Uwaga! Proszę o sprawdzenie czy poprawnie zaznaczone są kursywy w PIŚMIENNICTWIE (nr 14 i 21 nie są zaznaczone). PRACE ORYGINALNE / ORYGINAL PAPERS Wykrywanie markerów chorobowych w oddechu metodami optoelektronicznymi TADEUSZ STACEWICZ 1, TOMASZ TARGOWSKI 2, ZBIGNIEW BIELECKI 3, BOGUSŁAW BUSZEWSKI 4, TOMASZ LIGOR 4, JACEK WOJTAS 3, MAGDALENA GARLIŃSKA 3 1 Wydział Fizyki Uniwersytet Warszawski; 2 Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii CSK MON, Wojskowy Instytut Medyczny w Warszawie; 3 Instytut Optoelektroniki Wojskowa Akademia Techniczna, Warszawa; 4 Wydział Chemii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wykrywanie markerów chorobowych w oddechu metodami optoelektronicznymi Stacewicz T 1, Targowski T 2, Bielecki Z 3, Buszewski B 4, Ligor T 4, Wojtas J 3, Garlińska M 3. 1 Wydział Fizyki Uniwersytet Warszawski; 2 Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii CSK MON, Wojskowy Instytut Medyczny w Warszawie; 3 Instytut Optoelektroniki Wojskowa Akademia Techniczna, Warszawa; 4 Wydział Chemii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu W ostatnich latach obserwuje się ogromne zainteresowanie środowisk naukowych badaniami nad nieinwazyjnymi metodami diagnozowania stanów chorobowych z wykorzystaniem biomarkerów. Detekcja tych substancji w wydychanym powietrzu może dostarczyć cennych informacji o prawidłowości lub zaburzeniu procesów biochemicznych zachodzących w organizmie. Analiza oddechu jest nieinwazyjna, bezbolesna i może dać szybką odpowiedź o istnieniu danego schorzenia. Ponadto proces pobrania próbki odbywa się komfortowo zarówno dla pacjenta, jak i personelu medycznego. Celem pracy było przedstawienie możliwości zastosowania metod spektroskopowych do badań przesiewowych w diagnostyce medycznej przy użyciu czujników optoelektronicznych, ze szczególnym uwzględnieniem wyników prac prowadzonych w Instytucie Fizyki Doświadczalnej Wydziału Fizyki UW oraz w Instytucie Optoelektroniki WAT. Materiał i metody. Do wykrywania metanu i amoniaku w wydychanym powietrzu użyto technikę MUPASS (spektroskopia z komórkami wieloprzejściowymi). Do detekcji tlenku azotu wykorzystano metodę SSWO (spektroskopia strat we wnęce optycznej). Jako źródło promieniowania służył kwantowy laser kaskadowy. Do detekcji etanu zastosowano źródło PG711/DFG oraz metodę SSWO. Do kalibracji opracowanych sensorów stosowano modułowy generator gazów wzorcowych 491M firmy KIN-TEK. Wyniki. W wypadku pomiaru stężenia metanu granica wykrywalności (czułość) układu pomiarowego (~ 0,1 ppm) znacząco przewyższa górny limit stężenia metanu w oddechu zdrowego człowieka (10 ppm). Układ ten dobrze więc spełnia wymogi zarówno do badań stanów chorobowych (np. przy chorobach jelit) jak i do monitoringu metanu w powietrzu wydychanym. Dla amoniaku charakterystyka jest liniowa w zakresie stężeń większych niż 1 ppm. Górny próg stężenia amoniaku w oddechu zdrowego człowieka wynosi 2 ppm, więc układ ten dobrze nadaje się do stwierdzania stanów chorobowych (np. choroby wątroby). W detekcji tlenku azotu uzyskano granicę wykrywalności 30 ppb. Zgodnie z rekomendacją ATS jest to czułość wystarczająca do monitorowania stanu zdrowia ludzi i wykrywania chorób dróg oddechowych jak np. astma lub przewlekłe zapalenie oskrzeli. W wypadku detekcji etanu dla fali o długości 3,348 µm uzyskano granicę wykrywalności 20 ppb. Detection of disease markers in the breath using optoelectronic methods Stacewicz T 1, Targowski T 2, Bielecki Z 3, Buszewski B 4, Ligor T 4, Wojtas J 3, Garlińska M 3. 1 Faculty of Physics University of Warsaw; 2 Department of Internal Medicine, Pneumonology and Allergology, Central Clinical Hospital of the Ministry of National Defense, Military Institute of Medicine in Warsaw, Poland; 3 Institute of Optoelectronics Military University of Technology, Warsaw; 4 Faculty of Chemistry Nicolaus Copernicus University in Toruń Great interest of scientific community is observed recently over noninvasive tests methods dedicated to diagnose disease states using biomarkers. The ability to detect these substances in the human breath can provide valuable information about disorder of biochemical processes in the body. Breath analysis is non-invasive, painless and can provide a quick answer about the existence of the disease. In addition, the sampling process is carried out comfortably for both the patient and the medical staff. The aim of the study was to present opportunity of application the optoelectronic methods for screening tests in medical diagnostics. The results of the researches carried out at the Institute of Experimental Physics, Department of Physics UW and at the Institute of Optoelectronics MUT are presented. Material and methods. For the detection of methane and ammonia in breath the Multipass Spectroscopic Absorption Cells (MUPASS ) were used. In the case of nitric oxide and ethane observation, Cavity Enhanced Absorption Spectroscopy (CEAS) was applied. During the investigation modern tunable and sophisticated infrared radiation sources were used: single mode diode lasers (for CH4, NH3 detection) quantum cascade laser (NO sensing), and optical parametric generator (PG711/DFG) for ethane measurements. The investigations of developed sensors were conducted with use of reference samples of biomarkers, which were prepared with gas standards generator 491M from KIN-TEK company. Results. Experiments showed that sensitivities of the sensors are suitable for human breath analyzing. In case of methane sensor, the detection limit (sensitivity) of ~ 0.1 ppm was obtained. This value is significantly lower than the upper limit of methane concentration in the breath of healthy humans (10 ppm). Therefore, our system well satisfies the requirements for diseases screening (e.g. intestines diseases ) and for methane monitoring in healthy human breath. Ammonia sensor is characterized with linear response in the concentration range higher than 1 ppm. The upper limit of ammonia concentration in healthy human breath is approx. 2 ppm, so this system is well suited for the determination of disease states (e.g. liver diseases). During the observation of nitrogen oxide the detection limit of 30 ppb was obtained. According to the ATS recommendation such NO detection limit is sufficient to monitor people s health state and for the detection of respiratory diseases like asthma or chronic bronchitis. For ethane detection with a wavelength of 3.348 microns the detection limit of 20 ppb was obtained.
