Biotechnologia szans¹ dla zastosowania allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów

PRACE PRZEGL DOWE Biotechnologia szans¹ dla zastosowania allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów Agnieszka Gniazdowska Katedra Fizjologii Roœlin, Wydzia³ Rolnictwa i Biologii, Szko³a G³ówna Gospodarstwa Wiejskiego, Warszawa Biotechnology a chance for using allelopathy as alternative weed management strategy Summary Adres do korespondencji Agnieszka Gniazdowska, Katedra Fizjologii Roœlin, Wydzia³ Rolnictwa i Biologii, Szko³a G³ówna Gospodarstwa Wiejskiego, ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa; e-mail: agnieszka_gniazdowska@ sggw.pl 2 (77) 42 53 2007 Plants (crops and weeds) affect each other through allelochemicals, which may be released from living and dead organisms. Due to an increase in the number of herbicide resistant weeds and herbicides negative effect on the environment, there is an effort being made to design alternative weed management strategies. Allelopathic studies offer a challenge for a discovery of new compounds with new target side that may be able to control weeds. Crops producing allelochemicals can interfere with competing weeds sufficiently enough to allow significant reductions in the use of other weed management options, including synthetic herbicides. Some attempts enhancing the allelopathic potential of crops (rice, sorghum, barley and wheat) to control weeds are presented. Key words: allelopathy, allelochemicals, herbicide, weed management. 1. Wstêp Czym jest allelopatia? Wzajemne oddzia³ywania pomiêdzy roœlinami s¹ znane i obserwowane od wieków, jednak dopiero Hans Molish w 1937 r. zdefiniowa³ to zjawisko, wprowadzaj¹c pojêcie allelopatii. Okreœla ono interakcje wystêpuj¹ce w uk³adach: roœliny-roœliny, roœliny-mikroorganizmy oraz mikroorganizmy-mikroorganizmy. S¹ to

Biotechnologia szans¹ dla zastosowania allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów oddzia³ywania biochemiczne o charakterze zarówno szkodliwym jak i korzystnym (1). Na pierwszym œwiatowym kongresie allelopatii w 1996 r. rozszerzono tê definicjê i uznano, e allelopatia to zjawisko, w którym zaanga owane s¹ wtórne metabolity, wytwarzane przez roœliny, mikroorganizmy i grzyby, wp³ywaj¹ce na wzrost i rozwój systemów biologicznych i rolniczych. Zwi¹zki allelopatyczne (allelopatiny) s¹ to produkty metabolizmu wtórnego roœliny-donora, które po dostaniu siê do œrodowiska oddzia³uj¹ na znajduj¹ce siê w s¹siedztwie roœliny-akceptory. Dzia³anie allelopatin ujawnia siê na wszystkich poziomach organizacji ywego organizmu: od fizjologicznego przez komórkowy, po molekularny, a pod wzglêdem chemicznym obejmuj¹ one ró norodne zwi¹zki organiczne. S¹ wœród nich wystêpuj¹ce w formie gazowej terpeny: -pinen, -pinen, kamfen, cyneol obecne np. w tkankach bylic (roœliny z rodzaju Artemisia) (2), jak te skomplikowane, wielopierœcieniowe seskwiterpenoidy-heliannany np. heliannuole, laktony seskwiterpenów np. annuolid F ze s³onecznika (Helianthus annuus) (3). G³ówne klasy zwi¹zków allelopatycznych zosta³y szczegó³owo omówione w pracach przegl¹dowych Vyvyan (4) oraz Singh i wsp. (5). Wydzielanie zwi¹zków allelopatycznych do œrodowiska mo e odbywaæ siê na ró nej drodze: uwalniania lotnych substancji (ewaporacja); wymywania (³ugowanie) przez wodê z opadów atmosferycznych, wodê irygacyjn¹ lub rosê; wydzielania przez system korzeniowy (eksudacja); rozk³adu obumar³ych czêœci roœlin. Poszczególne drogi dostawania siê zwi¹zków allelopatycznych do œrodowiska zosta³y omówione w pracach w jêzyku polskim, m.in. przez Wójcik-Wojtkowiak i wsp. (6) oraz Gniazdowsk¹ i wsp. (7). Nagromadzone w glebie zwi¹zki allelopatyczne pochodz¹ zarówno od roœlin uprawnych, roœlin dziko rosn¹cych, chwastów, jak te mog¹ byæ metabolitami mikroorganizmów glebowych. 