PLATELIA CMV IgM 1 płytka 96 72811 TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO JAKOŚCIOWEGO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgM PRZECIWKO WIRUSOWI CYTOMEGALII W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU 881139 2013/11 1. ZASTOSOWANIE Platelia CMV IgM jest testem immunoenzymatycznym ELISA wykorzystującym technologię immunocapture do jakościowego oznaczania przeciwciał IgM anty-cmv w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2. ZNACZENIE KLINICZNE Ludzki cytomegalowirus (CMV) jest wirusem powszechnie występującym we wszystkich regionach geograficznych na świecie oraz we wszystkich grupach socjoekonomicznych. CMV należy do rodziny Hespervirus i jest przenoszony poprzez płyny ustrojowe w czasie bliskich kontaktów międzyludzkich (w moczu, ślinie, mleku matki, krwi, łzach, spermie i wydzielinie pochwy). Po zakażeniu CMV może przez lata pozostawać w stanie uśpienia w ciele zakażonych osób, a następnie reaktywuje się powodując nawracające infekcje z ryzykiem przeniesienia na inne osoby. Infekcja pierwotna zachodzi różnymi drogami i w różnych okresach życia (infekcje wrodzone, infekcje poporodowe). Po okresie uśpienia, może nastąpić infekcja wtórna w wyniku powtórnej infekcji wirusem egzogennym lub reaktywacji uśpionego wirusa. Od 50 do 85% populacji zostaje zakażone przed osiągnięciem wieku dorosłego, ale wiele zakażeń ma charakter bezobjawowy, jedynie 2% pacjentów wykazuje atypowe objawy, takie jak gorączka, osłabienie, bóle mięśni i stawów. Jednakże, infekcja CMV może mieć poważny przebieg u kobiet w ciąży, noworodków i nosicieli pozbawionych obrony immunologicznej. W czasie ciąży u od 1 do 3% kobiet dochodzi do zakażenia CMV, a przeniesienia zakażenia na płód drogą dyfuzji przez łożysko występuje u 40-50% pacjentów. 95% infekcji płodu jest bezobjawowych, ale u 5% komplikacje są bardzo poważne: hepatosplenomegalia, małogłowie, wodogłowie, wcześniactwo, opóźnienie psychoruchowe oraz śmierć płodu. W 10% infekcji bezobjawowych u noworodków dochodzi do późnych powikłań, takich jak częściowa lub całkowita utrata słuchu lub wzroku. W przypadku pacjentów pozbawionych obrony immunologicznej (AIDS, biorcy organów, choroby limfoproliferacyjne lub nowotwór) z rozsianymi i/lub wewnętrznymi infekcjami związane są poważne komplikacje: splenomegalia, zapalenie naczyniówki i siatkówki, zapalenie wątroby, zapalenie mięśnia sercowego, zapalenie mózgu. Infekcja u w takich przypadkach może mieć skutek śmiertelny. Kilka tygodni po zakażeniu CMV, reakcja układu immunologicznego prowadzi do powstania swoistych przeciwciał klasy IgM oraz po kolejnych kilku dniach, swoistych przeciwciał klasy IgG. Diagnostyka serologiczna zakażenia CMV polega na stwierdzeniu serokonwersji lub znaczącego wzrost miana przeciwciał IgG. Wykrycie swoistych przeciwciał IgM anty- CMV pomaga w diagnozie infekcji pierwotnej i wrodzonej. 3. ZASADA TESTU Platelia CMV IgM jest jakościowym testem immunoenzymatycznym do oznaczania przeciwciał klasy IgM anty-cmv w ludzkiej surowicy lub osoczu, z wychwytem IgM na fazie stałej Na fazie stałej opłaszczone są przeciwciała przeciwko ludzkim łańcuchom. Jako koniugat używana jest mieszanina antygenu CMV oraz monoklonalnego przeciwciała anty-cmv znakowanego peroksydazą. Wykonanie oznaczenia obejmuje następujące etapy: Etap 1 Próbki od pacjentów, kalibratory i kontrole są rozcieńczane w stosunku 1/21, a następnie przenoszone do studzienek mikropłytki. W czasie 1 godziny inkubacji w temperaturze 37 C, przeciwciała IgM obecne w próbce wiążą się z przeciwciałami anty-µ opłaszczonymi na studzienkach mikropłytki. Po inkubacji IgG oraz inne białka surowicy są usuwane przez wymywanie. Etap 2 Koniugat (mieszanina antygenu CMV oraz monoklonalnego przeciwciała anty-cmv oznaczonego peroksydazą) jest dodawany do studzienek mikropłytki. W czasie 1 godziny inkubacji w temperaturze 37 C, koniugat wiąże się ze swoistymi przeciwciałami IgM anty-cmv, które są na końcu wyłapywane na mikropłytce. Niezwiązany koniugat jest usuwany przez wymywanie na końcu inkubacji.
