Spis treści Przedmowa 10 1 Budowa genomu jądrowego (M.J. Olszewska, J. Małuszyńska) 13 1.1. Organizacja DNA jądrowego 13 1.1.1. Rodzaje sekwencji powtarzalnych i ich lokalizacja 14 1.1.1.1. Sekwencje rozproszone i retrotranspozony 16 1.1.1.2. Sekwencje tandemowe 19 1.1.1.2.1. Sekwencje satelitarne i telomerowe 19 1.1.1.2.2. Sekwencje kodujące rybosomowy RNA 21 1.1.1.3. Sekwencje kodujące trna 22 1.1.2. Sekwencje powtarzalne w ustalaniu pokrewieństwa gatunków 23 1.1.2.1. Sekwencje tandemowe 23 1.1.2.2. Sekwencje rozproszone niezidentyfikowane jako retroelementy 23 1.1.2.3. Retroelementy 24 1.1.3. Przekształcanie (remodelling) chromatyny 24 1.1.3.1. Metylacja DNA 26 1.1.3.2. Metylacja histonów 28 1.1.3.3. Acetylacja histonów 28 1.1.3.4. Fosforylacja histonów 29 1.1.3.5. Przykłady skutków epigenetycznego przekształcania chromatyny 29 1.1.4. Wyniki sekwencjonowania genomów jądrowych na przykładzie Arabidopsis thaliana 30 Literatura uzupełniająca 33 1.2. Architektura jądra interfazowego 34 1.2.1. Wzajemne ułożenie genomów rodzicielskich i ancestralnych 34 1.2.2. Ułożenie poszczególnych chromosomów 36 1.2.3. Jąderko 36 1.2.4. Badania porównawcze genomów 37 1.3. Wielkość genomu jądrowego 38 1.3.1. Paradoks C DNA i teoria nukleotypowa 39 1.3.2. Poliploidalność znaczenie w ewolucji 42 1.3.3. Ewolucja rozmiarów genomu jądrowego 43 1.4. Zmiany ilościowe i jakościowe DNA w ontogenezie 45 1.5. Programowana śmierć komórki 51 Literatura uzupełniająca 54 5
2 Struktura chromosomów mitotycznych (J. Małuszyńska, S. Rogalska, M.J. Olszewska) 56 2.1. Przekształcanie chromatyny interfazowej w chromosomy 56 2.2. Struktura i morfologia chromosomu mitotycznego 57 2.2.1. Organizacja strukturalna chromosomu mitotycznego 57 2.2.2. Struktura i funkcje centromeru oraz kinetochoru 58 2.2.3. Struktura i funkcja telomerów 62 2.2.4. Organizator jąderkowy (NOR) 64 2.2.5. Wzór prążkowy chromosomów 65 2.2.6. Typy chromosomów 68 2.2.6.1. Minichromosomy 68 2.2.6.2. Chromosomy B 69 2.2.6.3. Chromosomy płci 71 2.2.6.4. Sztuczne chromosomy 71 2.2.7. Kariotyp liczba i morfologia chromosomów 73 2.3. Fizyczne mapy chromosomów 78 2.3.1. Porównanie fizycznych i genetycznych map chromosomów 78 2.3.2. Metoda hybrydyzacji in situ 79 2.3.3. Lokalizacja genów metodą hybrydyzacji in situ 82 2.3.4. Lokalizacja sekwencji niekodujących 83 2.3.5. Genomowa hybrydyzacja in situ 85 2.4. Lokalizacja obszarów nadwrażliwych na DNazę I 86 2.4.1. Trawienie in situ DNazą I 87 2.4.2. Nick-translacja in situ z zastosowaniem DNazy I 87 2.5. Lokalizacja in situ sekwencji docelowych dla enzymów restrykcyjnych 89 2.5.1. Trawienie in situ enzymami restrykcyjnymi 89 2.5.2. Nick-translacja in situ z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych 90 Literatura uzupełniająca 92 3 Cykl komórkowy (S. Rogalska) 94 3.1. Regulacja cyklu komórkowego 94 3.1.1. Cykl komórkowy u drożdży 95 3.1.2. Białka cyklu komórkowego 97 3.1.3. Kontrola cyklu komórkowego 101 3.1.3.1. Geny cyklu komórkowego 101 3.1.3.2. Kontrola cyklu komórkowego u roślin 103 3.1.4. Replikacja DNA chromosomów roślin wyższych 105 3.1.5. Składanie nukleosomów w fazie S 108 3.2. Mitoza 109 3.2.1. Profaza mitotyczna 109 3.2.1.1. Kondensacja chromosomów 110 3.2.1.2. Formowanie i funkcjonowanie wrzeciona podziałowego 113 3.2.1.3. Budowa mikrotubul i motory mikrotubularne 116 3.2.1.4. Degradacja otoczki jądrowej i jąderka 117 3.2.2. Metafaza 118 3.2.3. Anafaza 118 3.2.4. Telofaza i cytokineza 119 Literatura uzupełniająca 120 6