2. Allelopatia chwastów Od drugiej po³owy XX w. wzros³o zainteresowanie oddzia³ywaniami allelopatycznymi miêdzy chwastami i roœlinami uprawnymi. Dostarczano coraz wiêcej dowodów, e roœliny uprawne i chwasty wprowadzaj¹ do œrodowiska zwi¹zki chemiczne, które mog¹ byæ toksyczne zarówno dla nich samych, jak równie dla innych gatunków (6). Pojawi³o siê szereg doniesieñ wskazuj¹cych, e niekorzystny wp³yw zachwaszczenia na uprawy jest zwi¹zany nie tylko z konkurencj¹ o œwiat³o, wodê i zwi¹zki mineralne, ale tak e mo e byæ wynikiem produkowania przez chwasty allelopatin dzia³aj¹cych jako inhibitory wzrostu i rozwoju roœlin uprawnych. Roœliny nale ¹ce do rodzaju Artemisia to chwasty, wystêpuj¹ce powszechnie w Azji, Europie i Ameryce Pó³nocnej. Bylica pospolita (A. vulgaris) stanowi jeden z najwiêkszych problemów w szkó³kach we wschodnich Stanach Zjednoczonych Ameryki Pó³nocnej (8). Posiada zdolnoœæ do wytwarzania silnego systemu korzeniowego i jest odporna na herbicydy, a tak e toleruje powtarzaj¹ce siê koszenie. Z kolei A. campestris, A. annua, A. herba alba i A. princeps var. orientalis tworz¹ gêste monokultury (9,10). Przyczyn¹ BIOTECHNOLOGIA 2 (77) 42-53 2007 43

Agnieszka Gniazdowska tego zjawiska mo e byæ zdolnoœæ tych roœlin do syntezy du ych iloœci olejków eterycznych w specjalnych gruczo³ach zlokalizowanych na powierzchni liœci. Wykazano w nich obecnoœæ kamfory, kamfenu, cyneolu, a tak e artemizininy. Zarówno liœcie jak i wodne ekstrakty Artemisia silnie hamuj¹ wzrost roœlin uprawnych. Tak e gleba pobrana z miejsc zajmowanych przez bylice hamuje wzrost i rozwój wielu gatunków roœlin oraz grzybów mikorytycznych. Nie poznano, jak dot¹d, molekularnego pod³o a oddzia³ywañ tych substancji, jednak e wydaje siê, e charakteryzuj¹ siê mechanizmami dzia³ania, ró nymi od mechanizmów dzia³ania typowych dla komercyjnych herbicydów (11). Wulpia mysi ogon (Vulpia myuros) pochodz¹ca z krajów œródziemnomorskich sta³a siê inwazyjnym chwastem Australii. Powoduje dotkliwe straty w plonach i jakoœci zbó, a walka z ni¹ jest utrudniona z uwagi na niewra liwoœæ na wiêkszoœæ syntetycznych herbicydów, ponadto pozosta³oœci tej roœliny wykazuj¹ znaczn¹ toksycznoœæ (12). W wodnych ekstraktach z resztek V. myuros, zidentyfikowano 20 aktywnych zwi¹zków, m.in. katechol, pirogallol, alkohol koniferylowy, kwasy benzoesowy, bursztynowy, hydrocynamonowy, salicylowy, protokatechusowy, wanilinowy, syringowy, p-hydroksybenzoesowy, dihydroferulowy, p-kumarowy, dihydrokawowy, ferulowy. Allelopatiny obecne w du ej iloœci, np kwasy: syringowy, wanilinowy, bursztynowy wykazuj¹ nisk¹ aktywnoœæ allelopatyczn¹, podczas gdy te obecne w ma³ych iloœciach: kwas hydrocynamonowy, katechol wykazuj¹ wysok¹ aktywnoœæ inhibitorow¹. Na podstawie wyników z przeprowadzonych eksperymentów wskazuje siê, e w oddzia³ywaniu allelopatycznym u wulpi o wiele wiêksze znaczenie ma mieszanina zwi¹zków allelopatycznych i powstaj¹ce efekty addytywne lub/i synergistyczne ni pojedyncze, bardzo aktywne allelopatiny (13). Okazuje siê, e agresywnoœæ perzu w³aœciwego (Agropyron regens) wynika nie tylko z konkurencji, ale ma równie pod³o e chemiczne. W wydzielinach korzeniowych tej roœliny zidentyfikowano szereg allelopatin, m.in. kwasy: wanilinowy, 4-hydrocynamonowy, ferulowy, protokatechusowy, syringowy, a tak e kwasy hydroksamowe np. DIBOA (2,4-dihydroksy-1,4(2H)benzoksazyn-3-on), dla których obserwowano najwy sz¹ aktywnoœæ allelopatyczn¹ (14). Euroazjatyckie gatunki z rodzaju Centaurea zachwaszczaj¹ zarówno pastwiska jak i pola uprawne Ameryki Pó³nocnej i Po³udniowej. Chaber plamisty (C. maculosa) inwazyjny chwast w zachodniej Ameryce Pó³nocnej wytwarza mieszaninê stereoizomerów (+)-katechinê i (-)-epikatechinê, gromadz¹ce siê w glebie wokó³ korzeni. Katechina hamuje rozwój i wzrost rodzimych gatunków traw Ameryki Pó³nocnej, a roœliny na ni¹ wra liwe reaguj¹ œmierci¹ komórek, postêpuj¹c¹ od wierzcho³ka korzenia (15). Badania nad rol¹ allelopatii w inwazyjnym sukcesie niektórych chwastów mog¹ pozwoliæ na skonstruowanie w przysz³oœci genetycznie zmodyfikowanych roœlin uprawnych, które bêd¹ odporne na allelopatiny wydzielane przez chwasty. Teoretycznie, mo liwe jest wprowadzenie do genomu roœlin uprawnych takich genów, których produkty bêd¹ bra³y udzia³ w procesie enzymatycznej detoksykacji allelopatin, na które gatunki uprawne s¹ obecnie wra liwe. 44 PRACE PRZEGL DOWE

