Organizmy modelowe - drożdże. Saccharomyces cerevisiae i nie tylko

Organizmy modelowe - drożdże Saccharomyces cerevisiae i nie tylko

Co można badać na drożdżach? Praktycznie wszystkie podstawowe aspekty biologii molekularnej, biologii komórki, genetyki

Transdukcja sygnału

Czego nie można badać na drożdżach Różnicowanie i rozwój Neurobiologia Regulacja przez małe niekodujące RNA (sirna, mirna) Alternatywny splicing

Drożdże i cykl komórkowy Nobel dla drożdży

Nobel 2001 Drożdże i cykl komórkowy

Cykl komórkowy

Mutanty cdc S. cerevisiae Cykl komórkowy podobny do wyższych Eukaryota Fazy G1, S, G2, M i wrzeciono podziałowe Lee Hartwell zastosowanie genetyki drożdży do badania cyklu komórkowego (1970-73) Mutanty temperaturowrażliwe (ts), analizowane za pomocą mikroskopii (zdjęcia poklatkowe) populacja zatrzymuje się w tej fazie, której dotyka mutacja stwierdzenie, której fazy cyklu dotyczy defekt w mutancie

Mutanty cdc S. cerevisiae http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2001/hartwell-lecture.pdf

Mutanty wee i cdc u S. pombe Podziały komórki skoordynowane z wzrostem komórek Mutant wee komórki zaczynają się dzielić, kiedy są jeszcze małe zaburzona kontrola startu cyklu

Regulacja cyklu wee1 inhibitor podziałów utrata funkcji - małe komórki cdc25, cdc2 aktywatory utrata funkcji duże komórki

Regulacja cyklu komórkowego

Od drożdży do człowieka mutację cdc2 S. pombe można odwrócić wprowadzając na plazmidzie ludzki gen CDK1 (Cyclin Dependent Kinase)

Drożdże i transkrypcja Kolejny Nobel dla drożdży

Drożdże i transkrypcja

Drożdże i transkrypcja Łatwość hodowli przydatne w projektach oczyszczania i krystalizacji białek

Drożdże i mitochondria

Profil metaboliczny S. cerevisiae Fakultatywne aeroby Efekt Pasteura tlen hamuje fermentację, ale Efekt Crabtree w obecności glukozy (C6) fermentacja anaerobowa nawet w obecności tlenu Glukoza hamuje oddychanie Etanol jest następnie wykorzystywany (jeżeli nadal jest tlen) Strategia akumulacja i konsumpcja

S. cerevisiae i mitochondria co szczególnego? Przeżywa bez funkcji oddechowej (fakultatywny tlenowiec, fermentacja) Mutanty z defektywnym oddychanie, petite (lata 1960.) Przeżywa bez genomu mitochondrialnego ( petite positive ) glukoza (fermentacja) glicerol (oddychanie)

Fenotyp petite u S. cerevisiae Zmiany w mtdna ρ 0 całkowita utrata mtdna ρ - częściowa utrata mtdna, znaczne delecje i reamplifikacja mit - - mutacje punktowe, prawidłowa struktura genomu Zmiany w ndna mutanty pet

Oddziaływania jądrowo mitochondrialne Proteom mitochondrium ~500-800 białek 8-9 kodowane w mtdna jądro mitochondrium Ponad 150 genów jądrowych Ucieczka genów niezbędnych do utrzymania mitochondrialnego systemu genetycznego Ewolucja nowych funkcji Utrata genów

Kompleks III Kompleks IV syntaza ATP Błona wewnętrzna III IV V Matrix Cox1 Cox2 Cox3 Atp6 Atp8 Atp9 polimeraza RNA Cob Rpo41 Mtf1 24 trna Translation 21S rrna mtdna Cob, Cox1, Cox2, Cox3, Atp6, Atp8, Atp9, Var1 LSU Transkrypcja Translacja 15S rrna SSU Var1 9S RNA + Rpm2 RNaza P Rybosom Bartosz Zapisek, 2011.

Nie tylko S. cerevisiae S. cerevisiae był od dziesiątków lat standardowym modelem genetyki mitochondrialnej metabolizm fakultatywnie aerobowy przeżywa bez mtdna (petite positive) Pod wieloma względami jest nietypowy przeżywa bez mtdna (petite positive) nietypowa organizacja, ekspresja i replikacja mtdna brak genów kompleksu I (dehydrogenaza NADH) w mtdna genom po epizodzie duplikacji całego genomu (WGD) i utracie redundantnych paralogów

Drożdże jako model dla genetyki człowieka

Genomy S. cerevisiae H. sapiens ~1,2 x 10 7 bp ~3 x 10 9 bp ~6500 genów ~25 000 genów ~1800 genów wykazuje homologie z genami H. sapiens (30%) ~ 4000 genów wykazuje homologie z genami S. cerevisiae (13%) Wiele podstawowych funkcji komórki jest zachowanych. Niekiedy możliwa wymienność białek drożdżowych i ludzkich (np. Ras, Oxa1)