52 T. Stacewicz i wsp. Wnioski. Dzięki dużej czułości, szybkim i selektywnym pomiarom stężenia danego gazu, opracowane sensory mogą być zastosowane do badań przesiewowych w celu wykrywania markerów chorobowych w wydychanym powietrzu na poziomie molekularnym. Słowa kluczowe: spektroskopia, biomarkery, badania wydychanego powietrza Pol Merkur Lekarski, 2015; XXXIX (231); 51... Conclusions. Developed sensors are characterized by high sensitivity (ppb-level) and high selectivity, simple and fast measurement procedure. Therefore, they can be applied as medical screening tools enabling biomarkers detection in exhaled air at the molecular level. Key words: spectroscopy, optoelectronic sensors, breath biomarkers, breath tests, screening sensors Pol Med J, 2015; XXXIX (231); 51... W ostatnich latach obserwuje się ogromne zainteresowanie środowisk naukowych badaniami nad nieinwazyjnymi metodami diagnozowania stanów chorobowych z wykorzystaniem biomarkerów. Biomarkery mogą być zawarte w ślinie, moczu czy wydychanym powietrzu. Dzięki wykryciu biomarkera i określeniu jego stężenia możliwa jest ocena stanu zdrowia osoby badanej. W przypadku powietrza wydychanego substancje endogenne, powstające podczas różnych procesów biochemicznych zachodzących w organizmie człowieka, przedostają się do krwi, a następnie są uwalniane w płucach. Możliwość detekcji tych substancji w wydychanym powietrzu może dostarczyć cennych informacji o prawidłowości lub zaburzeniu procesów biochemicznych zachodzących w organizmie. Analiza oddechu jest nieinwazyjna, bezbolesna i może dać szybką odpowiedź o istnieniu danego schorzenia. Ponadto proces pobrania próbki odbywa się komfortowo zarówno dla pacjenta, jak i personelu medycznego. Powietrze wydychane przez zdrowego człowieka zawiera azot, tlen, dwutlenek węgla, parę wodną, o względnie dużym stężeniu, oraz wiele innych związków chemicznych, jak np. aceton, izopren, propanol o stężeniu na poziomie ppb lub subppb (ang. parts per billion), a także ponad tysiąc innych składników, których stężenie jest zawarte w przedziale ppb-ppt (ang. parts per trillion) [5]. Występowanie stanów chorobowych może powodować zmianę stężenia poszczególnych składników wydychanego powietrza lub być przyczyną wydzielania innych substancji lotnych, niewystępujących u człowieka zdrowego. Z analizy oddechu można także uzyskać informacje o stosowanych lekach, używkach, czy rodzaju diety. Pierwsze wskazówki dotyczące oceny stanu zdrowia pacjenta na podstawie zapachu oddechu przedstawione były już w dziełach Hipokratesa. Od wieków wiadomo, że na przykład zapach acetonu z ust towarzyszy niekontrolowanej cukrzycy, zapach mocznika niewydolności nerek, a gnijących ryb niewydolności wątroby. Przyjmuje się, że współcześnie badania te zostały zainicjowane w 1971 roku przez wybitnego chemika Linusa Paulinga, laureata Nagrody Nobla. Obecnie do wykrywania markerów chorobowych w wydychanym powietrzu stosuje się chromatografię gazową (GC Gas Chromatography), chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas (GC/MS Mass Spectrometry), spektrometrię mas z jonizacją poprzez przeniesienie protonu (PTR/MS Proton Transfer Reaction Mass Spectrometry), spektrometrię mas z jonizacją w strumieniu wybranych jonów (SIFT-MS Selected Ion Flow Tube Mass Spectrometry), spektrometrię ruchliwości jonów (IMS Ion Mobility Spectrometry), elektroniczne nosy, oraz spektroskopię laserową [6,15]. Jednak nowoczesne systemy GC, GC/MS, PTR/MS, SIFT- MS, czy IMS są zazwyczaj bardzo drogie, wymagają złożonych procedur eksploatacyjnych oraz