Biotechnologia szans¹ dla zastosowania allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów 3. Allelopatiny w walce z chwastami Walka z zachwaszczeniem upraw w 2 po³owie XX w. w du ej mierze opiera³a siê na stosowaniu syntetycznych herbicydów. Wzmo one u ycie syntetycznych herbicydów w rolnictwie spowodowa³o jednak wzrost liczby roœlin odpornych na stosowane œrodki ochrony i zagro enie œrodowiska wynikaj¹ce z nagromadzania siê chemikaliów w glebie i wodach. Heap (16) podaje, e 177 gatunków chwastów (106 dwuliœciennych i 71 jednoliœciennych) podleg³o ewolucji prowadz¹cej do uzyskania odpornoœci na herbicydy. W Australii ycica (Lolium ridigum), pospolity i niezwykle agresywny chwast wykazuje odpornoœæ na herbicydy 9 g³ównych grup (16). Podobna odpornoœæ na herbicydy charakteryzuje tak e: owies g³uchy (Avena fatua), szar³at szorstki (Amaranthus retroflexus), komosê bia³¹ (Chenopodium album), w³oœnicê zielon¹ (Setaria viridis), chwastnicê jednostronn¹ (Echinochloa crus-galli), manneczkê piaskow¹ (Eleusine India), mietelnik akulê (Kochia skoparia) oraz przymiot³o kanadyjskie (Conyza canadensis) (17). Nabycie przez chwasty odpornoœci na herbicydy, definiowanej jako naturalna zdolnoœæ do prze ycia i reprodukcji po zastosowaniu letalnej dla innych roœlin tego samego gatunku dawki herbicydu, stwarza koniecznoœæ szukania innych ekologicznych sposobów ograniczania i zwalczania zachwaszczenia. W krajach cz³onkowskich Unii Europejskiej dokonuje siê przegl¹du œrodków ochrony roœlin, którego celem jest upewnienie siê, e bezpieczeñstwo œrodków ochrony roœlin dla ludzi, zwierz¹t i œrodowiska oceniane jest na podstawie nowoczesnych standardów wynikaj¹cych z aktualnego stanu wiedzy. Szacuje siê, e efektem tego dzia³ania bêdzie zmniejszenie o oko³o 60% liczby obecnie stosowanych substancji aktywnych. Wœród œrodków, które wycofuje siê ze sprzeda y znajduj¹ siê herbicydy zawieraj¹ce nastêpuj¹ce substancje aktywne: atrazynê, benazolinê, bromacyl, cyanazynê, cykloat, dichloroprop, dimefuron, fluoroglikofen, imazapyr, imazetapyr, metobromuron, napalam, prometrynesetoksydym, symazynê, terbacyl, terbutrynê (17). Mechanizm dzia³ania syntetycznych herbicydów dotyczy hamowania podstawowych procesów yciowych roœliny. Herbicydy hamuj¹ proces fotosyntezy (wœród nich mo na rozró niæ: inhibitory transportu elektronów, fosforylacji fotosyntetycznej, akceptacji elektronów), proces oddychania, ró norodne procesy biosyntezy (dotyczy to biosyntezy kwasów t³uszczowych i lipidów, aminokwasów i bia³ek), podzia³y komórkowe i wzrost merystemów. Istnieje te grupa herbicydów o dzia³aniu zbli onym do naturalnej auksyny. Kompleksowy opis mechanizmów dzia³ania wiêkszoœci stosowanych herbicydów syntetycznych znajdzie zainteresowany czytelnik w obszernym opracowaniu w jêzyku polskim (17). Istnieje jednak pilna potrzeba stworzenia nowych herbicydów spe³niaj¹cych warunki stawiane idealnym œrodkom ochrony roœlin, takie jak: efektywnoœæ (w dawkach oko³o 500 mg/ha) i szerokie spektrum dzia³ania, odpornoœæ na deszcz, elastycznoœæ terminu aplikacji i wysoki poziom bezpieczeñstwa (brak dzia³ania rakotwórczego i toksycznego dla ludzi i zwierz¹t), niskie koszty produkcji (18). Ogromna ró norodnoœæ allelopatin wystêpuj¹- BIOTECHNOLOGIA 2 (77) 42-53 2007 45

Agnieszka Gniazdowska cych w tkankach roœlinnych, jak siê wydaje, mo e byæ podstaw¹ do konstruowania na ich bazie herbicydów. Spoœród znanych allelopatin, które mog³yby byæ u yte jako naturalne herbicydy nale y wymieniæ: chinony juglon i sorgoleon; monoterpeny 1,8 cyneol i jego analog cinmetylinê, uwa an¹ za pierwszy dostêpny na rynku alleloherbicyd; laktony seskwiterpenów: artemizininê i dehydrozaluzaninê C (4) (rys.). Tym bardziej, e biochemiczny mechanizm dzia³ania tych allelopatin jest w du ej mierze poznany (11,19-21). St¹d, wykorzystanie ich do walki biologicznej z chwastami wzbudza coraz wiêksze zainteresowanie (8,22-24). Od lat w rolnictwie zachowawczym stosowane s¹ konwencjonalne metody zwalczania chwastów oparte na allelopatii. Polegaj¹ one na: 1) zastosowaniu roœlin allelopatycznych jako Ÿród³a naturalnych œrodków ochrony roœlin: w postaci wyci¹gów, ekstraktów, wyp³uczyn, np. ze s³omy, posprzêtnych pozosta³oœci roœliny allelopatycznej w systemie bezorkowym, rotacji upraw (zmianowanie), upraw z wsiewk¹; 2) tradycyjnej metodzie selekcji i hodowli roœlin uprawnych, które bêd¹ wygrywa³y konkurencjê z chwastami dziêki wysokiemu potencja³owi allelopatycznemu. Genotypy ogórka, ry u, sorgo i jêczmienia s¹ selekcjonowane w celu wzmocnienia zdolnoœci do syntezy metabolitów wtórnych, odpowiadaj¹cych za hamowanie