Walidacja analityczna wybranych metod stosowanych w ocenie przecieku matczyno-płodowego

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 Volume 47 Number 1 69-75 Praca oryginalna Original Article Walidacja analityczna wybranych metod stosowanych w ocenie przecieku matczyno-płodowego Quantification of feto-maternal hemorrhage: the validation of methods of choice Agnieszka Sapa 1, Andrzej Janus 2 1 Katedra i Zakład Chemii Klinicznej Analityki Medycznej, Akademia Medyczna we Wrocławiu, 2 Zakład Chirurgii Eksperymentalnej i Badania Biomateriałów, Akademia Medyczna we Wrocławiu Streszczenie Na skutek kontaktu antygenów krwinek płodu z krwią matki może dojść do wytworzenia alloprzeciwciał odpornościowych i rozwoju Choroby Hemolitycznej Płodu/Noworodka. Jednym z najczęstszych antygenów powodujących alloimmunizację jest antygen D z układu Rh. W tym zakresie od lat stosuje się immunoprofilaktykę, co w niektórych sytuacjach klinicznych wymaga uwzględnienia wielkości przecieku matczyno-płodowego. W pracy scharakteryzowano dwie metody umożliwiające jego wykrycie test cytofluorymetryczny Fetal Cell Count Kit (FCC) oraz metodę manualną Kleihauer-Betke (KB). W badaniach posłużono się krwią obwodową ochotniczek oraz krwią pępowinową pobieraną w trakcie cesarskich cięć. Powtarzalność testów, jako WZ, określono na 3 poziomach firmowego materiału kontrolnego i wynosiła kolejno 19,57 %, 20,45 %, 3,40 % dla FCC oraz 51,82 %, 48,11 %, 25,00 % dla KB. Poprawność określono posługując się szeregiem mieszanin krwi pępowinowej w zgodnej grupowo (AB0 i RhD) krwi obwodowej. Wyrażono ją jako % odzysku, który wynosił od 94 do 120 % dla FCC i od 40 do 94,2 % dla KB. Korelacja pomiędzy wartościami oczekiwanymi i wynikami uzyskanymi dla mieszanin wyniosła 0,9951 (FCC) i 0,9972 (KB). Wyznaczony wstępnie zakres wartości referencyjnych krwinek z HbF u zdrowych, nieciężarnych kobiet wyniósł 0 2,5 % (testem FCC) i 0 2,2 % (metodą KB). Określono również korelację pomiędzy wynikami uzyskanymi obydwiema metodami w grupie badanej (0,9804; p<0,0001) i dla mieszanin krwi (0,9973; p<0,0001). Przeprowadzone badania wskazują, że obydwa testy prawdopodobnie mogą być stosowane zamiennie. Wniosek ten wymaga jednak weryfikacji klinicznej na dużej grupie pacjentek ciężarnych. Należy rozważyć celowość wdrażania do rutynowej diagnostyki bardzo precyzyjnej metody FCC o wysokiej poprawności, jednakże kosztownej i wymagającej używania wysokospecjalistycznego aparatu. Summary Hemolytic disease of the fetus and newborn (HDF/N) is an alloimmune condition that develops in a fetus, when the IgG antibodies produced by the mother pass through the placenta. There is a possibility to prevent sensitization to the RhD antigen, using D immunoglobulin, which is given to a mother after birth. In some cases the measurement of fetal RBCs in maternal circulation (feto-maternal hemorrhage FMH) is critical for the adequate immunoglobulin dosage. In the study two FMH tests were evaluated: flow cytometry assay Fetal Cell Count Kit (FCC) and manual Kleihauer-Betke test (KB). In the study adult donor blood was examined as well as the cord blood, that was collected during Caesarean sections. Within-run imprecision was evaluated as a coefficient of variation on 3 levels of control blood and these values were 19,57 %, 20,45 % and 3,40 % for FCC Kit and 51,82 %, 48,11 % and 25,00 % for KB test. The accuracy was estimated using artificial mixtures of cord blood in adult blood (AB0 and RhD matched). The results ranged