specjalistycznej wiedzy od personelu. Niejednokrotnie badania z ich użyciem są czasochłonne. Powoduje to, że metody te nie są dedykowane do badań o charakterze przesiewowym. Elektroniczne nosy (e-nosy) są urządzeniami składającymi się z grup autonomicznych sensorów, z których każdy jest czuły na obecność specyficznych lotnych substancji. Działanie sensorów opiera się na rozróżnianiu masy cząsteczkowej związków organicznych, kształtu cząsteczek, ich hydrofilności, momentu dipolowego, itp. [9]. Zaletą e-nosów jest to, że jednocześnie uzyskuje się sumę informacji (tzw. obraz zapachowy) pochodzących ze wszystkich sensorów. Niestety ich czułość, rzędu kilku ppm, nie zawsze jest wystarczająca do wykrycia danego markera. Detekcja markerów chorobowych jest również możliwa przy pomocy wytresowanych psów. Po kilkumiesięcznej tresurze psy są w stanie wykryć np. raka płuc u 93% populacji spośród kilkuset chorych [7]. Jednakże metoda ta jest dość kłopotliwa w zastosowaniach praktycznych. Obserwowany ostatnio dynamiczny rozwój technologii optoelektronicznych, w tym fotodetektorów oraz laserów (a w szczególności laserów kaskadowych; ang. QCL Quantum Cascade Laser) daje możliwość opracowania wysokoczułych optoelektronicznych sensorów markerów chorobowych [4,16]. Autorzy przewidują, że już wkrótce badanie wydychanego powietrza stanie się niedrogą, dogodną i masowo dostępną procedurą przesiewową, która przyczyni się do zwiększenia wykrywalności wielu chorób w ich początkowych stadiach, a zatem zwiększy szansę szybszego powrotu do zdrowia i uniknięcia poważnych powikłań. Duże nadzieje można wiązać z wykorzystaniem tych metod we wczesnej diagnostyce nowotworów, a w szczególności raka płuca [2,8,10,13]. Rak płuca jest wiodącą przyczyną zgonów z powodu nowotworów z 88% pięcioletnią umieralnością niezależnie od typu histologicznego guza. Wysoka umieralność wynika przede wszystkim z późnego wykrywania choroby i małej skuteczności terapii onkologicznej. Rak płuca wykryty we wczesnych stadiach zaawansowania zwiększa szanse 5-letniego przeżycia do 60-80% [11]. Przesiewowe programy badawcze wczesnego wykrywania nowotworów płuc w grupach ryzyka są kosztowne i wiążą się z koniecznością wykonywania (czasami wielokrotnego) badań obrazowych płuc, narażających pacjentów na promieniowanie jonizujące [17]. Kolejną niedoskonałością badań obrazowych jest fakt, że zaledwie kilka do kilkunastu procent wykrywanych zmian ogniskowych płuc okazuje się w ostateczności nowotworami złośliwymi [17]. Dotychczas nie rozstrzygnięto jednoznacznie, czy oznaczanie biomarkerów raka w powietrzu wydychanym może być przydatne w praktyce klinicznej do wykrywania nowotworów lub różnicowania etiologii zmian ogniskowych płuc. Jednak wykorzystanie analizy wydechu w diagnostyce medycznej jest dziedziną stosunkowo nową, a przy tym dynamicznie rozwijająca się. Co roku organizowane są międzynarodowe konferencje poświęcone tej tematyce, wydawane są poświęcone tym badaniom czasopisma, działają dedykowane towarzystwa naukowe. W tabeli 1 przedstawiono biomarkery wybranych schorzeń i ich typowe stężenia w powietrzu wydychanym. W przypadku, gdy zawartość określonych związków przekracza wielkość podaną w kolumnie 2, może to świadczyć o stanie chorobowym. W niniejszym artykule opisano możliwości zastosowania metod spektroskopowych do badań przesiewowych w diagnostyce medycznej, przy użyciu czujników optoelektronicznych, ze szczególnym uwzględnieniem wyników prac prowadzonych w Instytucie Fizyki Doświadczalnej Wydziału Fizyki UW oraz w Instytucie Optoelektroniki WAT.