4 Mejoza (S. Rogalska) 121 4.1. Przebieg procesu mejotycznego 123 4.1.1. Interfaza przedmejotyczna 124 4.1.2. Profaza I 125 4.1.3. Metafaza I 129 4.1.4. Anafaza I 131 4.1.5. Telofaza I i interfaza między I a II podziałem mejotycznym 131 4.2. Drugi podział mejotyczny 132 4.3. Mechanizm rekombinacji crossing-over 132 4.3.1. Molekularne mechanizmy rekombinacji 133 4.3.2. Kompleks synaptemalny 136 4.4. Kontrola inicjacji i przebiegu mejozy 137 4.4.1. Kontrola przejścia z podziałów mitotycznych do mejotycznych 137 4.4.2. Geny mejotyczne u roślin 140 Literatura uzupełniająca 142 5 Uszkodzenia chromosomów i naprawa DNA (S. Rogalska, J. Małuszyńska) 143 5.1. Czynniki uszkadzające chromosomy i natura uszkodzeń 143 5.1.1. Czynniki uszkadzające chromosomy 143 5.1.2. Natura uszkodzeń chromosomowych 145 5.2. Podłoża molekularne uszkodzeń chromosomowych 146 5.3. Aberracje chromosomowe 150 5.3.1. Deficjencje 150 5.3.2. Duplikacje 151 5.3.3. Inwersje 152 5.3.4. Translokacje 154 5.3.5. Znaczenie aberracji chromosomowych w ewolucji i w badaniach genetycznych 157 5.4. Naprawa DNA 160 5.4.1. Fotoreaktywacja 161 5.4.2. Metylotransferaza O 6 -metyloguanino-dna 163 5.4.3. Naprawa przez wycinanie 163 5.4.4. Naprawa poreplikacyjna 166 5.4.5. Naprawa pomostowa ( bypass ) system SOS 167 5.5. Wymiany chromatyd siostrzanych 167 5.6. Wykorzystanie metod cytogenetyki molekularnej w wykrywaniu uszkodzeń DNA i aberracji chromosomowych 169 5.6.1. Test TUNEL 170 5.6.2. Test kometowy (SCGE) 170 5.6.3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) 171 Literatura uzupełniająca 172 6 Zmienność liczby chromosomów i układów chromosomowych (S. Rogalska) 173 6.1. Euploidy 173 6.1.1. Haploidy 174 6.1.2. Poliploidy 177 6.1.2.1. Powstawanie poliploidów 178 7
6.1.2.2. Fenotypowe przejawy poliploidalności oraz zakres jej występowania 179 6.1.2.3. Autopoliploidy 180 6.1.2.3.1. Autotriploidy 180 6.1.2.3.2. Autotetraploidy 183 6.1.2.4. Allopoliplody 190 6.2. Aneuploidy 193 Literatura uzupełniająca 196 7 Zastosowanie metod cytogenetycznych w badaniach genetycznych i w hodowli roślin (S. Rogalska) 197 7.1. Linie monosomiczne i nullisomiczne 197 7.1.1. Kariotyp pszenicy heksaploidalnej 198 7.1.2. Otrzymywanie, charakterystyka i zastosowanie linii monosomicznych pszenicy 199 7.1.3. Linie nullisomiczne 204 7.2. Linie z chromosomami telocentrycznymi i izochromosomami 205 7.3. Linie z podstawionymi chromosomami substytucyjne 208 7.3.1. Podstawianie chromosomów w obrębie gatunku 208 7.3.1.1. Podstawianie chromosomu objętego translokacją wzajemną 210 7.3.1.2. Znaczenie poznawcze i zastosowanie w hodowli linii z podstawionymi chromosomami 211 7.3.2. Podstawianie chromosomów między gatunkami 212 7.3.2.1. Naturalna substytucja 212 7.3.2.2. Substytucja kontrolowana 214 7.4. Linie addycyjne 