Lab-chipy DNA, mikroreaktory chemiczne/biochemiczne i cytometry zintegrowane wytwarzane z krzemu, szkła i SU8 - przegląd prac realizowanych w PMiM WEMiF PWr Rafał WALCZAK Pracowania Mikroinżynierii i Mikromechaniki Wydział Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki Politechnika Wrocławska Seminarium Zakładu Mechaniki i Fizyki Płynów PAN Warszawa, 21.11.2007
Plan wystąpienia 1. Wstęp rynek mikrosystemów, 2. Komponenty mikrofluidyczne - przegląd, 3. Lab-chipy, 4. Miniaturowy system RT-PCR, 5. Mikroreaktory biochemiczne i chemiczne, 6. Cytometr zintegrowany
Światowy rynek mikrosystemów w latach 2004-2009 Microfluidical systems MIcro Senosors and Microsystems World Wide Markets and Economic Impact, NEXUS Report
Podział światowego rynku mikrosystemów MIcro Senosors and Microsystems World Wide Markets and Economic Impact, NEXUS Report
Składniki sektora Medical and Life Sciences Blisko 70% w roku 2004 i ponad 80% w roku 2009 wartości rynku mikrosystemów typu M&LS to systemy mikrofluidyczne MIcro Senosors and Microsystems World Wide Markets and Economic Impact, NEXUS Report
System mikrofluidyczny Komponenty mikrofluidyczne Mikrokanały Mikrokolumny Mikropompy Mikrozawory Mikrodozowniki Mikrogrzejniki, Mikrowymienniki ciepła, Mikrochłodziarki Mikromieszalniki Mikroczujniki
System mikrofluidyczny (wizja artystyczna)
Technologie mikroinżynieryjne wykorzystywane do wytwarzania systemów mikrofluidycznych Clean room o klasie czystości 1000 i wyżej, ~500 m 2 Fotolitografia UV Głęboka obróbka krzemu (MAT, DRIE) i szkła (MIT) Nanoszenie warstw metalicznych (Au, Al, Cr, Ni, Pt) Procesy wysokotemperaturowe (utlenianie krzemu, dyfuzja domieszek) Bonding anodowy (Si-szkło), próżniowy i w kontrolowanej atmosferze, dyfuzyjny (Si-Si, szkłoszkło), foliowy (?-?), techniki specjalne Wszystkie wymienione technologie dostępne są w PMiM
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikrokolumny Przekrój mikrokolumny krzemowo-szklanej Mikrokolumna chromatograficzna gazowa, ID=150 µm, L=1,5 m Mikrokolumny cieczowe (chromatograficzne i reakcyjne)
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikropompa eżektorowa Przekrój krzemowo-szklanej pompy Detal konstrukcyjny - eżektor Widok mikropompy gotowej do pracy
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Sterowanie pneumatyczne Mikrozawory wlot wylot Przekrój krzemowo-szklanego mikrozaworu z membraną teflonową Krzemowo-szklany mikrozawór Widok gniazda mikrozaworu i komory sterującej
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikrodozowniki Mikrodozownik pięciozaworowy dla chromatografu gazowego Mikrodozownik o otwartej architekturze Mikrodozownik typu plujka
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikromieszalniki pasywne Mikromieszalnik typu Y Mikromieszalnik typu T Mikromieszalnik wielostrumieniowy
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikromieszalnik aktywny Schemat konstrukcji mikromieszalnika ultradźwiękowego PZT Membrana typu bossed Widok mikromieszalnika od strony dysku PZT i membrany z wyspą Bez mieszania ultradźwiękowego
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikroczujniki ciśnienia Piezorezystancyjne czujniki ciśnienia Pojemnościowy, przepływowy czujnik ciśnienia Optyczny czujnik ciśnienia
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikroczujnik przepływu termokonduktometryczny 5 mm Detektor TCD przed końcowym zamknięciem w metalowej obudowie Elementy składowe oraz przekrój przez detektor termoprzewodnościowy
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikroczujniki konduktometryczne Schemat budowy i przekrój krzemowo-szklanego mikroczujnika konduktometrycznego Vm=2 ml Vm=20 nl Mikroczujnik konduktometryczny w porównaniu do głowicy pomiarowej standardowego, makroskopowego czujnika
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikroczujniki optyczne absorpcyjne Schemat konstrukcji i zasady działania optycznego mikroczujnika absorpcyjnego Vm=300 nl Widok mikrokanału pomiarowego i gotowego mikroczujnika absorpcyjnego
Komponenty mikrofluiduczne - przegląd Mikroczujniki optyczne spektrofluorescencyjne Vm=15 nl Schemat konstrukcji i zasady działania optycznego mikroczujnika spektrofluorescencyjnego Widok czujnika i powiększony obszar wzbudzania i zbierania światła fluorescencji