Etap 3 Obecność kompleksów immunologicznych (przeciwciała przeciw ludzkim łańcuchom /IgM anty-cmv/antygenu CMV/monoklonalnego przeciwciała anty-cmv oznaczonego peroksydazą) jest wykazywana przez dodanie roztworu substratu dla enzymu do każdej studzienki. Etap 4 Po inkubacji w temperaturze pokojowej (+18-30 C) reakcja enzymatyczna jest zatrzymywana przez dodanie 1N roztworu kwasu siarkowego. Odczyt optycznej gęstości uzyskiwany przy pomocy spektrofotometru ustawionego na 450/620 nm jest proporcjonalny do ilości przeciwciał IgM CMV obecnych w próbce. 4. SKŁAD ZESTAWU Odczynniki wystarczają na wykonanie 96 oznaczeń. Wszystkie odczynniki zestawu służą wyłącznie do diagnostyki in vitro. Etykieta Postać odczynnika Prezentacja R1 Mikropłytka Mikropłytka (gotowa do użytku) 12 pasków z 8 łamanymi studzienkami opłaszczonymi przeciwciałami przeciw ludzkim łańcuchom R2 Skoncentrowany roztwór do płukania (20x) Skoncentrowany roztwór do płukania (20x) Bufor TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Konserwant: 0,04% ProClin 300 R3 Kontrola negatywna Kontrola negatywna Ujemna w kierunku IgG anty-cmv, HBsAg, anty-hiv1, anty- HIV2 i anty-hcv surowica ludzka Konserwant: 0,15% ProClin 300 R4 Kalibrator Kalibrator Surowica ludzka reaktywna dla przeciwciał IgG CMV i nierektywna w kierunku antygenu HBs, anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv Konserwant: 0,15% ProClin 300 R5 Kontrola pozytywna Kontrola pozytywna Surowica ludzka reaktywna dla przeciwciał IgG CMV i nierektywna w kierunku antygenu HBs, anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv Konserwant: 0,15% ProClin 300 R6a Antygen Antygen CMV Liofilizowany antygen CMV Konserwant: 0,1% ProClin 300 R6b Koniugat (101x) Koniugat (101 x) Mysie monoklonalne przeciwciało anty-cmv znakowane peroksydazą Konserwant: 0,16% ProClin 300 R7 Rozcieńczalnik Rozcieńczalnik do próbek i koniugatu (gotowy do użytku) Bufor Tris-NaCl, surowica płodów bydlęcych, surowica kozia, mysie IgG, czerwień fenolowa Konserwant: 0,15% ProClin 300 1 mikropłytka 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 6 x 4,5 ml 1 x 0,4 ml 1 x 80 ml R9 Chromogen TMB Chromogen (gotowy do użytku) 3,3,5,5 czterometylobenzydyna (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) 1 x 28 ml R10 Roztwór zatrzymujący reakcję Roztwór zatrzymujący reakcję (gotowy do użytku) Roztwór 1N kwasu siarkowego 1 x 28 ml Informacje dotyczące warunków przechowywania i daty ważności znajdują się na opakowaniu. 5. ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Wiarygodność wyników zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać przeterminowanych odczynników. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii.
