Ocena aktywacji płytek krwi u chorych na nadpłytkowość samoistną

PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 1, str. 111 118 JACEK TRELIŃSKI, MARZENA TYBURA, PIOTR SMOLEWSKI, KRZYSZTOF CHOJNOWSKI Ocena aktywacji płytek krwi u chorych na nadpłytkowość samoistną The assessment of platelet activation in patients with essential thrombocythemia Z Katedry i Kliniki Hematologii UM w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak STRESZCZENIE Nadpłytkowość samoistna (NS) charakteryzuje się zwiększoną częstością występowania zakrzepów i krwawień. ChociaŜ przyczyny tych powikłań upatruje się w zaburzeniach czynności/liczby płytek krwi to w ich rozwoju podejrzewa się równieŝ udział leukocytów. W pracy zbadano markery aktywacji płytek i leukocytów u 40 chorych z NS w okresie rozpoznania choroby. W grupie chorych stwierdzono m.in. zwiększoną ekspresję P-selektyny na płytkach, obniŝoną ekspresję L-selektyny na leukocytach, a takŝe zwiększony odsetek koniugatów płytkowo- leukocytarnych. U chorych z NS w wieku >60 lat obserwowano znamiennie większy odsetek płytek CD62P dodatnich w porównaniu do chorych w wieku <40 lat. Uzyskane przez nas wyniki świadczą o zwiększonej aktywacji płytek krwi i leukocytów u chorych na NS w czasie rozpoznania choroby. SŁOWA KLUCZOWE: Nadpłytkowość samoistna Markery aktywacji płytek krwi Zakrzepy i krwawienia SUMMARY Essential thrombocythemia (ET) is associated with an increased risk of both thromboembolic and bleeding complications. Changes in platelet count and function are crucial but leukocyte activation is also suspected. In paper platelet and leukocyte activation markers were assessed in 40 ET patients at the time of diagnosis. In ET group elevated expression of P-selectin on platelets, reduced expression of L-selectin on leukocytes and increased percentage of platelet-leukocyte conjugates were observed. In ET patients >60 years elevated CD62P expression in comparison to patients <40 years was observed. These results suggest both platelet and leukocyte activation in ET patients at diagnosis. KEY WORDS: Essential thrombocythemia Platelet activation markers Thrombosis and bleeding Nadpłytkowość samoistna (NS) charakteryzuje się zwiększoną częstością występowania powikłań zakrzepowo-zatorowych i krwotocznych. Tętnicza i Ŝylna choroba zakrzepowo-zatorowa stanowi przyczynę około 40% zgonów w NS (1 3). Kluczową rolę w rozwoju tych powikłań przypisuje się zaburzeniom liczby i funkcji płytek krwi.

112 J. TRELIŃSKI i wsp. Dotychczasowe badania czynności płytek krwi nie pozwoliły jednak na wyodrębnienie grupy chorych o zwiększonym ryzyku wystąpienia zakrzepów i/lub krwawień (4 6). W ostatnich latach zwraca się uwagę na rolę podwyŝszonej leukocytozy (7), aktywacji leukocytów (8 12), a takŝe tworzenia agregatów płytkowo-leukocytarnych (10) w patogenezie zakrzepicy u chorych na NS. Obserwacje te korelują z wynikami badań klinicznych, w tym badania PT-1, w którym zastosowanie hydroksymocznika (lek działający na wszystkie linie szpikowe) było skuteczniejsze od anagrelide (lek zmniejszający wyłącznie liczbę płytek krwi) w zapobieganiu zakrzepom tętniczym u chorych z NS z grupy wysokiego ryzyka (13, 14). Celem naszej pracy była ocena markerów aktywacji płytek i leukocytów (w tym koniugatów płytkowo-granulocytarnych) u chorych na NS w okresie rozpoznania choroby. MATERIAŁ I METODY Badania wykonano u 40 chorych z NS w czasie rozpoznania, które ustalono według kryteriów Polycythemia Vera Study Group (15). U dziewięciu chorych (22,5%) występowały w wywiadzie objawy kliniczne w tym u pięciu (12,5%) krwawienia z nosa lub dziąseł, a u czterech (10%) powikłania