MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 67-75 Alicja Budak 1,2, Paulina Paluchowska 1, Dorota Włodarczyk 1, Paweł Nowak 1, Małgorzata Węgrzyn, Wojciech Mudyna 3 GENETYCZNA CHARAKTERYSTYKA SZCZEPÓW ACINETOBACTER BAUMANNII ORAZ PSEUDOMONAS AERUGINOSA IZOLOWANYCH OD CHORYCH Z ZAPALENIEM PŁUC HOSPITALIZOWANYCH W ODDZIALE INTENSYWNEJ TERAPII 1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Wydział Farmaceutyczny UJ CM, Kraków 2 Pracownia Mikrobiologii ZDL, Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. L. Rydygiera, Kraków Kierownik: prof. dr hab. A. Budak 3 Oddział Anestezjologii i Intensywnej Terapii WSS im. L. Rydygiera, Kraków Ordynator: dr med. W. Mudyna Przedmiot badań stanowiły 33 szczepy Acinetobacter baumannii oraz 31 szczepów Pseudomonas aeruginosa izolowanych z aspiratów tchawicznych, pobranych od 19 chorych, z potwierdzonym mikrobiologicznie szpitalnym zapaleniem płuc, hospitalizowanych w Oddziale Anestezjologii i Intensywnej Terapii Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego im. L. Rydygiera w Krakowie. Izolaty genotypowano z wykorzystaniem metody RAPD-PCR, przy użyciu primerów 208, 272, ERIC-2 oraz PAL-2. Obserwowano zróżnicowanie w podobieństwie genetycznym analizowanych populacji szczepów niefermentujących pałeczek Gram-ujemnych. W ostatnich latach obserwuje się wzrost częstości występowania zakażeń szpitalnych. W oddziałach intensywnej terapii (OIT) ich dominującą formą są infekcje dolnych dróg oddechowych. Szpitalne zapalenia płuc (SzZP), stanowią 30% (15) wszystkich zakażeń w OIT, przy czym 80% (11,17) pneumonii związane jest ze sztucznym wspomaganiem oddechu (VAP ventilator associated pneumoniae). Szpitalne zapalenie płuc jest przyczyną wysokiej śmiertelności wśród pacjentów OIT w zakresie od 33 do 55%. Ponadto, przedłuża pobyt chorego w oddziale, co wiąże się ze wzrostem kosztów leczenia (6,7,13,18). Według danych piśmiennictwa, najczęściej izolowanymi etiologicznymi czynnikami szpitalnego zapalenia płuc u chorych OIT, są pałeczki Gram-ujemne niefermentujące, głównie z gatunków: Acinetobacter baumannii oraz Pseudomonas aeruginosa (1,2,3,14). Drobnoustroje te odpowiedzialne są za zakażenia o najcięższym przebiegu. Charakteryzując się wysokim stopniem oporności na powszechnie stosowane w terapii antybiotyki oraz chemioterapeutyki, zaliczane są do grupy patogenów alarmowych.
