórek ES nietransfekowanych, poddanych transfekcji niespecyficznym sirna i poddanych transfekcji sirna Pecam-1 skierowanym przeciwko transkryptom białka Pecam-1. Komórki wstrzykiwane były do zarodków 8- komórkowych oraz wczesnych blastocyst (z niewysegregowanymi komórkami PE i Epi). 75

Wydajność integracji komórek w zarodkach chimerowych (powstałych po wstrzyknięciu komórek ES do zarodka-biorcy) była bardzo zbliżona w obu grupach kontrolnych oraz w grupie doświadczalnej, niezależnie od stadium zarodka, do którego wprowadzane były komórki. Wynosiła ona od 85,7% dla grupy doświadczalnej po iniekcji do wczesnych blastocyst do 89,6% dla grupy kontrolnej po iniekcji do zarodków 8-komórkowych. Kontrola Liczba zarodków 8 Liczba komórek H2B-GFP w Epi - 95/95 a a a Niespecyficzne sirna Liczba zarodków 12 Liczba komórek H2B-GFP w Epi - 128/128 c c c sirna Pecam-1 Liczba zarodków 6 Liczba komórek H2B-GFP w Epi - 40/40 b b b Komórki ES (H2B-GFP) Gata4 Jądra komórkowe Ryc. 19. Lokalizacja komórek ES niepoddanych transfekcji (a-a ), poddanych transfekcji ns sirna (b-b ) i poddanych transfekcji sirna Pecam-1 (c-c ) w chimerowych blastocystach. Jądra komórkowe wybarwione DRAQ 5. Skala 20 µm. 4. Udział kadheryny E w tworzeniu PE Kadheryna E ma kluczowe znaczenie dla kompakcji zarodka oraz polaryzacji komórek TE, jednak jej rola w tworzeniu PE nie została do tej pory zbadana. Wyniki dotyczące zmian zachodzących w komórkach ES różnicujących in vitro pod wpływem RA, które opisałam powyżej (podrozdział 2.1), pokazały, że kadheryna E zanika we wczesnym etapie różnicowania tych komórek w kierunku PE. Dlatego też zbadałam lokalizację tego białka w zarodkach znajdujących się w stadium przed-, około- i poimplantacyjnym, gdy stopniowo 76

wyodrębnia się warstwa PE. Następnie sprawdziłam wpływ obniżenia ilości kadheryny E w pojedynczych blastomerach zarodka na ich różnicowanie w jedną z trzech linii komórkowych: Epi, PE i TE. 4.1. Lokalizacja kadheryny E w stadium okołoimplantacyjnym zarodka myszy W pierwszej kolejności określiłam obecność i lokalizację kadheryny E we wczesnych, 3,5-dniowych blastocystach (stadium przedimplantacyjne), późnych, 4,5-dniowych oraz 4,75- dniowych blastocystach (stadia okołoimplantacyjne) i w stadiach poimplantacyjnych, czyli 5,5 oraz 6,5-dniowych cylindrach zarodkowych. Zarodki izolowane były z myszy transgenicznych linii PdgfRα, w których komórki PE charakteryzują się obecnością białka fuzyjnego H2B-GFP, zatem ich jądra komórkowe miały zielony sygnał fluorescencyjny. We wczesnych blastocystach (zarodek 3,5-dniowy) kadheryna E była obecna w bocznej i spodniej części błony komórek TE. Nie obserwowałam natomiast jej obecności w domenie apikalnej (ryc. 20 a a ), co świadczy o spolaryzowaniu tych komórek. Komórki PE i Epi, które w tym stadium ułożone były według wzoru sól i pieprz, zawierały to białko równomiernie rozmieszczone w całej błonie komórkowej (ryc. 20 a a ). W późnych, 4,5-dniowych blastocystach kadheryna E występowała w bocznych częściach błony komórkowej komórek TE, a rzadziej w części spodniej błony. Komórki PE, wysegregowane na powierzchni ICM, również były spolaryzowane, o czym świadczyła obecność kadheryny E wyłącznie w części spodniej i bocznej błony. Natomiast komórki Epi, znajdujące się w głębi ICM, charakteryzowały się równomiernym rozmieszczeniem kadheryny E w błonie komórkowej (ryc. 20 b b ). Komórki PE spolaryzowane pod względem lokalizacji kadheryny E obserwowałam również w kolejnych stadiach: w 4,75-dniowym zarodku (ryc. 20 c c ) oraz w stadiach poimplantacyjnych: 5,5- oraz 6,5-dniowym (ryc. 20 d d oraz e e ). W tych stadiach zachodzi migracja komórek PE po spodniej powierzchni TE. Spolaryzowane rozmieszczenie kadheryny E charakteryzowało zarówno komórki PE pozostające na powierzchni ICM (endoderma proksymalna), jak i komórki PE migrujące po spodniej powierzchni TE (endoderma dystalna). Stwierdziłam ponadto, że w stadium 6,5-dniowym w epiblaście jest mniej kadheryny E, niż w ektodermie pozazarodkowej (ryc. 20 e e ). 77