Wykrywanie markerów chorobowych w oddechu metodami optoelektronicznymi 53 Tabela 1. Przykładowe biomarkery schorzeń i ich typowe stężenia Table 1. Examples of disease biomarkers and their typical concentrations Biomarker Stężenie w oddechu Przykładowe choroby Piśmiennictwo zdrowego człowieka [ppb] Aceton < 1400 Cukrzyca [18] Amoniak < 2000 Choroby wątroby, choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy [27] wywołana przez Helicobacter pylori Cyjanowodór < 14 Mukowiscydoza [24] Etan < 12 Choroba Alzhaimera, miażdżyca, cukrzyca, rak [20] Formaldehyd < 1500 Rak piersi, rak płuca [21] Metan <10000 Bakterie jelitowe [12] Siarczek < 30 Choroby wątroby, odrzucenie przeszczepu płuc [14] karbonylowy Tlenek azotu < 50 Astma, przewlekłe zapalenie oskrzeli [1] Tlenek węgla <10000 Rozstrzenie oskrzeli, stres oksydacyjny, astma, angina, [30] hiperbilirubinemia WIDMA ABSORPCYJNE WYBRANYCH MARKERÓW CHOROBOWYCH Optyczne oznaczanie stężeń biomarkerów dokonuje się poprzez badanie absorpcyjnych widm światła w próbkach wydychanego powietrza na długościach fal charakterystycznych dla poszukiwanego związku (ryc. 1). Promieniowanie przenikając przez próbkę ulega osłabieniu, przy czym osłabienie to jest miarą koncentracji absorbera. W zależności od właściwości badanej materii jej widm absorpcji stosuje się promieniowanie ultrafioletowe (UV), widzialne (VIS) lub podczerwone (IR). Dla większości biomarkerów widma absorpcyjne, ważne z punktu widzenia diagnostyki oddechu, są położone głównie w zakresie bliskiej i średniej podczerwieni. Rycina. 1. Uproszczony układ do wykrywania biomarkerów w powietrzu wydychanym Figure 1. Simplified system for the detection of biomarkers in exhaled air Na ryc. 2 przedstawiono widma absorpcyjne wybranych biomarkerów w zakresie podczerwonym. Widmo te dla niewielkich molekuł składają się z charakterystycznych pasm, które zbudowane są z wąskich i dobrze rozdzielonych linii. Rycina. 2. Widma absorpcyjne (przekroje czynne) wybranych biomarkerów w zależności od długości fali promieniowania Figure 2. The absorption spectra (cross sections) of the selected biomarkers in dependence of radiation wavelength Pokazano to na rys. 3, zawierającym precyzyjniejsze widma wybranych związków. Z punktu widzenia mechaniki molekuł linie te reprezentują przejścia między różnymi stanami oscylacji i rotacji molekuł. Linie te stanowią tzw. fingerprint molekuły i są wykorzystywane do detekcji markerów. Dlatego główną zaletą spektroskopii w podczerwieni jest możliwość selektywnego pomiaru stężenia wybranego markera. Jednak, aby dokonywać detekcji z wysoką czułością, niezbędne jest posłużenie się promieniowaniem o długości fali dostrojonej do maksimum wybranej linii. Spektroskopia z wykorzystaniem tradycyjnych źródeł światła, jakimi są lampy, czyli źródła szerokopasmowe, jest zbyt mało dokładna. Konieczne jest zastosowanie źródeł wąskopasmowych, czyli laserów. Do ultraczułej detekcji śladowych ilości materii wykorzystywana jest laserowa spektroskopia absorpcyjna, która zajmuje się oddziaływaniem promieniowania laserowego z materią [27]. Współczesne lasery umożliwiają wytwarzanie promieniowania monochromatycznego o dowolnej długości fali, określonej z dokładnością dziesiątki tysięcy razy większą niż w przypadku światła lamp, w dodatku o względnie dużym natężeniu. A zatem są stosowane lasery podczerwone, generujące promieniowanie o długości fali od 1,5 do 12 mikrometrów. Precyzyjne dostrojenie ich promieniowania do maksimum charakterystycznej linii absorpcyjnej wybranego markera decyduje o czułości detekcji (ryc. 3). Zastosowanie spektroskopii laserowej do analizy wydychanego powietrza jest ograniczone głównie do małych cząsteczek. Dla większych i złożonych cząsteczek widma absorpcyjne są bardziej złożone i rozmyte. Wtedy problemem staje się przekrywanie widm absorpcji poszukiwanych biomarkerów z innymi komponentami. W detekcji markerów chorobowych w powietrzu wydychanym duże problemy sprawiają interferenty przede wszystkim woda i dwutlenek węgla, których stężenie sięga pojedynczych procentów, zatem może być od tysięcy do nawet miliardów razy większe od typowych stężeń biomarkerów. Niestety, szerokie widma tych interferentów mogą przekrywać się z widmami poszukiwanych związków, przez co pomiar staje się niedokładny lub niemożliwy. Ominięcie tego problemu wymaga starannego doboru zakresu widmowego, dla którego wpływ absorpcji światła przez molekuły H 2 O oraz CO 2 jest najmniejszy. Poza tym stosuje się inne metody, jak redukcja stężeń interferentów (szczególnie wody, przez osuszanie próbki), czy zmniejszanie ciśnienia badanej próbki powietrza do wartości 0,05 0,1 atm. podczas badania spektroskopowego. Dzięki redukcji zjawiska zwanego poszerzeniem ciśnieniowym poszczególne linie widmowe ulegają zawężeniu, zatem widma absorpcyjne związków są lepiej rozdzielone i za pomocą precyzyjnie dostrajanego lasera można markery wykrywać z większą selektywnością i uniezależniając się od wpływu interferentów.