wzrostu i rozwoju chwastów. Jednak, jak na razie, próby te nie da³y komercyjnie zadowalaj¹cych efektów (25,26). Wraz z rozwojem biotechnologii (biologii molekularnej i chemii organicznej) otwiera siê jednoczeœnie nowa szansa dla podniesienia efektywnoœci i skutecznoœci allelopatii stosowanej jako alternatywna metoda ochrony roœlin. Koncepcje wykorzystania obserwowanych w naturze oddzia³ywañ allelopatycznych dotycz¹: 1) izolacji i produkcji allelopatin o charakterze herbicydów z roœlin, w których metodami in ynierii molekularnej doprowadzono do zwiêkszonej syntezy tych allelopatin; 2) konstruowania transgenicznych roœlin uprawnych zdolnych do produkcji allelopatin dzia³aj¹cych jako herbicydy; 3) syntezy herbicydów o strukturze chemicznej naturalnych allelopatin. 4. Próby okreœlenia molekularnych podstaw potencja³u allelopatycznego niektórych roœlin uprawnych Do najintensywniej badanych roœlin uprawnych charakteryzuj¹cych siê wysokim potencja³em allelopatycznym nale ¹ ry (Oryza sativa) i sorgo (Sorghum bicolor). Przebadano wiele odmian i linii ry u pod k¹tem oddzia³ywañ tej roœliny uprawnej na wzrost pospolitych chwastów (27). Podczas wieloletnich badañ nad allelopati¹ ry u doprowadzono do identyfikacji du ej liczby zwi¹zków chemicznych produkowanych przez tê roœlinê i obecnych w jej wydzielinach korzeniowych: momilacton B (28), rezorcynole, flawony, benzoksazolinony, cykloheksanony i pochodne glikozydowe (29). Ze wzglêdu na mnogoœæ allelopatin wydzielanych przez ró ne odmiany ry u, jak siê wydaje, trudno mówiæ o konkretnym zwi¹zku odpowiedzialnym za allelopatiê tej roœliny. Dodatkowo, z uwagi na obecnoœæ tak wielu zwi¹zków allelo- 46 PRACE PRZEGL DOWE

Biotechnologia szans¹ dla zastosowania allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów patyczych w tkankach ry u ich dzia³anie mo e byæ synergistyczne lub addytywne. Jednak sklonowanie kompletnego genomu ry u (30,31) da³o mo liwoœæ identyfikacji genów zwi¹zanych z produkcj¹ najwa niejszych allelopatin ry u. Xu i wsp. (32) zidentyfikowali gen koduj¹cy syntazê difosforanu syn-kopalylu odgrywaj¹c¹ g³ówn¹ rolê w syntezie momilactonu. Dayan i wsp. (33) zidentyfikowali enzym uczestnicz¹cy w tworzeniu pochodnych rezocynolowych obecnych w wydzielinach korzeniowych ry u. Uda³o siê im te zidentyfikowaæ 8 sekwencji odpowiadaj¹cych potencjalnym genom koduj¹cym ten enzym. Jednym ze zwi¹zków magazynowanych w du- ych iloœciach w tkankach ry u jest równie kwas p-kumarowy. Hydrolaza kwasu cynamonowego (CA4H) enzym katalizuj¹cy przekszta³cenie kwasu cynamonowego do p-kumarowego odgrywa g³ówn¹ rolê w biosyntezie zwi¹zków fenolowych u roœlin. Zaobserwowano, e aktywnoœæ CA4H jest indukowana przez œwiat³o UV (34). U yto zatem specyficznego promotora CASC aktywowanego przez œwiat³o UV w celu skonstruowania transgenicznego ry u, u którego mo na bêdzie regulowaæ syntezê fenylopropanoidów za pomoc¹ œwiat³a UV (35). Podjêto równie próby zmapowania loci cech iloœciowych odpowiedzialnych za potencja³ allelopatyczny ry u (26,36). Bach-Jansen i wsp. (26) badali loci cech iloœciowych (QTLs) allelopatii ry u w populacji 142 lini rekombinantów powsta³ych z krzy owania dwóch odmian ry u ró ni¹cych siê znacz¹co potencja³em alleopatycznym w stosunku do E. crus-galli, wybrano odmianê IAC 165 o wysokim potencjale allelopatycznym i odmianê CO 39 o niskim potencjale allelopatycznym. Zbadano 140 markerów genetycznych i zidentyfikowano cztery QTLs rozmieszczone na trzech chromosomach. Dwa spoœród zidentyfikowanych QTLs s¹ zlokalizowane na chromosomie 3 i, jak siê wydaje, s¹ stosunkowo ³atwe do manipulacji. Z kolei analiza RFLP (polimorfizm d³ugoœci fragmentów restrykcyjnych) przeprowadzona przez Ebana i wsp. (37) pozwoli³a na identyfikacjê siedmiu QTLs cechy allelopatii u ry u, rozmieszczonych na szeœciu chromosomach. W tym przypadku wariacja fenotypowa wynosi³a od 9,4 do 16,1%. Podobn¹ próbê identyfikacji loci cech iloœciowych allelopatii u pszenicy (Triticum aestivum) wykonali Wu i wsp. (38). Zbadali oddzia³ywania allelopatyczne pszenicy w stosunku do L. ridigum. U yli 271 linii podwójnych haploidów otrzymanych z roœlin pszenicy o wysokim i niskim potencjale allelopatycznym. Zaobserwowano ró nice w aktywnoœci allelopatycznej otrzymanych podwójnych haploidach okreœlane