MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 9-14 Ocena wzrostu na podłożu chromid C. difficile Agar klinicznych szczepów Clostridium difficile należących do różnych PCR-rybotypów Evaluation of growth of clinical Clostridium difficile strains belonging to different PCR-ribotypes on chromid C. difficile Agar Paweł Karpiński, Hanna Pituch, Dominika Lachowicz, Michał Piotrowski, Piotr Obuch-Woszczatyński Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Zastosowanie chromogennego podłoża ChromID C. difficile Agar do izolacji klinicznych szczepów Clostridium difficile przyspiesza wykrywanie tego patogenu w próbkach kału chorych z biegunką. Typowe szczepy C. difficile rosną na tym podłożu w postaci ciemnych kolonii. Jednak niektóre warianty mogą rosnąć nietypowo, w postaci jasnych kolonii, co może skutkować nierozpoznaniem tego patogenu. Odsetek polskich szczepów pochodzących z różnych źródeł, które rosły w postaci jasnych kolonii wyniósł ok. 6% i wszystkie należały do PCR-rybotypu 023. Słowa kluczowe: Clostridium difficile, podłoże chromogenne, ChromID C. difficile, PCR-rybotyp 023 ABSTRACT Introduction: Clostridium difficile is main reason of antibiotic-associated diarrhea in hospitalized patients. Diagnostic method for detection of Clostridium difficile infection (CDI) are limited to an enzyme immunoassays (EIAs), while the culture of toxigenic strains is still seen as the gold standard for the laboratory diagnosis. The aim of this study was to compare growth of C. difficile strains belonging to different polymerase chain reaction (PCR) ribotypes on new ChromID C. difficile Agar (CDIFF, biomérieux, Marcy l Etoile, France). Materials and Methods: One hundred thirty one of clinical C. difficile strains stored in Anaerobic Laboratory were cultured on ChromID C. difficile Agar. Ten faecal samples were cultured on the same chromogenic medium and incubated at 37 C for 24 h under anaerobic conditions. Isolates were confirmed as C. difficile on the basis of well-known criteria. PCR-ribotyping was performed by visually comparison of patterns of PCR products of the 16S 23S rrna intergenic spacer region. We examined the occurrence of beta-glucosidase
10 P. Karpiński i inni Nr 1 gene, responsible for the dark color of the colony C. difficile on ChromID C.difficile Agar using a pair of primers: gluf (5 -AAGGT GTAAATTTAGGAGGTTGGTT-3 ) i glur (5 -AGGTCCCAACTATCCC ATCC-3 ). Results: Among ten C. difficile isolates obtained from stool specimens one formed colorless colonies. We received 8 colorless isolates from 131 additional examined strains. All C. difficile isolates forming colorless colonies belonged to PCR ribotype 023. The prevalence of PCR-ribotype 023 was about 6%. We detected lack of beta-glucosidase gene in PCR-ribotype 023 isolates. Conclusions: There are some C. difficile strains forming colorless colonies on ChromID C.difficile Agar. This appearance is important in routine diagnostic use this chromogenic culture medium. Key words: Clostridium difficile, chromogenic culture medium, ChromID C. difficile medium, PCR-ribotype 023 WSTĘP Clostridium difficile to beztlenowa, przetrwalnikująca laseczka, stanowiąca ważny etiologiczny czynnik biegunek szpitalnych (7). W patogenezie biegunki o etiologii C. difficile najważniejszą rolę odgrywają dwie toksyny: toksyna A (TcdA) i toksyna B (TcdB) (4, 5). Niektóre szczepy mogą wytwarzać trzecią toksynę tzw. toksynę binarną. Szczepy C. difficile zarówno toksynotwórcze, jak i nietoksynotwórcze, wytwarzają w dużych ilościach typowe dla C. difficile białko o właściwościach antygenu tj. dehydrogenazę glutaminianową (GDH), którą wykorzystano w testach przesiewowych jako marker zakażenia. Zastosowanie testów immunoenzymatycznych do wykrywania toksyn A/B oraz antygenu C. difficile GDH to powszechnie stosowana metoda rozpoznawania zakażeń C. difficile (10). Wynik ujemny testu immunoenzymatycznego nie zawsze jednak wskazuje na brak zakażenia C. difficile, co w konsekwencji może prowadzić do niewłaściwej diagnozy (2). Metody hodowlane stanowią złoty standard w diagnostyce zakażeń C. difficile i dlatego zostały włączone do schematu postępowania diagnostycznego (3, 8). Wprowadzenie nowoczesnych pożywek selektywnych, jak np. pożywka ChromID C. difficile Agar, znacznie skróciło czas hodowli jak też zwiększyło czułość tej metody (6, 11). W pracy poddano ocenie wzrost klinicznych szczepów C. diffcile należących do różnych PCR-rybotypów na pożywce ChromID C. difficile Agar. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiło 131 klinicznych szczepów C. difficile wyhodowanych z próbek kału chorych z biegunką szpitalną. Szczepy wyhodowano na pożywkach selektywnych, niechromogennych (np. pożywka CLO, biomérieux, Marcy l Etoile, France) stosowanych wcześniej, w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej, przed wprowadzeniem do użytku pożywki ChromID. Szczepy do czasu eksperymentu przechowywano w stanie zamrożenia w temperaturze -70 C z wykorzystaniem systemu Microbank (Pro-Lab Diagnostics).