UWAGA: W przypadku roztworu do płukania (R2, etykieta: 20x koloru zielonego), chromogenu (R9, etykieta: TMB koloru turkusowego) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, etykieta: 1N koloru czerwonego), możliwe jest użycie innych serii niż zawarte w zestawie, pod warunkiem, że odczynniki te są identyczne i w danym badaniu używana jest ta sama seria. UWAGA: Dodatkowo w przypadku roztworu do płukania (R2, etykieta: 20x koloru zielonego), możliwe jest zmieszanie z dwoma innymi roztworami znajdującymi się w różnych zestawach odczynników Bio-Rad (R2, etykiety: 10x koloru niebieskiego lub 10x koloru pomarańczowego) przy prawidłowym ich rozcieńczeniu, pod warunkiem, że w danym badaniu używana jest tylko jedna mieszanina. Przed użyciem należy odczekać 30 minut, aby pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową (+18-30 C). Ostrożnie rozcieńczyć lub rozpuścić odczynniki nie dopuszczając do zanieczyszczenia. Nie przeprowadzać testu w obecności reaktywnych oparów (kwasów, zasad i aldehydów) lub kurzu, które mogą wpłynąć na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać dokładnie umytych naczyń szklanych po przepłukaniu ich wodą dejonizowaną lub, jeśli to możliwe, naczyń jednorazowego użytku. Mycie mikropłytki jest bardzo ważnym etapem procedury: należy przeprowadzić zalecaną liczbę cykli mycia i upewnić się, że studzienki zostaną całkowicie wypełnione, a następnie całkowicie opróżnione. Nieprawidłowe mycie może być powodem błędnych wyników. Nie dopuszczać do wyschnięcia mikropłytek po zakończeniu mycia i przed wprowadzeniem odczynników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu, wywołujący reakcję barwną. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na obecność metalu lub jonów metali. Z tego powodu nie można pozwolić na kontakt żadnego metalowego elementu z różnymi roztworami zawierającymi koniugat lub chromogen. Roztwór chromogenu (R9) powinien być bezbarwny. Pojawienie się niebieskiego koloru oznacza, że odczynnik nie nadaje się do użycia i należy go wymienić. Do każdej próbki należy używać nowej końcówki pipety. Należy skontrolować pipety i inny sprzęt pod względem dokładności i prawidłowego działania. BEZPIECZEŃSTWO I HIGIENA PRACY Materiał pochodzenia ludzkiego użyty do przygotowania odczynników został przebadany i wykazał brak reaktywności w kierunku antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBs Ag), przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C (anty-hcv) oraz wirusom ludzkiego niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2). Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny: Każdy materiał, łącznie z roztworami do płukania, który wejdzie w bezpośredni kontakt z próbkami i odczynnikami zawierającymi materiał pochodzenia ludzkiego, należy traktować jako potencjalnie zakaźny. Podczas pracy z próbkami i odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Unikać rozlewania próbek lub roztworów zawierających próbki. Miejsca, w których nastąpiło rozlanie należy przepłukać wybielaczem rozcieńczonym do 10%. W przypadku rozlania kwasu, należy go najpierw zneutralizować wodorowęglanem sodu, a następnie przemyć miejsce rozlania wybielaczem rozcieńczonym do 10% i osuszyć papierem chłonnym. Materiał użyty do czyszczenia należy wyrzucić do pojemnika ze skażonymi odpadami. Próbki pacjentów, odczynniki zawierające materiał pochodzenia ludzkiego oraz skażony materiał i produkty należy wyrzucać dopiero po ich odkażeniu: - przez zanurzenie w wybielaczu w stężeniu 5% podchlorynu sodu na 30 minut - lub przez sterylizacje w autoklawie w 121 C przez co najmniej 2 godziny. UWAGA: Nie wprowadzać do autoklawu roztworów zawierających podchloryn sodu Unikać kontaktu ze skórą i błoną śluzową wszelkich odczynników, również tych uważanych za bezpieczne. Chemiczne i biologiczne pozostałości należy traktować i utylizować zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Wszystkie odczynniki w zestawie są przeznaczone wyłącznie do diagnostycznego użytku in vitro. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej www.bio-rad.com. 6. PRÓBKI 1. Zalecanymi typami próbek są surowica i osocze (EDTA, heparyna lub cytrynian). 2. Podczas przetwarzania, przechowywania i pracy z próbkami krwi należy stosować się do poniższych zaleceń: Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego. Próbki surowicy pozostawić do powstania skrzepu przed odwirowaniem. Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. Po odwirowaniu jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od czerwonych krwinek i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temp. +2-8 C. Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp. -20 C lub niższej.