68 A. Budak i inni Nr 1 Zarówno szczepy z gatunku A. baumannii jak i P. aeruginosa mogą szerzyć się w OIT w sposób epidemiczny, a ich rezerwuarem przez długi okres czasu są zwykle wilgotne zbiorniki, płyny infuzyjne, czasem aparatura oraz sprzęt medyczny. Nadzór nad epidemicznym rozprzestrzenianiem się patogenów polega na ustaleniu źródła, z którego pochodzą szczepy oraz identyfikacji dróg ich szerzenia się. Wprowadzone w ostatnich latach do analizy epidemiologicznej, metody biologii molekularnej, ułatwiają wykrycie łańcucha epidemicznego, poprzez badanie u szczepów struktur genetycznych, które w przeciwieństwie do cech fenotypowych (biotypy, fagotypy, serotypy, wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki) charakteryzuje większa stabilność (5). Nadzór epidemiologiczny przyczynia się do zmniejszenia występowania zakażeń, co wiąże się ze skróceniem czasu pobytu chorego w oddziale, poprawą skuteczności leczenia oraz obniżeniem kosztów. Celem pracy, było uzyskanie lepszego wglądu w epidemiologię szpitalnych zapaleń płuc w oparciu o analizę genotypów szczepów Acinetobacter baumannii oraz Pseudomonas aeruginosa, najczęstszych etiologicznych czynników szpitalnego zapalenia płuc u chorych hospitalizowanych w oddziale intensywnej terapii. Do badań wykorzystano metodę RAPD-PCR. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Przedmiot badań stanowiły 33 szczepy Acinetobacter baumannii oraz 31 szczepów Pseudomonas aeruginosa wyizolowanych z aspiratów tchawiczych, pobranych od 19 pacjentów z mikrobiologicznie rozpoznanym zapaleniem płuc. Chorzy byli hospitalizowani w Oddziale Anestezjologii i Intensywnej Terapii Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego im. L. Rydygiera w Krakowie. W badanej grupie znajdowało się 15 mężczyzn oraz 4 kobiety w wieku od 18 do 81 lat. Analizowane szczepy pochodziły z okresu od czerwca 2006 do października 2007. Identyfikację (karta identyfikacyjna GN) oraz ocenę lekowrażliwości (karty antybiogramowe: AST- N037, AST-N041, AST-N022), wyizolowanych z aspiratu tchwiczego bakterii, wykonano z użyciem automatycznego systemu Vitek-2 Compact (biomerieux Polska Sp. z o. o.). Szczepy, do czasu wykonania badań genetycznych, przechowywano w bulionie z dodatkiem glicerolu, w temperaturze -80ºC. Hodowla szczepów. Z badanych izolatów zakładano 24-godzinną hodowlę na podłożu Mac Conkey Agar, inkubowaną w temp. 37ºC. Po inkubacji wybierano jedną kolonię szczepu, którą przesiewano na nowe podłoże Mac Conkey Agar oraz poddawano inkubacji w temp. 37ºC przez 24 godziny. Z czystych i jednorodnych kolonii sporządzono zawiesinę w 0,85% NaCl, którą wirowano i odrzucano supernatant. Izolacja DNA. Izolację genomowego DNA przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu Genomic Mini AX BACTERIA (A&A Biotechnolog, Polska). Pomiaru stężenia wyizolowanego DNA dokonano przy użyciu spektrofotometru (UV Photometer Biometra Gene Ray, Germany) przy długości fali 260 nm. Reakcja RAPD-PCR. Do sporządzenia mieszaniny reakcyjnej oraz DNA w ilości 40 ng wykorzystano, zgodnie z zaleceniami producenta, odczynniki firmy Promega. Amplifikacja przebiegała w termocyklerze T personal (Biometra). Różnicowanie wewnątrzgatunkowe szczepów przeprowadzono z zastosowaniem reakcji RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA-PCR) z użyciem primerów 208 (5 ACGGCCGACC 3 ), 272
