GENETYKA SĄDOWA GENETYKA SĄDOWA
Pobieranie materiału do badań DNA Krew Nasienie Ślina Mocz Włosy Zęby Kości Tkanki miękkie
Rodzaje śladów krwi pasywne (kapane) nałożone (smugi) natryskowe
Testy wstępne - wykrywanie krwi ludzkiej
Testy wstępne - wykrywanie śladów nasienia Lampa UV Test na kwaśną fosfatazę (Phosphatesmo KM) Test PSA (antygen specyficzny dla prostaty) Badanie obecności plemników pod mikroskopem
Testy wstępne - wykrywanie śladów śliny Lampa UV, Crimescope alfa-amylaza (RSID), test skrobiowy (SALIgAE )
Materiał porównawczy krew lub wymaz z jamy ustnej włosy rzeczy użytku osobistego, odzież osobista materiał szpitalny (preparaty histologiczne) znaczki i koperty
Próbka materiału biologicznego otrzymana z miejsca przestępstwa lub w do badania spornego ojcostwa Biologia Etapy badań DNA Izolacja DNA Obliczenie ilości DNA i jego jakości PCR dla wielu markerów STR Technologia Separacja i detekcja produktów PCR (Allele STR) Wyznaczenie genotypu DNA w próbce Genetyka Porównanie genotypu a próbki z rezultatami z innych próbek Generacja raportu z prawdopodobieństwem przypadkowej zgodności Jeśli istnieje zgodność to przeprowadza się porównanie profilu DNA z bazą danych Figure 1.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
mieszanina dowodów biologicznych Metoda lizy preferencyjnej SDS, EDTA i proteinaza K (bufor lizujący) Inkubacja 37 o C Perpetrator s sperm mixed with victim s epithelial cells SDS, EDTA i proteinaza K + DTT DTT liza główki plemnika sperma Odciągnąć nadsącz Frakcja męska sperma Frakcja żeńska
Termocyklery
Automatyczne analizatory DNA - elektroforeza kapilarna
Profil genetyczny
Identyfikacja genetyczna - w badaniach sądowych, odnosi się do procesu zmierzającego do pozytywnej odpowiedzi na pytania: Czy dwa otrzymane profile DNA są identyczne? Czy istnieje wystarczający dowód, pozwalający ustalić, że dwa profile DNA pochodzą z jednego źródła (od jednej osoby)?
Interpretacja wyników analizy genetycznej Układ polimorficzny B Dowód 2 D3S1358 14, 17 14, 15 VWA 15, 17 16, 19 D16S539 11 9, 13 D2S1338 19, 23 17, 20 Amelogenina X, Y X, Y D8S1179 10, 15 13, 14 D21S11 28, 30 28, 30 D18S51 14, 17 18, 19 D19S433 12, 18.2 14, 15 TH01 6, 8 8, 9.3 WYKLUCZENIE Porównanie wykazało brak zgodności oznaczonego w próbce dowodowej profilu DNA z profilem genetycznym oznaczonym w nadesłanym materiale porównawczym. Należy wykluczyć możliwość pochodzenia próbki dowodowej od podejrzanego. OPINIA KATEGORYCZNA FGA 19 22
Interpretacja wyników analizy genetycznej Układ polimorficzny A Dowód 1 D3S1358 16, 17 16, 17 BRAK WYKLUCZENIA VWA 14, 19 14, 19 D16S539 11, 12 11, 12 D2S1338 19, 24 19, 24 Amelogenina X, Y X, Y D8S1179 14 14 D21S11 28 28 D18S51 14, 15 14, 15 D19S433 12, 13 12, 13 TH01 6, 9.3 6, 9.3 FGA 23, 24 23, 24 Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z profilem DNA charakterystycznym dla podejrzanego A. OPINIA PROBABILISTYCZNA Wykazanie zbieżności profili genetycznych bez oszacowania przypadkowej zgodności nie ma znaczenia dla sądu. Ocena statystyczna dowodu!
