ZAŁĄCZNIK 2 AUTOREFERAT PRZEDSTAWIAJĄCY OPIS DOROBKU I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH Barbara Budzyńska Katedra i Zakład Farmakologii z Farmakodynamiką Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej Uniwersytet Medyczny w Lublinie Lublin 2016
SPIS TREŚCI I. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe 2 II. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych 2 III. Osiągnięcia wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 roku o 3 stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) a) tytuł osiągnięcia naukowego 3 b) autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa 3 c) omówienie celu naukowego i osiągniętych wyników 4 IV. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych 24 a) osiągnięcia naukowo-badawcze przed uzyskaniem stopnia doktora nauk 24 farmaceutycznych b) osiągnięcia naukowo-badawcze po uzyskaniu stopnia doktora nauk 26 farmaceutycznych c) współpraca z jednostkami naukowymi w kraju i za granicą 36 d) kierowanie międzynarodowymi i krajowymi projektami badawczymi oraz udział 37 w takich projektach e) międzynarodowe i krajowe nagrody oraz odznaczenia związane z działalnością 38 naukową f) recenzowanie publikacji w czasopismach międzynarodowych i krajowych 38 g) staże w zagranicznych lub krajowych ośrodkach naukowych lub akademickich 38 h) promotorstwo i opieka nad naukowymi pracami studenckimi 39 i) bibliometryczne podsumowanie osiągnięć naukowych 39 1
I. POSIADANE DYPLOMY I STOPNIE NAUKOWE 06.2002 stopień magistra farmacji, Akademia Medyczna w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej. Praca magisterska wykonana w Katedrze i Zakładzie Farmakodynamiki. Tytuł pracy Ocena wpływu nowych pochodnych imidazolowych na ośrodkowy układ nerwowy zwierząt doświadczalnych promotor: prof. dr hab. Sylwia Fidecka 2002 Prawo wykonywania zawodu farmaceuty wydane przez Lubelską Okręgową Izbę Aptekarską 04.2008 stopień doktora nauk farmaceutycznych z wyróżnieniem, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej. Praca wykonana w Katedrze i Zakładzie Farmakologii z Farmakodynamiką. Tytuł pracy Ocena mechanizmów powstawania działania nagradzającego i uzależnienia nikotynowego w zwierzęcych modelach doświadczalnych promotor: dr hab. Grażyna Biała Pozostałe posiadane dyplomy oraz świadectwa ukończenia specjalistycznych szkoleń przedstawione są w Załączniku 7, pkt. III q. II. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH od 02.10.2002-2004 pracownik inżynieryjno-techniczny w Katedrze i Zakładzie Farmakologii z Farmakodynamiką, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2004-2010 asystent w Katedrze i Zakładzie Farmakologii z Farmakodynamiką, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2010 do chwili obecnej adiunkt w Katedrze i Zakładzie Farmakologii z Farmakodynamiką, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2
III. OSIĄGNIĘCIA WYNIKAJĄCE Z ART. 16 UST. 2 USTAWY Z DN. 14 MARCA 2003 R. O STOPNIACH NAUKOWYCH I TYTULE NAUKOWYM ORAZ O STOPNIACH I TYTULE W ZAKRESIE SZTUKI (DZ.U. NR 65, POZ. 595 ZE ZM.) a) tytuł osiągnięcia naukowego Behawioralne i biochemiczne aspekty nadużywania nikotyny mechanizmy, interakcje, potencjalne strategie farmakoterapii Uzyskane osiągnięcia naukowe stanowiące podstawę habilitacji zostały przedstawione w monotematycznym cyklu sześciu prac, opublikowanych w latach 2011-2016. Łączny współczynnik oddziaływania (IF) wymienionych prac wynosi: 20.41, łączna punktacja KBN/MNiSW wynosi: 175 pkt. b) autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa M.1. Budzyńska B, Biała G. Effects of bupropion on the reinstatement of nicotineinduced conditioned place preference by drug priming in rats. Pharmacol Rep. 2011, 63 (2), 362 371 (IF=2.445; KBN/MNiSW=20) M.2. Budzyńska B, Polak P, Biała G. Effects of calcium channel antagonists on the motivational effects of nicotine and morphine in conditioned place aversion paradigm. Behav Brain Res. 2012, 228 (1), 144 150 (IF=3.327; KBN/MNiSW=30) M.3. Budzyńska B, Boguszewska-Czubara A, Kruk-Słomka M, Skalicka-Woźniak K, Michalak A, Musik I, Biała G, Głowniak K. Effects of imperatorin on nicotineinduced anxiety- and memory-related responses and oxidative stress in mice. Physiol Behav. 2013, 122, 46 55 (IF=3.033; KBN/MNiSW=30) M.4. Budzyńska B, Boguszewska-Czubara A, Kruk-Słomka M, Kurzepa J, Biała G. Mephedrone and nicotine: oxidative stress and behavioral interactions in animal models. Neurochem Res. 2015, 40(5), 1083 1093 (IF=2.593; KBN/MNiSW=20) M.5. Biała G, Pękała K, Boguszewska-Czubara A, Michalak A, Kruk-Słomka M, Budzyńska B. Behavioral and biochemical interaction between nicotine and chronic unpredictable mild stress in mice. Mol Neurobiol. 2016, 91, 1-18 (IF=5.137; KBN/MNiSW=40) 3
M.6. Budzyńska B, Skalicka-Woźniak K, Kruk-Słomka M, Wydrzyńska-Kuźma M, Biała G. In vivo modulation of the behavioral effects of nicotine by the coumarins xanthotoxin, bergapten, and umbelliferone. Psychopharmacology, 2016, 233(12), 2289-2300 (IF=3.875; KBN/MNiSW=35) Badania naukowe, opisane w wymienionych publikacjach, prowadziłam w oparciu o środki finansowe uzyskane z Uniwersytetu Medycznego w Lublinie oraz grantów Narodowego Centrum Nauki 2013/11/B/NZ7/04837 oraz 2014/13/B/NZ4/01249. C) omówienie celu naukowego i osiągniętych wyników 1. CEL NAUKOWO - BADAWCZY Cel moich badań naukowych, opisanych w pracach zgłoszonych do postępowania habilitacyjnego, koncentrował się na różnych aspektach nadużywania nikotyny, zarówno w kontekście uzależnienia, jak i wpływu czynników środowiskowych (stres) oraz interakcji z nowymi substancjami psychoaktywnymi (NPS) (mefedron) oraz na perspektywach rozwoju nowych, efektywniejszej kierunków farmakoterapii tego uzależnienia z użyciem zwierzęcych modeli doświadczalnych. Obecnie zajmuję się wieloma aspektami nadużywania substancji psychoaktywnych, tych znanych od setek lat (nikotyna, morfina), jak i tych nowych, nieprzebadanych, których skutki nadużywania nie zostały jeszcze poznane (mefedron). Obszar moich zainteresowań naukowo-badawczych, które znalazły swój wyraz w cyklu publikacji przedstawionych do postępowania habilitacyjnego, wykrystalizował się w trakcie przygotowywania rozprawy doktorskiej, kiedy badałam wapniowo-zależne mechanizmy uzależnienia nikotynowego. Już wtedy zauważyłam, jak dużym problemem jest nadużywanie nikotyny oraz jakie są rzeczywiste skutki jednoczesnego jej stosowania z innymi substancjami psychoaktywnymi. Zachęciło mnie to do współaplikowania o grant naukowy, który został pozyskany w roku 2013 (projekt NCN 2013/11/B/NZ7/04837: Behawioralna i biochemiczna ocena działania mefedronu oraz interakcji z innymi substancjami psychoaktywnymi, którego jestem głównym wykonawcą, kierownik - prof. dr hab. Grażyna Biała). Z kolei, w roku 2014 pozyskałam kolejny grant (NCN 2014/13/B/NZ4/01249: Wpływ struktury chemicznej pochodnych kumaryn na ich efekty ośrodkowe ocenianie w badaniach behawioralnych i biochemicznych ), którego jestem kierownikiem. Celem projektów jest między innymi ocena interakcji NPS z nikotyną oraz wpływ kumaryn na działanie nikotyny. 4