54 T. Stacewicz i wsp. Rycina 3. Widma absorpcji metanu (a), amoniaku (b), tlenku azotu (c) dla stężeń występujących u zdrowego człowieka: NO 35 ppb, CO 2 5%, H 2 O po osuszeniu 279 ppm, siarczku karbonylowego (d) dla stężeń występujących u zdrowego człowieka: OCS 10 ppb, CO 10 ppm, CO 2 5%, H 2 O po osuszeniu 279 ppm Figure 3. Absorption spectra of methane (a) ammonia (b), nitrogen oxide (c) for concentrations occurring in healthy humans: NO 35 ppb, CO 2 5%, H 2 O after drying 279 ppm, carbonyl sulfide (d) for concentrations found in healthy humans: OCS 10 ppb, CO 10 ppm, CO 2 5%, H 2 O after drying 279 ppm W Instytucie Fizyki Doświadczalnej Uniwersytetu Warszawskiego i w Instytucie Optoelektroniki Wojskowej Akademii Technicznej przeprowadzono szczegółowe analizy dotyczące wyboru pasm absorpcji ważnych, z punktu widzenia medycyny, markerów chorobowych. Przykładowe widma absorpcji wybranych markerów na tle widm dwutlenku węgla i pary wodnej przedstawiono na ryc. 3. Dla widm przedstawionych na ryc. 3a i 3b przyjęto stężenia markerów odpowiadające maksymalnemu stężeniu występującemu w oddechu zdrowego człowieka (tab. 1). Dla dwutlenku węgla i wody przyjęto stężenia wynoszące 5%, czyli największe spotykane w wydechu ludzkim. Na ryc. 3c przedstawiono widma absorpcji tlenku azotu dla granicznych stężeń występujących u zdrowego człowieka: NO 35 ppb (wartość graniczna dla dzieci), H 2 O po osuszeniu 279 ppm, natomiast na ryc. 3d widma absorpcji OCS dla stężeń występujących u zdrowego człowieka: OCS 10 ppb, CO 10 ppm, CO 2 5%, H 2 O po osuszeniu 279 ppm. UKŁADY SPEKTROSKOPII LASEROWEJ DO DETEKCJI ŚLADOWYCH ILOŚCI MARKERÓW CHOROBOWYCH Zwykła spektroskopia absorpcyjna (nawet laserowa) z jednokrotnym przejściem promieniowania przez badaną próbkę jest zbyt mało czuła do wykrywania markerów chorobowych w wydychanym powietrzu. Należy posłużyć się technikami ultraczułymi. Należą do nich: spektroskopia z komórkami wieloprzejściowymi (Multipass MUPASS, np. z komórkami Herriott a czy White a), spektroskopia fotoakustyczna PAS (ang. Photoacoustic Spectroscopy), spektroskopia strat we wnęce optycznej CRDS (ang. Cavity Ring Down Spectroscopy) oraz jej odmiany (np. CEAS Cavity Enhanced Absorption Spectroscopy, CALOS, ICOS, 2f- WMS). W nomenklaturze polskiej zamiast CEAS przyjęła się nazwa SSWO akronim spektroskopii strat we wnęce optycznej. Niektóre z tych technik łączy się z tzw. spektroskopią modulacyjną. Idea tych metod została podana w publikacjach [3,23,25,28,29]. W niniejszej pracy ograniczymy się jedynie do podania uzyskanych wyników. W układach zbudowanych na UW i WAT do wykrywania metanu i amoniaku zastosowano technikę MUPASS. Jest to metoda o czułości mniejszej niż SSWO, jednakże jest także mniej czuła na niekorzystne czynniki, które mogą wystąpić w aparaturze w trakcie badania oddechu (np. zabrudzenie systemu). Jest także wskazana dla detekcji biomarkerów takich, jak formaldehyd czy monotlenek węgla, które podobnie jak CH 4 i NH 3 wystepują w wydychanym powietrzu w wiekszym stężeniu (tab. 1). Badane powietrze zawierające wybrany biomarker (a także około 5% dwutlenku węgla i ok. 1% cząsteczek H 2 O) podawane było z układu przygotowania mieszanek do komory układu MU- PASS. Komora ta zawiera dwa zwierciadła odległe od siebie o 50 cm. Odbijając się między zwieciadłami wiązka lasera ulegała 30-krotnemu przejściu przez próbkę badanego powietrza. Na ryc. 4 przedstawiono uzyskane wyniki odpowiednio dla metanu (a) i amoniaku (b). Jak widać, dla metanu uzyskano liniową charakterystykę odpowiedzi układu detekcyjnego w szerokim zakresie stężenia tego biomarkera, zarówno dla stężeń mniejszych (od 0.1 ppm do około 2,4 ppm ryc. 4a), jak i dla stężeń większych (do 1000 ppm załącznik do ryc. 4a).