a a wczesne blastocysty, stadium 3,5-dniowe b b późne blastocysty, stadium 4,5-dniowe c c c stadium 4,75-dniowe d d stadium 5,5-dniowe e e epz ez stadium 6,5-dniowe Pdgfrα Kadheryna E Ryc. 20. Lokalizacja kadheryny E w zarodkach myszy od stadium 3,5-dniowej wczesnej blastocysty do stadium 6,5-dniowego cylindra zarodkowego. Epz ektoderma pozazarodkowa, ez endoderma zarodkowa. Skala 20 µm. Postanowiłam dokładniej przyjrzeć się zmianom w ilości kadheryny E zachodzącym w komórkach PE pomiędzy stadium wczesnej i późnej blastocysty, czyli w czasie gdy zachodzi segregacja komórek ICM. W tym celu określiłam względną ilość kadheryny E, mierząc intensywność fluorescencji na zdjęciach skrawków optycznych wykonanych przy użyciu mikroskopu konfokalnego. We wczesnych blastocystach mierzyłam intensywność fluorescencji pomiędzy dwiema komórkami Epi, dwiema komórkami PE oraz dwiema 78

komórkami TE (wykres 7 oraz podrozdział 2.11 w rozdziale Materiały i Metody). Natomiast w późnych blastocystach intensywność fluorescencji pomiędzy komórkami tych linii mierzyłam w dwóch miejscach styku błon komórek (wykres 7). Pomiary przeprowadziłam w czterech wczesnych oraz pięciu późnych blastocystach. Na podstawie uzyskanych wartości obliczyłam 95%-owe przedziały ufności dla średnich opisanych ilorazów. Wczesne blastocysty Późne blastocysty a b a b PE pierwotna endoderma EPI epiblast TE - trofektoderma Wykres 7. Przedziały ufności dla wartości średnich ilorazów pomiarów intensywności fluorescencji w liniach Epi, PE i TE we wczesnych (wykres a) oraz późnych (wykres b) blastocystach. Na zdjęciach zamieszczonych powyżej wykresów, będących powiększeniami zdjęć a i b z ryc. 20, umieszczono zielone linie obrazujące miejsce pomiaru intensywności fluorescencji. 79