from 94 to 120 % for FCC Kit and from 40 to 94,2 % for KB test. The correlation between expected values and results was very good R 2 = 0,9951 and R 2 = 0,9972 for FCC Kit and KB test, respectively. Preliminary estimated reference values for HbF-cells in adult, nonpregnant women were 0 2,5 % for FCC and 0 2,2 % for KB. The correlation coefficients between both tests results were 0,9804; p<0,0001 for adult blood samples and 0,9973; p<0,0001 for artificial mixtures. The results of the study show that both tests could probably have the same diagnostic value but this conclusion should be confirmed by performing a clinical study on a numerous group of pregnant patients. Nevertheless, one should consider usefulness of the accurate and precise flow cytometry assay that is expensive and requires specific instrument. 69

Walidacja analityczna wybranych metod stosowanych w ocenie przecieku matczyno-płodowego Słowa kluczowe: przeciek matczyno-płodowy, choroba hemolityczna płodu/noworodka, Fetal Cell Count Kit, Kleihauer-Betke, walidacja Key words: feto-maternal hemorrhage, hemolytic disease of the fetus and newborn, Fetal Cell Count Kit, Kleihauer-Betke, validation Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2009-2011 jako projekt badawczy nr N N407 050936 Wstęp Immunizacja matczyno-płodowa jest bardzo poważnym problemem perinatologicznym. Alloimmunizacja matki może nastąpić na skutek bezpośredniego kontaktu jej krwi z krwią dziecka lub być wynikiem immunizacji poprzetoczeniowej. Najczęściej jednak związana jest z patologicznym przebiegiem aktualnej lub poprzedniej ciąży. Wytworzenie przez matkę alloprzeciwciał odpornościowych, skierowanych przeciwko antygenom krwinek płodu, może prowadzić do Choroby Hemolitycznej Płodu/Noworodka (ChHP/N), w której dochodzi do niszczenia erytrocytów dziecka. Rozwijająca się ChHP/N może mieć różny przebieg: od bardzo łagodnej postaci możliwej do wykrycia jedynie w badaniach laboratoryjnych, do ciężkiej niedokrwistości jeszcze w stanie prenatalnym, silnej żółtaczki, niewydolności krążenia i obrzęku płodowego, a w skrajnych przypadkach nawet do śmierci wewnątrzmacicznej. Najlepszą metodą radzenia sobie z konfliktem i nie dopuszczania do rozwoju choroby jest stosowanie immunoprofilaktyki. Podanie preparatu immunoglobuliny anty-d kobiecie RhD-ujemnej do 72 h po porodzie zapobiega wytworzeniu przeciwciał i zapewnia ochronę kolejnej ciąży. Nieinwazyjne badania umożliwiające wykrycie zwiększonego przecieku płodowego, poprzez określenie ilości krwinek płodowych w krążeniu matki, mają ogromne znaczenie dla dobrania odpowiedniej dawki preparatu przeciwciał anty-d, gdyż w niektórych przypadkach konieczna jest jej modyfikacja. W niektórych krajach prowadzi się również takie badania celem zastosowania wczesnej immunoprofilaktyki śródciążowej, która jednak nie jest rutynowo stosowana w Polsce [1, 4, 6, 7, 12]. W wielu laboratoriach do oceny wielkości przecieku matczyno-płodowego rutynowo stosuje się test Kleihauer-Betke, który jest prostą manualną metodą, jednakże czasochłonną i obarczoną dużym błędem. Dostępnych jest także kilka testów diagnostycznych na cytometr przepływowy, z których większość oparta jest, podobnie jak metoda Kleihauer-Betke, o wykrywanie krwinek zawierających hemoglobinę płodową. Firma IQ Products (Holandia) opracowała test, zawierający dodatkowe przeciwciała, umożliwiający oddzielenie populacji krwinek płodowych od krwinek dorosłych, zawierających HbF. Celem badań było przeprowadzenie walidacji testu Fetal