215 7.5. Przenoszenie chromosomów z innych gatunków 218 7.5.1. Przenoszenie fragmentu obcego chromosomu 218 7.5.2. Dodawanie całych obcych genomów 221 Literatura uzupełniająca 229 8 Zastosowanie badań cytogenetycznych w biotechnologii (J. Małuszyńska, M.J. Olszewska) 230 8.1. Roślinne kultury in vitro 230 8.1.1. Czynniki wpływające na występowanie przemian chromosomowych 231 8.1.2. Mechanizmy prowadzące do powstania przemian chromosomowych 231 8.1.3. Wykorzystanie cytometrii przepływowej w analizie kultur in vitro 235 8.1.4. Kariotyp roślin zregenerowanych z kultur in vitro 235 8.2. Rośliny transgeniczne 236 8.3. GFP jako marker lokalizacji i regulacji ekspresji genów 236 Literatura uzupełniająca 237 9 Wybrane metody w badaniach cytogenetycznych (J. Małuszyńska, M.J. Olszewska) 239 9.1. Zawartość DNA jądrowego 239 9.1.1. Pomiary in situ po zabarwieniu metodą Feulgena 239 9.1.2. Cytometria przepływowa 241 9.1.2.1. Przygotowanie materiału roślinnego do pomiarów zawartości DNA w cytometrze przepływowym 243 9.2. Badania chromosomów 244 9.2.1. Materiał 245 8
9.2.1.1. Traktowanie materiału przed utrwalaniem 245 9.2.1.2. Utrwalanie materiału 246 9.2.1.3. Wykonanie preparatów metodą zgniatania 246 9.2.1.3.1. Wykonanie preparatów i barwienie materiału in toto 246 9.2.1.3.2. Trwałość preparatów 247 9.2.1.3.3. Wykonanie preparatów metodą maceracji enzymatycznej 248 9.2.1.3.4. Wykonanie preparatów metodą nakraplania 249 9.2.1.3.5. Ocena preparatów 250 9.2.1.4. Liczba chromosomów w komórkach somatycznych 251 9.2.1.5. Liczba chromosomów w komórkach generatywnych 251 9.2.2. Identyfikacja chromosomów mitotycznych 252 9.2.2.1. Metody prążkowe 252 9.2.2.1.1. Metoda barwienia prążków C 252 9.2.2.1.2. Metoda srebrzenia organizatorów jąderkowych i jąderek 253 9.2.2.1.3. Fluorescencyjne barwienie prążków 254 9.2.2.2. Hybrydyzacja in situ specyficznych sekwencji DNA 257 9.2.2.2.1. Preparaty 257 9.2.2.2.2. Preparaty z chromosomami mejotycznymi 258 9.2.2.2.3. Sonda DNA 258 9.2.2.2.4. Traktowanie wstępne 259 9.2.2.2.5. Mieszanina hybrydyzacyjna 260 9.2.2.2.6. Denaturacja 260 9.2.2.2.7 Hybrydyzacja 261 9.2.2.2.8. Płukanie 261 9.2.2.2.9. Wykrywanie sondy znakowanej (A) digoksygeniną, (B) biotyną 262 9.2.2.2.10. Podwójna hybrydyzacja in situ 266 9.2.2.2.11. Analiza preparatów 266 9.2.2.2.12. PRINS synteza in situ z udziałem startera 267 9.2.2.3. Trawienie in situ endonukleazami 268 9.2.2.4. Nick-translacja in situ 269 9.2.2.5. Metoda rozciągniętych włókien chromatynowych (EDF) 271 9.3. Wykrywanie uszkodzeń DNA 272 9.3.1. Test kometowy 272 9.3.2. Test TUNEL 275 9.4. Genomowa hybrydyzacja in situ (GISH) 276 9.5. Wymiana chromatyd siostrzanych (SCE) 277 9.6. Izolowanie chromosomów i klonowanie specyficznego DNA 279 9.6.1. Izolowanie bezpośrednie 279 9.6.2. Izolowanie z wykorzystaniem cytometru przepływowego 280 9.7. Komputerowa analiza chromosomów 281 9.7.1. Pomiary liniowe 281 9.7.2. Konstruowanie kariogramów 281 9.7.3. Wykorzystanie we fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ 283 9.7.4. Mikroskop konfokalny 283 Literatura uzupełniająca 284 Indeks 285 Ilustracje kolorowe Tablice I-XVI