W stadium wczesnej blastocysty granice 95%-owego przedziału ufności dla wartości średniej ilorazu PE/Epi wyniosły od 0,59 do 1,77, co oznacza, że względna ilość kadheryny E w obu liniach komórkowych była zbliżona. Granice przedziału ufności dla wartości średniej ilorazów Epi/TE oraz PE/TE były podobne i wynosiły odpowiednio 0,21 0,66 i 0,21 0,62. Wyniki te wskazują, że pomiędzy komórkami Epi i pomiędzy komórkami PE w tym stadium nie ma różnic we względnej ilości kadheryny E (wykres 7a). W stadium późnej blastocysty granice 95%-owego przedziału ufności dla wartości średniej ilorazu PE/Epi wyniosły od 0,40 do 0,62. Natomiast granice przedziałów ufności dla wartości średniej ilorazów Epi/TE oraz PE/TE były rozłączne i wynosiły odpowiednio 0,24 0,4 i 0,46 0,80 (wykres 7b). Sugeruje to, że w tym stadium względna ilość kadheryny E pomiędzy komórkami Epi była większa, niż pomiędzy komórkami PE. W celu weryfikacji tej hipotezy został policzony 95%-owy przedział ufności dla różnicy średnich ilorazów PE/Epi pomiędzy wczesnymi i późnymi blastocystami. Jego granice wyniosły: 1,2 3,4. Oznacza to, że iloraz PE/Epi będzie zawsze większy we wczesnych niż w późnych blastocystach, czyli że podczas segregacji komórek ICM powstaje różnica w ilości kadheryny E pomiędzy komórkami Epi i PE. W komórkach Epi jest tego białka więcej niż w komórkach PE. Co ciekawe, w komórkach PE w 4. Z 20. badanych późnych blastocyst zaobserwowałam obecność kadheryny E w jądrach komórkowych (ryc. 21). W żadnym z dwunastu zarodków w stadium 4,25-dniowym oraz trzynastu zarodków 4,75-dniowych nie wykryłam jądrowej lokalizacji kadheryny E. a a a Pdgfrα Kadheryna E Ryc. 21. Jądrowa lokalizacja kadheryny E w komórkach PE późnej blastocysty. 80

4.2. Zależność pomiędzy polaryzacją komórek ICM a ich lokalizacją i różnicowaniem Następnie postanowiłam sprawdzić, czy polaryzacja komórek PE jest związana z ich powierzchniową lokalizacją w ICM czy też ich różnicowaniem w kierunku PE. Żeby odpowiedzieć na to pytanie uzyskałam zarodki, w których ICM znajdowały się wyłącznie komórki Epi (określane jako grupa ICM-Epi) albo wyłącznie komórki PE (grupa ICM-PE). Takie blastocysty rozwijały się z zarodków 8-komórkowych hodowanych w obecności odpowiednio inhibitorów kinazy MEK i receptora FGFR2 oraz w obecności czynnika FGF4 (Yamanaka i wsp., 2010). Kontrolę do tego doświadczenia stanowiły zarodki 8-komórkowe, hodowane przez 72 godziny w pożywce KSOM do stadium późnej blastocysty. W tak uzyskanych zarodkach wyznakowałam kadherynę E i Sox17, będący markerem PE. Następnie policzyłam spolaryzowane komórki na powierzchni ICM oraz oznaczyłam w nich względną ilość kadheryny E. Zdjęcia zarodków kontrolnych, ICM-PE i ICM-Epi przedstawiłam na ryc. 22. a a a Zarodek kontrolny b b b Zarodek ICM-PE c c c Zarodek ICM-Epi Kadheryna E Sox17 Jądra komórkowe Ryc. 22. Lokalizacja białka Sox17 oraz morfologia zarodków: kontrolnych (fot. a a ), grupy ICM-PE (fot. b b ) oraz grupy ICM-Epi (fot. c c ). Jądra komórkowe zostały wybarwione DRAQ 5. Skala 20 µm. Stwierdziłam zasadnicze różnice w morfologii pomiędzy kontrolnymi blastocystami a blastocystami mającymi w ICM wyłącznie komórki Epi lub blastocystami zawierającymi 81