Cell Count Kit (IQ Products, Holandia) oraz metody Kleihauer-Betke. W toku badań zamierzano określić nieprecyzję, poprawność oraz liniowość obydwu testów. Przeprowadzone badania miały także określić korelację między wynikami uzyskanymi obydwoma testami. Zaplanowano również badania wstępnie umożliwiające wyznaczenie zakresu wartości referencyjnych dla odsetka krwinek zawierających HbF, występujących fizjologicznie u zdrowych klinicznie, nieciężarnych kobiet. Materiał i metody W badaniach posługiwano się dwoma rodzajami materiałów biologicznych: krew obwodowa 20 zdrowych ochotników, pobrana w ob- jętości 2,7 ml na EDTA-K2, z wykorzystaniem zamkniętych zestawów aspiracyjno-próżniowych S-Monovette firmy Sarstedt; krew pępowinowa, pobierana w objętości 4,9 ml na EDTA-K2 w trakcie wykonywania rutynowych zabiegów cesarskich cięć od pacjentek II Katedry i Kliniki Ginekologii, Położnictwa i Neonatologii Akademii Medycznej we Wrocławiu (kierownik: dr hab. n. med. Mariusz Zimmer, prof. nadzw.), przy wykorzystaniu zamkniętych zestawów aspiracyjno-próżniowych S-Monovette firmy Sarstedt; Każdy materiał od momentu pobrania do przeprowadzenia badań, przechowywany był maksymalnie do 48 godzin w temperaturze 2 6 C. Z krwi pępowinowej wykonano szereg rozcieńczeń w zgodnej grupowo (pod kątem AB0 i RhD) krwi obwodowej ochotników uzyskując 100 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2,5 %, 2 %, 1,5 %, 1 %, 0,5 % i 0,25 % mieszaniny krwi pępowinowej we krwi obwodowej. Do oznaczania ilości krwinek zawierających HbF wykorzystano dwukolorową technikę cytometrii przepływowej z zastosowaniem zestawu Fetal Cell Count Kit (IQ Products, Holandia). Test opiera się na zróżnicowaniu krwinek pod kątem ich składu. W erytrocytach płodowych zawarta jest duża ilość HbF, występującej w małych ilościach w krwinkach osób dorosłych. Erytrocyty matki natomiast są bogate w anhydrazę węglanową (CA), enzym spełniający fizjologiczną funkcję w transporcie CO 2 z tkanek do płuc, która nie wykazuje ekspresji w krwinkach w życiu płodowym. Zastosowane w teście swoiste znakowane przeciwciała skierowane przeciwko HbF oraz CA umożliwiają wykrycie i zróżnicowanie obydwu rodzajów erytrocytów. W badaniu stosuje się mysie monoklonalne przeciwciała znakowane fikoerytryną (R-PE) przeciwko ludzkiej hemoglobinie płodowej, oraz królicze poliklonalne przeciwciała znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przeciwko ludzkiej anhydrazie węglanowej, a poszczególne krwinki zliczane są za pomocą cytofluorymetru przepływowego. W badaniach posłużono się aparatem BD FACSCanto (Becton Dickinson, USA), będącym na wyposażeniu Laboratorium Biologii Molekularnej Akademickiego Centrum Diagnostyki Laboratoryjnej, Akademickiego Szpitala Klinicznego AM we Wrocławiu. Do każdej próby badanej dołączono kontrolę izotypową firmy IQ Products: 70

A. Sapa, A. Janus I.C.poly Ig FITC (Rabbit), seria 60416 oraz Isotype control IgG1 R-PE, klon MCG1 (Mouse), seria 60708. Wykrywanie krwinek zawierających HbF przeprowadzono także manualnym testem kwaśnej elucji, metodą Kleihauer-Betke, według [2]. Badanie wykorzystuje różnicę między erytrocytami osoby dorosłej oraz krwinkami płodu, która dotyczy występującej w nich hemoglobiny. Hemoglobina HbA1 stanowi u osób dorosłych 97 98 % Hb całkowitej, resztę stanowią hemoglobina HbA2 oraz niewielka ilość (około 1 %) hemoglobiny płodowej (HbF). W życiu płodowym HbF stanowić może około 90 % Hb całkowitej, u noworodków występuje ona natomiast w 50 80 %. HbF różni się budową