Nr 1 A. baumannii i P. aeruginosa w zapaleniu płuc 69 (5 AGCGGGCCAA 3 ), ERIC-2 (5 AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG 3 ) oraz PAL-2 (5 CTTCTTCAGCTCGACGCGACG 3 ) (4, 9, 12). Dla starterów 208 oraz 272 warunki przeprowadzonej reakcji obejmowały: 4 cykle, z których każdy składał się z denaturacji w temp. 94ºC przez 5 min., anilingu w temp. 36ºC przez 5min., oraz elongacji w temp. 72ºC przez 5 min., a następnie 30 cykli reakcyjnych z denaturacją w temp. 94ºC przez 1 min., anilingiem w temp. 36ºC przez 1 min., i elongacją w temp. 72ºC przez 2 min. Końcowa elongacja przebiegała w 72ºC przez 10 min. W reakcji PCR dla primera ERIC-2 zastosowano wstępną denaturację w temp. 94ºC przez 4 min., a następnie 35 cykli, z których każdy obejmował: denaturację w temp. 94ºC przez 1 min, aniling w temp. 25ºC przez 1 min oraz elongację w 74ºC przez 2 min. Końcowa elongacja przebiegała w temp. 74ºC przez 5 min. Reakcja PCR z zastosowaniem startera PAL-2 zachodziła według profilu temperaturowo-czasowego z denaturacją wstępną temp. 94ºC przez 5 min. Następnie wykonano 38 cykli, z których każdy składał się z denaturacji w temp. 94ºC przez 1 min, anilingu w temp. 30ºC przez 1 min, elongacji w 72ºC przez 1 min, oraz wydłużania końcowego w temp. 72ºC trwającego 5 min. Detekcja produktów reakcji RAPD-PCR. Produkty reakcji RAPD-PCR wykryto elektroforetycznie w 2% żelu agarozowym, wybarwionym bromkiem etydyny, w buforze Tris-Borate Buffer (TBA). Przy użyciu transluminatora UV (Vilber Lourmat, France) uwidoczniono fragmenty DNA, które sfotografowano aparatem cyfrowym Canon Power Shot G5. Wielkość otrzymanych produktów reakcji PCR porównano z markerem wielkości O Gene Ruler 100 bp Plus DNA Ladder. Dane, które otrzymano w typowaniu metodą RAPD, analizowano przy użyciu programu komputerowego BIO PROFIL Bio 1D++ (Vilber Lormat, France). Podobieństwo genetyczne szczepów zobrazowano w postaci dendrogramów utworzonych z wykorzystaniem metody klasteryzacji UPGMA (ang. Unweighted Pair Group Metod using arithmetic Averages). WYNIKI W analizie genotypowej 33 szczepów A. baumannii, wyhodowanych od 11 chorych OAiIT ze szpitalnym zapaleniem płuc, wykonanej metodą RAPD-PCR zastosowano primery 208, 272 oraz ERIC-2. Trzydzieści jeden izolatów P. aeruginosa, pochodzących od 8 pacjentów, genotypowano przy użyciu wymienionych starterów oraz dodatkowo PAL-2. U każdego chorego zbadano stopień podobieństwa genetycznego pomiędzy wszystkimi izolowanymi szczepami, należącymi do gatunku A. baumannii lub P. aeruginosa. W przypadku dwóch pacjentów typowano tylko po jednym izolacie, należącym do gatunku A. baumannii lub P. aeruginosa. U ośmiu osób, z grupy 11 chorych, od których wyhodowano A. baumannii, wszystkie zastosowane startery, potwierdziły wśród izolatów, obecność jednego profilu genetycznego. Pacjenci byli kierowani do OAiIT z różnych oddziałów szpitala: jeden z oddziału urazowoortopedycznego, trzech z neurologii, dwóch z oddziału wewnętrznego oraz dwóch chorych ze Szpitalnego Oddziału Ratunkowego (SOR-u). Spośród 10 chorych, od których izolowano więcej niż jeden szczep A. baumannii, u trzech osób stwierdzono obecność dwóch typów szczepów, różniących się wzorami pro-