w ICM jedynie komórki PE. Blastocysty ICM-Epi były mniejsze, a ich węzły zarodkowe bardziej kuliste (ryc. 22 c c ) w porównaniu z zarodkami grupy kontrolnej (ryc. 22 a a ) oraz grupy ICM-PE (ryc. 22 b b ). Zarodki ICM-PE miały większą średnicę oraz ICM bardziej płaskie i mocniej rozciągnięte na TE (ryc. 22 c c ) w porównaniu z zarodkami grupy kontrolnej i grupy ICM-Epi. W tabeli VI przedstawiłam liczbę komórek PE, Epi i TE (wartości średnie) w zarodkach grupy kontrolnej, grupy ICM-PE i grupy ICM-Epi. Liczba komórek Epi w zarodkach ICM-Epi była ponad dwukrotnie większa niż w zarodkach kontrolnych. W zarodkach ICM-PE tylko w trzech z dwudziestu dwóch zbadanych zarodków obecne były pojedyncze komórki Epi. Liczba komórek PE w grupie ICM-PE i grupie kontrolnej była bardzo zbliżona. Natomiast w zarodkach ICM-Epi nie zaobserwowałam obecności komórek PE. Stwierdziłam istotne różnice w liczebności komórek TE w zarodkach badanych grup. Różnice te były pozytywnie skorelowane z wielkością blastocyst poszczególnych grup. Blastocysty ICM-PE miały zdecydowanie więcej komórek TE niż blastocysty kontrolne, a te z kolei miały ich więcej od blastocyst ICM-Epi. Tabela VI. Liczba komórek Epi, PE i TE w badanych grupach zarodków. Liczba komórek Grupa zarodków Kontrolne Liczba zarodków 6 ICM-PE Liczba zarodków 22 ICM-Epi Liczba zarodków 7 Wartość średnia ± odchylenie standardowe PE Epi TE 20,2 ± 2,0 12,8 ± 3,4 115 ± 19,3 19,0 ± 4,3 0,6 ± 1,0 151 ± 16,2 0,0 28,5 ± 8,0 79,3 ± 15,4 Polaryzację komórek na powierzchni ICM w grupie kontrolnej, grupie ICM-PE i grupie ICM-Epi określiłam na podstawie rozmieszczenia kadheryny E w tych komórkach. Częstość występowania komórek spolaryzowanych i niespolaryzowanych w badanych zarodkach przedstawiłam w tabeli VII. 82

Tabela VII. Częstość występowania komórek spolaryzowanych i niespolaryzowanych znajdujących się na powierzchni ICM w grupach badanych zarodków. Grupa zarodków Kontrolne Liczba zarodków 17 Liczba komórek 119 ICM-PE Liczba zarodków 29 Liczba komórek 166 ICM-Epi Liczba zarodków 25 Liczba komórek 183 Udział komórek na powierzchni ICM spolaryzowanych niespolaryzowanych 74% 26% 81% 19% 30% 70% W zarodkach kontrolnych większość komórek (74%) znajdujących się na powierzchni ICM była spolaryzowana pod względem rozmieszczenia kadheryny E. Pozostałe 26% komórek pozostało niespolaryzowanych. W zarodkach ICM-Epi proporcje komórek spolaryzowanych i niespolaryzowanych były odwrotne, to znaczy większość komórek na powierzchni ICM miała kadherynę E równomiernie rozłożoną w błonie komórkowej (70%), a tylko 30% charakteryzowało się spolaryzowanym rozmieszczeniem tego białka. W zarodkach ICM-PE udział obu typów komórek był bardzo podobny do tego w zarodkach kontrolnych. Komórki spolaryzowane oraz niespolaryzowane stanowiły odpowiednio 81% i 19% powierzchniowych komórek ICM. We wszystkich badanych grupach zarodków komórki znajdujące się w głębi ICM nie były spolaryzowane. Następnie we wszystkchi rodzajach blastocyst porównałam względną ilość kadheryny E w komórkach znajdujących się w głębi ICM, w komórkach znajdujących się na jego powierzchni, a także w komórkach TE. W celu obliczenia względnej ilości kadheryny E dokonałam pomiarów fluorescencji na styku dwóch komórek spolaryzowanych znajdujących się na powierzchni ICM, na styku dwóch komórek znajdujących się w jego głębi oraz na styku dwóch komórek TE. Na podstawie uzyskanych wyników obliczyłam 95%-owe przedziały ufności, które przedstawiłam na wykresie 8 a, b oraz c. 83

a b c Wykres 8. Przedziały ufności wartości ilorazów pomiarów intensywności fluorescencji w zarodkach kontrolnych, ICM-Epi i ICM-PE. Ilorazy utworzone zostały z wartości pomiarów uzyskanych w komórkach znajdujących się na powierzchni ICM i w jego głębi (wykres a), w komórkach znajdujących się na powierzchni ICM i w komórkach 84