Baza danych

Przykładowe drożdżowe modele chorób Progerie Wernera i Blooma Choroby związane z defektami naprawy DNA (HNPCC, ataksjatelangiektazja) Ataksja Friedreicha Zaburzenia komunikacji jądrowo - mitochondrialnej (PEO) Choroby wywołane mutacjami w mtdna (NARP) Poszukiwanie leków za pomocą drożdży

C1orf31, COA6 C1orf31 - zachowywany w ewolucji gen, funkcja u człowieka nieznana Mutacje u chorych na choroby serca (kardiomiopatia przerostowa) związane z defektami mitochondrialnymi Homolog drożdżowy - COA6

COA6 Zaangażowany w składanie kompleksu IV (oksydaza cytochromowa) Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069

Fenotyp odwracany przez dodanie Cu 2+ W sekwencji białka motywy, które mogą wiązać jony miedzi Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069

Model mutacji znalezionych u pacjenta Mutacje u chorych w konserwowanych pozycjach Fenotyp zgodny z defektem oddychania komórkowego Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069

Model w układzie wielokomórkowym Wyciszenie homologicznego genu w zarodkach ryby Danio (TB - wyciszenie, MMC - kontrola) nie wymaga funkcjonalnego serca przez pierwsze 4-5 dni rozwoju u ssaków byłby to efekt letalny Fenotyp - defekt rozwoju serca Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069

Zaburzenia komunikacji jądrowomitochondrialnej Mutacje w genach kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie mtdna ANT1 (transporter ADP/ATP) POLG (polimeraza DNA) Choroby dziedziczone autosomalnie, objawiają się delecjami w mtdna lub deplecją mtdna

PEO PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni gałki ocznej) Postać dominująca (adpeo) lub recesywna (arpeo) Objawy opadanie powiek (ptosis), niezdolność do poruszania gałkami oczu, ogólne osłabienie mięśni, zaburzenia neurologiczne,

Inne choroby związane z mutacjami POLG Zespół Alpersa (ciężka postępująca choroba neurodegeneracyjna) SANDO (sensory ataxic neuropathy, dysarthria, and ophthalmoparesis)

Mutacje i modele drożdżowe POLG (mitochondrialna polimeraza DNA) drożdżowy homolog MIP1 ANT1 (mitochondrialny transporter ATP/ADP drożdżowy homolog AAC2

http://tools.niehs.nih.gov/polg

Homologia POLG i MIP1 Mutacje w MIP1 powodują niestabilność genomu mitochondrialnego spontaniczne delecje mutacje punktowe całkowita utrata mitochondrialnego DNA

Choroby wywołane mutacjami w mtdna Np. NARP Neurogenic Ataxia Retinitis Pigmentosa Mutacja w genie ATP6 W komórkach 70-90% zmutowanego DNA Obniżona aktywność syntezy ATP

Drożdżowe modele chorób mitochondrialnych S. cerevisiae jedyny organizm modelowy, u którego można wprowadzać DNA do mitochondriów ukierunkowana mutageneza mtdna Rak, M. et al. J. Biol. Chem. 2007;282:34039-34047

Poszukiwanie nowych leków

Identyfikacja substancji aktywnych Drożdże na szalce (murawa) Testowane związki nakraplane na krążki filtrów Drugs are deposited on filters kontrola negatywna Związki aktywne

Długowieczność i starzenie

Długowieczność drożdży Zastosowanie drożdży S. cerevisiae jako modelu zjawisk związanych ze starzeniem proponowano od lat 60. (Mortimer & Johnson) Dwa mechanizmy starzenie replikatywne limit podziałów komórki-matki (~30) starzenie chronologiczne przeżywalność w fazie spoczynkowej hodowli (wyczerpane źródła energii)

Mechanizmy kontrolujące długowieczność mogą być konserwowane w ewolucji

Drożdże i biologia systemów Drożdże w XXI wieku

Projekty na skalę genomową Delecje (analiza fenotypowa) Nadekspresja białek (MORF) Zmiany ekspresji genów (mikromacierze, fuzje reporterowe) Lokalizacja białek w komórce (fuzje z GFP) Interakcje białek (system dwuhybrydowy) Interakcje genetyczne (np. syntetyczne letalne) Mapowanie QTL

Problem analiz wysokoprzepustowych Geny pet (niezbędne do oddychania) Merz & Westermann, 2009

Problem analiz wysokoprzepustowych Powtarzalność wyników w różnych badaniach jest niewielka Znaczny wpływ tła genetycznego i warunków doświadczalnych

Analizy wysokoprzepustowe roboty laboratoryjne Singer Instruments, UK

Wykorzystanie kolekcji delecyjnych CP - Common Primer - wspólny starter UPTAG, DNTAG - kody kreskowe, unikatowe sekwencje Steinmetz & Davis, 2004, Nat. Rev. Genet. 5: 190 201

Steinmetz & Davis, 2004, Nat. Rev. Genet. 5: 190 201

Fenotyp a analiza ekspresji Dwa najczęstsze podejścia genomiki funkcjonalnej: analiza ekspresji (transkryptomika) - zmiany poziomu mrna w różnych warunkach analiza fenotypowa - defekt wzrostowy (fitness) w określonych warunkach Czy wyniki (zidentyfikowane geny) się pokrywają?