70 A. Budak i inni Nr 1 duktów RAPD. Zastosowane w reakcji PCR startery 208, 272 oraz ERIC-2 jednakowo zakwalifikowały szczepy do grup klonalnych, natomiast stwierdzono różnice w stopniu podobieństwa między grupami. Największy stopień pokrewieństwa wykazano przy użyciu primera 272 (81%, 81%, 76%). Dla starterów 208 oraz ERIC-2 stwierdzono niższy stopień homologii między grupami klonalnymi (od 33% do 61%) (Ryc. 1). Dwóch pacjentów, u których zidentyfikowano szczepy należące do dwóch grup klonalnych, przyjęto do OAiIT z oddziału urazowo-ortopedycznego, natomiast trzeci pacjent został skierowany bezpośrednio z SOR-u. Ryc. 1 Podobieństwo genetyczne szczepów Acinetobacter baumannii analizowane metodą RAPD przy użyciu primerów 208, 272, ERIC-2, dla pacjenta nr 2, u którego wystąpiły dwa typy szczepów Ponadto, dla 11 chorych, u których wyhodowano z aspiratów A. baumannii, określono pokrewieństwo genetyczne wybierając do analizy jeden szczep. W przypadku trzech pacjentów zbadano 2 szczepy, różniące się w dotychczasowych badaniach, wzorami produktów RAPD. Primer 208 potwierdził obecność 4 grup klonalnych o podobieństwie genetycznym między grupami wynoszącym 47% (Ryc. 2). Starter ERIC-2 wykazał niższe zróżnicowanie wśród badanych szczepów. Wyróżniono 3 grupy izolatów o wysokim stopniu pokrewieństwa, a homologia wszystkich szczepów wynosiła 33%. Najmniejszą zdolnością różnicowania charakteryzował się primer 272, który wyodrębnił 2 grupy klonalne o umiarkowanym stopniu podobieństwa genetycznego wynoszącym 78%. Genotypowanie 31 szczepów P. aeruginosa, wyhodowanych z aspiratów tchawicznych od 8 pacjentów, wykazało pomiędzy izolatami znaczny stopień zróżnicowania genetycznego. W przypadku dwóch chorych (nr 6 oraz nr 7), przyjętych do OAiIT z oddziału urazowo - ortopedycznego i oddziału chirurgii, wszystkie startery zastosowane w badaniu, potwierdziły obecność jednego profilu genetycznego (Ryc. 3). U pozostałych pacjentów wyróżniono, z użyciem różnych primerów, obecność jednej lub dwóch grup klonalnych. Dla chorego nr 1, startery 208 oraz 272 wykazały 100% homologii
Nr 1 A. baumannii i P. aeruginosa w zapaleniu płuc 71 Ryc. 2 Wyniki typowania szczepów Acinetobacter baumannii metodą RADP przy użyciu primera 208 wśród szczepów, natomiast ERIC-2 oraz PAL-2 rozróżniły dwie grupy klonalne. U pacjenta nr 2 primery 208 oraz PAL-2, potwierdziły 100% pokrewieństwo między szczepami, natomiast startery 272 i ERIC-2, zaliczyły izolaty do różnych grup, o pokrewieństwie odpowiednio 47% oraz 50%. Szczepy wyhodowane od chorego nr 3, zakwalifikowano przy użyciu starterów 272, ERIC-2 oraz PAL-2, do dwóch grup klonalnych o podobieństwie genetycznym, odpowiednio 57%, 25% oraz 75%. Starter 208 przyporządkował każdy szczep do innej grupy klonalnej. U pacjenta nr 4 primery 272 oraz PAL-2 wykazały 100% homologii między izolatami, natomiast wzory amplifikacji uzyskane dla startera 208 oraz ERIC-2, rozróżniły dwie grupy szczepów. Izolaty pochodzące od chorego nr 5, w analizie genotypowej z zastosowaniem starterów 208, 272 oraz PAL-2, reprezentowały ten sam genotyp. Tylko Ryc. 3 Podobieństwo genetyczne dla szczepów Pseudomonas aeruginosa analizowane metodą RAPD przy użyciu primerów 208, 272, ERIC-2, PAL-2, dla chorego nr 6