linii TE (wykres b) oraz w komórkach znajdujących się w głębi ICM i w komórkach linii TE (wykres c). Przedstawione na wykresie 8a 95%-owe przedziały ufności dla wartości średnich opisanych ilorazów dla zarodków kontrolnych, ICM-Epi i ICM-PE nie mogą być podstawą do określenia, czy istnieją różnice w wartościach opisanych ilorazów pomiędzy wymienionymi grupami zarodków. Dlatego obliczyłam 95%-owe przedziały ufności dla różnicy średnich wartości ilorazów, porównując ze sobą parami grupy zarodków. Granice tych przedziałów przedstawiłam w tabeli S3 znajdującej się w suplemencie. Analiza tych danych wskazuje na to, że wartość ilorazu komórki znajdujące się na powierzchni ICM/komórki znajdujące się w głębi ICM jest zawsze większa w zarodkach kontrolnych, zarówno względem zarodków ICM-Epi jak i ICM-PE. Z kolei wartość tego ilorazu jest bardzo zbliżona dla zarodków ICM-Epi i ICM-PE. Wartość ilorazu względnej ilości kadheryny E pomiędzy komórkami znajdującymi się na powierzchni ICM i względnej ilości kadheryny E pomiędzy komórkami TE wydaje się być zbliżona we wszystkich trzech grupach zarodków. Natomiast wartość ilorazu względnej ilości kadheryny E pomiędzy komórkami znajdującymi się w głębi ICM i względnej ilości kadheryny E pomiędzy komórkami TE może być równa w zarodkach ICM-Epi i ICM-PE, ale może też być większa w pierwszej grupie zarodków. Porównując zarodki kontrolne z zarodkami ICM-PE bądź ICM-Epi wykazałam, że wartość tego ilorazu może być zbliżona lub mniejsza w zarodkach kontrolnych. Warto także zwrócić uwagę na fakt, że wartość ilorazu względnej ilości kadheryny E w komórkach znajdujących się na powierzchni ICM względem ilości tego białka w komórkach znajdujących się w głębi ICM jest zawsze mniejsza od 1, zarówno w grupie kontrolnej jak i w grupach ICM-Epi i ICM-PE. Oznacza to, że zmniejszenie ilości tego białka pomiędzy komórkami znajdującymi na powierzchni ICM zależy od lokalizacji komórek, a nie od ich rodzaju (Epi lub PE). Przedstawione wyniki wskazują, że większa względna ilość kadheryny E w komórkach Epi niż w komórkach PE jest cechą charakterystyczną dla tych linii. Co więcej, komórki Epi trudniej ulegają polaryzacji po znalezieniu się na powierzchni ICM w porównaniu z komórkami linii PE. 85

4.3. Względna ilość mrna kodującego kadherynę E w komórkach PE i Epi przed i po segregacji W powstanie różnic w ilości kadheryny E pomiędzy komórkami PE i Epi po ich segregacji mogą być zaangażowane mechanizmy regulujące ilość mrna dla tego białka. Żeby to sprawdzić, wyizolowałam z trzech wczesnych oraz trzech późnych blastocyst po trzy komórki PE i trzy komórki Epi, kierując się odpowiednio brakiem lub obecnością białka PdgfRα. Następnie, dla każdego zarodka w puli komórek PE i puli komórek Epi zmierzyłam metodą PCR w czasie rzeczywistym względną ilość mrna dla kadheryny E. Jednocześnie sprawdziłam, czy w komórkach tych obecna jest kadheryna N, która jest drugim, po kadherynie E, białkiem z tej rodziny występującym w komórkach ssaczych. Do tej analizy użyłam dwóch genów referencyjnych (GAPDH i β-aktyny), których poziomy ekspresji były bardzo zbliżone. Użycie dwóch genów referencyjnych podyktowane było tym, że β-aktyna wiąże się z kadheryną E, zatem nie mogłam wykluczyć, że obniżeniu ekspresji genu kodującego kadherynę E będzie towarzyszyć obniżenie ekspresji genu kodującego β-aktynę. W doświadczeniu 1 względna ilość mrna kodującego kadherynę E była większa w komórkach Epi niż w komórkach PE zarówno przed, jak i po segregacji. Po segregacji różnica w ilości badanego mrna była znacznie większa ze względu na zwiększenie ilości transkryptów kadheryny E w komórkach Epi i zmniejszenie ich ilości w komórkach PE. W doświadczeniu 2 także względna ilość transkryptów kodujących kadherynę E była większa w komórkach Epi niż PE, z tą różnicą w porównaniu do doświadczenia 1, względna ilość mrna kadheryny E nie wzrosła w komórkach Epi po segregacji komórek ICM. W doświadczeniu 3 poziom mrna kodującego kadherynę E w komórkach Epi przed segregacją i w komórkach PE po segregacji był poniżej poziomu czułości metody RT-PCR. W komórkach PE przed segregacją względna ilość transkryptów dla kadheryny E podobnie była na niskim poziomie. W tym samym doświadczeniu jednak względny poziom mrna kadheryny E jest na zaskakująco wysokim poziomie w komórkach Epi po segregacji. W żadnej z badanych grup komórek nie wykryłam mrna dla kadheryny N (Wykres 9). 86