Nie należy używać próbek, które zostały rozmrożone więcej niż pięć razy. Wcześniej zamrożone próbki powinny być po rozmrożeniu dokładnie zmieszane (vortex) przed przystąpieniem do oznaczenia. 3. Próbki zawierające 90 g/l albuminy lub 100 mg/l wolnej bilirubiny, próbki lipemiczne zawierające ekwiwalent 36 g/l oleiny (trójglicerydu) oraz hemolizowane próbki zawierające do 10 g/l hemoglobiny nie mają wpływu na wyniki. 4. Nie należy podgrzewać próbek. 7. PROCEDURA OZNACZENIA 7.1 Wymagane materiały, które nie znajdują się w zestawie Worteks. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450 nm i 620 nm (*). Inkubator mikropłytek ustawiony termostatycznie na 37±1 C (*). Automatyczna, półautomatyczna lub ręczna płuczka mikropłytek (*). Jałowa woda destylowana lub dejonizowana. Rękawiczki jednorazowego użytku. Gogle lub okulary ochronne. Papier chłonny. Automatyczne lub półautomatyczne pipety lub multipipety regulowane lub ze stałym ustawieniem do odmierzania i wprowadzania od 10 µl do 1000 µl, oraz 1 ml, 2 ml i 10 ml. Cylindry z podziałką pojemności 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml. Podchloryn sodu (wybielacz) i wodorowęglan sodu. Pojemnik na odpady niebezpieczne dla człowieka i środowiska. Fiolki jednorazowego użytku. (*) Szczegółowe informacje na temat zalecanego sprzętu można uzyskać kontaktując się z działem technicznym naszej firmy. 7.2 Rozcieńczanie odczynników R1: Przed otworzeniem pozostawić torebkę na 30 minut w temperaturze pokojowej (+18-30 C). Wyciągnąć ramkę, niewykorzystane paski natychmiast schować z powrotem do torebki i sprawdzić obecność środka osuszającego. Dokładnie zamknąć ponownie torebkę i przechowywać w temperaturze +2-8 C. R2: Rozpuścić roztwór do płukania R2 w stosunku 1/20 w wodzie destylowanej: na przykład 50 ml R2 i 950 ml wody destylowanej w celu otrzymania gotowego do użytku roztworu do płukania. Przygotować 350 ml rozcieńczonego roztworu do płukania dla jednej płytki z 12 paskami w przypadku mycia ręcznego. R3, R4, R5: Rozcieńczyć w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/21 (przykład: 300 µl R7 + 15 µl kalibratora). R6a: Antygen CMV jest liofilizowany. Do przetestowania 2 pasków, rozcieńczyć jedną fiolkę liofilizowanego antygenu dodając 4,5 ml rozcieńczalnika (R7). Dokładnie wymieszać. Po rozcieńczeniu roztwór antygenu (R6a+R7) musi być idealnie przejrzysty. R6 (R6a+R6b) roztwór roboczy koniugatu: Dodać 45 µl koniugatu (R6b) do każdej fiolki z rozcieńczonym antygenem CMV (R6a+R7). Dokładnie wymieszać. Roztwór roboczy koniugatu musi zostać użyty natychmiast po rozcieńczeniu. 7.3 Przechowywanie i okres przydatności otwartych i/lub rozcieńczonych odczynników Zestaw należy przed otwarciem przechowywać w temperaturze +2-8 C, każdy składnik może zostać użyty do upływu daty przydatności umieszczonej na zewnętrznej etykiecie zestawu. R1: Po otwarciu paski pozostaną stabilne do 8 tygodni, jeśli przechowywane będą w temperaturze +2-8 C w tej samej dokładnie zamkniętej torebce (sprawdzić obecność środka osuszającego). R2: Po rozcieńczeniu roztwór do płukania może być przechowywany do 2 tygodni w temperaturze +2-30 C. Po otwarciu skoncentrowany roztwór do płukania przechowywany w temperaturze +2-30 C przy braku zanieczyszczeń pozostanie stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie. R3, R4, R5, R6b, R7: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8 