Przeprowadzone badania miały charakter nowatorskich i zawierają się w dwóch obszarach badań: behawioralnych i biochemicznych. Badania behawioralne: Badania behawioralne miały na celu określenie aktywności farmakologicznej nikotyny w kontekście jej działań awersyjnych, interakcji i perspektyw farmakoterapii uzależnienia od nikotyny: [1] ocena wapniowo-zależnych mechanizmów działania awersyjnego nikotyny i morfiny [M.2.] [2] interakcje nikotyny z czynnikami środowiskowymi (stres) oraz z innymi substancjami wpływającymi na aktywność ośrodkowego układu nerwowego (OUN), zarówno związków z grupy NPS, powszechnie znanych pod nazwą dopalacze (mefedron), jak i pochodzenia naturalnego z grupy furanokumaryn izolowanych w Katedrze i Zakładzie Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych UM w Lublinie (imperatoryna) [M.3., M.4., M.5., M.6.]. [3] Poszukiwanie i rozwój kierunków terapeutycznych w farmakoterapii nikotynizmu (kumaryny, bupropion) [M.1., M.3., M.6.]. Badania biochemiczne Badania biochemiczne mające na celu określenie parametrów stresu oksydacyjnego w OUN gryzoni po podaniu nikotyny, mefedronu, imperatoryny oraz u zwierząt znajdujących się pod wpływem chronicznego, przewlekłego, umiarkowanego stresu (chronic mild unpredictable stress CMUS) wykonane zostały we współpracy z Zakładem Chemii Medycznej UM w Lublinie. W całym mózgu, hipokampie i korze mózgowej myszy oznaczony został: [1] ogólny status antyoksydacyjny mózgu wyrażony całkowitym potencjałem antyoksydacyjnym TAS; [2] aktywność enzymów antyoksydacyjnych (peroksydazy glutationowej GPx, reduktazy glutationowej GR, dysmutazy ponadtlenkowej SOD); [3] stężenie antyoksydantów niskocząsteczkowych (glutationu GSH); [4] stężenie dialdehydu malonowego (MDA) głównego produktu peroksydacji lipidów. 5
WPROWADZENIE W TEMATYKĘ BADAWCZĄ Szacuje się, że palenie tytoniu jest przyczyną około 20% zgonów w krajach wysoko rozwiniętych. Z uwagi na to, że nadużywanie nikotyny jest problemem ogólnoświatowym, niosącym ze sobą ryzyko wystąpienia licznych chorób, nie tylko dotyczących dróg oddechowych, a farmakoterapia nikotynizmu jest niezadawalająca, podjęłam próbę oceny behawioralnych efektów nikotyny w zwierzęcych modelach doświadczalnych. Na wstępie chciałabym przybliżyć ogólne zagadnienia dotyczące farmakologii nikotyny i informacje, które skłoniły mnie do podjęcia w swoich badaniach tego tematu. Nikotyna Nikotyna (1-metylo-2-(β-pirydylo) -pirolidyna; Ryc. 1) jest naturalnym alkaloidem pirydynowym występującym w roślinach z rodziny Solanaceae. N N Rycina 1. Wzór strukturalny nikotyny CH 3 Wchłanianie i metabolizm nikotyny Nikotyna jest łatwo absorbowana z układu oddechowego, błony śluzowej policzków, a także skóry, co jest szczególnie istotne dla nikotynowej terapii zastępczej (NTZ). Jako słaba zasada nieznacznie wchłania się z żołądka. Nikotyna zawarta w dymie papierosowym występuje głównie w postaci zjonizowanej, niewchłanianej z błony śluzowej jamy ustnej, zaś szybkiej absorbcji ulega przede wszystkim w płucach. Wchłanianie tą drogą jest porównywalne do podania dożylnego. Z krwioobiegu nikotyna jest transportowana do wątroby, nerek, śliny i śluzówki żołądka. Po około 10-20 sekundach od wypalenia papierosa dociera do OUN [Hukkanen i wsp., 2005; Tutka i wsp., 2005b]. Około 90% zaabsorbowanej nikotyny jest metabolizowane w hepatocytach, pozostała ilość w nerkach i płucach. Kluczowa rola w metabolizmie nikotyny przypada oksydazie cytochromu P450 (CYP), której jedną z form jest enzym CYP2A6 (dawniej nazywany hydroksylazą kumarynową), uczestniczący w reakcjach: 5 - hydroksylacji, 2 -hydroksylacji i N-demetylacji nikotyny. U większości ssaków nikotyna jest metabolizowana w 70-80% do kotyniny [Murphy i wsp., 2005; Yamanaka i wsp., 6
2004]. Nikotyna i jej metabolity wydalane są przede wszystkim z moczem, w mniejszym stopniu ze śliną, potem, mlekiem matki, żółcią i kałem [Hukkanen i wsp., 2005]. Receptory nikotynowe Mechanizm działania nikotyny związany jest z jej wpływem na nikotynowe receptory cholinergiczne (nachr) (Ryc. 2) [Benowitz 1996]. Rycina 2. Ilustracja podjednostek nachr ułożonych wokół kanałów jonowych. Najliczniej w OUN występują: heteromeryczny α4β2 nachr i homomeryczne α7 nachr. Miejsca oznaczone czarnymi znakami obrazują miejsca wiązania acetylocholiny [McKay i wsp., 2007]. Umiejscowione są one głównie presynaptycznie, a ich stymulacja prowadzi do uwolnienia wielu neuroprzekaźników: dopaminy, noradrenaliny, acetylocholiny, kwasu glutaminowego i kwasu gamma aminomasłowego (GABA) [Wonnacott 1997]. Receptory nachr zbudowane są z pięciu podjednostek: α (2-7, 9, i 10), β (1-4), γ, δ i ε [Albuquerque i wsp., 2011; Papke, 2014]. Podjednostka α8 została zlokalizowana w tkankach ptasich. Dominującym w układzie mezokortykolimbicznym receptorem nachr jest receptor zawierający podjednostkę α 4β 2. Uważa się, że jest on zaangażowany w uzależnienie od nikotyny [Picciotto i wsp., 2000]. Receptory te są zlokalizowane presynaptycznie na neuronach dopaminergicznych, ich aktywacja powoduje wzrost wydzielania dopaminy, szczególnie w jądrze półleżącym (nucleus accumbens, NAC), co leży u podstaw wzmocnienia pozytywnego. Badania z wykorzystaniem zwierzęcych modeli doświadczalnych potwierdzają wspomniany mechanizm działania nagradzającego nikotyny. U myszy pozbawionych genu kodującego białko podjednostki β2 (knock-out β2) nie odnotowano wzrostu stężenia dopaminy w OUN, zaś w teście samopodawania nie zaobserwowano efektów wzmacniających. Z kolei, przywrócenie działania nagradzającego nikotyny stwierdzono po przywróceniu aktywności genu kodującego podjednostkę β2 w obszarze nakrywki brzusznej (ventral tegmental area, VTA). Podjednostka α 4 wydaje się być czynnikiem 7