zakrzepowe (3 tętnicze i 1 Ŝylne). Grupę kontrolną stanowiło 20 osób w zbliŝonym do badanych wieku. śadna z osób w grupie kontrolnej nie przebyła incydentu zakrzepowo-zatorowego w wywiadzie, a takŝe nie miała znanych czynników ryzyka choroby zakrzepowej. Badani nie przyjmowali leków wpływających na czynność płytek krwi w czasie 14 dni poprzedzających wykonanie testów. W grupie chorych stwierdzono znacząco większe średnie wartości płytek krwi, leukocytozy i neutrofili (Tab. 1) Tabela 1. Charakterystyka grupy badanej i kontrolnej Table 1. Characteristics of study subjects Dane/Grupa Grupa chorych na NS Grupa kontrolna Liczba badanych 40 20 Kobiety/męŜczyźni 28/12 13/7 Wiek (średnia i zakres w latach) 58,3 (20 84) 50.1 (22 73) Liczba erytrocytów ( 10 12 /L) 4.84 ± 0.73 4.58 ± 0.33 Leukocyty ( 10 9 /L) 9.84 ± 3.48 5.94 ± 1.31 Neutrofile ( 10 9 /L) 7.64 ± 2.57 3.28 ± 1.16 Liczba płytek krwi ( 10 9 /L) 929.3 ± 284.4 248.4 ± 68.1 Hemoglobina (g/l) 13.5 ± 2.03 13.84 ± 1.1 Hematokryt (%) 40.8 ± 5.16 40.16 ± 2.98 p< 0.05 vs kontroli, wyniki podane jako średnia ± odchylenie standardowe. Analiza statystyczna Wyniki badań opracowano statystycznie. Porównania zmiennych pomiędzy grupami były wykonane testem t-studenta, a w przypadku rozkładu nienormalnego uŝyto testu Manna-Whitney a.

Ocena aktywacji płytek krwi u chorych na NS 113 Analiza cytometryczna Oznaczenia wykonywano we krwi pełnej pobranej w sposób typowy dla badań koagulologicznych, tzn. na 3,8% cytrynian sodu w stosunku 1:9. Pomiarów dokonywano przed i po aktywacji płytek krwi, indukowanej za pomocą ADP, kolagenu oraz epinefryny. Stan wyjściowy płytek krwi oceniano po zahamowaniu ich aktywacji poprzez rozcieńczenie buforem fosforanowym (PBS) w stosunku 1:5. Natomiast do oceny płytek po aktywacji wykorzystano krew z badania czasu okluzji na aparacie PFA-100 firmy Dade-Behring (West Sacramento, CA), z uŝyciem gotowych zestawów pomiarowych zawierających ADP/kolagen i epinefrynę/ kolagen tej samej firmy. Analiza aktywności płytek krwi Próbki krwi przygotowane w powyŝszy sposób znakowano przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko antygenom płytek krwi, znakowanymi fluoresceiną (FITC): anty-cd61 (Becton Dickinson, San Jose CA, USA) i anty-cd62p (Serotec, Oxford, UK). Inkubacja z przeciwciałami prowadzona była przez 30 minut, w ciemności, w temperaturze pokojowej. Po tym czasie próbki rozcieńczano buforem PBS i analizowano przy uŝyciu cytometru przepływowego FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose CA, USA). Populację zawierającą płytki krwi wyodrębniano na podstawie oceny parametrów światła rozproszonego lasera, FSC (forward scatter) vs. (side scatter), analizując komórki na skali logarytmicznej. Następnie komórki wykazujące ekspresję antygenu CD61 bramkowano jako populację płytek krwi. Z kaŝdej próbki zliczano i analizowano 5000 komórek CD61+. Aktywność płytek oceniano na podstawie odsetka komórek wykazujących ekspresję antygenu CD62P (Rycina 1). M1 CD62P FITC 10 0 101 102 103 104 Płytki krwi FSC-Height FSC CD61 FITC CD61 CD62P Ryc. 1. Analiza cytometryczna ekspresji antygenu CD62P Fig. 1. Flow cytometry analysis for the detection of CD62P antigen Ocena koniugatów płytkowo-leukocytarnych W celu oceny odsetka koniugatów płytkowo-leukocytarnych, badany materiał znakowano odpowiednio przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko antygenom linio-