Wykrywanie markerów chorobowych w oddechu metodami optoelektronicznymi 55 Rycina. 4. Wyniki badań eksperymentalnych detekcji: a) metanu, b) amoniaku Figure 4. Experimental results of detection: a) methane, b) ammonia Granica wykrywalności (czułość) układu pomiarowego (~ 0,1 ppm) znacząco przewyższa górny limit stężenia metanu w oddechu zdrowego człowieka (10 ppm). Układ ten dobrze więc spełnia wymogi zarówno do badań stanów chorobowych (np. przy chorobach jelit) jak i do monitoringu metanu w powietrzu wydychanym. Dla amoniaku (ryc. 4b) charakterystyka jest liniowa w zakresie stężeń większych niż około 1 ppm. Górny próg stężenia amoniaku w oddechu zdrowego człowieka wynosi 2 ppm, więc układ ten dobrze nadaje się do stwierdzania stanów chorobowych (np. choroby wątroby, choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy wywołana przez Helicobacter pylori). Jednak jego dokładność jest niewystarczająca do monitoringu stężenia amoniaku w oddechu zdrowego człowieka. Prawdopodobnie zdolność amoniaku do reagowania z parą wodną, jak również do przylegania do ścianek aparatury są jednymi z przyczyn niepewności wyznaczania stężenia tego związku w oddechu. Do detekcji tlenku azotu zastosowano metodę SSWO. Jako źródło promieniowania wykorzystano kwantowy laser kaskadowy typu sbcw1517 (Alpes Lasers SA). W trakcie tych pomiarów uzyskano granicę wykrywalności 30 ppb. Zgodnie z rekomendacją ATS osiągnięta granica wykrywalności dla tlenku azotu jest wystarczająca do monitorowania stanu zdrowia ludzi i wykrywania chorób dróg oddechowych, jak np. astma lub przewlekłe zapalenie oskrzeli. Fotografię stanowiska do pomiaru stężenia ditlenku azotu przedstawiono na ryc. 5. Do detekcji etanu jako źródło promieniowania użyto generator parametryczny PG711/DFG; posłużono się metodą SSWO. Dla fali o długości 3,348 µm uzyskano granicę wykrywalności 20 ppb. Do kalibracji opracowanych sensorów stosowano modułowy generator gazów wzorcowych 491M firmy KIN-TEK. Generator ten stosowano również do wytwarzania próbek referencyjnych biomarkerów. W systemie detekcji biomarkerów ważną rolę odgrywa układ pobierania próbek [26]. Umożliwia on pobranie powietrza w odpowiedniej fazie wydechu podczas swobodnego procesu oddychania przez pacjenta. Odpowiednie fazy oddechu są określane poprzez monitorowanie stężenia ditlenku węgla CO 2 (metoda PCO 2, ang. carbon dioxide pressure) w wydychanym powietrzu. Proces wydechu powietrza można podzielić na trzy fazy (ryc. 6). Rycina 6. Poglądowy kapnograf przedstawiający zmiany ciśnienia cząstkowego CO 2 w wydychanym powietrzu [22] Figure 6. The illustrative capnograph showing changes in partial pressure of CO 2 in exhaled air [22] Rycina 5. Fotografia stanowiska laboratoryjnego do pomiarów stężenia NO metodą SSWO Figure 5. Photography of laboratory setup for measurement of NO concentration by SSWO method W fazie pierwszej powietrze pochodzi z górnych dróg oddechowych. W fazie drugiej zauważalny jest gwałtowny wzrost ciśnienia cząstkowego dwutlenku węgla. Powietrze pochodzące z pęcherzyków płucnych należy mierzyć w trzeciej fazie wydechu. W punkcie PetCO 2 (ang. end-tidal carbon dioxide pressure) kończy się faza trzecia [22]. Schemat układu do pobierania próbek powietrza w odpowiedniej fazie wydechu przedstawiono na ryc. 7.
56 T. Stacewicz i wsp. Rycina 7. Schemat układu do pobierania biomarkerów od pacjenta [26] Figure 7. Scheme of sampling system for taking the biomarkers from a patient [26] Na początku procedury pomiarowej pacjent zakłada maskę twarzową wyposażoną w filtr antybakteryjny. Następnie wdycha powietrze syntetyczne z butli poprzez elektrozawór Ez1, układ regulacji przepływu, worek oddechowy i zespół rur oddechowych z systemem zaworów zwrotnych. Podczas wydechu powietrze, wstępnie oczyszczone z zanieczyszczeń biologicznych, jest przesyłane do sensora CO 2 sprzężonego z mikrokontrolerem. Mikrokontroler steruje obiegiem wydychanego powietrza za pomocą elektrozaworów Ez1 i Ez2. Cykl oddechowy pacjenta jest wizualizowany przy użyciu wskaźników LED. Powietrze otrzymane w poszczególnych fazach wydechu jest przesyłane do układu kondycjonowania próbek. Zgodnie z normą ATS/ERS, zapewniona jest prędkość wydychanego powietrza 3 dm 3 /min. Opracowany układ, może pracować w jednym z dwóch trybów tzn. on-line lub off-line. W trybie on-line pobrane od pacjenta powietrze przesyłane jest bezpośrednio do sensora gazu. W trybie off-line próbkę wydechu kieruje się do tedlarowego worka probierczego, który w późniejszym czasie jest podłączany do sensora celem przeprowadzenia dalszych badań. W obydwu trybach monitorowane są wartości przepływu i ciśnienia. Rycina 8. Schemat blokowy laboratoryjnego modelu układu kondycjonowania [31] Figure 8. Block diagram of a laboratory model of conditioning system [31]