i zawartością poszczególnych łańcuchów polipeptydowych, ale także charakteryzuje się ona większym powinowactwem do tlenu i większą odpornością na kwaśną elucję. W toku badań, krwinki zawierające hemoglobinę dorosłych zostają wypłukane z hemoglobiny i w obrazie mikroskopowym są bladoróżowe (określa się je mianem cieni krwinek). Natomiast erytrocyty wypełnione HbF (trudniejszej do elucji z krwinek) barwią się na czerwono erytrozyną, a kolor jest tym intensywniejszy, im większe jest stężenie hemoglobiny płodowej w danych komórkach. Otrzymane w wyniku barwienia preparaty mikroskopowe ocenione były pod imersją za pomocą mikroskopu świetlnego Olympus CX21 (przy 1000-krotnym powiększeniu), a zdjęcia obrazów wykonane przy pomocy aparatu Samsung SGH-U700. W każdym preparacie liczono do 2000 krwinek czerwonych i odnotowano liczbę krwinek płodowych, obliczając odsetek krwinek zawierających HbF [2, 3, 13]. Do każdej z serii badań przeprowadzonych metodą manualną oraz cytometryczną, dołączano kontrole Fetaltrol firmy Trillium (USA), przy czym każda z nich była przygotowywana do badania w taki sam sposób, jak próbki badane. Producent określił wartości nominalne dla metody Kleihauer-Betke oraz dla testów cytometrycznych, opartych wyłącznie o wykrywanie krwinek z HbF, czyli inną, niż stosowaną w niniejszej pracy, metodą. Wartości te przedstawiono w tabeli I. Obliczenia statystyczne przeprowadzono przy użyciu programu MedCalc (wersja 10.4.7.0). Wykres korelacji między wartościami oczekiwanymi i wynikami uzyskanymi badanymi testami, wykonano w MS Office Excel 2007. Wyniki Różnicowanie krwinek zawierających HbF i krwinek dorosłych. Na rycinie 1 przedstawiono cytogram i histogram uzyskany Rycina 1. Cytogram (A) i histogram (B) uzyskany dla 5 % mieszaniny krwinek. Rycina 2. Cytogram (A) i histogram (B) uzyskany dla próbki krwi osoby dorosłej. 71

Walidacja analityczna wybranych metod stosowanych w ocenie przecieku matczyno-płodowego Rycina 3: Obraz mikroskopowy uzyskany metodą Kleihauer-Betke. Fetaltrol firmy Trillium Diagnostics (USA), których charakterystyka została przedstawiona w Tabeli I. Uzyskane wyniki powtarzalności obydwu metod przedstawiono w Tabeli II. Poprawność testów W celu określenia poprawności metod, posłużono się szeregiem mieszanin krwi pępowinowej z krwią pełną zdrowych, nieciężarnych kobiet. Badanie wykonano każdą metodą w 3 seriach, a pod uwagę brano średnie arytmetyczne z otrzymanych wyników. Poprawność metod obliczono jako % odzysku. Otrzymane wartości przedstawiono w Tabeli III. Liniowość testów W celu zbadania liniowości, określono korelację między wartościami oczekiwanymi, a wynikami uzyskanymi przy określaniu poprawności, co przedstawiono na wykresie (ryc. 4). Tabela I Odsetek krwinek z HbF w kontrolach Fetaltrol dla metody FCC i KB. kontrola Level 1 Level 2 Level 3 seria F09-02N F09-02L F09-02H odsetek krwinek zawierających HbF dla metody FCC odsetek krwinek zawierających HbF dla metody KB 0,0 0,03 % 0,11 0,19 % 1,31 1,69 % 0,0 0,04 % 0,1 0,3 % 1,3 1,8 % Tabela II Nieprecyzja metody Fetal Cell Count Kit i Kleihauer-Betke (X ŚR wartość średnia; OS odchylenie standardowe; WZ współczynnik zmienności). Level 1 Level 2 Level 3 X ŚR OS WZ % X ŚR OS WZ % X ŚR OS WZ % FCC 0,2900 0,0568 19,57 0,3300 0,0675 20,45 1,5500 0,0527 3,40 KB 0,2080 0,1078 51,82 0,2360 0,1135 48,11 1,6540 0,4136 25,00 metodą cytometryczną dla 5 % mieszaniny krwinek. Wszystkie krwinki płodowe wykazywały ekspresję HbF, częściowo jednak również ekspresję anhydrazy