decydującym o wrażliwości receptora na nikotynę [Benowitz 1998]. Z kolei uważa się, że podjednostka α 3β 4 pośredniczy we wpływie nikotyny na układ sercowo-naczyniowy, zaś homomeryczne receptory α 7 odpowiadają za udział w szybkiej transmisji synaptycznej i odgrywają rolę w procesach uczenia się [Benowitz, 1998; Rezvani i Levin 2001]. Dodatkowo badania wykazały, że podjednostka β 2 odpowiada zarówno za efekt wzmacniający, jak również za afektywne objawy nikotynowego zespołu abstynencyjnego, natomiast podtypy α 5 i α 7 odpowiadają za fizyczne (somatyczne) objawy odstawienne [Jackson i wsp., 2008, 2009]. Ponadto nachr zlokalizowane na neuronach glutaminianergicznych (α 7) mają dużą przepuszczalność dla jonów wapniowych (Ca 2+ ) i biorą udział w powstawaniu długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (long term potentiation, LTP) [Jain i wsp., 2008; Wang i wsp., 2001]. Przepuszczalność dla jonów Receptory nachr w organizmach ssaków są przepuszczalne dla kationów jednoi dwuwartościowych, które mają zdolność przenikania przez wąskie hydrofilowe kanały [Albuquerque i wsp., 2009; Dani i Bertrand, 2007]. Mimo, iż jony sodowe i potasowe stanowią większość prądu jonowego, to jony Ca 2+ wnoszą znaczący wkład w aktywność receptorów nachr, powodując ich depolaryzację, a przepuszczalność dwuwartościowego kationu odgrywa istotną rolę fizjologiczną. Jony Ca 2+ biorą też udział w procesach neuroplastyczności synaptycznej, np. LTP, zaś nikotyna poprzez receptory nachr pobudza przepływ Ca 2+ oraz aktywuje Ca +2 /kalmodulinozależną kinazę białkową II (CaMKII) i kinazę białkową C (PKC), które regulują uwalnianie neuroprzekaźników i rozwój LTP [Courtney i wsp., 1991]. Działanie nagradzające nikotyny, uzależnienie od nikotyny Nikotyna wywiera pozytywnie wzmacniające działanie, które związane jest z nasileniem uwalniania dopaminy w układzie nagrody, zaś negatywne aspekty, takie jak objawy odstawienne oraz zachowania poszukiwawcze nie pozwalają na skuteczne zerwanie z nałogiem. Światowa Organizacja Zdrowia definiuje uzależnienie, jako złożony proces zmian fizjologicznych, behawioralnych i poznawczych, w których zdobycie i stosowanie substancji lub grupy substancji staje się priorytetem dla danej osoby w stosunku do zachowań, które wcześniej miały większe znaczenie. Główną cechą uzależnienia jest kompulsywne poszukiwanie (drug-seeking) i pobieranie środka uzależniającego (drug taking). Powrót do uzależnienia może nastąpić nawet po okresie długotrwałej abstynencji i może być związany z występowaniem silnego subiektywnego głodu (craving) substancji [Hajek i wsp., 2013]. 8
Proces uzależnienia jest związany z zaburzeniami funkcji układu nagrody (Ryc. 3). Układ ten składa się VTA, dającej projekcje do NAC tworząc układ mezolimbiczny i do kory przedczołowej (PFC) tworząc drogę mezokortykalną. Poza wspomnianymi strukturami układ ten obejmuje także guzek węchowy i jądro migdałowate (amygdala). Pobudzenie VTA powoduje wzrost uwalniania dopaminy w synapsach łączących neurony VTA z NAC i dalej z PFC. Z kolei, NAC hamuje zwrotnie VTA, zapobiegając nadmiernemu pobudzeniu. Oprócz neuronów dopaminergicznych tworzących szlak mezokortykolimbiczny, rolę w rozwoju uzależnień odgrywa neuroprzekaźnictwo glutaminianergiczne, GABA-ergiczne, serotoninergiczne, endokanabinoidowe oraz układ endogennych opioidów [Fürst i wsp., 2013]. kora czołowa jądro półleżące nakrywki hipokamp obszar nakrywki brzusznej Rycina. 3. Struktury neuroanatomiczne mózgu zaangażowane w rozwój uzależnienia od substancji psychoaktywnych. Farmakoterapia uzależnienia od nikotyny Aktualna farmakoterapia uzależnienia od nikotyny jest niesatysfakcjonująca, nie spełnia oczekiwań zarówno lekarzy, jak i osób chcących zerwać z nałogiem. Szacuje się, że jedynie niewielki odsetek (1 2%) osób palących jest w stanie samodzielnie zerwać z nałogiem. Dlatego większość osób próbujących zaprzestać palenia powinno stosować farmakoterapię. Do form terapii uzależnienia od nikotyny o udowodnionej skuteczności zliczamy: 1) nikotynową terapię zastępczą (NTZ) 2) lek przeciwdepresyjny bupropion 3) częściowych agonistów receptora nikotynowego wareniklinę i cytyzynę. 9
OMÓWIENIE WYNIKÓW STANOWIĄCYCH PODSTAWĘ HABILITACJI Ocena działania awersyjnego nikotyny indukowanego podaniem mekamylaminy, rola jonów wapnia [M.2.] Analizując dane literaturowe podczas przygotowania się do obrony pracy doktorskiej stwierdziłam, że chociaż działaniu nagradzającemu i wzmacniającemu nikotyny poświęcono wiele publikacji, niewielu badaczy podejmowało próbę wyjaśnienie afektywnych aspektów odstawienia nikotyny oraz poznania mechanizmów zaangażowanych w te procesy. W doświadczeniach opisanych w pracy doktorskiej, badałam rolę jonów Ca 2+ w somatycznych objawach abstynencji nikotynowej indukowanej podaniem mekamylaminy. Chociaż somatyczne objawy odstawienne są z pewnością nieprzyjemne, zastanowiło mnie czy unikanie afektywnego komponentu odstawienia odgrywa ważną rolę w utrzymaniu uzależnienia. Ta hipoteza przyczyniła się do zainteresowania procedurami obrazującymi afektywne modele objawów odstawiennych. Dane literaturowe wskazują, że negatywne doświadczenie podczas zaprzestania stosowania substancji uzależniającej może być skojarzone z wcześniej neutralnym bodźcem, i że te warunkowane bodźce nabierają właściwości awersyjnych [Guillem i wsp., 2008]. Postanowiłam, więc zmodyfikować ustaloną w Katedrze i Zakładzie Farmakologii z Farmakodynamiką procedurę warunkowanej nikotyną preferencji miejsca (conditioned palce preference, CPP), w której oceniano działanie nagradzające nikotyny (Załącznik 7, IIa.1). Do badania CPP wykorzystany został aparat podzielony na trzy pomieszczenia: dwa duże pomieszczenia jedno pomalowane na biało, drugie na czarno oddzielone gilotynowymi drzwiami od małego, środkowego pomieszczenia koloru szarego. Przeprowadzana procedura jest prostą, nieinwazyjną metodą opartą na klasycznym warunkowaniu pawłowowskim. Substancja uzależniająca, która posiada właściwości wzmacniające stanowi bodziec bezwarunkowy. Jej podanie skojarzone z określonym otoczeniem sprawia, że to otoczenie przejmuje właściwości wzmacniające stając się bodźcem warunkowym. W teście CPP wykazano, że substancje o potencjale uzależniającym powodują preferencję miejsca początkowo niepreferowanego, a następnie skojarzonego z ich podawaniem [Tzschentke, 2007]. W teście CPP iniekcja nikotyny kojarzona była z pierwotnie niepreferowaną, białą częścią aparatu, a w czasie testu, szczury mając wolny wybór wybierały tą część aparatu. Celem badawczym w omawianej pracy była ocena awersyjnego działania obserwowanego podczas nikotynowego i morfinowego zespołu abstynencyjnego 10