Interpretacja wyników analizy genetycznej Układ polimorficzny B Dowód 3 D3S1358 14, 17 14 VWA 15, 17 D16S539 11 D2S1338 19, 23 Amelogenina X, Y X, Y D8S1179 10, 15 10 D21S11 28, 30 D18S51 14, 17 D19S433 12, 18.2 12 BRAK ROZSTRZYGNIĘCIA Częściowy profil genetyczny, który oznaczono w próbce dowodowej nie pozwala na przeprowadzenie wnioskowania odnośnie zgodności profili DNA. OPINIA NIEROZSTRZYGAJĄCA TH01 6, 8 FGA 19
Trudności w profilowaniu i brak pozytywnych wyników w analizie kontaminacja obcym materiałem mała ilość DNA/degradacja DNA działanie inhibitorów fizyczne i chemiczne czynniki degradujące monozygotyczne bliźniaki chimeryzm/heteroplazmia materiał biologiczny z tkanek nowotworowych (LOH-onkogeny/MSI-geny naprawcze) bloczki histologiczne złe przechowywanie próbek błąd człowieka/zawodność aparatury pochodzeniu odzwierzęcym badanego materiału biologicznego stwierdzenie, czy wynik jest dobry czy zły zależy od wiedzy i doświadczenia eksperta zasadniczym elementem oceny jest morfologia pików
Problemy z determinacją płci błędna interpretacja wyników genotypowania delecja genu amelogeniny przemieszczenie odcinka z genem SRY z chromosomu Y do X (niepłodni mężczyźni XX z genem SRY i kobiety XY Y bez genu SRY) chimeryzm zupełny po przeszczepie (biorca kobieta a dawca mężczyzna) aberracje chromosomowe (XXY, XXX, XYY, X0, CAIS fenotypowo kobieta XY) inaktywacja 5-alfa-reduktazy (XY- kobieta)
Wymagania i standardy współczesnej opinii genetycznej Atestacje dotyczące testów biegłości w badaniach genetycznych w zakresie śladów biologicznych i ustalania ojcostwa, zgodne z aktualnymi zaleceniami Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Sądowej (ISFG), Komisji Genetyki Sądowej PTMSiK* oraz Europejskiej Sieci Instytutów Kryminalistycznych (ENFSI) Badania dla potrzeb atestacji laboratoriów w zakresie badań śladów biologicznych, muszą być przeprowadzane w zakresie minimum 10 loci oraz markera płci* Badania dla potrzeb atestacji laboratoriów w zakresie ustalania pokrewieństwa, w tym ojcostwa, muszą być przeprowadzane w zakresie minimum 13 loci oraz markera płci systemu CODIS* Wartość szansy ojcostwa (PI) wymagana, aby wyniki atestacji zostały uznane za prawidłowe, w przypadku potwierdzenia ojcostwa musi wynosić co najmniej 1 000 000, a wykluczenie ojcostwa musi być wykazane co najmniej w 4 loci genowych* Akredytacja laboratoriów wg normy PN-EN ISO/IEC 17025
Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych Rozpoznanie zwłok opiera się na: dowodach pozamedycznych (daktyloskopia, odzież, przedmioty) dowodach medycznych oględziny zewnętrzne oględziny wewnętrzne badania genetyczne Identyfikacją zajmują się medycy sądowi i antropolodzy
Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych Oględziny zewnętrzne Oględziny zewnętrzne zwłok, w zależności od stanu zwłok pozwalają na ustalenie: - wieku, płci, wzrostu, wagi ciała, rozmiaru obuwia - owłosienie głowy - koloru tęczówek - cech twarzy, rąk, stóp, budowy ciała, co powinno być zarejestrowane na zdjęciach lub filmie - znaki szczególne (znamiona, blizny, zniekształcenia) - uzębienie (w Polsce bardzo rzadko ludzie leczą się u jednego stomatologa i posiadają kartę stomatologiczną) - superprojekcja i metoda Gerasimowa - do odtworzenia wyglądu twarzy
Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych Oględziny wewnętrzne Oględziny wewnętrzne czyli sekcja zwłok pozwala na ustalenie stanu zdrowia tj. schorzeń narządów wewnętrznych, przebytych operacji, zmian pourazowych, np. wygojonych złamań kości. Najlepszy materiał sekcyjny do badań DNA krew (zwłoki bez widocznego rozkładu gnilnego) nienaruszone stomatologicznie zęby trzon kości piszczelowej lub udowej guzowatość kości potylicznej chrząstka żebrowa wątroba lub śledziona (w wyjątkowych przypadkach)
Identyfikacja zwłok rozkawałkowanych Należy odpowiedzieć na pytania: jak długo od śmierci i w jakich warunkach pozostawały poszczególne fragmenty ciała czy poszczególne fragmenty należą do tego samego osobnika (dopasowanie anatomiczne, zgodność serologiczna lub testy DNA) czy poszczególne części ciała należą do osobnika tej samej płci jaki wzrost i wagę ciała miała ofiara
Metody identyfikacji zwłok* porównanie profilu genetycznego DNA porównanie odcisków palców badanie uzębienia i innych danych odontologicznych badania radiologiczne porównanie danych medycznych (przebyte zabiegi lecznicze i chirurgiczne) porównanie znaków szczególnych (blizny, tatuaże) porównanie danych rysopisowych identyfikacja rzeczy osobistych identyfikacja na podstawie dokumentów ujawnionych przy zwłokach lub szczątkach rozpoznanie przez świadków, członków rodziny lub znajomych *opracowane podczas V Konferencji Komisji Interpolu do spraw Identyfikacji Ofiar Katastrof Masowych i Klęsk Żywiołowych, która odbyła się w Lyonie w 1993r