węglanowej, w związku z czym lokalizowały się zarówno w polu Q1 jak i Q2. Na populację krwinek płodowych założono dodatkową bramkę P4. Wszystkie krwinki zawierające HbF, znajdujące się we krwi dorosłych ochotniczek, wykazywały ekspresję anhydrazy węglanowej i lokalizowały się wyłącznie w polu Q2 cytogramu. Na rycinie 2 przedstawiono typowy cytogram i histogram uzyskany we krwi osoby dorosłej. W tym przypadku, zaznaczona na cytogramie bramka P4, została założona w celu podkreślenia odmiennej lokalizacji dorosłych krwinek HbFdodatnich. Na rycinie 3 przedstawiono obraz mikroskopowy uzyskany metodą manualną w preparacie wykonanym z 5 % mieszaniny krwinek. Krwinki płodowe są intensywnie wybarwione, natomiast widoczne w tle cienie komórkowe to krwinki dorosłe. Nieprecyzja w serii jednoczesnej (powtarzalność) Powtarzalność dla testu Fetal Cell Count Kit (FCC) oraz metody Kleihauer-Betke (KB) określono na 3 poziomach materiału kontrolnego. W tym celu wykorzystano kontrole Tabela III Poprawność metod Fetal Cell Count Kit i Kleihauer-Betke jako % odzysku. wartość zaplanowana % odzysku dla metody Fetal Cell Count Kit Statystyczny opis grupy badanej % odzysku dla metody Kleihauer-Betke 5,0 % 100,0 94,2 4,0 % 97,5 90,6 3,0 % 90,0 86,8 2,5 % 94,0 90,6 2,0 % 102,5 88,5 1,5 % 96,7 75,7 1,0 % 105,0 61,5 0,5 % 110,0 40,0 0,25 % 120,0 48,0 Celem wstępnego określenia fizjologicznej ilości krwinek zawierających HbF, wykrywanych każdą z metod w badanej populacji, przeprowadzono badania na krwi pełnej pocho- 72

A. Sapa, A. Janus Rycina 4. Liniowość metod FCC i KB, wykres korelacji między wartościami oczekiwanymi i wynikami uzyskanymi obydwoma testami. Rycina 5. Wykres korelacji między wynikami ochotników, dla metod FCC i KB. dzącej od 20 ochotniczek, którymi były nieciężarne kobiety, klinicznie zdrowe. Biorąc pod uwagę podstawowe dane statystyczne wyników uzyskanych metodą Fetal Cell Count Kit (FCC) i Kleihauer-Betke (KB), obliczono przeciętną liczbę krwinek zawierających HbF. Określony zakres wartości referencyjnych przedstawiono w tabeli IV. Tabela IV Zakres liczby krwinek zawierających HbF u osób dorosłych (dla metod FCC i KB). Zakres wartości referencyjnych (X ŚR ± 2 OS) Fetal Cell Count Kit Kleihauer-Betke 0 2,5 % 0 2,2 % Rycina 6. Wykres korelacji między wynikami mieszanin, dla metod FCC i KB. Korelacja między wynikami uzyskanymi testem FCC i KB Charakterystyka testów Fetal Cell Count Kit i Kleihauer- Betke, jako korelacja między wynikami uzyskanymi obydwoma metodami u ochotników oraz jako korelacja między wynikami uzyskanymi obydwoma metodami dla mieszanin krwi pępowinowej i krwi pełnej (do obliczeń wykorzystano wartości średnie wyników uzyskanych w poszczególnych seriach) przedstawiona została w Tabeli V oraz na wykresach (Ryc. 5 i 6). Tabela V Wartości korelacji między wynikami ochotników i mieszanin, dla metod FCC i KB. Parametr ochotnicy mieszaniny krwi współczynnik 0,9804 0,9973 korelacji R 2 poziom istotności P<0,0001 P<0,0001 przedział ufności 0,9502 0,9924 0,9869 0,9995 Dyskusja Przyczyną wystąpienia konfliktu serologicznego jest wytworzenie przez matkę alloprzeciwciał odpornościowych skierowanych przeciwko antygenom krwinkowym płodu. Wynikiem alloimmunizacji może być rozwój Choroby Hemolitycznej Płodu/Noworodka, która, w przypadku przecieku płodowe- go, może wykształcić się jeszcze w trakcie ciąży. Ciężki przebieg ChHP/N może prowadzić do masywnego niszczenia krwinek dziecka, a nawet do śmierci wewnątrzmacicznej. Istnieje możliwość zapobiegania