114 J. TRELIŃSKI i wsp. wym dla granulocytów i monocytów: przeciwciałem anty-cd11b (sprzęŝonym z fikoerytryną; PE) (Becton Dickinson, San Jose CA, USA) oraz anty-cd14 (sprzęŝonym z FITC) (Becton Dickinson, San Jose CA, USA). Ponadto, próbki krwi inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi anty CD42b i anty CD-62P, w celu oceny aktywacji płytek krwi w badanych konglomeratach. Próbki inkubowano przez 30 minut, w ciemności, w temperaturze pokojowej. Po tym czasie krwinki czerwone lizowano przez 15 minut przy uŝyciu BD FACS Lysing Solution (Becton Dickinson, San Jose CA, USA), a następnie immunofluerescencje komórek analizowano w cytometrze przepływowym. Na podstawie dystrybucji FSC vs. bramkowano komórki o wysokich wartościach FSC i, z których następnie wyodrębniano populację zawierającą granulocyty (CD11b+/CD14 ). Z kaŝdej z próbek zliczano 5000 tych komórek. Procent komórek CD 42b+ lub CD62P+ odpowiadał odsetkowi koniugatów, zawierających aktywne płytki krwi (Ryc. 2). M1 CD62P FITC 10 0 101 102 103 104 Granulocyty CD62P FITC CD62P M1 0 200 400 600 800 1000 FSC CD11b PE CD11b CD42b FITC 10 0 101 102 103 104 CD42b Ryc. 2. Analiza cytometryczna odsetka koniugatów płytkowo-granulocytarnych Fig. 2. Flow cytometry analysis for the detection of platelet-leukocytes conjugates Ponadto, na leukocytach (komórki CD 11b+) określano ekspresję L-selektyny poprzez znakowanie przeciwciałem monoklonalnym anty-cd62l sprzęŝonym z FITC (Bender MedSystems, Vienna, Austria). Dla kaŝdej z próbek wykonano odpowiednią kontrolę izotypową z uŝyciem przeciwciał klasy IgG1 znakowanych FITC i IgG2a znakowanych PE (Becton Dickinson, San Jose CA, USA).

Ocena aktywacji płytek krwi u chorych na NS 115 WYNIKI Porównanie grupy NS do kontroli Odsetek CD62P pozytywnych płytek (nie aktywowanych) był znacząco większy w grupie NS w stosunku do grupy kontrolnej (Tab. 2). Natomiast nie stwierdzono istotnych róŝnic pomiędzy badanymi grupami w odniesieniu do ekspresji antygenu CD62P po aktywacji ADP/kolagenem i epinefryną/kolagenem. Ekspresja antygenu CD42b w obu grupach nie róŝniła się znacząco. W grupie chorych występowały statystycznie większe wartości koniugatów płytkowo- leukocytarnych CD11b/CD42b, a takŝe mniejsze L-selektyny. Odsetek koniugatów płytkowo-leukocytarnych po stymulacji agonistami był większy w grupie z NS, ale róŝnica ta nie była znamienna statystycznie. Po stymulacji ADP/kolagenem u chorych obserwowano istotnie mniejszą ekspresję CD62L. Tabela 2. Wyniki wybranych markerów aktywacji płytek krwi u chorych na NS i w kontroli Table 2. The results of selected platelet activation markers in ET patients and in control Badana zmienna Grupa chorych Grupa kontrolna p CD62P 8.23 (5.22 16.39) 2.10 (1.23 6.75) <0.002 CD42b 94.84 (87.2 97,34) 91.12 (86.72 94.74) >0.05 CD11b/CD42b 10.67 (2.55 67.31) 6.4 (3.27 16.34) <0.002 CD11b/62P 9.22 (1.73 44.7) 8.70 (4.87 29.14) >0.05 CD62L 60.57 (1.43 93.88) 80.56 (55.07 98.02) <0.002 CD62L po ADP/kolagen 49.42 (10.02 90.23) 74.15 (46.56 94.35) <0.002 p< 0.05, wyniki przedstawione jako mediana i zakres Odsetek CD62P pozytywnych płytek był znacząco większy w grupie chorych powyŝej 60 rŝ (Tab. 3). Ponadto w tej grupie chorych stwierdzono większy odsetek koniugatów płytkowo-granulacytarnych (CD11b/CD42b i CD11b/CD62P) a takŝe mniejszą ekspresję L-selektyny ale bez znamienności statystycznej. Tabela 3. Wyniki wybranych markerów aktywacji płytek krwi w chorych na NS (< 40 i > 60 roku Ŝycia) Table 3. The results of selected platelet activation markers in ET patients (< 40 and > 60 years old) Badana zmienna <40 lat (8 chorych) >60 lat (24 chorych) p CD62P 2.0 (1.0 7.0) 5.9 (2.3 16.0) <0.002 CD42b 94.0 (92.1 99.0) 92.8 (77.7 98.0) >0.05 CD11b/CD42b 7.0 (2.6 28) 8.9 (4.2 54.0) >0.05 CD11b/62P 2 (1.0 19.0) 2.9 (0.3 26.0) >0.05 CD62L 66.0 (1.4 88.0) 60.2 (5.3 94.0) >0.05 p< 0.05, wyniki przedstawione jako mediana i zakres.