jako procent hamowania wzrostu korzenia chwastu, kszta³tuj¹ce siê w granicach 23,7-88,3%. Na podstawie analizy RFLP, AFLP (polimorfizm d³ugoœci amplifikowanego fragmentu) i SSRs (mikrosatelitarny polimorfizm krótkich tandemowych powtórzeñ) wykonano identyfikacjê dwóch QTLs allelopatii pszenicy rozmieszczonych na chromosomie 2. Potencja³ allelopatyczny pszenicy podobnie jak ry u i yta zwi¹zany jest g³ównie z biosyntez¹ kwasów hydroksamowych, takich jak DIBOA (2,4-dihydroksy-1,4(2H)benzoksazyn-3-on), DIMBOA (2,4-dihydroksy-7-metoksy-1,4-benzoksazyn-3-on) i benzoksazolinonów BOA (2(3H)-benzoksazolinon), MBOA (6-metoksy-2(3H)-benzoksazolinon) (rys.) (39). Najwiêksz¹ przysz³oœæ, jak siê wydaje, ma sorgo jako Ÿród³o allelopatin i potencjalny przedmiot manipulacji biotechnologicznych. Zaobserwowano, e sorgoleon BIOTECHNOLOGIA 2 (77) 42-53 2007 47

Agnieszka Gniazdowska (rys.) jest wydzielany przez komórki w³oœnikowe korzeni sorgo do ryzosfery. Wydzieliny korzeniowe sorgo zawieraj¹ oko³o 85-90% czystego sorgoleonu, a stê enie tego zwi¹zku w glebie na której roœnie sorgo dochodzi do 10-5 -10-4 M (19). Sorgoleon stosowany dolistnie w stê eniach podobnych jak atrazyna (0,6 kg ha -1 ) hamowa³ wzrost 14-dniowych siewek ró nych jedno- i dwuliœciennych chwastów (40). Podobnie, przedsiewne stosowanie sorgoleonu by³o toksyczne dla wiêkszoœci chwastów (41). Yang i wsp. (42) wykorzystuj¹c dwa ró ne systemy uprawy roœlin sorgo, w których uda³o siê uzyskaæ siewki sorgo nie wykszta³caj¹ce w³oœników (nie syntetyzuj¹ce sorgoleonu) i wykszta³caj¹ce prawid³owe w³oœniki (zdolne do biosyntezy sorgoleonu) zidentyfikowali gen SOR1 warunkuj¹cy syntezê sorgoleonu. Dayan i wsp. (43) zidentyfikowali nie znan¹ dot¹d desaturazê kwasów t³uszczowych, która mo e byæ odpowiedzialna za unikatowy wzorzec rozmieszczenia nienasyconych wi¹zañ w ³añcuchu alifatycznym cz¹steczki sorgoleonu. Bia³ko SOR1 bêd¹ce produktem genu SOR1 pod wzglêdem sekwencji aminokwasowej wykazuje podobieñstwo do desaturaz omega-3 kwasów t³uszczowych wystêpuj¹cych u ry u i pszenicy (42). Obecnie trwaj¹ prace nad testowaniem funkcji genu SOR1 w Arabidopsis thaliana. Byæ mo e, podstaw¹ w wyjaœnieniu roli genu SOR1 w kreowaniu potencja³u allelopatycznego sorgo bêd¹ doœwiadczenia prowadz¹ce do uzyskania roœlin tego gatunku z nadekspresj¹ lub wyciszeniem genu SOR1. Identyfikacja genu SOR1 mo e staæ siê kamieniem milowym w zastosowaniu allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów. Próby genetycznych manipulacji prowadz¹cych do zwiêkszenia syntezy allelopatin w roœlinach, jak na razie pozostaj¹ niestety na poziomie badañ wstêpnych. Jednak nale y pamiêtaæ, e metody in ynierii molekularnej mog¹ byæ niezwykle przydatnym narzêdziem w uzyskiwaniu ekologicznych herbicydów opartych na zwi¹zkach allelopatycznych. Konieczne jest ponadto prowadzenie interdyscyplinarnych badañ, które obok identyfikacji zwi¹zków allelopatycznych i genów odpowiedzialnych za cechy allelopatyczne bêd¹ dotyczy³y okreœlenia mechanizmów dzia³ania allelopatin i reakcji roœlin na ich obecnoœæ w œrodowisku. 5. Allelopatiny jako podstawa dla opracowania struktury nowych herbicydów S³onecznik (H. annuus) wykazuje silne dzia³anie allelopatyczne w stosunku do wielu roœlin uprawnych i pospolitych chwastów (44). Z tkanek tej roœliny wyizolowano ponad 100 ró nych zwi¹zków (niektóre charakterystyczne tylko dla s³onecznika, np. heliannany i heliespirany) wykazuj¹cych dzia³anie podobne do syntetycznych herbicydów. Zespó³ biochemików z pracowni Maciasa stosuj¹c s³onecznik jako roœlinê modelow¹ podj¹³ próby opracowania nowych herbicydów w oparciu na badaniach zale noœci pomiêdzy struktur¹ zwi¹zku allelopatycznego a jego funkcj¹ fizjologiczn¹ w roœlinie akceptorze. Tak¹ strategiê mo na by nazwaæ podpatrywaniem 48 PRACE PRZEGL DOWE

