Ekstrakcja olejków eterycznych i możliwości ich zastosowania w zwalczaniu pleśniakowca lśniącego, Alphitobius diaperinus Panzer. 1
Problem Masowe występowanie pleśniakowca lśniącego w kurnikach i brojlerniach Źródło: http://en.wikipedia.org/wiki/alphitobius_diaperinus Źródło:http://www.wipasz.pl/nasza-oferta/doradcy/czytaj/glowne-przyczynywystepowania-biegunek-u-drobiu/ Źródło:http://olx.pl/oferta/plesniakowiec-lsniacy-zwalczanie-plesniakowcana-fermach-CID619-ID23iGh.html 2
Cel rozprawy doktorskiej Celem rozprawy doktorskiej było wyizolowanie olejków eterycznych z wybranych gatunków roślin oraz ocena ich właściwości insektycydalnych i możliwości zastosowania w zwalczaniu i pleśniakowca lśniącego, Alphitobius diaperinus. Zakres części chemicznej pracy doktorskiej obejmował pozyskanie olejków eterycznych z wybranych gatunków roślin metodą destylacji z parą wodną z wykorzystaniem aparatu Derynga. Zbadanie składu chemicznego poszczególnych destylatów. Wykonanie widm magnetycznego rezonansu jądrowego 1 H NMR dla olejków oraz ich głównych komponentów. Określono również zmianę składu chemicznego wybranych olejków eterycznych w czasie oraz szybkość parowania acetonu. Badania biologiczne pozwoliły ocenić aktywność ekstraktów roślinnych oraz ich głównych składników w stosunku do larw i postaci imaginalnych A. diaperinus w tym: właściwości deterentne, wpływ olejków na rozwój szkodnika od stadium larwy do postaci dorosłej, wpływ olejków na strukturę jelita środkowego wpływ wyselekcjonowanych terpenów na aktywność wybranych enzymów trawiennych larw pleśniakowca lśniącego. Ustalenie efektywnych dawek olejków eterycznych wobec larw i chrząszczy pleśniakowca lśniącego 3
Badania chemiczne Materiał roślinny Olejki eteryczne izolowano z : wrotyczu pospolitego Tanacetum vulgare (astrowate: Asteroideae) bylicy piołun Artemisia absynthium (astrowate: Asteroideae) żywotnika zachodniego Thuja occidentalis (cyprysowate: Cupressaceae) tymianku pospolitego Thymus vulgaris (jasnotowate: Lamiaceae) szałwii lekarska Salvia officinalis (jasnotowate: Lamiaceae) oregano greckiego Oregano vulgare subsp. hirtum (jasnotowate: Lamiaceae) anyżu gwiaździstego Illicum verum (magnoliowate: Magnoliaceae) eukaliptusa właściwego Eucalyptus globulus (mirtowate: Myrtaceae) goździkowca korzennego Eugenia caryophyllata (mirtowate: Myrtaceae) barszczu mantegazyjskiego Heracleum mantegazzianum (selerowate: Apiaceae). Przebadano również główne komponenty olejków eterycznych. CH 3 CH 3 CH 3 OH H 3 C CH 3 CH 3 4
Analiza GC-MS Analizy jakościowe i ilościowe otrzymanych destylatów wykonane zostały przy pomocy aparatu GC-MS SATURN 2000 firmy Varian Chrompak, stosując metodę electron impact (70eV) lub jonizację chemiczną względem izobutanu. Związki identyfikowano w oparciu o widma rozpadu masowego zgromadzonych w bibliotece NIST 2009, indeksów retencji Kovaca, bazę MassFinder 4.0 oraz widm otrzymanych dla substancji wzorcowych. W celu wyznaczenia indeksów retencji Kovaca zastosowano serię nastrzyków n-alkanów od C-6 do C-28. 5