72 A. Budak i inni Nr 1 primer ERIC-2 rozróżnił obecność dwóch grup klonalnych. Chorych do OAiIT skierowano z oddziału urazowo-ortopedycznego (pacjent nr 2), nefrologii (pacjent nr 1), neurologii (pacjent nr 3), SOR-u (pacjent nr 4) oraz oddziału chirurgii (pacjent nr 5). Również, u 8 chorych określono pokrewieństwo genetyczne wyosobnionych izolatów, wybierając do badania jeden lub dwa szczepy P. aeruginosa, jeżeli w dotychczasowych badaniach różniły się profilem RAPD. W wyniku genotypowania 31 izolatów pałeczki ropy błękitnej z zastosowaniem starterów: 208, 272 (Ryc. 4), ERIC-2 oraz PAL-2, stwierdzono obecność odpowiednio: 10, 10, 13 oraz 8 profili RAPD. Wartość podobieństwa genetycznego wszystkich analizowanych szczepów, uzyskana dla poszczególnych primerów, wynosiła odpowiednio: 63%, 37%, 35% oraz 47%. Analiza homologii szczepów w przypadku primera 272 wykazała w badanej grupie izolaty o umiarkowanym stopniu pokrewieństwa. Pozostałe stratery wyróżniły izolaty o wysokim stopniu podobieństwa. Ryc. 4 Określenie 10 profili genetycznych u wybranych szczepów Pseudomonas aeruginosa przy użyciu startera 272 DYSKUSJA W oddziałach intensywnej terapii pałeczki Gram-ujemne niefermentujące są przyczyną zakażeń o najcięższym i bardzo gwałtownym przebiegu. Według piśmiennictwa, dominującą formą infekcji wywołaną przez szczepy P. aeruginosa oraz A. baumannii jest szpitalne zapalenie płuc. Naturalna oporność tych bakterii na niektóre leki przeciwbakteryjne oraz zdolność wytwarzania różnych mechanizmów oporności wobec wszystkich głównych klas antybiotyków, jest przyczyną istotnych problemów terapeutycznych. Do badań epidemiologicznych w oddziale intensywnej terapii krakowskiego szpitala wykorzystano metodę RAPD-PCR. Do analizy genetycznej, podobnie jak inni autorzy, zastosowano startery: 208, 272, ERIC-2, PAL-2 (4,9,12). Określono podobieństwo genetyczne wśród szczepów pałeczek, należących do gatunków Acinetobacter baumannii oraz Pseudomonas aeruginosa, które izolowano od chorych z mikrobiologicznie potwierdzonym szpitalnym zapaleniem płuc. Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że infekcje dróg oddechowych u pacjentów hospitalizowanych w OAiIT były wywołane przez szczepy A. baumannii pochodzące głównie ze środowiska szpitalnego. Również autorzy badań prowadzonych w
Nr 1 A. baumannii i P. aeruginosa w zapaleniu płuc 73 innych ośrodkach, wskazują na problem zakażeń oraz kolonizacji występującej u chorych, spowodowanych przez szczepy szpitalne tego gatunku (8,10). Wśród 33 zbadanych przez nas szczepów A. baumannii, wyróżniono tylko dwa izolaty pochodzenia pozaszpitalnego. Stwierdzono, że 31 szczepów należało do 3 grup klonalnych, które najprawdopodobniej pochodziły od dwóch różnych subpopulacji, obecnych w OAiIT od dłuższego czasu. Natomiast Valentine i wsp. (16), wśród 20 szczepów A. baumannii, będących przyczyną zakażeń szpitalnych w Los Angeles, wykazali przy pomocy techniki PEGE, obecność aż 8 linii rodowodowych, reprezentowanych przez różne grupy izolatów. Analiza dendrogramów podobieństwa szczepów A. baumannii, izolowanych wielokrotnie od uwzględnionych w naszych badaniach 11 chorych, wykazała, że tylko u dwóch z nich, wystąpiły dwa typy izolatów o odmiennych profilach genetycznych. Od jednej osoby wyhodowano jeden szczep szpitalny oraz jeden o charakterze pozaszpitalnym. Natomiast, u 8 pacjentów badane szczepy A. baumannii charakteryzowały się identycznym układem prążków. W przeprowadzonych przez nas badaniach, populacja izolatów P. aeruginosa była znacznie bardziej zróżnicowana pod względem genetycznym. W grupie 31 badanych szczepów, dla poszczególnych primerów: 208, 272, ERIC-2, PAL-2, rozpoznano odpowiednio 10, 10, 13 oraz 8 profili RAPD. Wszystkie