Bezpośrednie porównanie Profil DNA ofiary z katastrofy D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D Profil DNA z dowodowego materiału (szczoteczka do zębów należąca do ofiary) Analiza pokrewieństwa ofiara D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D? żona 11,13 8,12 8,12 8,9 10,12 8,10 żona syn 11,13 8,14 8,9 9,13 10,10 9,10 syn domniemany profil ofiary 11,? or?,13?,14 9,??,13?,10 9,? ofiara (ojciec) profil ofiary z katastrofy 12,13 11,14 9,9 11,13 10,10 9,12 uzyskany profil Figure 24.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Barkoding DNA narzędzie do opisu bioróżnorodności 1. Opis i ewidencja bioróżnorodności 2. Analizy ekologiczne i fitogeograficzne 3. Analizy kryminalistyczne 4. Ustalanie składu żywności oraz leków 5. Kontrola bezpieczeństwa biologicznego 6. Zapobieganie i identyfikacja nielegalnego handlu zwierzętami lub roślinami będącymi pod ochroną 7. Klasyfikacja i opisywanie nowych gatunków
Sprawy kryminalne
Proces analizy mitochondrialnego DNA oczyszczenie i pobranie materiału do badania izolacja mtdna amplifikacja regionu HV1/HV2 metodą PCR sekwencjonowanie amplikonów regionu HV1/HV2 porównanie sekwencji badanych porównanie sekwencji badanych z referencyjną sekwencją Andersona sprawdzenie z bazą danych częstości haplotypowej danej sekwencji
Interpretacja wyników sekwencjonowania mtdna wykluczenie różnica dwóch lub więcej nukleotydów pomiędzy badanymi próbkami brak rozstrzygnięcia różnica w jednym nukleotydzie pomiędzy badanymi próbkami brak wykluczenia brak różnicy w sekwencji nukleotydów pomiędzy badanymi próbkami
Analiza klasycznych cech grupowych w badaniach o ustalenie ojcostwa układ AB0 antygeny erytrocytarne: MNSs, Rh, Kell, Jk(a,b), Fy(a,b) specyficzne białka surowicy krwi: układ GM, haptoglobiny (HP) izoenzymy zawarte w krwinkach czerwonych: APC (kwaśna fosfataza krwinkowa), PGM (fosfoglukomutaza), ESD (esteraza D), GLO (glioksolaza), GPT (aminotransferaza), PGP (fosfataza fosfoglikolanowa) antygeny układu zgodności tkankowej HLA
Badanie ojcostwa testami genetycznymi DNA? Pobranie krwi lub wymazu z jamy ustnej do badania Izolacja DNA Amplifikacja 15 polimorficznych markerów genetycznych techniką PCR (Identifiler) Rozdział produktów amplifikacji techniką zautomatyzowanej elektroforezy sekwenator ABI Prism 377 Interpretacja 5-kolorowego cyfrowego obrazu elektroforezy w teście tym tylko 1 mężczyzna nie będący ojcem, na milion nie będących ojcami pozostanie niewykluczony wykluczenie ojcostwa stwierdzane jest średnio w 9 spośród 15 układów brak wykluczenia ojcostwa jest praktycznie równoznaczny z jego udowodnieniem prawdopodobieństwo napotkania innego mężczyzny, którego ojcostwo nie zostałoby wykluczone w teście wynosi średnio 1 na 9 miliardów
Test na ojcostwo Mężczyzna nie będący ojcem biologicznym? Mężczyzna będący ojcem biologicznym? Matka Dziecko Odwrotny test na ojcostwo (identyfikacja zaginionego dziecka) Domniemany ojciec Domniemana matka Zasady dziedziczenia 1) dziecko ma dwa allele dla każdego markera autosomalnego (jeden od matki i jeden od biologicznego ojca)? Zaginione dziecko 2) dziecko dziedziczy mitochondrialny haplotyp DNA po matce (wyłączając mutacje) 3) dziecko płci męskiej dziedziczy haplotyp chromosomu Y po ojcu (wyłączając mutacje)
Parametry biostatystyczne Prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa (PE) definiuje się jako prawdopodobieństwo, z jakim zastosowany zestaw markerów genetycznych pozwala na wykluczenie niesłusznie pozwanego mężczyzny; czyli określa procent mężczyzn w populacji, którzy nie mogą być biologicznymi ojcami dziecka ze względu na brak wspólnego allela Szansa ojcostwa (PI) interpretując wyniki badań genetycznych rozważamy dwie hipotezy - jedną potwierdzającą ojcostwo, a drugą zaprzeczającą ojcostwu badanego mężczyzny. Wielkość współczynnika PI informuje nas o tym, dla której hipotezy otrzymane wyniki badań genetycznych są bardziej prawdopodobne. Przykładowo, wartość PI = 1 000 000 oznacza, że otrzymany wynik badań genetycznych jest 1 000 000 razy bardziej prawdopodobny przy założeniu, że badany mężczyzna jest biologicznym ojcem, niż przy założeniu, że ojcem dziecka jest inny mężczyzna Prawdopodobieństwo ojcostwa (P) obliczane na podstawie szansy ojcostwa (PI) oraz tzw. prawdopodobieństwa a priori, którego wartość przyjmuje się najczęściej jako 0.5. Gdy wartość P przekracza 99.999999%, szansa ojcostwa (PI) wynosi przynajmniej 1 000 000
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej UJCM