Wykrywanie markerów chorobowych w oddechu metodami optoelektronicznymi 57 W przypadku pomiaru stężenia tlenku azotu należy z mierzonej próbki usunąć parę wodną. W tym celu w Instytucie Optoelektroniki WAT opracowano taki system. Składa się on z osuszacza nafionowego [19], filtru aerozoli, higrometru, regulatora ciśnienia, regulatora przepływu oraz pompy próżniowej. Schemat blokowy tego systemu przedstawiono na ryc. 8. System ten umożliwia osuszenie badanej próbki do około 3% wilgotności względnej, co oznacza blisko stukrotne zmniejszenie zawartości wody w stosunku do powietrza wydychanego z płuc (ryc. 9). stycznego jest szczególnie istotna w przypadku chorób, które w swej początkowej fazie przebiegają bezobjawowo. Postęp, jaki obserwuje się w ostatnich latach w optoelektronice, a w szczególności w zakresie nowych laserowych źródeł promieniowania [4] oraz fotodetektorów sprawia, że już teraz możliwe jest opracowanie stosunkowo niewielkiego i lekkiego (przenośnego), względnie taniego (dostępnego nawet dla lekarzy pierwszego kontaktu) oraz prostego w obsłudze sensora wybranych biomarkerów, współpracującego z dowolnym komputerem osobistym. Wyrażamy nadzieję, że już w niedalekiej przyszłości wysokoczułe optoelektroniczne sensory markerów chorobowych, będą stosowane w gabinetach lekarskich do badań przesiewowych. W niniejszym artykule opisano kilka sensorów markerów chorobowych. Oczywiście istnieje możliwość opracowania przyrządów, które umożliwią wykrywanie innych markerów. Wiąże się to ze zmianą lasera, elementów optycznych i fotodetektora. Dzięki dużej czułości, szybkim i selektywnym pomiarom stężenia danego gazu, opracowane sensory mogą być zastosowane do badań przesiewowych w celu wykrywania markerów chorobowych w wydychanym powietrzu na poziomie molekularnym. PIŚMIENNICTWO Rycina 9. Charakterystyka określająca stopień osuszania gazu [28] Figure 9. Characteristic defining the degree of gas drying [28] W celu poprawy czułości sensorów, w Katedrze Chemii Środowiska i Bioanalityki Wydziału Chemii UMK w Toruniu, rozwijane są prace w zakresie metodyki pobierania próbek oraz zastosowania modułu do ich wzbogacenia [5,6,15]. Składniki wydychanego powietrza wychwycone w dużej objętości analizowanego powietrza są selektywnie kumulowane w module wzbogacania. Następnie moduł ten jest łączony z sensorem optycznym. Na skutek podgrzania modułu wzbogacania, następuje uwolnienie biomarkerów. Zatem do sensora doprowadzone zostaną próbki powietrza o znacznie większym stężeniu wybranych komponentów. Umożliwi to tym samym znaczną poprawę czułości w odniesieniu do całego systemu pomiarowego. Granice wykrywalności, które osiągnięto podczas badań związanych z zastosowaniem laserowej spektroskopii w sensorach do wykrywania wybranych biomarkerów chorób w oddechu ludzkim przedstawiono w tab. 2. PODSUMOWANIE Zastosowanie sensorów optoelektronicznych do pomiaru stężenia biomarkerów wydaje się być niezwykle potrzebnym uzupełnieniem, a w niektórych wypadkach bardzo dobrą alternatywą do kosztownych, skomplikowanych i trudno dostępnych, a często inwazyjnych metod diagnostycznych. Przy użyciu nowoczesnych, wysokoczułych sensorów będzie można określić różnicę stężenia danego biomarkera dla osoby zdrowej i chorej. Potrzeba opracowania nowoczesnego systemu diagno- 1. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxid. Am J Respir Crit Care Med. 2005; 171, 912-930. 2. Bajtarevic A., Ager C., Pienz M. et al.: Noninvasive detection of lung cancer by analysis of exhaled breath. MBC Cancer. 2009; 9:348, 1-16. 3. Bielecki Z., Stacewicz T., Wojtas J. et al.: Application of quantum cascade lasers for trace gas detection. Bulletin of the Polish Academy of science Technical science. 2015; 63(2), (in print). 4. Bugajski M., Kosiel K., Szerling A. et al.: GaAs/AlGaAs (~9.4 µm) quantum cascade laser operating at 260K. Bull. Pol. Ac.: Tech. 2010; 58(4), 471-476. 5. Buszewski B., Grzywiński D., Ligor T. et al.: Detection of volatile organic compounds as biomarkers in breath analysis by different analytical techniques. Bioanalysis. 2013; 5(18), 2287-2306. 6. Buszewski B., Kesy M., Ligor T. et al.: Human exhaled air analytics: biomarkers of diseases. Biomed. Chromatogr. 2007; 21, 553-566. 7. Buszewski B., Rudnicka J., Ligor T. et al.: Analytical and unconventional methods of cancer detection using odor. Trends in Analytical Chemistry. 2012; 38, 1-12. 8. Chan H.P., Lewis C., Thomas P.S.: Exhaled breath analysis: novel approach for early detection of lung cancer. Lung Cancer. 2009; 63(2), 164-168. 