izolaty P. aeruginosa wywodziły się prawdopodobnie od kilku subpopulacji szczepu szpitalnego, który uległ znacznemu zróżnicowaniu w czasie, w wyniku zmieniających się warunków środowiska szpitalnego oraz stosowania leków przeciwbakteryjnych. Podobnie Mahenthiralingam i wsp. (9) w badaniach przeprowadzonych w grupie 20 chorych z mukowiscydozą, wykazali również wysoki stopień zróżnicowania wśród 385 wyizolowanych szczepów P. aeruginosa. Za pomocą reakcji RAPD z wykorzystaniem ośmiu primerów, w tym między innymi startera 272 oraz 208, wyodrębnili 35 genotypów, w tym jedynie od dwóch chorych wyhodowano szczepy pałeczki ropy błękitnej o identycznych wzorach prążków. Luna i wsp. (8) w analizie genotypu szczepów wielokrotnie izolowanych od poszczególnych pacjentów, również wykazali wysoki stopień zróżnicowania genetycznego. Jedynie od dwóch chorych wyizolowano szczepy o 100% homologii genetycznej. Podsumowując, w przeprowadzonych badaniach zaobserwowano różnice w podobieństwie genetycznym wśród analizowanych populacji szczepów pałeczek Gram-ujemnych niefermentujących z gatunków: Acinetobacter baumannii oraz Pseudomonas aeruginosa. Znaczny stopień dywergencji ewolucyjnej, której uległ szczep P. aeruginosa, dając początek zróżnicowanej populacji izolatów tego gatunku, wskazuje na jego doskonałe zdolności adaptacyjne do zmieniających się warunków środowiska szpitalnego.
74 A. Budak i inni Nr 1 A. Budak, P. Paluchowska, D. Włodarczyk, P. Nowak, M. Węgrzyn, W. Mudyna THE GENETIC DESCRIPTION OF ACINETOBACTER BAUMANNII AND PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS ISOLATED FROM PATIENTS WITH HOSPITAL ACQUIRED PNEUMONIA HOSPITALIZED IN INTENSIVE CARE UNIT SUMMARY The aim of study was to recognize the epidemiology of hospital acquired pneumonia on the base of genotypes of Acinetobacer baumannii and Pseudomonas aeruginosa strains. Gram negative- non fermenting bacilli are the most frequent aetiologic agent of hospital acquired pneumonia among patients from Anesthesiology and Intensive Care Unit in the Rydygiers hospital in Cracow. In the following research RAPD- PCR method was applied and there 272, 208, ERIC- 2 and PAL- 2 primers were used. The investigation was conducted among 33 Acinetobacter baumannii and 31 Pseudomonas aeruginosa strains which were isolated from endotracheal aspirates (ETA). ETA were taken from 19 patients with microbiologically confirmed pneumonia. The result of our study shows that most A. baumannii strains came from hospital habitat. In the investigated group of A. baumannii strains, 31 belonged to 3 clonal groups and probably came from two bacteria subpopulations which were present in ICU from a long time. There were only two isolates which had got the posthospital origin. Moreover, the assay of genetic similarity between A. baumannii strains, isolated from individual patients, showed that only in two patients were observed strains with different genetic profiles. Isolates which came from 8 patients had got the same pattern of bands. There were many genetic differences between investigated P. aeruginosa strains. In the group of 31 isolates, which were investigated by using 208, 272, ERIC- 2 and PAL- 2 primers, recognized respectively 10, 10, 13 and 8 of genetic profiles. All isolates of P. aeruginosa probably came from a few subpopulations of hospital strain which has undergone