alloimmunizacji w zakresie antygenu D z układu Rh, poprzez stosowanie immunoprofilaktyki, jednak jest ona skuteczna jedynie przy jej odpowiednio wczesnym rozpoczęciu odpowiednią dawką przeciwciał anty-d. Ocena liczby krwinek płodowych w krążeniu matki jest kluczowym sposobem na obliczenie wystarczającej dawki immunoglobuliny anty-d do podania śródciążowego lub po porodzie, w sytuacjach klinicznych związanych ze zwiększonym przeciekiem matczyno-płodowym. W niniejszej pracy scharakteryzowane zostały dwa nieinwazyjne testy umożliwiające ocenę wielkości przecieku Fetal Cell Count Kit (IQ Products, Holandia) oraz metodę Kleihauer- Betke [1,6,7,12]. Podczas przeprowadzanych badań zaobserwowano rozbieżność pomiędzy uzyskanymi wynikami, a deklaracją producenta testu FCC. Badanie krwi pępowinowej wykazało, że część krwinek płodowych oprócz obecności HbF, wykazuje jednoczesną ekspresję anhydrazy węglanowej. Z podobnymi obserwacjami nie spotkali się autorzy innych, zbliżonych badań [9,10,11]. Przyczyną zaistniałej sytuacji prawdopodobnie jest fakt, że stosowana w eksperymentach krew pępowinowa pobierana była w czasie rutynowych zabiegów 73

Walidacja analityczna wybranych metod stosowanych w ocenie przecieku matczyno-płodowego cięć cesarskich, przeprowadzanych w 42 43 tygodniu ciąży. Pod koniec fizjologicznej ciąży, w erytrocytach płodowych HbF-dodatnich, pojawiać się może ekspresja anhydrazy węglanowej. Do porównania testów wzięto zatem pod uwagę liczbę wszystkich krwinek zawierających hemoglobinę płodową, uzyskanych testem FCC, niezależnie od koekspresji anhydrazy węglanowej. Badanie powtarzalności testu FCC i KB ukazało rozbieżność między obydwiema metodami. Fetal Cell Count Kit na każdym poziomie materiału kontrolnego charakteryzował się o wiele wyższą precyzją w porównaniu z manualną metodą Kleihauer-Betke. Duża nieprecyzja w serii jednoczesnej, będąca niewątpliwą wadą testu KB, związana jest z metodologią badania, która jest w dużej mierze zależna od subiektywnej oceny badacza. Na ostateczny wynik mają wpływ m.in. grubość rozmazu i pole widzenia brane pod uwagę podczas zliczania komórek. Badania wykazały ponadto, że znacznie lepszą precyzję uzyskuje się w próbkach o większej zawartości krwinek HbF-dodatnich. Współczynnik zmienności obydwu metod był niższy w materiale kontrolnym oznaczonym jako Level 3, niż w kontrolach Level 1 i Level 2. W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano różnicę między wynikami uzyskanymi obydwoma metodami, a liczbą krwinek płodowych oznaczonych przez producenta dla kontroli Level 1 i Level 2. Natomiast średnia ilość krwinek zawierających hemoglobinę płodową, oznaczona metodą FCC i KB w kontroli 3 (kolejno 1,55 % i 1,65 %), mieściła się w zakresie podanym przez producenta. Może to wskazywać, że obydwa testy nie są w stanie poprawnie oznaczyć ilości krwinek płodowych na poziomie poniżej 0,19 %. Uzyskana granica wykrywalności odbiega od wyników uzyskanych przez Porra i wsp. [10], gdzie dla testu FCC i KB wyniosła odpowiednio 0,03 % oraz 0,1 %. Różnice wynikać mogą ze stwierdzonej wcześniej dużej nieprecyzji metody. Otrzymane wyniki są natomiast zbliżone do wartości dolnej granicy wykrywalności dla testu FCC określonej przez Janssen i wsp. [5], gdzie wynosiła ona 0,12 %, oraz dolnej granicy wykrywalności dla testu KB określonej przez Ochsenbein- Imhof i wsp. [9], wg których metoda Kleihauer-Betke nie była w stanie w ogóle wykryć krwinek płodowych w ilości mniejszej niż 0,1 %. Przy badaniu poprawności testu FCC i