Nr 1 Wzrost klinicznych szczepów na podłożu chromid C. difficile Agar 11 W badaniach uwzględniono również 10 próbek kału pochodzących od chorych z rozpoznaniem zakażenia C. difficile. W próbkach kału, w ramach rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej, wykryto antygen GDH i toksyny A/B C. difficile stosując test C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE (TechLab, USA). Próbki kału nie były wcześniej posiewane na żadną pożywkę selektywną. Do izolacji szczepów C. difficile z próbek kału zastosowano podłoże chromid C.difficile Agar (biomérieux, Marcy l Etoile, Francja). Hodowlę prowadzono w warunkach beztlenowych w ciągu 24 godz. a wyhodowane szczepy potwierdzano jako C. difficile stosując dodatkowo standardowe metody (1). Typ genetyczny (tzw. PCR-rybotyp) szczepów C. difficile określono stosując metodę PCR-rybotypowanie, opartą na wykrywaniu różnic w profilach amplifikowanych fragmentów DNA w regionie o wysokiej zmienności, położonego między genami kodującymi podjednostki 23SrRNA i 16SrRNA (9). Przeprowadzono również test PCR na obecność genu beta-glukozydazy, enzymu warunkującego reakcję, w wyniku której szczep rośnie na pożywce chromogennej w postaci ciemnych kolonii. W tym celu, zaprojektowano startery do wykrywania genu glu za pomocą programu Primer 3 Plus. Zastosowano startery gluf (5 -AAGGTGTAAATTTAGGAGGTT- GGTT-3 ) i glur (5 -AGGTCCCAACTATCCC ATCC-3 ) i ustalono profil temperaturowy: denaturacja wstępna 5 min 94 C, następnie 35 cykli denaturacja 30s, hybrydyzacja starterów 30 sek, 55 C, elongacja 1min, 72 C oraz elongacja końcowa 5min 72 C. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Spośród 131 szczepów C. difficile posianych na podłoże chromid C. difficile Agar, 123 szczepy rosły w postaci typowych, ciemnych kolonii, natomiast 8 szczepów rosło w postaci jasnych kolonii (Ryc.1-2). Przeprowadzono PCR-rybotypowanie 131 szczepów i określono, że należały one do PCR-rybotypów: 001, 014, 017, 023, 027, 046 i 176. Wszystkie szczepy Ryc. 1 Wzrost szczepów C.difficile o PCR-rybotypie 023 na podłożu chromid C.difficile.
12 P. Karpiński i inni Nr 1 Ryc. 2 Porównanie wzrostu C.difficile na podłożu chromid C.difficile w zależności od PCR-rybotypu. należące do PCR-rybotypu 023 rosły w postaci jasnych kolonii, natomiast pozostałe rosły w postaci ciemnych kolonii. Z każdej z 10 próbek kału wyhodowano szczep C. difficile (n=10). Dziewięć szczepów wyrosło w postaci ciemnych kolonii a jeden szczep rósł nietypowo, dając jasne kolonie. Za pomocą metody PCR-rybotypowanie ten szczep przypisano do PCR-rybotypu 023. Szczepy należące do PCR-rybotypu 023 są toksynotwórcze i wytwarzają toksynę A i B oraz posiadają geny toksyny binarnej. Badania populacji polskich szczepów szpitalnych potwierdziły obserwacje innych autorów, że szczepy należące do PCR-rybotypu 023, mogą rosnąć w postaci jasnych koloni (7). Natomiast nie potwierdzono w naszej pracy, obserwacji tychże autorów, że bezbarwne kolonie tworzą też izolaty należące do PCR-rybotypu 001. Żaden z polskich szczepów należących do PCR-rybotypu 001 nie rósł w postaci jasnych kolonii i charakteryzowały się one typowym, ciemnym wzrostem na podłożu chromogennym. Odsetek szczepów izolowanych w Polsce należących do PCR-rybotypu 023 o jasnej barwie kolonii wyniósł 5,7%. Odsetek szczepów należących do PCR-rybotypu 023 w pracy Perry i wsp. był ponad 8-krotnie niższy (7). Szczepy PCR-rybotypu 023 zbadano również pod względem występowania genu kodującego beta-glukozydazę, enzymu odpowiedzialnego między innymi za charakterystyczny kolor kolonii na podłożu ChromID C. difficile Agar. Zaobserwowano brak genu beta-glukozydazy w szczepach należących do PCR-rybotypu 023, które rosły w postaci jasnych kolonii. Jako szczepów kontrolnych użyto izolatów rosnących typowo na podłożu chromogennym, należących między innymi do PCR-rybotypów: 017, 027 oraz 176. W szczepach tych wykryto fragment genu beta-glukozydazy o długości 1114 par zasad (Ryc.3).