9. Chrostowski J.: Sztuczne nosy. Wiedza i życie. 2006; 2, 30-33. 10. Dent A.G., Sutedja T.G., Zimmerman P.V.: Exhaled breath analysis for lung cancer. J Thorac Dis. 2013; 5(5), 540-550. 11. Dominioni L., Imperatori A., Rovera F. et al.: Stage I nonsmall cell lung carcinoma: analysis of survival and implications for screening. Cancer. 2000; 89, 2334-2344. 12. Dryahina K., Smith D., Spanel P.: Quantification of methane in humid air and exhaled breath using selected ion flow tube mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2010; 24, 1296-1304. 13. Fuchs P., Loeseken C., Schubert J.K. et al.: Breath gas aldehydes as biomarkers of lung cancer. Int J Cancer. 2010; 126(11), 2663-2670. 14. Karlsson M.: Characterization of absorption spectra of molecular constituents in the mid-infrared region and their role as potential markers for breath analysis. Student thesis. Umea University, Faculty of Science and Technology, Department of Physics, 2014. 15. Ligor T.: Analytical methods for breath investigation. Crit. Rev. Anal. Chem. 2009; 39, 2-12. 16. M. Bugajski: Room temperature AlGaAs/GaAs quantum cascade lasers. Photonics Letters of Poland. 2011; 3(2), 55-57. Tabela 2. Zestawienie osiągniętej granicy wykrywalności dla wybranych biomarkerów Table 2. The detection limits for selected biomarkers Biomarker Długość fali [µm] Typ lasera Rodzaj detektora Granica Niepewność Zastosowana wykrywalności [ppb] pomiaru [%] metoda Amoniak NH 3 2,239 DFB InGaAs 1000 10 MUPASS Metan CH 4 2,2536 DFB InGaAs 100 10 MUPASS Etan C 2 H 6 3,348 PG711/DFG HgCdTe 20 2,7 SSWO Tlenek azotu NO 5,263 QCL-DFG HgCdTe 30 10 SSWO
58 T. Stacewicz i wsp. 17. McWilliams A., Mayo J.: Computed tomography-detected noncalcified pulmonary nodules: a review of evidence for significance and management. Proc Am Thorac Soc. 2008; 5(9), 900-904. 18. Namjou K., Roller C.B., Reich T.E. et al.: Determination of exhaled nitric oxide distributions in a diverse sample population using tunable diode laser absorption spectroscopy. Appl. Phys. B: Lasers Opt. 2006; 85, 427-435. 19. Oficjalna strona producenta osuszaczy nafionowych dostępna pod adresem http://www.atut.lublin.pl/plk/nafion.pdf (z dn. 27.02. 2015) 20. Patterson C.S., McMillan L.C., Stevenson K. et al.: Dynamic study of oxidative stress in renal dialysis patients based on breath ethane measured by optical spectroscopy. J. Breath Res. 2007, 1, 026005: 1-026005:8. 21. Salthammer T.: A critical review of indoor formaldehyde concentrations and guideline values. Formacare-Formaldehyde Science Conference. 19.-20.04.2012, Madrid. 22. Schubert J. K., Spittler K.H., Braun G. et al.: CO2-controlled sampling of alveolar gas in mechanically ventilated patients. Journal of Applied Physiology. 2001; 90(2), 486-492. 23. Stacewicz T., Wojtas J., Bielecki Z. et al.: Cavity Ring Down Spectroscopy: detection of trace amounts of matter. Opto-Electron. Rev. 2012; 20( 1), 34-41. 24. Stamyr K., Vaittinen O., Jaakola J. et al.: Background levels of hydrogen cyanide in human breath measured by infrared cavity ring down spectroscopy. Biomarkers. 2009; 14(5), 285-291. 25. Starecki T.: Wybrane aspekty optymalizacji przyrządów fotoakustycznych, BTC, Legionowo, 2009. 26. Szabra D., Prokopiuk A., Majsterek D. i wsp.: Mikroprocesorowy układ pobierania próbek powietrza z oddechu ludzkiego. Elektronika. 2014; 55(12), 29-30. 27. Wang Ch., Sahay P.: Breath Analysis Using Laser Spectroscopic Techniques: Breath Biomarkers, Spectral Fingerprints, and Detection Limits. Sensors. 2009; 9, 8230-8262. 28. Wojtas J., Bielecki Z., Stacewicz T. et al.: Ultrasensitive laser spectroscopy for breath analysis. Invited Paper in Opto-Electron. Rev. 2012; 20(1), 77-90. 29. Wojtas J., Tittel F.K., Stacewicz T. et al.: Cavity-Enhanced Absorption Spectroscopy and Photoacoustic Spectroscopy for Human Breath Analysis. Int J. Thermophys. 2014; 35(12), 2215-2225. 30. Yamaya M., Sekizawa K., Ishizuka S. et al.: Increased Carbon Monoxide in Exhaled Air of Subjects with Upper Respiratory Tract Infections. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 1998; 158(1), 311-314. 31. Zając A.: Badania układu osuszania próbek pomiarowych do systemu wykrywania markerów chorobowych w wydychanym powietrzu. Praca inżynierska. WAT, Warszawa, 2015. Podziękowania Wyniki badań osiągnięto w ramach projektów finansowanych z budżetu Narodowego Centrum Badań i Rozwoju ID: 179900, ID: 179616, oraz Narodowego Centrum Nauki ID: 151673. Adres do korespondencji: Prof. dr hab. med. Tomasz Targowski Wojskowy Instytut Medyczny Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii CSK MON 04-141 Warszawa-44, ul. Szaserów 128 Tel. 22 612-24-10 e-mail: ttargowski@wim.mil.pl