indukowanego podaniem mekamylaminy lub naloksonu. W tym celu wdrożono procedurę warunkowanej awersji miejsca (conditioned place aversion, CPA), w której wykorzystano powtarzające się łączenie odrębnych sygnałów środowiskowych z niepożądanymi efektami związanymi z odstawieniem substancji psychoaktywnych. W przeprowadzonych doświadczeniach szczurom, które przewlekle otrzymywały iniekcje nikotyny (1,168 mg/kg, 11 dni, trzy razy dziennie), podano antagonistę receptorów nachr mekamylaminę (3,5 mg/kg) i umieszczano je w pierwotnie preferowanej (czarnej) części aparatu w trakcie warunkowania. W niniejszej pracy udowodniono, że mekamylamina wywołuje znaczącą awersję miejsca w teście CPA u szczurów uzależnionych od nikotyny. Postanowiono także przebadać aspekt awersyjny zespołu odstawiennego od opioidów. W tym celu szczurom, które przewlekle otrzymywały iniekcje morfiny (10 mg/kg, 11 dni, dwa razy dziennie) podawano antagonistę receptorów opioidowych nalokson (1 mg/kg). Wykazano, iż nalokson, wywołuje znaczną awersję miejsca u szczurów otrzymujących przewlekle morfinę. Kolejnym moim celem badawczym była ocena roli jonów Ca +2 w efektach awersyjnych nikotyny, a także morfiny. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że jony Ca +2 zaangażowane są w działanie nagradzające, wzmacniające nikotyny oraz somatyczne objawy abstynencyjne po jej odstawieniu (Załącznik 7, IIa.1,2,7,8). Wpływ związków blokujących kanały wapniowe, należących do grupy antagonistów kanałów wapniowych, na efekty działania nikotyny wynika ze ścisłych interakcji pomiędzy receptorami nachr, a napięciowo-zależnymi kanałami wapniowymi. Napięciowozależne kanały wapniowe zaangażowane są w różne formy plastyczności synaptycznej, w tym LTP i długotrwałe osłabienie synaptyczne (long term depression, LTD) [Kapur i wsp., 1998; Wickens i Abraham 1991], a przepływ jonów Ca 2+ odgrywa ważną rolę w efektach behawioralnych i neurochemicznych indukowanych podaniem substancji o potencjale uzależniającym [Haller i wsp., 2008; Karler i wsp., 1991]. W omawianych badaniach udało się po raz pierwszy wykazać zależność homeostazy jonów Ca +2 i działania awersyjnego morfiny, gdyż wszystkie zastosowane związki z grupy antagonistów kanałów wapniowych powodowały osłabienie warunkowanej awersji miejsca indukowanej naloksonem. Natomiast u szczurów otrzymujących przewlekłe iniekcje nikotyny, a podczas warunkowania mekamylaminę, flunaryzyna, związek o dużej lipofilności, najwyraźniej osłabiła obserwowaną awersję. Wyniki pracy opublikowane zostały w prestiżowym czasopiśmie Behavioral Brain Research [M.2.]. 11
Wpływ nikotyny na procesy pamięciowe i emocjonalne indukowane chronicznym, łagodnym, nieprzewidywalnym stresem u myszy [M.5.] Kolejnym interesującym mnie zagadnieniem były interakcje pomiędzy stresem a nikotyną. Uczestnicząc w badaniach dotyczących wpływu nikotyny na procesy pamięciowe i emocjonalne w zwierzęcych modelach doświadczalnych zastanowiło mnie, w jaki sposób wpływa ona na organizmy poddane przewlekłemu stresowi, łagodzi czy też nasila objawy indukowane stresem. W sytuacjach stresowych niektórzy ludzie, w celu zmniejszenia napięcia sięgają po używki, takie jak papierosy czy alkohol. Dlatego podjęte przeze mnie badania dotyczyły zagadnienia związanego ze zmianami behawioralnymi i procesami stresu oksydacyjnego indukowanymi CMUS u myszy oraz interakcjami pomiędzy stresem oraz nikotyną w zwierzęcych modelach doświadczalnych. Nie do końca poznany i spójny jest związek przyczynowo-skutkowy pomiędzy stresem a efektami działania nikotyny. Wiadomo, że stres może wywoływać behawioralne i metaboliczne zmiany w organizmie skutkujące chorobami somatycznymi i umysłowymi. W odpowiedź organizmu na bodziec stresowy zaangażowane są przede wszystkim układ współczulny i oś podwzgórze-przysadka-nadnercza (PPN). Stres zaburza także przekaźnictwo amin katecholowych, opioidowe oraz serotoninergiczne [Hellriegel i D Mello, 1997; Yamauchi i wsp., 1997]. Natomiast cholinergiczne zmiany indukowane stresem nie zostały dokładnie przebadane. W celu oceny czy stres i nikotyna mogą modyfikować wzajemny wpływ na zachowania lękowe, depresyjne i procesy kognitywne ustalona została procedura CMUS u gryzoni. Stwierdzono, że stosowanie łagodnych czynników stresujących, takich jak: wilgotna ściółka lub jej brak, przechylenie klatki o 45 stopni, ograniczenie wody lub pokarmu, sygnał dźwiękowy (90dB) przez 4 tygodnie, 2 godziny dziennie indukuje zachowania lękowe oceniane w teście podniesionego labiryntu krzyżowego (elevated plus-maze test, EPM), efekty prodepresyjne w teście wymuszonego pływania (forced swimming test, FST) oraz zaburzenia pamięci w teście biernego unikania (passive avoidance, PA). Działanie nikotyny w tych testach zostało wcześniej przebadane przez nasz zespół i jej dawki oraz schemat podawania były ustalone (Załącznik 7, IIa.5, 11, 15). Do oceny zachowań lękowych wybrany został powszechnie używany w farmakologii doświadczalnej test EPM. Aparat składa się z dwóch ramion otwartych i dwóch zamkniętych. Test wykorzystuje naturalne bodźce: strach przed nową, otwartą przestrzenią oraz obawa przed poruszaniem się na stosunkowo wąskiej i podwyższonej powierzchni otwartego ramienia aparatu. W ciągu 5 pierwszych minut testu obserwowane są wyraźne zmiany w zachowaniu gryzoni, dlatego właśnie tyle wynosi czas badania. Działanie anksjolityczne badanej substancji charakteryzuje się zwiększoną 12