Biotechnologia szans¹ dla zastosowania allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów przyrody (44). Zosta³a ona szczegó³owo przedstawiona w polskim opracowaniu Maciasa i wsp. (45). Podobnie, chemiczne modyfikacje allelopatin, takich jak kostunolidy: kostunolacton i cynaropikryna, produkowanych w tkankach kostusa (Saussurea lappa) oraz karczocha (Cynara scolymus) pozwoli³y na uzyskanie ponad 20 ró nych pochodnych, wykazuj¹cych aktywnoœæ herbicydow¹ w stosunku do L. rigidum i E. crus-galli wy sz¹ ni syntetyczny Logran (46). Szczególnie aktywne okaza³y siê pochodne oksyetanolaktonowe otrzymane w wyniku modyfikacji kostunolaktonu (46). Przyk³adem skutecznego wdro enia do praktyki rolniczej wyników badañ nad dzia³aniem allelopatin jest mezotrion (2-[4-(methylosulfonylo)2-nitrobenzoilo]cykloheksano-1,3-dion) (nazwa produktu Callisto), herbicyd opracowany przez firmê Syngenta AG, u ywany do zwalczania chwastów w uprawach kukurydzy. Jest to synte- Rys. Wzory strukturalne niektórych allelopatin, mog¹cych znaleÿæ zastosowanie jako naturalne herbicydy. BIOTECHNOLOGIA 2 (77) 42-53 2007 49

Agnieszka Gniazdowska tyczna pochodna leptospermonu (rys.) syntetyzowanego przez korzenie kuflika cytrynowego (Callistemon citrinus) (47). Zwi¹zek ten zosta³ odkryty przypadkowo, gdy jeden z biologów firmy Syngenta zauwa y³, e w jego przydomowym ogródku pod C. citrinus nie rosn¹ inne roœliny. Zafascynowany t¹ obserwacj¹ pobra³ próbki gleby spod C. citrinus i rozpocz¹³ proces identyfikacji substancji odpowiadaj¹cej za to zjawisko, a nastêpnie zsyntetyzowa³ jej pochodne. Próby wykonane z u yciem czystego leptospermonu nie by³y obiecuj¹ce, widoczny efekt hamowania wzrostu pospolitych chwastów obserwowano przy bardzo wysokiej dawce allelopatiny, wynosz¹cej 9000 gramów na hektar. Dopiero w przypadku mezotrionu (2-[4-(methylosulfonylo)2-nitrobenzoilo]cykloheksano-1,3-dion) bêd¹cego pochodn¹ leptospermonu wykazano wysok¹ skutecznoœæ jako herbicydu stosowanego w dawkach 75-225 gramów na hektar (47). Od 2000 r. Callisto jest dopuszczony do u ycia w Stanach Zjednoczonych Ameryki Pó³nocnej oraz niektórych krajach Europy w tym równie w Polsce. Jest to przypadek œwietnie ilustruj¹cy mo liwoœæ wykorzystania allelopatii do uzyskiwania œrodków ochrony roœlin, bezpiecznych dla ludzi i œrodowiska naturalnego. Jednoczeœnie cyjanamid oraz jego sole (g³ównie cyjanamid wapnia) s¹ syntetycznymi zwi¹zkami stosowanymi od ponad stu lat jako nawozy i herbicydy, jednak dopiero w ostatnim czasie obecnoœæ tego zwi¹zku zosta³a wykazana w tkankach wyki kosmatej (Vicia villosa) (48). Roœlina ta jest obecnie testowana w sadach i na polach ry owych Japonii jako naturalna ochrona przed chwastami (49). 6. Ryzyko zwi¹zane z zastosowaniem allelopatii w praktyce rolniczej 6.1. Ewolucyjne wykszta³canie odpornoœci chwastów na allelopatiny Podobnie jak w przypadku nabywania przez roœliny odpornoœci na syntetyczne herbicydy nie mo na wykluczyæ mo liwoœci nabycia przez roœliny (chwasty) odpornoœci na allelopatiny. Przyk³ad chabra C. diffusa wskazuje, e jego pozycja jako roœliny inwazyjnej w Stanach Zjednoczonych Ameryki Pó³nocnej jest zwi¹zana prawdopodobnie z wra liwoœci¹ roœlin amerykañskich na wydzielane allelopatiny. W Europie natomiast, sk¹d pochodzi, nie wykazuje takiej ekspansywnoœci, co wiêcej roœliny europejskie cechuje znacznie ni sza wra liwoœæ na wydzielan¹ przez niego katechinê (50). Na podstawie dotychczasowych danych zebranych na przyk³adzie C. diffusa sugeruje siê, e w toku ewolucji mo e dochodziæ do nabywania przez roœliny odpornoœci na allelopatiny (50,51). Jednak proces ten, nie jest raptowny. Jego szybkoœæ zale y od wielu czynników m.in. presji selekcyjnej. Presja selekcyjna wywo³ana przez allelopatiny z jednej strony, mo e mieæ charakter ci¹g³y i szeroki, co sprzyja³oby nabywaniu odpornoœci, jednak z drugiej, relatywnie niski poziom efektywnoœci znanych allelopatin w warunkach polowych, obni a rzeczywist¹ szansê na ewolucjê tej odpornoœci (52). Dodatkowo, fakt e wiêkszoœæ allelopatin dzia³a na ró ne procesy 50 PRACE PRZEGL DOWE

Biotechnologia szans¹ dla zastosowania allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów fizjologiczne i na ró nych poziomach organizacji komórkowej równie obni a prawdopodobieñstwo nabycia takiej odpornoœci. 