Tab 1. Zawartość procentowa (%) głównych składników olejków eterycznych Związek Główny składnik Procentowa zawartość [%] Pozostałe [%] Żywotnik zachodni α- tujon 69.8 β- tujon 9.5 Wrotycz pospolity β- tujon 61.0 kamfora 9.7 eukaliptol 3.2 Szałwia lekarska (PL) α- tujon 41.8 β- tujon 6.4 kamfora 12.5 Szałwia lekarska (H) α- tujon 17.6 β- tujon 11.1 kamfora 14.7 Bylica piołun α- tujon 12.7 β- tujon 2.8 p-cymen 2.9 Anyż gwiaździsty (E)-anetol 90.8 limonen 2.6 Goździkowiec korzenny eugenol 92.6 octan eugenolu 5.6 Tymianek pospolity tymol 76.3 karwakrol 6.5 Oregano subs. hirtum karwakrol 84.4 Eukaliptus właściwy eukaliptol 68.3 Barszcz mantegazyjski p-cymen 42.8 p-cymen 3.5 γ- terpinen 3.9 p-cymen 10.2 limonen 12.8 γ- terpinen 9.7 limonen 9.4 6
Analiza NMR Widma 1 HNMR wykonano na spektrometrach: Bruker Avance II 600 MHz (Laboratorium Badań Strukturalnych NMR Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej). Analizy wykonano w roztworach CDCl 3 dla olejków eterycznych oraz ich głównych składników. Przesunięcia chemiczne skalowano wobec sygnałów pochodzących od protonów CHCl 3 (δh = 7,26). 7
Rys. 1. Widmo 1 HNMR olejku z szałwii lekarskiej. 8
Rys. 2. Widmo 1 HNMR olejku z szałwii lekarskiej z przypisanymi syganłami głównych składników. 9
Badania biologiczne Badania nad aktywnością insektycydalną olejków eterycznych i ich komponentów wobec pleśniakowca lśniącego 1. Wpływ wybranych olejków eterycznych i ich głównych komponentów na wzrost i rozwój populacji A. diaperinus 2. Ocena właściwości deterentnych/atraktantnych 3. Histopatologia jelita środkowego 4. Aktywność enzymów trawiennych 10
Wyniki badań biologicznych 11
Wpływ wybranych olejków eterycznych i ich głównych komponentów na wzrost i rozwój populacji A. diaperinus 12
Średnia masa ciała [mg/larwę] Średnia masa ciała [mg/larwę] 20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 Kontrola Anyż gwiaździsty Goździkowiec korzenny Oregano Tymianek pospolity Anetol Eugenol Tymol Karwakrol 25,00 20,00 15,00 10,00 Kontrola Anyż gwiaździsty Goździkowiec korzenny Oregano Tymianek pospolity Anetol Eugenol Tymol Karwakrol 6,00 4,00 5,00 2,00 0,00 0 6 15 21 Dzień 0,00 0 6 15 21 Dzień Rys. 3a Rys. 3b Rys. 3. Wpływ olejków eterycznych bogatych w związki fenolowe lub ich pochodne na wzrost: a) larw 10-cio dniowych A. diaperinus b) 20-dniowych A. diaperinus 13
Tab. 3. Śmiertelność larw 10-cio i 20-dniowych pod wpływem olejków eterycznych i ich głównych komponentów 14
Parametry wzrostu A B C D E F Fot. 1. Larwy młodsze po 14-stu dniach trwania eksperymentu A- Kontrola: 20,6 mg (13mm) B- Eugenol 1%: 7,2 mg (9mm) C- Oregano 1% : 1,9 mg (6mm) D- Karwakrol 1%: 1,5 mg (6mm) E- Oregano 0,5% : 4,8 mg (8mm) F- Karwakrol 0,5 % : 4,8 mg(8mm) 15
Co było przyczyna ograniczenia wzrostu? Badania nad mechanizmami działania olejków eterycznych wobec pleśniakowca lśniącego Ocena właściwości deterentnych/atraktantnych Histopatologia jelita środkowego Aktywność enzymów trawiennych 16
Tab. 4. Ocena właściwości antyfidantnych wybranych związków R= K-E/ K+E x100 A= KK EE/ KK +EE x 100 T= A+R T 0 0 T 50 51 T 100 101 T 150 151 T 200 atraktant słaby deterent deterent średniej mocy dobry deterent bardzo dobry deterent 17
Badania histologiczne Histopatologia jelita środkowego 18
KONTROLA k m tch cm kcn śj j tp cts ctt łn 200 µm Fot.2. Przekrój poprzeczny przez larwę kontrolną A. diaperinus: k-kutikula, śj-światło jelita; j-jelito; tp-treść pokarmowa; m- mięśnie szkieletowe; ctt-ciało tłuszczowe, warstwa trzewiowa; cts-ciało tłuszczowe; warstwa ścienna; cm-cewki 19 Malphigiego; tch-tchawka; łn-łańcuszek nerwowy (x 10).