liczbą wejść oraz wydłużeniem czasu spędzonego w otwartych ramionach labiryntu. Z kolei, działanie anksjogenne definiowane jest zmniejszeniem tych wartości. Mierząc ilość wejść myszy do zamkniętych ramion lub ogólną ilość wejść do wszystkich ramion labiryntu można ocenić wpływ leków na aktywność lokomotoryczną gryzoni [Lister, 1987]. Do oceny procesów kognitywnych wybrano test PA, będący jednym z najczęściej używanych zwierzęcych modeli pamięci i uczenia się. Aparat, wyposażony w podłogę z metalowych prętów przewodzących prąd elektryczny, składa się z dwóch pomieszczeń, jasnego i zaciemnionego, oddzielonych gilotynowymi drzwiami. W doświadczeniu dwukrotnie mierzony był czas przejścia myszy z jasnego do ciemnego pomieszczenia aparatu. Pierwszy pomiar następował po iniekcji substancji (pomiar akwizycji procesów pamięciowych) lub bezpośrednio przed iniekcją (ocena procesów konsolidacji pamięci). Kolejny pomiar następował po upływie 24 h od odpowiedniej iniekcji. Zastosowanie tego testu daje możliwość rzetelnej oceny funkcjonowania pamięci długotrwałej oraz wpływu na pamięć substancji o właściwościach prokognitywnych lub związków o potencjale amnestycznym [Allami i wsp., 2011; Javadi-Paydar i wsp., 2012]. Z kolei, zachowania depresyjne oceniane były w teście FST. Procedura polegała na umieszczeniu myszy w cylindrycznym naczyniu wypełnionym wodą i obserwacji zachowań związanych z próbami wydostania się z niego. Początkowo zwierzę podejmuje aktywne próby ucieczki, a następnie przyjmuje bierną postawę bezruchu (immobility), polegającą na wykonywaniu jedynie ruchów, umożliwiających utrzymanie głowy gryzonia nad powierzchnią wody. Substancje działające przeciwdepresyjnie wydłużają czas wzmożonej aktywności zwierzęcia [Porsolt i wsp., 1977]. W omawianych doświadczeniach zaobserwowano, że nikotyna podana jednorazowo w dawce 0,2 mg/kg oraz chronicznie (14 dni), w dawce 0,1 mg/kg, wykazywała efekt przeciwdepresyjny oraz osłabiała efekty depresyjne indukowane CMUS u myszy. Nikotyna podawana zarówno jednorazowo (0,5 mg/kg), jak i chronicznie (0,1 mg/kg) nie wpływała na zachowania lękowe, natomiast w połączeniu z CMUS wydłużyła czas przebywania w ramionach otwartych labiryntu i zwiększyła ilość wejść na te ramiona, co wskazuje na łagodzenie lęku indukowanego zastosowaniem procedury CMUS. Jednorazowe podanie nikotyny (0,5 mg/kg) poprawiło procesy uczenia się i pamięci, natomiast jej chroniczne podanie (0,05 mg/kg) nie wpływało na obserwowane procesy. Zaobserwowano również, że zaburzenia pamięci indukowane stresem są łagodzone zarówno podaniem nikotyny jednorazowo, jak i jej przewlekłymi iniekcjami. W badaniach zastosowano również metyrapon (50 mg/kg), inhibitor syntezy kortyzolu 13
i kortykosteronu, który osłabił zachowania depresyjne indukowane przewlekłym stresem, co sugeruje wpływ glikokortykosteroidów i osi PPN na indukowaną stresem anhedonię. Aktywacja układu PPN oraz wzrost stężenia hormonów stresu w osoczu pobudza także procesy stresu oksydacyjnego i związaną z nim nadprodukcję reaktywnych form tlenu (RFT). RFT powodują uszkodzenie błon komórkowych, zaburzenia w strukturze i funkcji białek enzymatycznych i nieenzymatycznych, a także zaburzenia w budowie DNA. Nie tylko nadmierne wytwarzanie wolnych rodników, ale także zmniejszenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych mogą być przyczyną stresu oksydacyjnego [Faria i wsp., 2014]. Tkanka mózgowa, wykorzystująca 20% tlenu dostarczonego do organizmu, jest szczególnie wrażliwa na działanie RFT, ze względu na dużą zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych. Zachodzi w niej także intensywny metabolizm tlenowy przy stosunkowo małej aktywności enzymów antyoksydacyjnych. Kortyzol podnosi ciśnienie tętnicze oraz przyspiesza pracę serca, w związku z tym zwiększa dostawę tlenu, substratu do produkcji RFT do tkanek, także do OUN. Hormon ten zaburza także transport elektronów w łańcuchu oddechowym, przyczyniając się to powstawania RFT [Che i wsp., 2015]. Organizm ludzki posiada mechanizmy obronne zabezpieczające przed wolnymi rodnikami. Zaliczamy do nich układ enzymatyczny, który składa się z enzymów (CAT, SOD, GPx) katalizujących reakcje neutralizacji RFT oraz układ nieenzymatyczny (m.in. glutation, bilirubina, kwas moczowy, melatonina), czyli antyoksydanty niskocząsteczkowe, które reagując bezpośrednio z RFT pozbawiają je rodnikowego charakteru [Moniczewski i wsp., 2015]. Wspomniane informacje skłoniły nas do oceny, jaki wpływ ma sam stres, nikotyna oraz ich połączenie na parametry stresu oksydacyjnego. Dlatego też, przebadano wpływ CMUS na ogólny status antyoksydacyjny mózgu wyrażony TAS; aktywnościami enzymów antyoksydacyjnych (GPx, SOD) oraz MDA głównego produktu peroksydacji lipidów, w całym mózgu, hipokampie, korze mózgowej i móżdżku myszy. Potwierdzono pro-oksydacyjny wpływ CMUS, co pozostaje w zgodzie z danymi literaturowymi [Rinwa i Kumar, 2012]. Uzyskane wyniki wykazały obniżenie wartości TAS u stresowanych myszy, zmniejszenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych SOD i GPx, jak również wzrost stężenia MDA. Wykazano, że nikotyna wywołuje stres oksydacyjny w mózgu zwierząt doświadczalnych ex vivo, co jest również zgodne z wcześniejszymi doniesieniami [Newman i wsp., 2002]. Zaobserwowano również znaczące zwiększenie stężenia MDA, obniżenie TAS oraz zmniejszenia stężenia enzymów antyoksydacyjnych (SOD i GPx) po podaniu nikotyny we wszystkich badanych strukturach mózgu i w całej tkance mózgowej. Dodatkowo, prezentowane badania potwierdziły dalsze zwiększenie parametrów stresu oksydacyjnego po ostrym oraz chronicznym podawaniu nikotyny myszom poddanym 14