C pozostaną stabilne do 8 tygodni. R6 (R6a+R6b): Po rozcieńczeniu roztwór roboczy koniugatu musi zostać natychmiast użyty. R9: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C pozostanie stabilny do 8 tygodni. R10: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C pozostanie stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie. 7.4 Procedura Należy bezwzględnie przestrzegać procedury oznaczenia i zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Przed użyciem należy pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową (+18-30 C). Użycie odłamywalnych studzienek wymaga szczególnej uwagi podczas pracy z nimi. Podczas każdego cyklu należy użyć wszystkich kalibratorów w celu weryfikacji wyników testu. 1. Dokładnie ustalić plan wprowadzania i identyfikacji kalibratorów, kontroli i próbek pacjentów. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór do płukania(r2) [patrz: punkt 7.2].
3. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania [patrz: punkt 7.2]. 4. Przygotować roztwór roboczy koniugatu R6 (R6a+R6b) [patrz: punkt 7.2]. 5. W oznakowanych probówkach rozcieńczyć kalibrator (R4), kontrole (R3, R5) oraz próbki pacjentów (S1, S2 ) w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/21: 300 µl rozcieńczalnika (R7) i 15 µl próbki. Wymieszać rozcieńczone próbki. 6. Nanieść rozcieńczone kalibratory i próbki po 200 l do każdego dołka, ściśle wg podanego schematu: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. Natychmiast przystąpić do inkubacji mikropłytki w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze przez 1 godzinę 5 minut w temperaturze 37 C 1 C. 8. Po zakończeniu inkubacji zdjąć folię. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Przemyć mikropłytkę 4 razy 350 µl roztworu do czyszczenia (R2). Odwrócić mikropłytkę i delikatnie ostukać na papierze chłonnym w celu usunięcia pozostałej ilości płynu. 9. Natychmiast dodać 200 µl roboczego roztworu koniugatu (R6) do wszystkich studzienek. Przed użyciem roztworu należy nim delikatnie wstrząsnąć. 10. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. Natychmiast przystąpić do inkubacji mikropłytki w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze przez 1 godzinę 5 minut w temperaturze 37 C 1 C. 11. Po zakończeniu inkubacji zdjąć folię. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Przemyć mikropłytkę 4 razy 350 µl roztworu do czyszczenia (R2). Odwrócić mikropłytkę i delikatnie ostukać na papierze chłonnym w celu usunięcia pozostałej ilości płynu. 12. Szybko dodać 200 µl roztworu chromogenu (R9) do każdej studzienki z dala od światła. Pozwolić reakcji przebiegać w ciemności przez 30 ± 5 minut w temperaturze pokojowej (+18-30 C). W czasie tej inkubacji nie używać folii adhezyjnej. 13. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10) do każdej studzienki. Zastosować tę samą sekwencję i szybkość wprowadzania jak w przypadku roztworu preparatu enzymatycznego. 14. Ostrożnie przetrzeć dolną stronę płytki. Odczytać gęstość optyczną przy 450/620 nm korzystając z czytnika płytki w ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji. Przed dokonaniem odczytu paski muszą znajdować się ciągle z dala od światła. 15. Przed wydaniem wyników należy sprawdzić zgodność odczytu z planem dystrybucji płytki i próbek. 