metody KB, posłużono się 3 seriami mieszanin krwi pępowinowej z krwią pełną osób dorosłych. Znacznie lepszą poprawność, wyrażoną jako % odzysku, uzyskano dla testu cytofluorymetrycznego, niż dla metody manualnej (odpowiednio 90 120 % i 48 94 %). Uzyskane wyniki znajdują potwierdzenie w pracach innych autorów [9, 11]. Zasadniczo większe różnice między wartościami oczekiwanymi i otrzymanymi wynikami uzyskano dla metody KB. Zwrócono natomiast uwagę, że w materiałach o zaplanowanej ilości krwinek płodowych od 2 % do 5 %, metodą KB uzyskiwano % odzysku rzędu 90 %. Stopniowy spadek wartości można zaobserwować już dla mieszaniny 1,5 %, dla której % odzysku wyniósł 75,7 %, dla mieszaniny 1 % osiągnął wartość 61,5 %, natomiast dla mieszanin 0,5 % i 0,25 % wynosił kolejno 40 % i 48 %. Może to wskazywać na utratę poprawności metody KB przy badaniu krwi w której erytrocyty z HbF stanowią mniej niż 2 %. Ostatnim etapem walidacji metod było wyznaczenie liniowości metody FCC i KB. Dla obu metod uzyskano bardzo wysoki współczynnik korelacji dla oznaczonej liczby erytrocytów płodowych i wartości oczekiwanych (dla FC R² = 0,9951, dla KB R² = 0,9972). Korelacja określona dla metody FCC była wyższa od przedstawionej przez Pourazar i wsp. [11], gdzie współczynnik korelacji wyniósł 0,8842. Wstępnie oszacowany zakres krwinek zawierających HbF, występujący fizjologicznie u zdrowych klinicznie, nieciężarnych kobiet, wykazuje nieznaczne różnice w zależności od metody, którą został wyznaczony. Przy użyciu testu FCC uzyskano kolejno najmniejszą i największą liczbę krwinek z HbF rzędu 0,3 % i 2,7 %, oraz 0,13 % i 2,45 % dla metody KB. Biorąc pod uwagę wartości średnie i odchylenie standardowe, wstępnie oszacowano przeciętną liczbę krwinek zawierających HbF na 0 2,5 % dla testu Fetal Cell Count Kit i 0 2,2 % dla metody Kleihauer-Betke. Są to wartości przekraczające zakres podany przez Nelson i wsp. [8], gdzie wg autorów wynosi on zaledwie 0,02 0,16 %, oraz zakres podany przez Porra i wsp. [10], którzy dla krwinek HbF-dodatnych, CA-ujemnych oszacowali go na 0,0 0,021 %. Uzyskane wyniki, w odniesieniu do zaobserwowanego spadku poprawności testu KB dla materiałów zawierających poniżej 2 % krwinek z HbF, wskazują, że ta utrata poprawności metody prawdopodobnie nie ma dużego znaczenia klinicznego. Mimo wymienionych różnic między testami Fetal Cell Count Kit oraz Kleihauer-Betke, współczynnik korelacji między wynikami uzyskanymi obydwiema metodami dla mieszanin krwi pępowinowej i krwi pełnej, był bardzo wysoki i wyniósł 0,9973 (p<0,0001). Jest to wartość wyższa od współczynnika korelacji uzyskanego przez Porra i wsp. [10], którzy uzyskali wartość 0,94 (p<0,01). Dodatkowo obliczono współczynnik korelacji między wynikami uzyskanymi metodą FCC i KB dla próbek ochotników i uzyskano wartość 0,9804 (p<0,0001). Biorąc pod uwagę uzyskane wyniki, należy rozważyć celowość wdrażania do rutynowej diagnostyki metody kosztownej, wymagającej użycia wysokospecjalistycznego i trudnodostępnego aparatu, jakim jest cytofluorymetr przepływowy. Wnioski 1. Test Fetal Cell Count Kit charakteryzuje się znacznie mniejszą nieprecyzją w serii jednoczesnej niż manualna metoda Kleihauer-Betke. Zarówno test FCC jak i metoda KB wykazują niską powtarzalność przy badaniu materiałów gdzie ilości krwinek z HbF nie przekracza 0,19 %. 2. Przy badaniu próbek, w których krwinki z hemoglobiną HbF stanowią co najmniej 2 %, test FCC wykazuje zbliżoną poprawność z manualną metodą Kleihauer-Betke. Poniżej tej wartości metoda KB, w odróżnieniu od testu FCC, charakteryzuje się znaczącym spadkiem poprawności, co z uwagi na określoną w badaniach, przecięt- 74