procedurze CMUS. Przeprowadzone badania pozwoliły ustalić interakcje pomiędzy nikotyną a stresem zarówno na poziomie behawioralnym, jak i biochemicznym i są pierwszymi tak kompleksowymi badaniami dotyczącymi tego zagadnienia. Publikacja [M.5.] to przykład współpracy interdyscyplinarnej między farmakologami i biochemikami. Połączenie wyników uzyskanych w badaniach behawioralnych i biochemicznych daje pełniejszy obraz zależności stres-nikotyna. Ocena interakcji behawioralnych i biochemicznych pomiędzy nikotyną a mefedronem [M.4.] Substancje psychoaktywne często są łączone przez osoby uzależnione. Wiadomo, że alkoholicy częściej palą papierosy niż osoby nieuzależnione od etanolu, zaś palacze częściej sięgają po substancje pochodzące z konopi indyjskich (marihuana, haszysz). Wiele doniesień badawczych dotyczy ewaluacji interakcji pomiędzy nikotyną a znanymi, nadużywanymi od lat i dobrze przebadanymi substancjami psychoaktywnymi, takimi jak morfina, kannabinoidy czy metylenodioksymetamferamina (MDMA). W doświadczeniach opisanych w mojej pracy doktorskiej oraz publikowanych w kolejnych latach również przebadałam interakcje nikotyny, m.in. z morfiną, ligandem receptorów kannabinoidowych oraz etanolem (Załącznik 7, IIa. 1,2,5,6,8,9,11,12). Natomiast zauważyłam, że brakuje badań dotyczących łącznego stosowania nikotyny i związków klasyfikowanych, jako NPS, powszechnie znanych pod nazwą dopalacze. Mefedron, zaliczany do NPS jest półsyntetycznym związkiem należącym do pochodnych katynonu. Podobnie jak metamfetamina hamuje wychwyt serotoniny i dopaminy oraz wykazuje powinowactwo do transporterów obu neuroprzekaźników i receptorów błonowych (5-HT 2 i D 2) [Schifano i wsp., 2010; Vardakou i wsp., 2010]. Dodatkowo wykazano, że podanie mefedronu zwiększa zewnątrzkomórkowe stężenie serotoniny i dopaminy w NAC, a efekt jest wyraźniejszy w odniesieniu do serotoniny. Mefedron, przez długi czas, był łatwo dostępny w sprzedaży zarówno internetowej oraz w niektórych sklepach, tzw. smart shops. W Polsce został zdelegalizowany 25 sierpnia 2010 r., co niestety tylko nieznacznie ograniczyło jego sprzedaż, która przeniosła się, m.in. do internetu. Jak donoszą dane epidemiologiczne, mefedron jest jednym z najczęściej używanych narkotyków, tak jak marihuana, kokaina czy MDMA [Winstock i wsp., 2011]. Podobnie jak większość innych NPS, jest często stosowany w połączeniu z różnymi substancjami psychoaktywnymi, w tym nikotyną, MDMA, marihuaną, amfetaminą, kokainą czy kofeiną. Mimo, iż nadużywanie dopalaczy, szczególnie przez młodzież jest bardzo powszechne, to zrozumieniu skutków ich stosowania, mechanizmom działania oraz interakcjom nie poświęcano w badaniach zbyt wiele uwagi. 15
Literatura dotycząca tego tematu jest raczej uboga, chociaż problem wydaje się być istotny. Lekarze pracujący na oddziałach toksykologicznych zaznaczają wciąż brak cennych, naukowych doniesień dotyczących działania mefedronu czy zatruć mieszanych. Informacje te skłoniły mnie do współaplikowania o grant NCN (który uzyskano w 2013 roku i którego jestem głównym wykonawcą) i podjęcia prób poznania interakcji i neurotoksyczności tych związków. Prowadzone przeze mnie badania wykazały anksjogenne działanie mefedronu w dawkach 0,25 mg/kg oraz 0,1 mg/kg. Wykazano również, że łączne podanie mefedronu (0,05 mg/kg) oraz nikotyny (0,05 mg/kg) w dawkach niedziałających wywołało efekt anksjogenny, wskazując na działanie synergistyczne badanych substancji na procesy lękowe. Kolejnym celem mojej pracy była ocena łącznego wpływu mefedronu i nikotyny na procesy kognitywne. Wykazano, że dawka 5 mg/kg mefedronu poprawia procesy konsolidacji pamięci. W prezentowanych badaniach działanie prokognitywne na etapie konsolidacji wykazano również po łącznym podaniu nikotyny (0,05 mg/kg) oraz mefedronu (2,5 mg/kg) w dawkach niewykazujących wpływu na procesy pamięciowe. Wskazuje to na synergizm działania badanych substancji. Badane, pod kątem stresu oksydacyjnego, struktury mózgu odpowiedzialne za procesy pamięciowe: hipokamp i kora przedczołowa są bardzo podatne na uszkodzenia oksydacyjne. Prezentowane badania wykazały, że mefedron podawany w wyższych dawkach (2,5 i 5 mg/kg), nikotyna (0,05 mg/kg), a także jednoczesne podawanie mefedronu i nikotyny indukuje procesy stresu oksydacyjnego, obserwowane, jako wzrost stężenia MDA oraz spadek wartości TAS i aktywności CAT w obu strukturach. Uzyskane wyniki sugerowałyby upośledzenie procesów pamięciowych. Jednakże, można przypuszczać, że indukowane jednorazowym podaniem mefedronu procesy stresu oksydacyjnego nie są długotrwałe, biorąc pod uwagę silne mechanizmy obronne organizmów zdrowych zwierząt doświadczalnych. Prawidłowo funkcjonujący układ przeciwutleniaczy przeciwdziała długotrwałemu utrzymywaniu się zaburzeń, a obserwowana poprawa procesów pamięciowych po podaniu samego mefedronu i w połączeniu z nikotyną wynika raczej z wpływu tych związków na układy neuroprzekaźnikowe w OUN. Próby zrozumienia podstawowych mechanizmów adaptacyjnych odpowiedzi komórek na indukowane mefedronem i nikotyną procesy stresu oksydacyjnego zapewnią nowy wgląd w rozwój neuroprotekcyjnego leczenia wśród osób zażywających substancje psychoaktywne. Sensytyzacja behawioralna dotyczy nasilenia aktywności nikotyny, ale również innych związków psychoaktywnych po ich wielokrotnym, przerywanym podawaniu. Powtarzane, co 48 godzin iniekcje nikotyny indukują nasilenie aktywności 16
lokomotorycznej u gryzoni, co sugeruje występowanie zjawisk neuroplastyczności synaptycznej [Vanderschuren i Kalivas, 2000]. W omawianych doświadczeniach potwierdziłam, iż powtarzalne iniekcje nikotyny w dawce 0,5 mg/kg sukcesywnie nasilają aktywność lokomotoryczną gryzoni. Wyraźne nasilenie tego efektu obserwujemy po podaniu ostatniej iniekcji (tzw. dawka challenge) po 7-dniowej przerwie (Załącznik 7, IIa.1,2,12,16). Świadczy to o rozwinięciu się sensytyzacji na ten efekt. W prezentowanych badaniach po raz pierwszy wykazałam, że istotny wzrost ruchliwości nastąpił u myszy z rozwiniętą sensytyzacją lokomotoryczną na nikotynę po podaniu ostatniego dnia doświadczenia mefedronu w dawce (1 mg/kg). W dawce tej mefedron po jednorazowym podaniu nie wpływa na aktywność lokomotoryczną gryzoni. Obserwowany efekt może wynikać z nasilenia przekaźnictwa dopaminergicznego w układzie nagrody przez oba związki i sugeruje istnienie sensytyzacji krzyżowej między badanymi substancjami. Uzyskane wyniki wzbogacają wiedzę dotyczącą działania mefedronu oraz jego interakcji z innymi substancjami psychoaktywnymi. Te pionierskie wyniki badań opublikowane zostały w roku 2015 na łamach czasopisma Neurochemical Research [M.4.] Ocena aktywność bupropionu w zapobieganiu nawrotom uzależnienia nikotynowego [M.1] Bupropion jest atypowym lekiem przeciwdepresyjnym, który obecnie jest uznany za najskuteczniejszy lek pierwszego rzutu w terapii nikotynizmu [Arias i wsp., 2014]. Skuteczność kliniczna bupropionu wynika z hamowania wychwytu zwrotnego neuroprzekaźników, takich jak noradrenalina oraz dopamina i tym samym działania stymulującego na OUN, oraz blokowania receptorów nachr [Nomikos i wsp., 1989; Slemmer i wsp., 2000]. Oprócz bardzo dobrze udokumentowanej aktywności przeciwdepresyjnej bupropionu [Dwoskin i wsp., 2006], lek ten wykazuje szeroki zakres efektów, takich jak: hipotermia [Dhir i wsp., 2007], jadłowstręt [Zarrindast i wsp., 1988], aktywność drgawkotwórczą [Tutka i wsp., 2005a] oraz poprawia procesy uczenia się i pamięci [Barros i wsp., 2002]. Bupropion zmniejsza działanie nagradzające nie tylko nikotyny, ale także innych substancji psychoaktywnych: metamfetaminy u ludzi, oraz kokainy i morfiny u gryzoni [praca przeglądowa Arias i wsp., 2014]. Potwierdzone jest jego działanie redukujące głód nikotynowy i łagodzące objawy zespołu abstynencji po zaprzestaniu palenia. Jednakże w literaturze brakowało informacji, czy bupropion również hamuje procesy powrotu do nałogu nawet po długotrwałej abstynencji. Zjawisko nawrotu do nałogu jest bardzo istotnym problemem w rozważnym w aspekcie trudności 17