6.2. Problemy zwi¹zane z wprowadzaniem genów allelopatii Próby konstrukcji transgenicznych roœlin zdolnych do syntezy allelopatin napotykaj¹ na wiele trudnoœci. Jedn¹ z nich jest obecnoœæ w roœlinie, substratu dla enzymu bêd¹cego produktem genu warunkuj¹cego potencja³ allelopatyczny. Nawet, je- eli substrat jest w tkance, zwiêkszenie potencja³u allelopatycznego roœliny mo e byæ utrudnione z powodu zjawiska autotoksycznoœci. Unikanie autotoksycznoœci polega na detoksykacji i/lub magazynowaniu allelopatin, np. w wakuolach. Kolejn¹ barierê stanowi tkankowo/komórkowo specyficzna biosynteza allelopatin, wymagaj¹ca u ycia do transformacji promotora warunkuj¹cego ekspresjê wprowadzonego genu w œciœle okreœlonych komórkach, np. w³oœnikach lub komórkach wydzielniczych, tak aby mo liwe by³o wydzielanie allelopatiny do œrodowiska i by nie by³a ona obecna w plonie rolniczym. Ponadto, manipulacje genetyczne prowadz¹ce do zwiêkszenia syntezy allelopatin mog¹ doprowadziæ do niekorzystnych zmian we wzroœcie i rozwoju roœliny (ograniczony wzrost, obni one plonowanie), a nadmierna produkcja metabolitów wtórnych mo e obni yæ wartoœæ smakow¹ plonu. Nie mo na pomin¹æ faktu, e zastosowanie transgenicznych roœlin allelopatycznych mo- e wywo³aæ bezpoœrednie zagro enie dla ludzi zwi¹zane z dzia³aniem produktów wprowadzonych genów jako alergenów lub potencjalnymi zmianami jakie mog¹ byæ przez nie wywo³ane w œrodowisku. Wydaje siê jednak, e ewentualne wzmo enie cechy allelopatycznej w roœlinach uprawnych takich jak np. ry czy sorgo nie powinno nieœæ za sob¹ niebezpieczeñstwa dla zdrowia ludzkiego, poniewa zró nicowanie stosowanych odmian pod wzglêdem potencja³u allelopatycznego waha siê od skrajnie niskiego do bardzo wysokiego. Co najwa niejsze, roœliny, które pozostaj¹ w centrum uwagi biotechnologów, np. sorgo zdolne s¹ do syntezy allelopatin w wyspecjalizowanych tkankach lub komórkach, dziêki czemu nie odnajduje siê allelopatin w plonie rolniczym wykorzystywanym do produkcji po ywienia. 7. Podsumowanie Poznanie biochemicznych i molekularnych mechanizmów oddzia³ywañ allelopatycznych pomiêdzy roœlinami oraz genetycznego pod³o a warunkuj¹cego potencja³ allelopatyczny stanowi podstawê zastosowania allelopatii w rozwijaj¹cym siê rolnictwie zrównowa onym. Izolacja, okreœlenie struktury chemicznej allelopatin oraz wyjaœnienie szlaku biosyntezy tych zwi¹zków w organizmach roœlinnych mo e wytyczyæ kierunki poszukiwania i produkcji herbicydów nowej generacji. Po³¹czenie wiedzy o genetycznych podstawach allelopatii roœlin uprawnych z postêpem w dziedzi- BIOTECHNOLOGIA 2 (77) 42-53 2007 51

Agnieszka Gniazdowska nie konstruowania roœlin genetycznie zmodyfikowanych mo e doprowadziæ w przysz³oœci do otrzymania roœlin, których uprawa nie bêdzie wymaga³a stosowania dodatkowych œrodków ochrony przed chwastami. Badaniom zmierzaj¹cym do osi¹gniêcia tych celów musz¹ jednak nadal towarzyszyæ próby selekcji takich genotypów roœlin uprawnych, w których wysokiemu potencja³owi allelopatycznemu towarzyszyæ bêdzie wysoka jakoœæ plonów. Literatura 1. Inderjit, Duke S. O., (2003), Planta, 217, 529-539. 2. Tellez M. R., Canel C. Rimando A. M., Duke S. O., (1999), Phytochemistry, 52, 1035-1040. 3. Macias F. A., Varela R. M., Torres A., Galindo J. L. G., Molinillo J. M. G., (2002), Chemical Ecology of Plants: Allelopathy in Aquatic and Terrestrial Ecosystems, Eds. Inderjit, Mallik A. U., 73-87, Birkhauser Verlag, Basel, Boston, Berlin. 4. Vyvyan J. R., (2002), Tetrahedron, 58, 1631-1646. 5. Singh H. P., Batish D. R., Kohli R. K., (2003), Crit. Rev. Plant Sci., 22, 239-311. 6. Wójcik-Wójtkowiak D., Politycka B., Weyman-Kaczmarkowa W., (1998), Allelopatia, Wyd. AR, im. A. Cieszkowskiego, Poznañ. 7. Gniazdowska A., Oracz K., Bogatek R., (2004), Kosmos, 53, 207-218. 8. Weston L. A., Duke S. O., (2003), Crit. Rev. Plant Sci., 22, 367-389. 9. Yun K. W., Kil B., (1992), J. Chem. Ecol., 18, 1933-1940. 10. Yun K. W., Maun M. A., (1997), Can. J. Bot., 75, 1903-1912. 11. Dayan F. E., Hernandez A., Allen S. N., Moraes R. M., Vroman J. A., Avery M. A., Duke S. O., (1999), Phytochemistry, 50, 607-614. 12. An M., Pratley J. E., Haig T., (2001), J. Chem. Ecol., 27, 395-409. 13. An M., Pratley J. E., Haig T., (2000), J. Chem. Ecol., 26, 1465-1476. 14. An M., Pratley J. E., Haig T., Lin D. L., (2005), Nonlinear. Biol. Toxicol. Med., 3, 245-260. 15. Bais H. P., Vepachedu R., Gilroy S., Callaway R., Vivanco J. M., (2003), Science, 301, 1377-1380. 16. Heap I., (2005), www.weedscience.com. 17. Praczyk T., Skrzypczak G., (2004), Herbicydy, PWRiL, Poznañ. 18. Evans D. A., (1999), Pesticide Chemistry and Bioscience: the Food Environment Challenge, Eds. Brooks G. T., Roberts T. R., 124-128, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK. 19. Czarnota M. A., Paul R. N., Dayan F. E., Nimbal C. I., Weston L. A., (2001), Weed Tech., 15, 813-825. 