116 J. TRELIŃSKI i wsp. DYSKUSJA Powikłania zakrzepowe i krwotoczne są najpowaŝniejszym problemem klinicznym u chorych na NS. Według danych z piśmiennictwa dotyczą one odpowiednio 11 25% i 3,6 37% chorych w okresie rozpoznania (3, 16) natomiast w naszej grupie występowały z częstością 10% i 12,5%. Pomimo wielu wysiłków dotychczas udało się jedynie wyodrębnić: wiek chorych >60 lat, przebyty incydent zakrzepowy i liczbę płytek >1.5 G/l jako niezaleŝne czynniki pozwalające przewidzieć wystąpienie powikłań zakrzepowych i krwotocznych u chorych na NS (17 19). Badania czynności płytek krwi wykonywane za pomocą agregometrii nie spełniły pokładanych w nich nadziei. Pomimo występowania róŝnych nieprawidłowości (wskazujących na upośledzoną i/lub nadmierną czynność płytek krwi z róŝnymi agonistami) nie udało się stwierdzić korelacji z objawami klinicznymi (5). Charakterystyczna dla NS obecność spontanicznej agregacji okazała się takŝe bez znaczenia prognostycznego (20). W latach 2006 2007 Wolanskyj i wsp. oraz Carobbio i wsp. wskazali na podwyŝszoną liczbę krwinek białych jako kolejny niezaleŝny czynnik prognostyczny zakrzepicy w NS (7, 21). Stwierdzono ponadto, iŝ u chorych na NS leukocyty krąŝą w stanie pobudzenia i są zdolne do tworzenia agregatów płytkowo-leukocytarnych, których odsetek jest czułym markerem aktywacji zarówno leukocytów jak i płytek (8 10, 12). Dlatego w pracy postanowiliśmy zbadać takie markery aktywacji płytek krwi i leukocytów jak: P-selektyna (CD62P), L-selektyna (CD62L) czy odsetek koniugatów płytkowo-granulocytarnych (CD11b/CD42b i CD11b/62P). W grupie z NS wykazaliśmy istotnie większą w stosunku do kontroli ekspresję P- selektyny. Białko to, w warunkach spoczynkowych przechowywane w ziarnistościach α płytek krwi, jest podczas aktywacji uwalniane na ich powierzchnię odgrywając istotną rolę w interakcjach pomiędzy płytkami krwi, leukocytami i komórkami śródbłonka. Jej zwiększone wartości stwierdzono w róŝnych sytuacjach klinicznych związanych z aktywacją płytek i leukocytów, w tym w udarze niedokrwiennym mózgu, niestabilnej chorobie wieńcowej a takŝe w NS (10, 22 25). Z kolei L-selektyna (CD62L) znajduje się konstytucjonalnie na powierzchni leukocytów. Po aktywacji neutrofili dochodzi do jej proteolitycznego odszczepienia i zmniejszenia ekspresji na powierzchni komórek. Wyniki naszych badań (znamiennie mniejsza ekspresja CD62L w grupie z NS) wskazują na zwiększoną aktywację leukocytów w porównaniu do grupy kontrolnej. W analizowanej przez nas grupie 40 chorych na NS wykazano istotnie większe w stosunku do kontroli wartości koniugatów płytkowo-leukocytarnych CD11b/CD42b. W 2001 roku Jensen i wsp. przy uŝyciu cytometrii przepływowej udowodnili obecność zwiększonego odsetka krąŝących koniugatów płytkowo-leukocytarnych u 50 chorych z przewlekłymi zespołami mieloproliferacyjnymi w porównaniu do 30 osobowej grupy kontrolnej, co korelowało z liczbą, a takŝe odsetkiem CD62P dodatnich płytek. Dodatkowo u chorych z dodatnim wywiadem zakrzepowym obserwowano większe średnie wartości koniugatów płytkowo-leukocytarnych (9). Villmow i wsp. oraz Falanga i wsp. stwierdzili takŝe zwiększony odsetek koniugatów płytkowo-leukocytarnych w NS cho-