ze skutecznym zaprzestaniem nadużywania substancji psychoaktywnych. Odczuwanie silnego pragnienia przyjęcia substancji uzależniającej (drug-craving) utrzymuje się nawet przez lata od ostatniego kontaktu z nią. W badaniach zarówno przed, jak i po obronie mojej pracy doktorskiej potwierdzone zostało działanie nagradzające nikotyny teście CPP. Wykazano również, że jednorazowa iniekcja nie tylko nikotyny, ale i innych substancji psychoaktywnych (morfina, etanol, agonista receptorów kannabinoidowych) powoduje nasilenie zachowań poszukiwawczych nawet po wygaszeniu CPP (Załącznik 7, IIa. 7,8,9,10,12). W omawianej pracy wykazano, że wytworzona nikotynowa preferencja miejsca uległa krótkotrwałemu wygaszeniu w wyniku powtarzanych testów bez iniekcji substancji, a nikotynową preferencję miejsca przywróciła pojedyncza iniekcja nikotyny (0,175 mg/kg, wolna zasada) oraz morfiny (10 mg/kg). W prezentowanych doświadczeniach wykazano, że podanie bupropionu w dawkach 10 i 20 mg/kg przed iniekcjami wyzwalającymi nikotyny wyraźnie osłabiało przywrócenie nikotynowej preferencji, z kolei podanie badanego związku w dawkach 5 i 10 mg/kg osłabiło przywrócenie nikotynowej preferencji indukowane wyzwalającą dawką morfiny. Badania dostarczają cennych informacji dotyczących profilu farmakologicznego bupropionu i mogą sugerować ze związek ten może być skutecznym lekiem nie tylko w łagodzeniu objawów abstynencyjnych po zaprzestaniu palenia, ale także wykazuje skuteczność w hamowaniu nawrotów do nałogu po okresie abstynencji. Ocena wpływu kumaryn na efekty behawioralne indukowane podaniem nikotyny w zwierzęcych modelach doświadczalnych [M.3.; M.6.] Zauważając znaczącą rolę naturalnych produktów w terapii schorzeń OUN podjęłam próbę oceny wpływu furanokumaryn na efekty działania nikotyny, z rozważeniem ewentualnego zastosowania furanokumaryn w terapii uzależnienia od nikotyny. Furanokumaryny, ze względu na swoją wielokierunkową aktywność farmakologiczną, stanowią grupę związków pochodzenia naturalnego interesującą naukowców. Zaliczana do nich imperatoryna, bergapten i ksantotoksyna, izolowane z roślin z rodziny Apiaceae, wykazują działanie fotouczulające, przez co najszersze zastosowanie znalazły, w leczeniu bielactwa i łuszczycy. Dane literaturowe donoszą, iż związki te, poprzez hamowanie aktywności acetylocholinesterazy, korzystnie wpływają na procesy pamięciowe. Wykazują również aktywność w stosunku do receptora GABAergicznego typu A oraz są inhibitorami monoaminooksydazy (MAO). Wykazano również, 18
że furanokumaryny są inhibitorami ludzkiego CYP2A6 i mysiego CYP2A5, głównych enzymów biorących udział w metabolizmie nikotyny. Badania rozpoczęłam od przebadania interakcji pomiędzy nikotyną a imperatoryną. Imperatoryna jest jedną z aktywnych biologicznie furanokumaryn izolowanych z korzenia Angelica dahurica i owoców Angelica archangelica L. (Arcydzięgiel litwor) (Apiaceae/Umbelliferae Selerowate/Baldaszkowate). We wcześniejszych badaniach wykazałam, że imperatoryna działała przeciwlękowo u myszy w teście EPM oraz poprawia procesy kognitywne w testach PA i zmodyfikowanego EPM (modified EPM, mepm) (Załącznik 7, IIa.15, 19). Imperatoryna jest częściowym agonistą receptorów GABA-A [Bergendorff i wsp., 1997]. Dodatkowo, jej działanie związane jest z pobudzeniem przekaźnictwa GABAergicznego w wyniku nieodwracalnego hamowania transaminazy GABA i zwiększenia poziomu tego neuroprzekaźnika w OUN [Choi i wsp., 2005]. Ta furanokumaryna jest także inhibitorem acetylocholinesterazy zwiększając tym samym poziom acetylocholiny, neuroprzekaźnika zaangażowanego w procesy kognitywne w OUN. Te informacje przyczyniły się do zaplanowania badań dotyczących wpływu omawianej kumaryny na zachowania lękowe, procesy pamięciowe oraz oceny wpływu na wspomniane efekty indukowane nikotyną. Dawki nikotyny wybrane zostały w oparciu o wcześniejsze publikacje (Załącznik 7, IIa.5,11,14,). W badaniach wykazano, że imperatoryna podana w dawkach 10 i 20 mg/kg hamuje anksjogenne działanie nikotyny obserwowane, jako wydłużenie czasu spędzonego przez myszy w otwartych ramionach labiryntu, jak i procentu wejść do tych ramion. Wykazano także, że jednorazowe, łączne podanie obu związków w niedziałających dawkach: nikotyny (0,05 mg/kg) i imperatoryny (1 mg/kg) powoduje istotną statystycznie poprawę procesów pamięci w fazie akwizycji, pozostając bez wpływu na fazę konsolidacji. Z kolei, subchroniczne podanie imperatoryny (1 mg/kg, 6 dni, 2 razy dziennie) poprawia procesy kognitywne (zarówno akwizycję, jak i konsolidację) indukowane podaniem nikotyny w dniu testu. Wyniki omawianych badań potwierdzają również, że nikotyna indukuje procesy stresu oksydacyjnego w strukturach mózgu odpowiedzialnych za uczenie się i procesy pamięciowe. Z kolei, imperatoryna wykazała właściwości antyoksydacyjne. Badana furanokumaryna podawana łącznie z nikotyną hamowała proces peroksydacji lipidów (obniżenie stężenia MDA) i nadprodukcję RFT (zwiększenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych SOD, GPx i GR). Podsumowując, w prezentowanych doświadczeniach wykazałam wpływ jednorazowego oraz przewlekłego podania imperatoryny na zachowania lękowe, 19