Fenotyp a ekspresja Wzrost na galaktozie Giaever et al. Nature 418, 387 391 (2002)

Fenotyp a ekspresja Tolerancja wysokiego stężenia soli Giaever et al. Nature 418, 387 391 (2002)

Fenotyp a ekspresja Nakładanie się znaczącej zmiany ekspresji i defektu wzrostu <7% dla wzrostu na galaktozie i 1M NaCl ~7% dla wzrostu na niefermentowalnych źródłach węgla ~16% dla sporulacji

Poszukiwanie interakcji genetycznych Oddziaływania łagodzące (np. supresja) selekcja bezpośrednia Oddziaływania syntetyczne syntetyczna letalność: pojedyncze mutacje gen1 i gen2 nie są letalne, ale podwójny mutant gen1, gen2 nie przeżywa syntetyczne wzmocnienie pojedyncze mutacje gen1 i gen2 słaby fenotyp, podwójny mutant gen1, gen2 silny fenotyp (np. spowolnienie wzrostu)

Ujęcie ilościowe Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25

SGA Synthetic Gene Array Kolekcja delecji, krzyżowana z badanym genem Sporulacja, Selekcja haploidów MATa Selekcja pojedynczych i podwójnych mutantów Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437

http://www.utoronto.ca/boonelab/sga_technology/index.shtml SGA

dslam Diploid-based synthetic lethality analysis with microarrays (dslam)

Rekonstrukcja sieci interakcji Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25

Interakcje genetyczne ujęcie systemowe Interakcje genetyczne wskazują na związki funkcji Mogą wiązać elementy tego samego szlaku/kompleksu, ale też różnych szlaków, powiązanych funkcją Zestaw interakcji (pozycja na mapie interaktomu genetycznego) może wskazywać na funkcję genu

Sieci interakcji Sieć interakcji syntetycznych letalnych jest rzadka około 1% Interakcje syntetyczne są jednak częste pomiędzy genami o powiązanej funkcji (18%-25%) Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25

Interakcje genetyczne a fizyczne Interakcje fizyczne i genetyczne rzadko się nakładają, choć częściej, niż przewidywano by dla pełnej losowości Nakładanie się interakcji genetycznych i fizycznych częste dla interakcji pozytywnych (epistaza) Interakcje negatywne z reguły pomiędzy różnymi kompleksami fizycznymi Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25

Wyniki sieci interakcji genetycznych

Costanzo i wsp., (2010) Science 327, 425

Genomika cech wieloczynnikowych Dziedziczenie wieloczynnikowe - fenotyp zależy od interakcji alleli wielu genów oraz środowiska W odróżnieniu od fenotypów mendlowskich mają zwykle charakter zmienności ciągłej (ilościowej), a nie dyskretnej QTL - Quantitative Trait Loci - loci cech ilościowych - obszary genomu w istotny sposób wpływające na fenotyp cechy wieloczynnikowej

Genomika cech wieloczynnikowych Ważne zagadnienie dla genetyki człowieka częste choroby, zmienność prawidłowa genetyki roślin uprawnych genetyki zwierząt hodowlanych teorii ewolucji Głównie analizy statystyczne Czy można zastosować proste organizmy modelowe?

QTL u drożdży QTL u drożdży można badać wykorzystując szczepy o różnym tle genetycznym S. cerevisiae - bardzo duża zmienność, nawet wśród szczepów laboratoryjnych

QTL u drożdży - 3 strategie Bulk Segregant Analysis (BSA) - masowa analiza segregantów Individual Segregant Analysis (ISA) - analiza pojedynczych segregantów (równoległa) Reciprocal Hemizygosity Scanning (RHS) - analiza hemizygotycznych delecji

QTL u drożdży Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865

QTL u drożdży - metoda ISA Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865

QTL u drożdży Metoda ISA pozwala na mapowanie cech, których nie można selekcjonować (np. kształt kolonii) Skuteczność zależy od liczby pojedynczych segregantów, które można przeanalizować Obecnie do ~1000

Genotypowanie szczepów Co można dziś Do 384 bibliotek/tydzień <15 /próbka 30x pokrycie Wilkening et al. BMC Genomics 2013 14:90

Inne zastosowanie metody ISA Mapa częstości rekombinacji homologicznej w skali genomu Wilkening et al. BMC Genomics 2013 14:90

Ewolucja eksperymentalna

Ewolucja eksperymentalna Możliwość prowadzenia wielu hodowli równolegle przez wiele pokoleń

Ewolucja wielokomórkowości Selekcja w hodowlach S. cerevisiae w kierunku szybkiego opadania osadu Pojawiają się grupy komórek ( płatki śniegu )

Ewolucja wielokomórkowości wyjściowe - jednokomórkowe po 14 pokoleniach selekcji po 60 pokoleniach selekcji

Ewolucja specjalizacji Pod koniec w zgrupowaniach pojawił się podział funkcji niektóre komórki inicjują programowaną śmierć by ułatwić podział grupy przez fragmentację

Wzrost kolonii

Podział kolonii