8 INTERPRETACJA WYNIKÓW 8.1 Obliczanie wartości odcięcia (CO) Wartość odcięcia (CO) odpowiada średniej wartości gęstości optycznych (OD) kalibratora (R4): CO = średnia OD dla R4 8.2 Obliczanie indeksu próbki Wynik próbki jest wyrażany w formie indeksu na podstawie poniższego wzoru: Indeks próbki = OD próbki /CO 8.3 Kontrola jakości Dla każdej mikropłytki i każdego cyklu należy uwzględnić kalibrator i kontrole, a następnie przeanalizować uzyskane wyniki. W celu weryfikacji testu należy spełnić następujące kryteria: Wartości gęstości optycznej: - CO > 0,200-0,80 x CO < OD R4 Repl.1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 Repl.2 < 1,20 x CO (Wartość OD dla kalibratorów (R4) nie może różnić się od wartości CO o więcej niż 20%). Stosunki gęstości optycznej: - Stosunek R3 (OD R3 / CO) < 0,50 - Stosunek R5 (OD R5 / CO) > 1,60
Jeśli te kryteria kontroli jakości nie zostaną spełnione, należy powtórzyć test. 8.4 Interpretacja wyników Indeks próbki Wynik Interpretacja Indeks < 0,90 Ujemny Próbka jest uważana za niereaktywną pod względem obecności przeciwciał IgM CMV. 0,90 Indeks < 1,10 Niejednoznaczny Próbka jest uważana za niejednoznaczną pod względem obecności przeciwciał IgM CMV. Wynik należy potwierdzić przez inny test wykonany na drugiej próbce pobranej co najmniej 3 tygodnie po pierwszym badaniu. Indeks 1,10 Dodatni Próbka jest uważana za reaktywną pod względem obecności przeciwciał IgM CMV. Jeśli podejrzewana jest niedawna infekcja, przydatne w potwierdzeniu diagnozy może być przeprowadzenie innych testów serologicznych, takich jak pomiar awidności przeciwciał IgG. 8.5 Rozwiązywanie problemów Wyniki nie spełniające kryteriów walidacji i niepowtarzalne reakcje są często powodowane przez: Niedokładne przemycie mikropłytek. Zanieczyszczenie negatywnych próbek surowicą lub osoczem o wysokim stężeniu przeciwciał. Zanieczyszczenie roztworu preparatu enzymatycznego chemicznymi odczynnikami utleniającymi (wybielacz, jony metalu...). Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję. 9 CHARAKTERYSTYKA TESTU Charakterystyka testu Platelia CMV IgM została oceniona w 2 ośrodkach przy użyciu w sumie 824 próbek od kobiet w ciąży i dawców krwi. 9.1 Prewalencja Prewalencja przeciwciał anty-cmv IgM zostało oznaczona przy pomocy produktu Platelia CMV IgM na panelu 300 próbek od kobiet w ciąży z Paryża (Francja). 5 próbek dało pozytywny wynik w kierunku przeciwciał anty-cmv IgM. Prewalencja oznaczona przy pomocy testu Platelia CMV IgM została określona na 1,7% (5/300). 9.2 Swoistość Względna swoistość została określona na panelu 740 próbek z dwóch ośrodków znajdujących się we Francji o następującym podziale: 252 próbki surowicy od dawców krwi 488 próbek surowicy od kobiet w ciąży Wyniki zostały porównane z tymi uzyskanymi przy pomocy dwóch komercyjnie dostępnych testów EIA uznanych za źródła odniesienia. Badana populacja / ośrodek Ośrodek 1 Ośrodek 2 Kobiety w ciąży Dawcy krwi Kobiety w ciąży Liczba próbek surowicy Ujemny Niejednoznaczny Dodatni Swoistość 205 203 1 1 252 249 2 1 283 282 0 1 Suma 740 734 3 3 Próbki o wątpliwym wyniku zostały uznane za pozytywne przy obliczaniu swoistości [IC 95%] = 95% przedział ufności. 99,0% [96,5 99,9] (203/205) 98,8% [96,6 99,7] (249/252) 99,7% [98,1 100,0] (282/283) 99,2% [98,2 99,7] (734/740)