a 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 Doświadczenie 1 Epi PE Epi PE kadheryna E kadheryna N z wczesnych blastocyst z późnych blastocyst b 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 Doświadczenie 2 Epi PE Epi PE kadheryna E kadheryna N z wczesnych blastocyst z późnych blastocyst c Wykres 9. Względne ilości mrna białka kadheryny E i kadheryny N w blastomerach Epi i PE wyizolowanych z blastocyst wczesnych i późnych w trzech powtórzeniach (wykresy a, b i c). 87

W dwóch z trzech przedstawionych doświadczeń we wczesnych blastocystach względna ilość transkryptów dla kadheryny E jest większa w komórkach Epi, a w jednym doświadczeniu w komórkach PE. Natomiast po segregacji komórek ICM, w późnych blastocystach, w każdym doświadczeniu widoczna jest zależność, że względna ilość transkryptów kadheryny E jest większa w komórkach Epi niż w komórkach PE. 4.4. Wpływ obniżenia ilości kadheryny E na różnicowanie blastomerów zarodka myszy Zaobserwowałam, że kadheryna E zanika we wczesnych etapach różnicowania in vitro komórek ES w kierunku PE pod wpływem RA. Jednocześnie dowiodłam, że w ICM późnej blastocysty względna ilość tego białka oraz kodującego go mrna jest większa w komórkach Epi w porównaniu z komórkami PE. Dlatego też postanowiłam zbadać wpływ obniżenia ilości kadheryny E na różnicowanie komórek w zarodku myszy. W tym celu wstrzykiwałam dwuniciowy RNA (dsrna) skierowany przeciwko fragmentowi mrna kadheryny E do jednego blastomeru zarodka w stadium 8-komórkowym. Razem z dsrna wstrzykiwałam mrna kodujące białko fuzyjne histon H2B z białkiem GFP (mrna znacznikowe), dzięki czemu mogłam śledzić los komórek potomnych nastrzykniętych blastomerów w rozwijającym się zarodku. W doświadczeniu tym kontrolami były dwie grupy zarodków. Pierwszą z nich stanowiły zarodki 8-komórkowe, w których do pojedynczych blastomerów wstrzykiwałam tylko znacznikowy mrna, natomiast w drugiej grupie kontrolnej do zarodków wstrzykiwałam znacznikowy mrna wraz z kontrolnym dsrna skierowanym przeciwko mrna białka Cherry, które nie występuje naturalnie w komórkach ssaków. Zbadałam w jakim stopniu zastosowane przeze mnie dsrna obniża ilość kadheryny E w zarodkach poprzez określenie względnej ilości tego białka oraz względnej ilości mrna w nastrzykniętych blastomerach 24 godziny po iniekcji. Porównałam względną ilość kadheryny E pomiędzy dwiema komórkami potomnymi jednego z nienastrzykniętych blastomerów i pomiędzy dwiema komórkami potomnymi nastrzykniętego blastomeru. W tym celu, 24 godziny po iniekcji utrwaliłam po 5 zarodków z grupy doświadczalnej oraz z obu grup kontrolnych i wyznakowałam w nich kadherynę E metodą immunofluorescencji pośredniej. Przykładowe zdjęcie zarodka po 24 hodowli od iniekcji dsrna przedstawiłam na ryc. 23. 88