Ocena aktywacji płytek krwi u chorych na NS 117 ciaŝ w przeciwieństwie do naszej pracy większość chorych otrzymywała leczenie cytoredukcyjne i/lub kwasem acetylosalicylowym (10, 26, 27). Zbyt mała liczba chorych nie pozwoliła na ocenę aktywacji płytek krwi w zaleŝności od występowania objawów klinicznych. Jednak wstępne, nie przedstawione w pracy, wyniki badań wykazały tendencję do zwiększonego odsetka płytek CD62P dodatnich i koniugatów płytkowo-leukocytarnych u chorych objawowych. Z kolei uzyskane wyniki badań markerów aktywacji płytek u chorych >60 lat mogą potwierdzać zwiększone ryzyko zakrzepowe w tej grupie chorych. W podsumowaniu, przedstawione wyŝej obserwacje świadczą o zwiększonej aktywacji płytek krwi oraz leukocytów u chorych na nadpłytkowość samoistną w okresie rozpoznania choroby. Przedmiotem dalszych badań na większym materiale chorych powinno być ustalenie związku pomiędzy stwierdzoną aktywacją a występowaniem objawów klinicznych. Ciekawe wydaje się takŝe ustalenie wpływu leków w tym szczególnie leków działających zarówno na układ płytkotwórczy jak i białokrwinkowy. PIŚMIENNICTWO 1. Rozman C, Giralt M, Feliu E et al. Life expectancy of patients with chronic nonleukemic myeloproliferative disorders. Cancer. 1991; 67: 2658-63. 2. Brodmann S, Passweg JR, Gratwohl A et al. Myeloproliferative disorders: complications, survival and causes of death.ann Hematol. 2000; 79: 312-8. 3. Elliott MA, Tefferi A. Thrombosis and haemorrhage in polycythaemia vera and essential thrombocythaemia. Br J Haematol. 2005; 128: 275-90. 4. Barbui T, Cortelazzo S, Viero P et al. Thrombohaemorrhagic complications in 101 cases of myeloproliferative disorders:relationship to platelet number and function. Eur J Cancer Clin Oncol. 1983; 19: 1593-9. 5. Balduini C.L, Bertolino G, Noris P et al. Platelet aggregation in platelet-rich plasma and whole blood in 120 patients with myeloproliferative disorders. Am J Clinical Pathol 1991; 95: 82-86. 6. Manoharan A, Gemmell R, Brighton T et al. Thrombosis and bleeding in myeloproliferative disorders: identification of at-risk patients with whole blood platelet aggregation studies. Br J Haematol. 1999; 105: 618-25. 7. Carobbio A, Finazzi G, Guerini V et al. Leukocytosis is a risk factor for thrombosis in essential thrombocythemia:interaction with treatment, standard risk factors, and Jak2 mutation status.blood. 2007; 109: 2310-3. 8. Falanga A, Marchetti M, Evangelista V et al. Polymorphonuclear leukocyte activation and hemostasis in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera.blood. 2000; 96: 4261-6. 9. Jensen MK, de Nully Brown P, Lund BV et al. Increased circulating platelet-leukocyte aggregates in myeloproliferative disorders is correlated to previous thrombosis, platelet activation and platelet count. Eur J Haematol. 2001; 66: 143-51. 10. Falanga A, Marchetti M, Vignoli A et al. Leukocyte-platelet interaction in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera.exp Hematol. 2005; 33: 523-30. 11. Falanga A, Marchetti M, Barbui T et al. Pathogenesis of thrombosis in essential thrombocythemia and polycythemia vera: the role of neutrophils. Semin Hematol. 2005; 42: 239-47. 12. Arellano-Rodrigo E, Alvarez-Larrán A, Reverter JC et al. Increased platelet and leukocyte activation as contributing mechanisms for thrombosis in essential thrombocythemia and correlation with the JAK2 mutational status. Haematologica. 2006; 91: 169-75.