9.3 Czułość Względna czułość została określona na panelu 113 próbek z dwóch ośrodków znajdujących się we Francji o następującym podziale: 35 próbek od 16 pacjentów wykazujących kinetykę pierwotnej infekcji CMV (ośrodek 2) 49 próbek z 3 sprzedawanych paneli serokonwersji (ośrodek 1) 29 pojedynczych próbek pozytywnych pod względem obecności przeciwciał anty-cmv IgM (ośrodek 1) Wyniki zostały porównane z tymi uzyskanymi przy pomocy dwóch komercyjnie dostępnych testów EIA uznanych za źródła odniesienia. Wśród 35 próbek z pierwotnych infekcji CMV, w 29 próbkach wykryto przeciwciała IgM przy użyciu różnych metod. Wszystkie 29 próbek posiadało przeciwciała anty-cmv IgG o niskiej awidności. 2 próbki zostały określone jako pozytywne pod względem obecności przeciwciał anty-cmv IgM w wyniku testu referencyjnego, jednak nie w wyniku testu Platelia CMV IgM. Te 2 próbki posiadały przeciwciała anty CMV IgG o średniej awidności i odpowiadały próbkom pobranym niedługo po początku infekcji. Wyniki uzyskane na 3 panelach serokonwersji były następujące: W przypadku jednego panelu test Platelia CMV IgM wykrył przeciwciała anty-cmv IgM 10 dni przed uzyskanym wynikiem pozytywnym dla testu referencyjnego. W przypadku jednego panelu wykrycie przeciwciał anty-cmv IgM miało miejsce jednocześnie (wątpliwy wynik testu referencyjnego i pozytywny testu Platelia CMV IgM) W przypadku jednego panelu test Platelia CMV IgM wykrył przeciwciała anty-cmv IgM 3 dni po przeprowadzeniu testu referencyjnego (wątpliwy wynik testu referencyjnego i negatywny testu Platelia CMV IgM). Ostatecznie 28 z 29 pojedynczych próbek wykazało potwierdzony wynik pozytywny przy użyciu testu Platelia CMV IgM, natomiast pozostała próbka uzyskała wynik wątpliwy. 9.4 Reaktywność krzyżowa Panel 156 próbek zawierający 115 próbek o wyniku pozytywnym dla toksoplazmozy, różyczki, EBV, HSV, VZV, świnki, odry i HIV oraz 41 próbek o wyniku pozytywnym dla czynnika reumatoidalnego, autoprzeciwciał, przeciwciał heterofilnych i od pacjentów ze szpiczakiem został oznaczony z użyciem testu Platelia CMV IgM oraz komercyjnie dostępnych testów EIA w celu zbadania obecności przeciwciał anty-cmv IgM. Wśród tych próbek tylko 2 uzyskały wynik pozytywny w teście Platelia CMV IgM: 1 próbka surowicy pod względem IgG przeciwko wirusowi różyczki i negatywna w teście referencyjnym, 1 próbka surowicy pod względem czynnika reumatoidalnego i zgodna z testem referencyjnym. 9.5 Precyzja Powtarzalność wewnątrz-testowa (powtarzalność): W celu oceny powtarzalności w ramach jednego testu przetestowano jedną próbkę o wyniku negatywnym i trzy próbki o wyniku pozytywnym 30 razy w ciągu tego samego cyklu. Indeks (OD próbki/co) został określony dla każdej próbki. Poniższa tabela zawiera średni indeks, standardowe odchylenie (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) każdej z czterech próbek: Powtarzalność N=30 Próbka ujemna Próbka słabo Próbka Indeks (OD próbki / wartość graniczna) Próbka wysoko Średnia 0,11 1,13 1,90 3,75 SD 0,01 0,07 0,09 0,09 %CV 11,4% 6,2% 4,8% 2,3% Powtarzalność między-testowa (odtwarzalność): W celu oceny powtarzalności pomiędzy testami przetestowano cztery próbki (jedną próbkę o wyniku negatywnym i trzy próbki o wyniku pozytywnym) 20 razy w dwóch cyklach dziennie przez okres 20 dni. Indeks (OD próbki/co) został określony dla każdej próbki. Poniższa tabela zawiera średni indeks, standardowe odchylenie (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) każdej z czterech próbek: Odtwarzalność N=80 Próbka ujemna Próbka słabo Próbka Indeks (OD próbki / wartość graniczna) Próbka wysoko Średnia 0,18 1,06 1,76 3,28 SD 0,041 0,11 0,18 0,30 %CV 22,5% 9,9% 10,3% 9,1%