a a kadheryna E jądra komórkowe jądra komórkowe nastrzykniętych komórek Ryc. 23. Lokalizacja kadheryny E w 16-komórkowym zarodku po 24 godzinach od iniekcji dsrna przeciwko transkryptowi kodującemu to białko. Na fot. a kolorem czerwonym wyznakowana jest kadheryna E, kolorem zielonym - jądra komórkowe nastrzykniętych komórek, a kolorem niebieskim jądra komórkowe pozostałych komórek. Na fot. a przedstawiono tylko lokalizację kadheryny E. Skala 20 µm. Po obliczeniu ilorazu względnej ilości kadheryny E pomiędzy komórkami pochodzącymi od nienastrzykniętych blastomerów i komórkami pochodzącymi od nastrzykniętych blastomerów, obliczyłam przedziały ufności dla wartości średnich tego ilorazu dla każdej z trzech grup zarodków. Dla zarodków, do których wstrzykiwany był specyficzny dsrna wyniósł on 2,3 4,1; dla zarodków nastrzykiwanych tylko znacznikowym mrna: 0,7 1,2; natomiast dla zarodków nastrzykniętych znacznikowym mrna oraz niespecyficznym mrna: 0,8 1,3 (wykres 10). 95%-owe przedziały ufności dla różnic średnich dla przedstawionych wartości ilorazów wyniosły 1,87 3,4 oraz 1,73 3,24 odpowiednio przy porównaniu grup dsrna i znacznikowego mrna oraz dsrna i znacznikowego i niespecyficznego mrna. Analiza ta oznacza, że w moich doświadczeniach dsrna przeciwko kadherynie E powoduje zmniejszenie ilości tego białka w nastrzykniętych blastomerach 1,5-3-krotnie. 89

Przedziały ufności 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Względna ilość kadheryny E pomiędzy blastomerami nienastrzykniętymi i nastrzykniętymi w grupach: dsrna znacznikowy mrna znacznikowy mrna niespecyficzny dsrna Wykres 10. Przedziały ufności wartości ilorazów pomiarów intensywności fluorescencji pomiędzy dwoma blastomerami nastrzykniętymi dsrna, znacznikowym mrna oraz znacznikowym mrna i niespecyficznym dsrna. Sprawdziłam również, w jakim stopniu dsrna wprowadzony do blastomerów obniżył w nich ilość transkryptów kodujących kadherynę E. W tym celu po 24 godzinach od iniekcji dsrna, zdezagregowałam 5 zarodków, a wyizolowane pojedyncze komórki pochodzące od nastrzykniętego blastomeru i komórki potomne blastomeru nienastrzykniętego połączyłam w dwie grupy po 5 blastomerów. Następnie poddałam je lizie, przy czym w każdej grupie znajdowało się po jednym blastomerze z każdego zarodka. Następnie analizowałam ilość mrna kadheryny E w obu typach komórek metodą RT-PCR (wykres 10). Stwierdziłam, że w blastomerach, które były nastrzyknięte dsrna przeciwko kadherynie E, poziom tego mrna średnio zmalał ponad siedemnastokrotnie. 90

Względna ilość trankryptów 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Względna ilość transkryptów kadheryny E komórki potomne nastrzykniętych blastomerów komórki potomne nienastrzykniętych blastomerów Wykres 10. Względna ilość transkryptów kadheryny E w komórkach pochodzących z blastomerów nastrzykniętych dsrna i nienastrzykniętych, pochodzących z tych samych zarodków. Na wykresach 11a, 11b i 11c przedstawiłam udział komórek potomnych nastrzykniętych blastomerów w liniach Epi, PE oraz TE we wszystkich trzech badanych grupach zarodków. Kontrola dsrna markerowe mrna a b c markerowe mrna niespecyficzne ds RNA Liczba zarodków 24 Liczba komórek - 297 Liczba zarodków 20 Liczba komórek - 182 Liczba zarodków 14 Liczba komórek - 131 Wykres 11. Rozmieszczenie komórek potomnych powstałych w wyniku podziałów nastrzykniętych blastomerów w liniach Epi, PE oraz TE, we wszystkich trzech badanych grupach zarodków. 91