Lab-chipy do elektroforezy kapilarnej Szklany chip do elektroforezy kapilarnej i powiększony obszar dozownika (~5 nl) Krzemowo-szklany chip do elektroforezy kapilarnej ze zintegrowanym optycznym detektorem absorpcyjno-fluorescencyjnym,
Lab-chipy DNA Krzemowo-szklany przepływowy mikroreaktor PCR Wlot bufora Wlot próbki Strefa 1 Strefa 2 Strefa 3 Wylot Schemat konstrukcji mikroreaktora z trzema niezależnymi strefami grzewczymi Przekrój i elementy składowe mikroreaktora
Lab-chipy DNA Krzemowo-szklany przepływowy mikroreaktor PCR Określenie poziomu namnożenia fragmentów DNA możliwe dopiero po procesie amplifikacji Widok mikroreaktora PCR od strony mikrokanału reakcyjnego i od strony grzejników
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD Miniaturowy system RT (Real Time) PCR Mini-kamera CCD i komputerowy system ekspercki Chip PCR umożliwiający wprowadzanie światła do komory PCR Termocykler PCR
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD Miniaturowy system RT-PCR termocykler PCR Karta komputerowa A/C, I/O Oprogramowanie kontrolno-sterujące
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD Komora reakcyjna Miniaturowy system RT-PCR chipy reakcyjne i sposoby wprowadzania światła do komory rekcyjnej Komora reakcyjna Światłowód planarny Światłowody włókniste Komora reakcyjna 5 mm Chip DNA opracowany przez IKERLAN, Hiszpania Chip DNA opracowany przez PMiM WEMiF PWr Chip DNA opracowany przez MIC DTU, Dania
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD Miniaturowy system RT-PCR układ odczytu optycznego 300 250 Fluorescence intensity [au] 200 150 100 50 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Time [s] Miniaturowa kamera CCD z układem optycznym i filtrem interferencyjnym Oprogramowanie eksperckie prowadzące analizę obrazów (fluorescencji) w czasie rzeczywistym
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD Laser: 636 nm Chromofor: TO-PRO 3 Miniaturowy system RT-PCR obrazy chipów w trakcie analizy Ludzkie oko Układ odczytu optycznego
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD Intensywność fluorescencji [au] 300 250 200 150 100 50 Miniaturowy system RT-PCR intensywność fluorescencji w funkcji stężenia DNA (łososia) Chromofor: TO-PRO 3 Limit detekcji ~ 2 ng/ml!!! Poziom tła (brak DNA) 0 1 10 100 1000 10000 Stężenie DNA [ng/ml]
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD Miniaturowy system RT-PCR krzywa mięknięcia DNA (łososia) Intensywność fluorescencji [au] 300 250 200 150 100 50 Chromofor: TO-PRO 3 Tm=77,8 o C 16 14 12 10 8 6 4 2 -df/dt 0 20 30 40 50 60 70 80 90 0 Temperatura [ o C]
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD Miniaturowy system RT-PCR rzeczywisty proces
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD Miniaturowy system RT-PCR rzeczywisty proces Intensywność fluorescencji [au] Temperatura [ o C] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 DNA: Campylobacter J. Chromofor: TO-PRO 3 Fluorescencja Temperatura 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 Czas [s]
Lab-chipy DNA OPTOLABCARD 75 Miniaturowy system RT-PCR intensywność fluorescencji w kolejnych cyklach Intensywność fluorescencji [au] 70 65 60 55 50 2 4 6 7 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Time [min] DNA: Campylobacter J. Chromofor: TO-PRO 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Cykl PCR Standard PCR micro PCR Elektroforeza żelowa wykonana przez D.D. Banga z VET DTU
Mikroreaktory biochemiczne Electro-spray chip konstrukcja i detale Widok mikroreaktora Detale konstrukcyjne dysza electro-spray
Mikroreaktory biochemiczne Electro-spray chip wynik analizy masowej gramicydyny i mioglobiny Testy przeprowadzono przy współpracy z prof. J. Silberringiem z Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie
Mikroreaktory biochemiczne Immunoassay chip konstrukcja i detale Widok mikroreaktora Detale konstrukcyjne dozownik elektroforetyczny i mieszalnik typu Y wraz z mikrokolumną reakcyjną
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Inteligentny mikroreaktor schemat budowy
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Mikroreaktor krzemowo-szklany zintegrowany z czujnikami Awers i rewers mikroreaktora chemicznego do prowadzenia reakcji nitracji, powiększony obszar mieszalniki wielostrumieniowego