bp mok rszcz jk c t kcn śj 50µm Fot.3. Fragment przekroju poprzecznego przez jelito środkowe larwy kontrolnej A. diaperinus: śj-światło jelita; bp-błona podstawna; kcnkomórki cylindryczne nabłonka; jk-jądro komórkowe; ct-ciało tłuszczowe; rszcz-rąbek szczoteczkowy (x 40). 20
śj krople wydzielnicze Komórek nabłonkowych kcn Jądra komórkowe bp gniazda regeracyjne mp mok Fot. 4 Przekrój poprzeczny przez jelito środkowe larwy kontrolnej A. diaperinus śj- światło jelita; kcn- komórki cylindryczne nabłonka; jk-jądro komórkowe; bp- błona podstawna; mok- warstwa mięśni okrężnych; mp-mięśnie podłużne 21
k m Zniszczona struktura nabłonka Wakuolizacja i zanik ciała tłuszczowego Fot. 5. Przekrój przez ciało larwy A. diaperinus traktowanej 1% roztworem olejku z Oregano vulgare subs. hirtum. k-kutikula; m-mięśnie 22
Wpływ oregano na strukturę jelita środkowego ct Komórki nabłonkowe uległy rozpadowi śj Jądra komórkowe rozrzucone w świetle jelita Fot. 6. Fragment jelita środkowego larwy A. diaperinus traktowanej 1% roztworem olejku z Oregano vulgare subs. hirtum. śj- światło jelita; ct-ciało tłuszczowe 23
Wpływ karwakrolu na strukturę jelita środkowego Zniszczony nabłonek jelitowy, odklejony od błony podstawnej św ct m k nj bp św un mp Fot. 7. A Fot. 7. B A- przekrój przez larwę A. diaperinus traktowaną 1% roztworem karwakrolu B- fragment jelita środkowego larwy A. diaperinus traktowanej 1% roztworem karwakrolu nj- uszkodzony nabłonek jelita; m-mięśnie; k- kutikula; św- światło jelita; mp- mięśnie podłużne; ct-ciało tłuszczowe 24
Wpływ Karwakrolu+Eugenolu 1% na strukturę jelita środkowego Fot. 7 Przekrój przez larwę A. diaperinus traktowaną 1% roztworem Karwakrolu+ Eugenolu 25
Badania enzymatyczne 26
Stężenie białka [mg/ml] 0,7000 0,6000 0,5000 0,4000 * Kontrola 0,3000 0,2000 0,1000 ** - 46.1% - 31.1% Karwakrol Eugenol 0,0000 Związek Rys. 5. Stężenie białka w próbach z jelit owadów traktowanych pokarmem 27
Stężenie maltozy [µmole/ml ] 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 ** - 28.4 % * - 20.9 % Kontrola Karwakrol Eugenol 0,20 0,10 0,00 Związek Rys. 6. Stężenie α-amylazy w próbach z jelit owadów traktowanych pokarmem 28
Podsumowanie Wysoką aktywność insektycydalną wobec obu stadiów larwalnych wykazywał olejek z oregano, karwakrol oraz eugenol. Substancje te silnie hamowały wzrost, wydłużały cykl rozwojowy, powodowały zaburzenia w metamorfozie oraz wysoką śmiertelność obu stadiów larwalnych. Olejek z żywotnika zachodniego i z goździkowca korzennego oraz tymol i eukaliptol wpływały na wysoką śmiertelność wśród młodszych larw. Ocena właściwości antyfidantnych wybranych związków pokazała, że dorosłe osobniki A. diaperinus odznaczają się wyższą wrażliwością sensoryczną w porównaniu z larwami. Najwyższe wartości współczynników deterentności otrzymano dla tymolu i karwakrolu oraz olejku z oregano Olejek z oregano, karwakrol oraz eugenol powodują silne zmiany histopatologiczne w jelicie środkowym larw A. diaperinus. Uszkodzona struktura jelita środkowego uniemożliwia prawidłowe trawienie i przyswajanie pokarmu przez owady. Ekstrakty roślinne wpływają na aktywność enzymów trawiennych. Karwakrol i eugenol obniżyły aktywność α- amylazy. U owadów hodowanych na diecie zawierającej terpeny obserwowano również spadek zawartości białka w porównaniu z próbami kontrolnymi, co było przyczyną ich słabszego wzrostu. Liczebność następnej generacji owadów hodowanych na traktowanym pokarmie jest niższa w stosunku do prób kontrolnych. Najmniejszą liczbę powstałych larw obserwowano w próbach hodowanych wcześniej na pokarmie wzbogaconym olejkiem z goździkowca korzennego. Z przeprowadzonych badań wynika, iż w praktyce możliwe zastosowanie znaleźć mogą terpeny takie jak karwakrol i eugenol, a także bogaty w karwakrol, olejek z oregano. Znaczną redukcję liczebności młodszych larw można osiągnąć po zastosowaniu tymolu i eukaliptolu oraz olejku z żywotnika zachodniego i goździkowca korzennego. Związek o silnych właściwościach atraktantnych, taki jak α- tujon stosowany łącznie z insektycydem poprzez wzrost poziomu żerowania może wpłynąć na obniżenie dawek stosowanych insektycydów. 29
Projekt realizowany w ramach: Interdyscyplinarnych Studiów Doktoranckich Matematyczno-Przyrodniczch w ramach projektu pn. Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych realizowanego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki (nr projektu POKL.04.01.01-00-081/10) projektu "Krok w przyszłość - stypendia dla doktorantów" realizowanego przez Urząd Marszałkowski Województwa Kujawsko-Pomorskiego we współpracy z uczelniami wyższymi z regionu w ramach 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki 2007-2013. Kapitał Ludzki. 30
Dziękuję za uwagę 31