118 J. TRELIŃSKI i wsp. 13. Cortelazzo S, Finazzi G, Ruggeri M et al. Hydroxyurea for patients with essential thrombocythemia and a high risk of thrombosis. N Engl J Med. 1995; 332: 1132-6. 14. Harrison CN, Campbell PJ, Buck G et al. United Kingdom Medical Research Council Primary Thrombocythemia 1 Study. Hydroxyurea compared with anagrelide in high-risk essential thrombocythemia.n Engl J Med. 2005; 353: 33-45. 15. Murphy S, Peterson P, Iland H et al. Experience of the Polycythemia Vera Study Group with essential thrombocythemia: a final report on diagnostic criteria, survival, and leukemic transition by treatment. Semin Hematol. 1997; 34: 29-39. 16. Landolfi R, Marchioli R, Patrono C. Mechanisms of bleeding and thrombosis in myeloproliferative disorders.thromb Haemost. 1997; 78: 617-21. 17. Cortelazzo S, Viero P, Finazzi G et al. Incidence and risk factors for thrombotic complications in a historical cohort of 100 patients with essential thrombocythemia.j Clin Oncol. 1990; 8: 556-62. 18. Finazzi G, Barbui T. Risk-adapted therapy in essential thrombocythemia and polycythemia vera. Blood Rev. 2005; 19: 243-52. 19. Vannucchi AM, Barbui T. Thrombocytosis and thrombosis. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007; 363-70. 20. Wehmeier A, Fricke S, Scharf RE et al. A prospective study of haemostatic parameters in relation to the clinical course of myeloproliferative disorders.eur J Haematol. 1990; 45: 191-7. 21. Wolanskyj AP, Schwager SM, McClure RF et all. Essential thrombocythemia beyond the first decade: life expectancy, long-term complication rates, and prognostic factors. Mayo Clin Proc. 2006; 81: 159-66 22. Jensen MK, de Nully Brown P, Lund BV et al. Increased platelet activation and abnormal membrane glycoprotein content and redistribution in myeloproliferative disorders. Br J Haematol. 2000; 110: 116-24. 23. Frijns CJ, Kappelle LJ, van Gijn J et al. Soluble adhesion molecules reflect endothelial cell activation in ischemic stroke and in carotid atherosclerosis. Stroke. 1997; 28: 2214-8. 24. Vidal C, Spaulding C, Picard F et al. Flow cytometry detection of platelet procoagulation activity and microparticles in patients with unstable angina treated by percutaneous coronary angioplasty and stent implantation. Thromb Haemost. 2001; 86: 784-90. 25. Griesshammer M, Beneke H, Nussbaumer B et al. Increased platelet surface expression of P- selectin and thrombospondin as markers of platelet activation in essential thrombocythaemia. Thromb Res. 1999; 96: 191-6. 26. Villmow T, Kemkes-Matthes B, Matzdorff AC. Markers of platelet activation and plateletleukocyte interaction in patients with myeloproliferative syndromes.thromb Res. 2002; 108: 139-45. 27. Treliński J, Tybura M, Chojnowski K. Patelet activation and platelet-leukocyte aggregates in patients with asymptomatic essential thrombocythemia. Pathophysiol Haemost Thromb 2006; 35. Abstract 1074. Praca wpłynęła do Redakcji 10.03.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 31.03.2008 r. Adres Autorów: Klinika i Katedra Hematologii UM w Łodzi ul. Pabianicka 62 93-513 Łódź