procesy pamięciowe oraz parametry stresu oksydacyjnego indukowane podaniem nikotyny. Uzyskane wyniki mogą przyczynić się do rozwoju nowych kierunków terapii chorób przebiegających z podwyższonym poziomem lęku, zaburzeń lękowych wywołanych stosowaniem nikotyny oraz upośledzeniem procesów pamięciowych. Przedstawione wyniki są pierwszymi, prezentującymi behawioralne i biochemiczne zależności pomiędzy imperatoryną i nikotyną [M.3.] Moje kolejne badania miały na celu ocenę, czy trzy kumaryny (ksantotoksyna, bergapten i umbeliferon) modulują procesy pamięciowe i emocjonalne indukowane podaniem nikotyny u myszy. Badałam czy indukowane podaniem kumaryn zahamowanie metabolizmu nikotyny przedłuży jej działanie w testach behawioralnych. Jak wcześniej wspomniałam, metabolizm nikotyny przebiega głównie przy udziale aminooksygenazy CYP2A6 cytochromu P-450 [Hukkanen i wsp., 2005]. Dane literaturowe donoszą, że furanokumaryny hamują aktywność ludzkiego cytochromu CYP2A6 i CYP2A13. Udowodniono również, że ksantotoksyna hamuje aktywność cytochromu CYP2A5 u myszyi CYP2A3 u szczurów. Szacuje się, że ponad 80% obu enzymów jest zgodne z sekwencją aminokwasową ludzkiego CYP2A6. Może to sugerować zastosowanie inhibitorów CYP2A6, jako środków wykorzystywanych do leczenia uzależnienia od nikotyny [Visoni i wsp., 2008]. Dodatkowo, wykazano, że gen CYP2A6 jest polimorficzny, więc sugeruje się, że hamowanie enzymu nie będzie miało negatywnych skutków. Ponadto, niewiele leków jest metabolizowanych przez CYP2A6 i ryzyko istotnych interakcje wydaje się być mało prawdopodobne. Wcześniejsze badania wykazały, że nikotyna w dawce 0,5 i 0,1 mg/kg poprawia procesy akwizycji i konsolidacji pamięci mierzone 24 godzin po podaniu związku w teście PA (Załącznik 7, IIa.14). Co więcej, ten alkaloid, wykazuje aktywność przeciwdepresyjną w dawce 0,2 mg/kg w teście FST. Badania wykazały również, że ksantotoksyna (15 mg/kg), bergapten (25 mg/kg) i umbeliferon (25 mg/kg), wykazują działanie prokognitywne w teście PA, zaś nie wpływają na czas bezruchu w teście FST. Efekty zarówno nikotyny, jaki kumaryn wygaszone zostały 48 godzin po iniekcjach związków. Uzyskane w omawianych doświadczeniach wyniki sugerują, że kumaryny zwalniają metabolizm nikotyny i tym samym powodują utrzymanie jej efektów behawioralnych, gdyż działanie przeciwdepresyjne i prokognitywne zaobserwowane było 48 godzin po łącznym podaniu związków. Może to sugerować zastosowanie inhibitorów enzymu CYP2A6 w farmakoterapii nikotynizmu w połączeniu z NTZ, ponieważ wiadomo, że chociaż postaci transdermalne zapewniają ciągłe dozowanie nikotyny nawet przez 24 godziny to w przypadku gum do żucia, inhalatorów czy pastylek do ssania problematyczną kwestią może być dla pacjenta stosowanie preparatów kilka razy 20
dziennie, w celu utrzymania odpowiedniego poziomu nikotyny i łagodzenia objawów abstynencyjnych. Badania te opublikowane zostały w 2016 roku w prestiżowym czasopiśmie Psychopharmacology. 2. PODSUMOWANIE Monotematyczny cykl publikacji przedstawiony, jako osiągnięcie naukowe do postępowania habilitacyjnego dotyczy różnych efektów nadużywania nikotyny w zwierzęcych modelach doświadczalnych. Powyżej przedstawione interdyscyplinarne badania dotyczące aktywności farmakologicznej nikotyny, mechanizmów jej działania awersyjnego, interakcji ze stresem, NPS, związkami pochodzenia naturalnego oraz farmakoterapii uzależnienia od nikotyny wykonane zostały we współpracy z Katedrą i Zakładem Farmakognozji UM w Lublinie oraz Katedrą i Zakładem Chemii Medycznej UM w Lublinie. Wyniki badań przedstawionych w pracach składających się na niniejszy cykl można ująć w następujących punktach: M.1. Budzyńska B, Biała G. Effects of bupropion on the reinstatement of nicotineinduced conditioned place preference by drug priming in rats. Pharmacol Rep. 2011, 63 (2), 362-371 nikotyna i morfina, przywracają wygaszoną nikotynową preferencję miejsca; bupropion podany przed przywracającymi iniekcjami nikotyny i morfiny wyraźnie osłabiał przywrócenie nikotynowej preferencji; uzyskane wyniki wskazują, że bupropion może być skutecznym lekiem w hamowaniu nawrotów do nałogu po okresie abstynencji. M.2. Budzyńska B, Polak P, Biała G. Effects of calcium channel antagonists on the motivational effects of nicotine and morphine in conditioned place aversion paradigm. Behav Brain Res. 2012, 228 (1), 144 150 mekamylamina indukuje awersję miejsca u szczurów otrzymujących przewlekle iniekcje nikotyny, zaś nalokson u szczurów otrzymujących przewlekle iniekcje morfiny w teście CPA; związki z grupy antagonistów kanałów wapniowych (nimodypina, flunaryzyna, werapamil) hamują awersję miejsca u szczurów otrzymujących przewlekle iniekcje nikotyny i morfiny; 21
uzyskane wyniki sugerują rolę jonów Ca +2 w działaniu awersyjnym nikotyny i morfiny. M.3. Budzyńska B, Boguszewska-Czubara A, Kruk-Słomka M, Skalicka-Woźniak K, Michalak A, Musik I, Biała G, Głowniak K. Effects of imperatorin on nicotineinduced anxiety- and memory-related responses and oxidative stress in mice. Physiol Behav. 2013, 122, 46-55 imperatoryna podana jednorazowo łącznie z nikotyną osłabia anksjogenne działanie nikotyny w teście EPM; jednorazowe podanie imperatoryny łącznie z nikotyną działa prokognitywnie w fazie akwizycji pamięci; imperatoryna podawana subchronicznie, a w dniu testu z nikotyną działa prokognitywnie w fazie akwizycji i konsolidacji pamięci; imperatoryna osłabia procesy stresu oksydacyjnego indukowane podaniem nikotyny; wpływ imperatoryny na zachowania lękowe, procesy pamięciowe oraz parametry stresu oksydacyjnego indukowane nikotyną sugeruje skuteczność strategii opartych na furanokumarynach w leczeniu nikotynizmu. M.4. Budzyńska B, Boguszewska-Czubara A, Kruk-Słomka M, Kurzepa J, Biała G. Mephedrone and nicotine: oxidative stress and behavioral interactions in animal models. Neurochem Res. 2015, 40(5), 1083-93 pojedyncza iniekcja mefedronu poprawia procesy pamięci w fazie konsolidacji w teście PA oraz wykazuje działanie anksjogenne w teście EPM; łączne podanie niewpływających na procesy pamięciowe oraz lękowe dawek nikotyny oraz mefedronu poprawia procesy pamięci w fazie konsolidacji oraz indukuje zachowania lękowe; powtarzalne iniekcje nikotyny powodują rozwój sensytyzacji na efekty lokomotoryczne, nasilanej przez podanie mefedronu w dniu challenge; obydwa związki nasilają procesy stresu oksydacyjnego w OUN myszy; przeprowadzone badania mogą okazać się pomocne w poznaniu interakcji oraz rzeczywistych skutków jednoczesnego podawania substancji psychoaktywnych w OUN. 22