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Mikroreaktor krzemowo-szklany zintegrowany z czujnikami testy mieszania Testy mieszania. Widok z kamery w różnych miejscach meandra Mieszanie KMnO4 + H2O (DI)
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Mikroreaktor krzemowo-szklany zintegrowany z czujnikami testy mieszania Testy mieszania Widok z kamery IR Mieszanie H 2 SO 4 (100%) + H 2 O (DI) Utrzymano temperaturę poniżej 30,5 C (zgodnie z założeniami) Testy przeprowadzono w Frauhofer Institut für Chemische Technologie
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Mikroreaktor z fotoszkła (FOTURAN) z platformą mikroczujników Widok mikroreaktora (mikroglas, Niemcy) oraz elementy obudowy wraz z platformą sensorową
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Platforma mikroczujników dla mikroreaktora Czujnik ciśnienia PCB Czujnik temperatury
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Mikroreaktor z FOTURANu z platformą mikroczujników Złącze elektryczne Obudowy czujników PCB Mikroreaktor Dolna część obudowy mikroreaktora Dystansowniki
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Mikroreaktor z FOTURANu z dyskretnymi mikroczujnikami Przekrój przez mikroreaktor w metalowej obudowie i z czujnikami ciśnienia oraz temperatury
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Dyskretne mikroczujniki ciśnienia dla mikroreaktora Parameter Full scale output voltage (FSO)* Offset voltage* Bridge resistance Non-linearity * Pressure hysteresis * Sensitivity coefficient * Temperature offset coefficient ** Temperature sensitivity coefficient ** Total pneumatic error * Value 285 25,5 5 0,38 0,33 9,7 0,1 0,32 0,71 Unit mv mv kω % % mv/v/100kp a %/ C %/ C % Krzemowo-szklana struktura mikroczujnika oraz czujnik w metalowej obudowie gotowy do wkręcenia do obudowy mikroreaktora Główne parametry metrologiczne mikroczujnika
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Mikroreaktor z FOTURANU z metalowej obudowie i wyposażony w dyskretne czujniki ciśnienia
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Krzemowo-szklany detektor optyczny absorpcyjny na zakres NIR/IR Ścianki separujące Zasada działania i separacji toru optycznego i mikrofluidycznego Widok z góry i przekrój mikrodetektora
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Krzemowo-szklany detektor optyczny absorpcyjny na zakres NIR/IR wygląd struktury i detale konstrukcyjne
Mikroreaktory chemiczne NEPUMUC Krzemowo-szklany detektor optyczny absorpcyjny na zakres NIR/IR Wyniki analizy mieszanin kwasu siarkowego z wodą i azotowego z wodą
Zintegrowany cytometr Krzemowo-szklany mikrocytometr - konstrukcja Możliwość jednoczesnej pracy w trybie absorpcyjnym i fluorescencyjnym Detektor Analit Absorpcja Źródło światła Detektor Kanał mikrofluidyczny: 250 µm szeroki,155 µm głęboki Mikrokomora pomiarowa: objętość 40 nl Długość drogi optycznej 520 µm lub 600 µm Światłowody włókniste: Ocean Optics 125/100 µm, ST Analit Źródło światła Fluorescencja
Zintegrowany cytometr Krzemowo-szklany mikrocytometr widok struktury Cytometr przed montażem światłowodów i detale konstrukcyjne (zdjęcia SEM)
Zintegrowany cytometr Krzemowo-szklany mikrocytometr gotowy do pracy Cytometr po montażu światłowodów włóknistych Testy optyczne cytometru
Zintegrowany cytometr Krzemowo-szklany mikrocytometr układ pomiarowy
Zintegrowany cytometr Krzemowo-szklany mikrocytometr wyniki pomiarów absorpcyjnych Limit detekcji: 2 µm
Zintegrowany cytometr Krzemowo-szklany mikrocytometr wyniki pomiarów fluorymetrycznych Limit detekcji: 70 nm
To działa!!!
Podziękowania Przedstawione wyniki są rezultatem wielu lat badań prowadzonych pod kierownictwem prof. J. Dziubana w zespole Pracowni Mikroinżynierii i Mikromechaniki w obecnym składzie: dr inż. A. Górecka-Drzazga, dr inż. R. Walczak, mgr inż. P. Knapkiewicz, oraz wieloletnich współpracowników: dr inż. Ł. Nieradko, dr inż. S. Bargiel, obecnie z Universite Franche-Comte, Besancon, Francja. Szczególne wyrazy wdzięczności dla mgr inż. J. Koszura i Jego Zespółu z ITE w Warszawie Dziękujemy wielu naszym współpracownikom i magistrantom. Badania finansowane były/są przez zlecenia statutowe, granty krajowe i europejskie.