20. Jose S., (2002), Chemical Ecology of Plants: Allelopathy in Aquatic and Terrestial Ecosystems, Eds. Inderjit, Mallik A. U., 149-172, Birkhäuser Verlag, Basel, Boston, Berlin. 21. Duke S. O., (1999), Phytochemistry, 52, 805-513. 22. Bhowmik P. C., Inderjit, (2003), Crop Prot., 22, 661-671. 23. Bond W., Grundy A. C., (2001), Weed Res., 41, 383-405. 24. Duke S. O., Dayan F. E., Romagni J. G., Rimando A. M., (2000), Weed Res., 40, 99-111. 25. Duke S. O., Rimando A. M., Baerson S. R., Scheffler B. E., Ota E., Belz R., (2002), J. Pest. Sci., 27, 298-306. 26. Olofsdotter M., Bach-Jensen L., Courtois B., (2002), Plant Breed., 121, 1-9. 27. Dilday R. H., Mattice J. D., Moldenhauer K. A., Yan W., (2001), J. Crop Prod., 4, 287-301. 28. Kato-Noguchi H., Ino T., (2003), Phytochemistry, 63, 551-554. 29. Kong C., Liang W., Xu X., Hu F., (2004), J. Agric. Food Chem., 52, 2861-2865. 30. Goff S. A., Ricke D., Lan T-H, Pressing G., Wang R., Dunn M., Glazebrook J., Session A., Oeller P., Varma H., Hadley D., Hutchison D., Martin C., Katagiri F., Lange B. M., Moughamer T., Xia Y., Budworth P., Hong J., Migiel T., Paszkowski U., Hang S., Colbert M., et. al., (2002), Science, 296, 92-100. 52 PRACE PRZEGL DOWE

Biotechnologia szans¹ dla zastosowania allelopatii jako alternatywnej metody zwalczania chwastów 31. Yu J., Hu S., Wang J., Wong G. K., Li S., Liu B., Deng Y., Dai L., Zhou Y., Hang X., Cao M., Liu J., Sun J., Tang J., Chen Y., Huang X., Lin W., et. al., (2002), Science, 296, 79-92. 32. Xu M., Hellwig M. L., Prusic S., Coates R. M., Peters R. J., (2004), Plant J., 39, 309-318. 33. Dayan F. E., Cook D., Baerson S. R., Rimando A. M., (2005), Proceedings of the 4 th Word Congress on Allelopathy, Eds. Harper J. D. I., An M., Wu H., Kent J. H., 175-181, Charles Sturt University, Wagga Wagga, NSW, Australia. 34. Kim H. Y., Shin H. Y., Sohn D. S., Lee I. J., Kim K. U., Lee S. C., Jeong H. J., Cho M. S., (2000), Korean J. Crop Sci., 46, 22-28. 35. Kim K. U., Shin D. H., (2002), www.fao.org./documents/. 36. Bach-Jensen L., Courtois B., Shen L., Li Z., Olofsdotter M., Mauleon R. P., (2001), Agr. J., 93, 21-26. 37. Ebana K., Yan W. G., Dilday R. H., Namai H., Okuno K., (2001), Breed. Sci., 51, 47-51. 38. Wu H., Pratley J., Ma W., Haig. T., (2003), Theor. Appl. Genet., 107, 1477-1481. 39. Wu H., Haig T., Pratley J., Lemerle D., An M., (2000), J. Chem. Ecol., 26, 2141-2154. 40. Nimbal C. I., Yerkes C. N., Weston L. A., Weller S. C., (1996), Pest. Biochem. Physiol., 54, 73-83. 41. Weston L. A., Czarnota M., (2001), J. Crop Prod., 4, 363-377. 42. Yang X., Scheffler B. E., Weston L. A., (2004), J. Exp. Bot., 55, 2251-2259. 43. Dayan F. E., Kagan I. A., Rimando A M., (2003), J. Biol. Chem., 278, 28607-28611. 44. Macias F. A., Molinillo J. M. G., Galindo J. C. G., Varela R. M., Simonet A. M., Castellano D., (2001), Allelopathy in Agroecosystems, Eds. Kohli R. K., Singh H. P., Batish D. R., 237-256, Food Products Press an Imprint of the Howarth Press, Inc. New York, London, Oxford. 45. Macias F. A., Simonet A. M., Oleszek W., (2001), Biochemiczne oddzia³ywania œrodowiskowe, red. Oleszek W., G³owniak K., Leszczyñski B., 47-60, AM, Lublin. 46. Macias F. A., Vinolo V. M. I., Molinillo J. M. G., (2005), Proceedings of the 4 th Word Congress on Allelopathy, Ed. Harper J. D. I., An M., Wu H., Kent J. H., 477-480, Charles Sturt University, Wagga Wagga, NSW, Australia. 47. Cornes D., (2005), Proceedings of the 4 th Word Congress on Allelopathy, Eds. Harper J. D. I., An M., Wu H., Kent J. H., 569-572, Charles Sturt University, Wagga Wagga, NSW, Australia. 48. Kamo T., Hiradate S., Fujii Y., ( 2003), J. Chem. Ecol., 29, 275-283. 49. Fujii Y., Hiradate S., (2005), Proceedings of the 4 th Word Congress on Allelopathy, Ed. Harper J. D. I., An M., Wu H., Kent J. H., 73-76, Charles Sturt University, Wagga Wagga, NSW, Australia. 50. Callaway R. M., Ridenour W. M., (2004), Front Ecol. Environ., 2, 436-443. 51. Gniazdowska A., (2005), Kosmos, 54, 221-226. 52. Scheffler B. E., Duke S. O., Dayan F. E., Ota E., (2001), Recent Adv. Phytochem., 35, 257-273. BIOTECHNOLOGIA 2 (77) 42-53 2007 53