A. Sapa, A. Janus ną liczbę krwinek z HbF występującą u osób dorosłych, prawdopodobnie nie ma znaczenia klinicznego. 3. Obydwiema metodami uzyskano zbliżony zakres wartości dla liczby krwinek zawierających HbF u dorosłych, zdrowych klinicznie, nieciężarnych kobiet. Zakres dla testu Fetal Cell Count Kit wyniósł 0 2,5 %, dla metody KB został określony na 0 2,2 %. 4. Wyniki uzyskane obydwiema metodami wykazują dużą wzajemną korelację, większą dla wartości wyższych (stosowanych w mieszaninach krwi pępowinowej z krwią dorosłą) i mniejszą dla wartości niższego rzędu (występujących w badanej grupie kontrolnej). Obydwie metody prawdopodobnie mogą być stosowane zamiennie, wniosek ten wymaga jednak dalszych badań i przeprowadzenia weryfikacji klinicznej na dużej grupie pacjentek ciężarnych. Adres do korespondencji: Katedra i Zakład Chemii Klinicznej Analityki Medycznej, Akademia Medyczna we Wrocławiu 50-367 Wrocław, ul. Pasteura 2 tel. (71) 784-11-15, fax. (71) 784-00-54 e-mail: agnieszkasapa@gmail.com Zaakceptowano do publikacji: 02.02.2011 Piśmiennictwo 1. Bil J, Gaciong Z. Immunhematologia. Immunologia. Gołąb J., Jakóbisiak M, Lasek W. i wsp. PWN, Warszawa 2009: 428-443. 2. Bomski H. Podstawowe laboratoryjne badania hematologiczne. PZWL, Warszawa 1989: 114-119. 3. Brzezińska E, Drews K, Puacz P. i wsp. Rozwój diagnostyki i terapii choroby hemolitycznej płodu. Ginekol Prakt 2001; 9(5): 31-35. 4. Garratty G, Petz LD. Approaches to selecting blood for transfusion to patients with auto- immunehemolytic anemia. Transfusion 2002; 42: 1390-1392. 5. Janssen WCM, Hoffmann JJML. Evaluation of flow cytometric enumeration of foetal erythrocytes in maternal blond. Clin Lab Haem 2002; 24: 89-92. 6. Lenkiewicz B, Żupańska B. Znaczenie przeciwciał innych niż anty-d, w chorobie hemolitycznej płodów i noworodków (CHHP/N). Ginekol Pol 2003; 74(1): 48-54. 7. Meissner W, Pietryga M, Brązert J. Anemia u płodu wykładniki biochemiczne i ultrasonograficzne. Ultrason Gin Poł 2007; 3(3): 190-194. 8. Nelson M, Popp H, Horky K, i wsp. Development of a flow cyto- metric test for the detection of D-positive fetal cells after fetomaternal hemorrhage and a survey of the prevalence in D-negative women. Immunohematol 1994; 10: 55-9. 9. Ochsenbein-Imhof N, Ochsenbein AF, Seifert B. i wsp. Quantification of fetomaternal hemorrhage by fluorescence microscopy is equivalent to flow cytometry. Transfusion 2002; 42: 947-953. 10. Porra V, Bernaud J, Gueret P. i wsp. Identification and quantifi- cation of fetal red blood cells In maternal blood by a dual-color flow cytometric method: evaluation of the Fetal Cell Count kit. Transfusion 2007; 47: 1281-1289. 11. Pourazar A, Homayouni W, Rezaei A. i wsp. The Assessment of Feto-Maternal Hemorrhage in an Artificial Model Using Anti-D and Anti-Fetal Hemoglobin Antibody by Flow Cytometry. Iranian Biomedical Journal 2008; 12 (1): 43-48. 12. Scheier M, Hernandez-Andrade E, Carmo E. i wsp. Prediction of fetal anemia in rhesus disease by measurement of fetal middle cerebral artery peak systoli velocity. Ultrasound Obstet Gynecol 2004; 23: 432-436. 13. Seyfriedowa H, Kuśnierz-Alejska G, Michalweska B. Immunologia transfuzjologiczna krwinek czerwonych. Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania, obowiązujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi. Łętowska M. IHiT, Warszawa 2006, 7.1-7.95. 75