evolutionary divergence phenomenon in time as a result of changing condition of hospital environment and application of antibiotics. The assay of genotype of P. aeruginosa strains which were repeatedly isolated from individual patients showed that only from two patients strains with 100% genetic homology were isolated. PIŚMIENNICTWO 1. Babcock HM, Zack JE, Garrison T i inni. Ventilator-associated pneumonia in a multi-hospital system: differences in microbiology by location. Infect Control Hosp Epidemiol 2003; 24: 853-58. 2. Bannister BA., Begg NT, Gillespie SH. Choroby zakaźne. Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner. Wydanie I. Wrocław 1998. 3. Bartlett JG. Leczenie zakażeń układu oddechowego. Medycyna Praktyczna. Wydanie I. Kraków 2000. 4. Campbell M, Mahenthiralingam E, Speert DP. Evaluation of random ampliefied polymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa. J Clin Microbiol 2000; 38: 4614-15. 5. Pawińska A. Szpitalne zapalenie płuc. W: Zakażenia szpitalne. Red. Dzierżanowska D. Alfa- Medica Press. Wydanie II. Bielsko-Biała 2008, 376-92. 6. Ewig S, Bauer T, Torres A. The pulmonary physician in critical care: Nosocomial pneumonia. Thorax 2002; 57: 366-71. 7. Kollef MH. Antibiotic management of ventilator-associated pneumonia due to antibiotic-resistant gram-positive bacterial infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: 794-803. 8. Luna CM, Aruj PK. Nosocomial Acinetobacter pneumonia. Respirology 2007; 12: 787-91.
Nr 1 A. baumannii i P. aeruginosa w zapaleniu płuc 75 9. Mahenthiralingam E, Campbell ME, Foster J i inni. Random amplified polymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol 1996; 34: 1129-35. 10. Maragakis LL, Perl TM. Acinetobacter baumannii: epidemiology, antimicrobial resistance and treatment options. Clin Infect Dis 2008; 46: 1254-63. 11. Mehta RM, Niederman MS. Nosocomial pneumonia in the intensive care unit: controversies and dilemmas. J Intensive Care Med 2003; 18: 175-88. 12. Nazik H, Ongen B, Erturan Z, Salcioglu M. Genotype and antibiotic susceptibility patterns of Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolated from cystic fibrosis patients. Jpn J Infect Dis 2007; 60: 82-6. 13. American Thoracic Society. Infectious Diseases Society of America. Guidelines for the management of adults with hospital-acquired, ventilator-associated and healthcare-associated pneumonia. Am J Respir Crit Care Med, 2005; 171: 388-416. 14. Richards MJ Edwards JR Culver DH i inni. Nosocomial infections in medical intensive care units in the United States. Crit Care Med 1999; 27: 887-92. 15. Świechowski M, Gajdosz R. Szpitalne zapalenie płuc u pacjentów w oddziale intensywnej terapii. Zakażenia 2001; 3: 10-13. 16. Valentine SC, Contreras D, Tan S i inni. Phenotypic and molecular characterization of Acinetobacter baumannii clinical isolates from nosocomial outbreaks in Los Angeles County, California. J Clin Microbiol 2008; 46: 2499-507. 17. Vincent JL. Nosocomial infections in adult intensive-care units. Lancet 2003; 361: 2068-77. 18. Wróblewska M, Rudnicka J, Marchel H, Łuczak M. Multidrug-resistant bacteria isolated from patients hospitalized in Intensive Care Units. Int J Antimicrob Agents 2006; 27: 285-9. Otrzymano: 11 I 2010 r. Adres Autora: 30-688 Kraków, ul. Medyczna 9, Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum, e-mail: budak@cm-uj.krakow.pl