10 OGRANICZENIA PROCEDURY Diagnostyka zakażenia CMV może być prowadzona wyłącznie na podstawie jednoczesnej analizy danych klinicznych i biologicznych. Wynik pojedynczego oznaczenia miana przeciwciał anty-cmv IgM nie stanowi dostatecznego dowodu, aby postawić rozpoznanie niedawnego zakażenia CMV. Diagnoza niedawnej infekcji może zostać postawiona wyłącznie na podstawie pełnych informacji na temat pacjenta, łącznie z danymi klinicznymi i biologicznymi (znaczny wzrost przeciwciał anty-cmv IgG w 2 próbkach surowicy pacjenta pobranych w odstępie 3 tygodni i przebadanych w ramach tego samego oznaczenia, obecność anty-cmv IgM na istotnym poziomie, niska awidność IgG). Obecność przeciwciał anty-cmv IgM nie jest wystarczającym dowodem potwierdzającym niedawną infekcję, ponieważ IgM mogą utrzymywać się przez kilka miesięcy lub nawet lat po infekcji. Po wykryciu IgM należy przeprowadzić badanie ilościowe przeciwciał anty-cmv IgG oraz dalsze badanie ewolucji przeciwciał anty- CMV, przynajmniej na drugiej próbce surowicy pobranej trzy tygodnie później. Jeśli próbka zostanie poddana testowi zbyt wcześnie w czasie niedawnej infekcji pierwotnej, przeciwciała anty- CMV IgM mogą jeszcze nie być obecne. Jeśli istnieje podejrzenie zakażenia, należy pobrać drugą próbkę około 3 tygodni później i przeprowadzić na niej ponownie test na obecność IgM. 11 KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie produkowane i wprowadzane do sprzedaży odczynniki są przygotowywane zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu, i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Odpowiednie protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii są przechowywane w firmie. 12 LITERATURA 1. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J. 1990. Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S753. 2. Demmler G.J. 1991. Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: 315-329. 3. Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A. 1990. The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: 663-667. 4. Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A. 2003. Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162: 248-253. 5. Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al. 1997. Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: 944-946. 6. Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P. 1998. Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36: 3540-3544. 7. Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L. 2004. A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: 861-863. 8. Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D. 2005. Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: 4713-4718. 9. Revello M.L., Gerna G. 2002. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: 680-715. 10. Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al. 1982. Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306: 945-949.
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/11 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881139 www.bio-rad.com