Nr 1 Wzrost klinicznych szczepów na podłożu chromid C. difficile Agar 13 Ryc.3 Porównanie występowania genu beta-glukozydazy u szczepów o PCR-rybotypie 023 z innymi PCR-rybotypami. (1 GENERULER 100BP DNA LADDER PLUS, READY-TO- -USE, 2-4 PCR-rybotyp 023, 5 PCR-rybotyp 039, 6 PCR-rybotyp 017, 7 PCR-rybotyp 176, 8 PCR-rybotyp 027) PODSUMOWANIE Zastosowanie pożywki Chrom ID C. difficile Agar do izolacji szczepów C. difficile z próbek kału biegunkowego znacznie skraca czas hodowli szczepów. Jest to związane między innymi z krótszym okresem hodowli (24 godziny), w porównaniu do innych pożywek selektywnych (48 godzin), jak też możliwością przyspieszenia wstępnej identyfikacji szczepu ze względu na charakterystyczny wzrost. Należy jednak brać pod uwagę możliwość wystąpienia w Polsce szczepów C. difficile, które rosną na tym podłożu nietypowo, w postaci jasnych kolonii. Występowanie takich szczepów szacuje się na poziomie około 6%. Szczepy te mogą być pomijane w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej ze względu na ich nietypowy wzrost. W związku z tym zaleca się bardzo wnikliwą ocenę wzrostu na pożywce ChromID Agar wyhodowanych szczepów z próbek kału pacjentów z podejrzeniem biegunki poantybiotykowej, w szczególności jeśli obserwuje się mieszaną hodowlę (jasnych i ciemnych kolonii) lub obserwuje się,,monokulturę w postaci jasnych kolonii na ciemnym podłożu. Uważna obserwacja z zastosowaniem lupy umożliwia wykrycie tych szczepów ze względu na charakterystyczny kształt kolonii szczepów C. difficile mimo ich nietypowego koloru. Praca została sfinansowana z grantu NCN nr DEC-2011/01/B/NZ7/02720.
14 P. Karpiński i inni Nr 1 PIŚMIENNICTWO 1. Carman RJ, Wickham KN, Chen L i inni. Glutamate dehydrogenase is highly conserved among Clostridium difficile ribotypes. J Clin Microbiol 2012; 50: 1425-6. 2. Eastwood K, Else P, Charlett A i inni. Comparison of nine commercially available Clostridium difficile toxin detection assays, a real-time PCR assay for C. difficile tcdb, and a glutamate dehydrogenase detection assay to cytotoxin testing and cytotoxigenic culture methods. J Clin Microbiol 2009; 47: 3211 7. 3. Kądzielska J, Pituch H, Banaszkiewicz A i inni Ocena przydatności podłoża chromogennego do izolacji Clostridium difficile z przewodu pokarmowego dzieci z biegunką. Med Dośw Mikrobiol 2012; 64: 197-201. 4. Kuehne SA, Cartman ST, Minton NP. Both, toxin A and toxin B, are important in Clostridium difficile infection. Gut Microbes 2011; 2: 252-5. 5. Obuch-Woszczatynski P, Lachowicz D, Schneider A. Occurrence of Clostridium difficile PCR-ribotype 027 and it s closely related PCR-ribotype 176 in hospitals in Poland in 2008-2010. Anaerobe 2014; 28: 13-7. 6. Perry JD, Asir K, Halimi D i inni. Evaluation of a chromogenic culture medium for isolation of Clostridium difficile within 24 hours. J Clin Microbiol 2010; 48: 3852 8. 7. Rupnik M, Wilcox MH, Gerding DN. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nat Rev Microbiol 2009; 7: 526-36. 8. Shin BM, Kuak EY, Lee E J i inni. Algorithm combining toxin immunoassay and stool culture for diagnosis of Clostridium difficile infection. J Clin Microbiol 2009; 47: 2952 6. 9. Stubbs SL, Brazier JS, O Neill GL i inni. PCR targeted to the 16S-23S rrna gene intergenic spacer region of Clostridium difficile and construction of a library consisting of 116 different PCR ribotypes. J Clin Microbiol 1999; 37: 461 3. 10. Swindells J, Brenwald N, Reading N. Evaluation of diagnostic tests for Clostridium difficile infection. J Clin Microbiol 2010; 48: 606-08. 11. Yang J, Nam Y, Kim M. Evaluation of a Chromogenic Culture Medium for the Detection of Clostridium difficile. Yonsei Med J 2014; 55: 994-8. Otrzymano: 10 III 2015 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego