Cel tematu badawczego 1

WYNIKI z realizacji zadania na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w 2015 roku Poszukiwanie wspólnych mechanizmów dziedziczenia płodności roślin z cytoplazmą CMS - C oraz z cytoplazmą CMS-Pampa 3. 1. Temat badawczy 1 Precyzyjne określenie na mapach genetycznych lokalizacji głównych genów restorerowych dla obu systemów CMS, identyfikacja genów pobocznych, porównanie lokalizacji. Cel tematu badawczego 1 Proszę podać cel (jak w szczegółowym opisie) i napisać, czy cel został osiągnięty, ew. w jakim stopniu; jeśli cel nie został osiągnięty w całości podać przyczyny. Ocena płodności roślin z genem Rfp1 obecnym w odmianie Gonello F1 i mieszańcach z jej udziałem oraz porównanie lokalizacji badanego genu względem genu Rfc1 cel osiągnięty Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Materiał badawczy, który wykorzystano w 2015 roku do konstruowania wysoko zagęszczonych map genetycznych chromosomu 4RL stanowiły dwie populacje mapujące. Pierwsza populacja składała się z 43 rekombinacyjnych linii wsobnych (RIL) otrzymanych po skrzyżowaniu dopełniającej (zawierającej allele sterylności) linii 544 z linią DS2, która przywraca płodność żyta z cytoplazmą C. W celu określenia zawartości alleli sterylności/płodności w badanych RIL, w latach 2011-12 każdą z nich skrzyżowano w pokoleniu S 5 z męskosterylną wersją linii 544C, a uzyskane mieszańce oceniono fenotypowo pod kątem męskiej płodności przy wykorzystaniu skali bonitacyjnej Geigera i Morgensterna (1975). Zgromadzone wcześniej dane fenotypowe posłużyły do określenia lokalizacji genu Rfc1 na utworzonej w bieżącym roku mapie genetycznej. Druga populacja mapująca została otrzymana w wyniku zapylenia męskosterylnej linii S305P z cytoplazmą Pampa, pyłkiem pojedynczej rośliny wybranej z odmiany Gonello F1. Odmiana Gonello F1 oznaczana jest przez hodowcę (KWS-Zboża) symbolem Pollen-Plus i posiada efektywny gen restorerowy Rfp1 zlokalizowany na długim ramieniu chromosomu 4R. W roku 2015 oceniono męską płodność 86 osobników pokolenia F 2 tego mieszańca. Ocenę wykonano dwiema metodami: wzrokowo przy użyciu skali bonitacyjnej Geigera i Morgensterna (1975) oraz jako odsetek zawiązanych ziaren w głównym kłosie umieszczonym przed kwitnieniem pod izolatorem z tomofanu. DNA obu populacji mapujących izolowano z liści przy użyciu zestawów Gene Elute Plant Mini Kit (Sigma-Aldrich). Do genotypowania wykorzystano metodę oznaczeń GBS (ang. Genotyping by Sequencing) opartą o wykorzystanie technik NGS - sekwencjonowania nowej generacji (ang. Next Generation Sequencing). Metoda ta pozwala na uzyskanie w nowej generacji sekwenatorach DNA danych, które po analizie bioinformatycznej służą do genotypowania roślin generując duże ilości markerów molekularnych, głównie z kategorii SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism). Analizy GBS zostały zlecone w firmie Diversity Arrays Technology w Australii. Poza markerami GBS w obrębie obu populacji mapujących wykonano ocenę polimorfizmu markerów opartych o metodę PCR (markery SCAR), których znana lokalizacja na chromosomie 4R pozwalała na zidentyfikowanie właściwej grupy sprzężeń, w której należy oczekiwać obecności genów Rfc1 i Rfp1. Konstruowanie grup sprzężeń wykonywano przy użyciu programu JoinMap wykorzystując algorytm Maximum Likelihood (ML). Grupowanie wykonywano w oparciu o funkcję LOD, a dystanse na mapach określono w centymorganach (cm) przy zastosowaniu funkcji Kosambi. Lokalizację genu Rfc1 określanano na podstawie danych segregacyjnych o charakterze jakościowym, które otrzymano w czasie analizy mieszańców testowych. Lokalizację genu Rfp1 określano na podstawie danych liczbowych z oceny męskiej płodności roślin wykorzystując metodę Interval Mapping (IM) i program MapQTL 5.0. Dodatkowym materiałem badawczym, który poddano analizom w celu zainicjowania mapowania asocjacyjnego było 280 roślin odmiany Gonello F1. Przed rozpoczęciem strzelania w źdźbło, każdą z roślin rozklonowano uzyskując po dwa klony, z których każdy 1

poddano w czasie kwitnienia ocenie pod kątem męskiej płodności (ocena wzrokowa i na podstawie osadzania ziaren pod izolatorami). Genotypowanie wykonano dla 95 osobników wykorzystując markery GBS (podobnie jak w przypadku analiz w obrębie populacji mapujących). Wyniki (opisać) W wyniku analizy GBS w populacji mapującej [544xDS2]RIL otrzymano dane genotypowe obejmujące 20678 markerów DArTseq-SNP. Wśród nich 7527 było polimorficznych i segregowało w populacji mapującej w proporcjach zgodnych z jednogenowym modelem dziedziczenia. Markery te wraz z danymi o segregacjach 17 markerów SCAR oraz danymi otrzymanymi z oceny fenotypowej męskiej płodności użyto do skonstruowania mapy długiego ramienia chromosomu 4R. Wśród markerów SCAR osiem było rezultatem konwersji markerów DArT i były to markery wcześniej niepublikowane np. d398747 (fot.1). Grupę sprzężeń utworzono przy wartości LOD=10. Składała się ona z 260 loci: 250 markerów DArTseq-SNP, 9 markerów SCAR i locus genu Rfc1. Utworzona mapa sprzężeń obejmuje długość niespełna 40cM. Jej przeciętna gęstość to 1 marker na 0,15cM, ale widoczne są obszary, gdzie przerwy między markerami przekraczają 2cM. Tak jest między innymi w sąsiedztwie locus Rfc1 (rys.1). Fot.1. SCAR d398747 amplifikowany w populacji [544xDS2]RIL 2

4RL 0 5 10 15 20 5137856_14:C>T 3343021_20:T>G 3359197_42:G>C 5207988_7:C>G 3584663_17:A>G 4490062_51:C>A 3748211_23:T>C 4099648_50:C>T 5501388_18:C>G 3358339_29:G>A 4489597_26:G>T 3593938_7:T>C 3597154_43:C>A 5034892_51:C>T 3731407_22:G>A 7466501_61:T>G 3742738_43:C>G 3354890_68:G>A 7105667_66:A>G 7466553_26:C>G 3581049_36:C>G 5208151_5:G>A 3582868_8:T>C 3355745_25:T>G 3360367_10:C>T 5208154_7:T>C 3599747_19:T>C 3356715_9:C>G 3363035_14:A>G 3742723_47:T>G 3888959_26:G>T 3744041_45:C>G 3360251_16:G>C 3365390_10:G>A 3363924_56:C>T 7063881_14:G>C 7466020_8:C>T 3745145_37:A>G 5497507_37:G>A 3906054_68:T>G 3743612_54:A>G 3742340_55:C>G 3739417_16:T>C 3593094_15:G>C 3592669_10:T>C 3578677_13:A>G 5211374_7:T>C 5207392_9:G>A 3585958_42:C>T 5040976_5:T>C 7092861_49:C>G 3887029_13:C>T 7466907_12:T>C 7466617_22:A>G 3363306_68:C>G 5211141_46:A>C 7073119_52:G>C 3745028_30:T>C 3603093_25:G>C 3597488_48:C>T 7105763_37:C>G 3601416_34:C>G 7094677_15:T>C 7091283_28:G>A 3739297_28:T>C 3342122_45:A>G 5200167_52:A>G 5798469_22:G>C 3352472_16:T>C 3363815_8:C>T 5797971_20:G>C 3363949_47:A>C 3363731_62:G>A 3360712_64:G>T 3585379_47:C>A 3346720_58:C>T 7105745_13:T>G 3894004_52:A>C 3354128_61:G>T 5224979_5:T>G 3359109_17:A>G 3746033_68:A>G 3595257_32:A>G 3363870_8:C>T 4493680_17:G>A 5036977_61:G>T 3908073_13:T>G 3746033_53:C>G 3359109_6:A>T 7093185_47:A>C 3364801_47:G>C 3599316_44:G>A 5503406_40:A>G 3730462_32:A>G 4490506_68:G>C 5203400_6:T>A 3354333_38:T>C 3596841_32:T>C 5224465_37:C>G 7091348_28:C>A 3364305_32:T>C 3363515_52:G>C 4102521_13:G>C 3348199_22:G>T 5503372_33:C>T 5503372_25:G>C 3363701_34:T>C 3351819_12:A>C 7092189_15:G>A 5045670_19:A>T 5803433_15:A>G 7103965_50:C>A 3350284_40:A>G 3743891_45:G>C 3586618_14:G>C 3597151_34:G>T 3744093_34:C>G 7103912_14:G>C 7103542_13:G>A 3739661_37:C>T 4490799_47:A>C 6211875_10:T>C 3346401_15:C>G 7091111_15:C>A 3363355_27:G>A 7091378_16:C>T 3354860_27:T>C 3364969_6:T>A 5227139_26:G>A 3731607_34:T>C 5215726_12:A>T 3362071_22:G>A 3884568_25:C>T 3357464_8:C>G 3346962_19:A>G 7087373_27:C>T 3351437_43:C>G 5046562_15:G>C 5503884_15:C>G 5216192_61:C>G 5223903_44:A>G 3341752_18:C>T 3739639_20:G>C 3744337_10:T>C 3363025_20:T>G 3743932_46:T>A 5047363_58:C>G 3740297_6:A>C 3346401_5:G>A 3346962_9:C>T 5042053_66:A>G Rfc1 3599105_18:T>C 3588020_41:C>G 3737664_6:A>C 3356950_45:C>T 5789371_37:A>C 5214117_28:C>G 3736229_6:C>G 3359481_7:G>T 3577758_40:C>T 3592035_9:C>T 3363481_13:G>C 3736469_5:T>C 5504785_6:A>C 7092970_55:A>G 3341900_33:A>G 3742805_41:A>C 3905464_14:G>T 5221930_60:T>C 3592313_41:C>G 3743976_41:A>C 3736973_28:T>C 7089211_9:T>C 7103551_52:A>G 3363534_48:C>T 3361937_58:A>C 3602916_20:C>T 3362379_29:A>C 7094084_37:G>A SCP14M55 3592501_35:G>C 7093282_7:T>A 3736973_32:C>T 3351285_33:G>C 3743723_61:G>C 3743169_47:T>G 3579772_24:T>C 7468274_46:A>G 3909565_11:T>G 7086852_12:C>G 3595169_15:C>T 5504091_16:T>C 3355644_8:A>C 5801146_32:G>T 5226695_41:G>A 3733348_28:T>C 3595169_29:C>A 7090999_27:A>C 3595169_17:G>A 25 3362201_64:T>C 3579536_27:G>T 3343251_52:T>C 3346006_23:C>A 3346006_46:C>T 3365314_20:T>G 5204744_31:C>G 5211716_21:A>T 7094165_8:G>C 5501989_27:G>T 7092808_49:C>T 3346523_24:G>A 4489538_44:T>G 3744086_27:G>T 5212338_40:G>C 3732573_17:C>G 3355458_9:C>T 3597423_17:A>C 3602916_8:G>C 3599105_31:T>C 3363534_56:T>C d398695 7467471_24:C>T 3349465_43:C>T SCSz334L700 3361904_55:T>A 3743892_42:G>C 3899069_12:T>C 3364870_17:G>A 30 3348250_40:T>G 3362779_49:A>C 3348682_25:T>C 3343321_22:C>G 5214136_36:A>G 3362779_13:G>A 3342362_68:G>C 3747614_13:G>A 3581696_10:C>A 3586211_11:T>C 3364877_33:C>T 3595879_7:C>G SCSz319L550F3R4 3599624_7:T>G 4491008_29:T>C 3600221_5:C>T 5496982_45:C>G d507164 35 3745398_58:G>A 3580442_22:G>C 5215391_27:T>A 3346319_16:G>A SCSz670L900 d508573 7094751_22:A>T 3891905_28:C>A 3909713_38:C>G 3579772_31:G>C SCP12M55 3346319_68:A>G d508638 Rys.1 Mapa sprzężeń obejmująca fragment długiego ramienia chromosomu 4R w populacji [544xDS2]RIL 3

Ocena fenotypowa płodności roślin tworzących populację mapującą [S305P x Gonello249-1]F2 ujawniła bimodalny rozkład badanej cechy. Najliczniejsza w badanym materiale była grupa roślin w pełni męskopłodnych (rys.2). Ponad pięćdziesięcioprocentowy udział roślin ocenionych w skali Geigera i Morgensterna na 9, które dobrze wiązały ziarna pod izolatorami wskazuje na obecność w badanym materiale silnego genu przywracającego płodność u żyta z cytoplazmą Pampa. Nieco miej liczne, stanowiące około jedną czwartą badanej populacji były rośliny w pełni męskosterylne. Stosunkowo nieliczne były rośliny z częściowo przywróconą płodnością. Wyniki te były zbliżone do ocen otrzymanych dla tej samej kombinacji krzyżowania poddanej ocenie fenotypowej w roku 2011 wskazując na powtarzalność wyników w różnych sezonach wegetacyjnych, co świadczy o stabilności działania badanego genu restorerowego oznaczanego symbolem Rfp1. Ocena płodności wykonana wzrokowo w bieżącym sezonie wegetacyjnym była weryfikowana na podstawie danych o zawiązywaniu ziaren pod izolatorami. Z uwagi na słabą kondycję roślin wysianych jesienią 2014 roku zakładano początkowo, że poprawna ocena wzrokowa połączona z jednoczesnym izolowaniem kłosów będzie możliwa dla około 50 roślin, ale względnie łagodna zima oraz korzystne warunki wegetacji wiosną 2015 roku wpłynęły na dobre rozkrzewienie wielu roślin słabych na początku wegetacji. Ostatecznie ocena męskiej płodności obiema metodami została wykonana na 86 roślinach badanego mieszańca. Uzyskano wysoką zgodność wyników otrzymanych obiema metodami wsp. korelacji równy 0,88. 60 50 52 40 30 20 10 0 14 6 2 2 3 4 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Płodność (skala 9-stopniowa) Rys.2. Wyniki wzrokowej oceny pylenia roślin populacji [S305P x Gonello 249-1]F2 Analizy genotypowe mieszańca [S305P x Gonello 249-1]F2 zaowocowały danymi o 31500 markerach DArTseq-SNP. Po usunięciu markerów monomorficznych oraz segregujących w proporcjach niezgodnych z jednogenowym modelem dziedziczenia zostało wytypowanych do konstruowania mapy genetycznej 5418 markerów SNP. Markery te nie miały określonej lokalizacji chromosomowej. Dlatego, w celu poprawnego zidentyfikowania grupy sprzężeń loci z chromosomu 4R, bazę danych użytą do mapowania rozszerzono o 1541 markery DArT i 5 markerów SCAR o znanych lokalizacjach na chromosomach żyta (obecnych na opublikowanych przez różnych autorów mapach genetycznych żyta). Dodatkowo w badaniach wykorzystano 5 niepublikowanych markerów SCAR pochodzących z prac nad konwersję markerów DArT (3 markery) i DArTseq (2 markery) m. in. marker 4

d508800 (fot.2) będący rezultatem konwersji markera XrPt508800. Ogółem do utworzenia grup sprzężeń użyto 6969 markerów. Grupa wybrana na podstawie obecności markerów z 4R i użyta do skonstruowania mapy genetycznej została utworzona przy LOD=6. Liczyła ona 775 loci i przypuszczalnie obejmowała cały chromosom 4R. Markery na mapie zostały rozlokowane na długości ponad 1,5 tys. cm, przy średnim zagęszczeniu: 1 marker na około 2cM. Rozmieszczenie markerów na utworzonej mapie było względnie równomierne (rys.3), ale sporadycznie obserwowano przerwy przekraczające 10cM. Do określenia położenia genu odpowiedzialnego za męską płodność w badanym mieszańcu z cytoplazmą Pampa użyto metody Interval Mapping wprowadzając dane liczbowe z oceny osadzania ziaren pod izolatorami. W metodzie tej istotność statystyczna parametru LOD przekroczenie wartości krytycznej (w obecnych badaniach przyjęto wartość 2,5) pozwala wytypować region, gdzie jest zlokalizowany genu kontrolujący badaną cechę. Uzyskane wyniki wskazują na obecność poszukiwanego genu Rfp1 na długim ramieniu chromosomu 4R (rys.4). Fot. 2. SCAR d508800 amplifikowany w obrębie populacji [S305PxGonello249-1]F2 5

0,0 4,6 6,8 8,9 11,0 13,1 14,2 16,3 21,8 25,1 29,5 32,7 39,4 40,3 43,3 44,9 45,0 50,4 55,2 55,9 56,3 56,9 58,0 59,0 59,5 60,1 61,1 62,2 64,3 66,4 67,3 68,5 69,6 70,6 71,7 72,5 72,7 72,9 76,0 82,3 82,4 82,7 83,7 85,9 88,8 89,1 90,1 92,3 93,3 94,4 95,4 100,1 109,7 110,2 111,9 119,7 125,5 126,6 127,7 130,9 134,1 135,2 135,7 136,2 137,6 139,4 140,4 141,5 142,6 144,7 145,8 146,8 151,2 157,3 166,1 174,0 182,0 185,3 186,3 188,5 190,6 191,7 193,8 194,8 195,9 196,9 199,1 200,1 202,2 208,5 217,1 217,3 226,9 233,0 234,1 236,2 239,8 247,4 255,3 258,5 259,6 262,8 263,9 267,1 270,3 274,7 277,9 283,6 295,4 300,7 306,8 315,5 317,1 318,2 323,8 324,8 325,8 326,9 330,1 333,3 334,4 335,5 341,1 344,3 348,3 349,5 350,8 351,9 352,9 355,1 356,1 358,2 361,5 364,7 365,8 366,8 368,9 373,3 375,4 376,5 376,7 380,4 384,9 387,2 387,3 387,8 388,3 389,4 390,4 391,8 392,6 393,0 400,7 403,8 406,2 408,3 409,9 411,5 414,5 416,8 419,4 422,3 423,7 425,5 428,7 433,0 437,4 438,5 439,5 440,6 441,6 442,7 447,0 455,1 467,4 468,2 472,5 476,8 479,3 481,6 483,3 484,9 486,0 487,0 488,1 490,2 492,3 493,4 495,5 496,5 497,6 498,7 499,7 500,8 501,8 502,9 506,2 510,8 511,9 513,0 514,0 515,1 516,1 517,2 518,3 520,4 521,5 522,5 523,6 524,6 527,9 531,2 535,6 540,0 545,5 549,9 560,1 576,4 588,1 598,8 600,9 602,0 606,4 614,5 625,1 631,9 634,0 636,2 640,2 643,9 647,5 650,4 662,1 667,4 672,4 678,3 684,9 700,4 701,5 702,5 703,6 704,6 706,1 707,8 709,9 711,0 712,5 714,2 715,9 717,4 720,7 721,7 723,9 727,1 729,1 731,3 733,1 734,6 735,6 736,7 737,7 738,8 739,8 740,9 746,4 749,6 750,7 751,7 753,9 756,0 764,8 771,9 772,9 774,0 776,1 778,2 779,3 780,3 781,4 782,4 783,5 785,6 787,4 788,8 790,5 792,0 793,1 794,1 794,6 798,5 799,5 800,6 801,6 802,7 803,7 805,9 808,0 809,1 814,6 821,7 827,1 830,4 831,4 834,7 839,0 849,0 856,2 858,3 860,5 864,2 871,0 873,1 875,3 876,3 878,5 890,3 903,3 905,4 906,5 920,0 925,2 927,9 931,4 935,9 957,6 991,2 992,5 998,0 1003,8 1011,7 1013,8 1016,0 1017,0 1020,2 1022,4 1025,6 1033,5 1037,9 1038,9 1045,1 1054,3 1066,8 1080,4 1092,5 1094,1 1095,7 1096,8 1097,8 1098,9 1099,9 1101,0 1102,0 1104,5 1106,3 1113,0 1116,9 1119,5 1122,7 1124,8 1125,9 1128,2 1130,2 1132,9 1135,6 1138,9 1142,1 1145,3 1146,4 1147,4 1149,9 1152,8 1153,8 1158,4 1162,7 1170,6 1172,8 1173,8 1177,1 1178,1 1180,2 1184,6 1186,5 1189,1 1189,4 1197,2 1215,6 1215,9 1218,8 1228,9 1236,0 1241,8 1244,4 1246,8 1249,6 1260,9 1262,0 1263,0 1264,1 1265,1 1266,2 1270,5 1271,3 1272,6 1275,9 1279,1 1287,6 1288,1 1288,4 1295,7 1298,4 1307,0 1308,3 1312,1 1324,8 1325,7 1327,5 1327,6 1330,3 1330,6 1330,8 1336,7 1337,4 1337,9 1338,5 1339,6 1340,5 1341,1 1345,0 1346,1 1350,4 1350,7 1351,7 1352,8 1352,9 1354,9 1356,0 1357,0 1359,1 1362,9 1363,5 1365,1 1366,7 1367,8 1368,8 1369,5 1369,8 1369,9 1372,2 1374,9 1377,6 1385,4 1391,0 1392,3 1394,2 1394,7 1395,3 1397,0 1398,4 1399,6 1400,6 1401,6 1407,2 1410,4 1414,8 1421,5 1424,8 1425,8 1426,9 1430,1 1433,2 1448,2 1457,3 1465,4 1468,7 1482,2 1491,4 1491,8 1492,1 1492,5 1492,9 1493,3 1495,1 1499,2 1505,5 1509,1 1509,8 1514,4 1515,6 1517,0 1517,1 1517,3 1517,5 1522,0 1522,6 1522,7 1522,9 1523,1 1523,6 1525,8 1542,0 1546,0 1562,6 5503116_43:A>G 3743246_31:G>C 3597175_16:T>A 3350047_5:C>T 3583802_24:C>T 3743808_25:A>G 3579516_43:T>C 3600682_31:C>G 3582802_20:T>C 3600505_20:T>C 3578754_31:C>A 3597318_24:A>G 3596715_55:A>G 3742314_31:C>G 3595819_34:A>G 5211283_9:A>G 3906064_6:C>G rpt401421na 3358014_16:C>G rpt506899na 3576374_10:C>A 3591058_39:T>A 3362033_29:A>T 3591449_47:A>G rpt505774na 5034826_19:T>A rpt508932na 3596142_27:C>T 3362070_65:A>C 3580945_28:A>G rpt399656na 3363484_35:T>C 3348713_42:G>A rpt398772na 3740628_57:C>G 3597495_56:A>T 3593419_17:T>C 7356842_5:T>C 3601323_28:A>T 3345219_17:G>T rpt506011na 4485302_13:A>G rpt508519na 3354313_38:C>G rpt509459na 3743751_13:T>C 3603015_25:G>A 3588434_68:C>G 5224485_47:C>A rpt390148na 6211338_10:C>T 3584100_25:T>C 3362412_27:A>G rpt508864na 5499623_16:G>C 3596580_9:T>G 3365108_50:C>G 3363803_25:G>C 3349241_10:G>A 3596691_16:T>C 3735973_25:T>C rpt505477na 5214982_41:A>T 3736340_35:C>T 3590516_48:C>T 5499736_13:C>G rpt508381na 3595887_43:T>C 3342500_21:G>T 3362450_9:C>T 5504772_25:C>T rpt507855na 3909278_21:T>G rpt5060074r rpt4025104r 5200422_14:C>A 5803500_29:T>G 3593579_57:C>T rpt507218na 5226974_9:C>T 3360466_37:G>A 4485919_17:G>A 3908821_50:C>G 3363872_10:G>A 3597864_17:C>T 3597761_56:G>A 3594853_13:G>C 3743908_48:C>G 5211433_32:A>C 5801914_6:G>C 3748402_16:A>G 3743102_40:C>G rpt4003654r 5047116_25:G>A rpt4003634r 5487833_66:A>G rpt4015634r 5796469_16:G>A 5499617_26:A>G 5222833_55:G>T 3737862_26:G>A 3358627_5:C>T 5213291_25:C>G 3598072_14:A>G 3365170_10:C>G 3346390_7:G>A 3588563_11:T>C 3743799_11:C>G rpt507170na 4490517_63:A>T rpt4008254r 5224485_16:T>C rpt505626na 3359252_21:T>G 3342170_60:A>T rpt505689na 5501066_66:T>C 4496416_42:C>T 3595972_38:A>G 3597341_24:T>G 3581580_41:C>G 3363557_32:T>C rpt505782na 3341863_18:A>C 3742803_38:A>G 3362741_9:T>C 3589636_8:G>T 3358494_22:G>C 6211367_8:C>G 3363275_12:A>G 3599494_43:A>G 5225201_11:A>G 3364012_30:A>C 3739432_6:C>T 3589543_11:A>C 3354501_9:C>T 3597416_49:G>C 3901724_65:G>A 7088293_12:C>G 3589502_23:G>C 3355704_33:T>C 3592731_17:C>T 3362080_36:C>T 3579113_38:A>G 3596310_14:G>A 3342291_32:C>T 3360648_20:T>A 3581002_37:T>C 3588758_64:T>G 5201082_21:C>A 5222304_11:T>C 4486982_21:A>C 3349556_17:T>C 3584209_33:T>C 5202334_43:G>T 3594991_7:C>G 3345779_66:A>G 3362152_55:T>G 3596729_30:A>G 3363811_49:C>T 4489941_19:C>G 3365380_32:G>A 3595337_11:C>T 3598209_11:T>C 3587280_41:T>G 7468004_15:C>T 3596671_28:A>C 3598538_17:A>G 3592591_26:G>A 3362879_40:G>A 3601522_46:C>T 5209015_6:G>C 7104831_14:G>C 3602372_9:A>G 4092712_20:C>T rpt506117na 4493830_30:T>C rpt509110na 5204824_8:C>G 3745810_21:C>G 3596250_19:C>T 5224988_31:G>C 3743146_31:C>A 3603173_9:G>C 3909247_7:G>A 3584869_19:A>G 3581468_37:G>C 3602239_5:G>A 3594010_12:G>A 5502771_9:A>T 3590652_16:A>G 3894249_42:T>G 3884413_6:G>A 3906410_22:C>G 5502801_39:C>T 7358198_8:G>C 3887132_43:A>G 5225262_60:T>A 3730728_46:A>G 3743752_58:T>C 3910106_10:A>G 3341816_16:T>C 3892384_22:T>C 3905637_9:T>C rpt399514na 3905124_31:A>G tpt4576na 3595454_43:G>A 3597688_49:C>T 3597466_52:C>G wpt3444514r 3579892_10:A>G 3896571_6:C>T 3588886_33:T>C 3741073_19:A>C 3352433_27:A>G 4487835_13:C>G 5208172_63:G>T 5796119_19:C>T 3364157_20:A>G 3599050_54:T>C 5214740_43:T>G rpt3906864r 3744790_41:T>G 3352468_53:G>T 5219974_8:A>T 3589913_18:A>G 3903598_8:C>T 5211411_40:G>A 4095539_33:C>T 3595693_43:G>C 4092485_23:A>T 3579480_38:A>G 3342219_11:T>A 3603215_24:G>C 3352898_68:T>C 3362135_56:T>C 3581326_41:G>C 4486753_20:G>C 3578851_53:G>C rpt5067374r 3745161_20:C>G 3595344_16:G>T rpt5092054r 3741149_18:C>T 3593500_31:T>C rpt3988164r 3601873_7:T>A 3597249_68:C>G 3362034_8:A>T 5227992_19:C>G 3361558_28:G>A rpt5066064r 3360149_19:C>A rpt4010004r 3592346_37:A>G rpt5062164r 3361871_17:A>C 5209362_17:T>C rpt5054314r 3733225_15:C>A rpt3986364r 3741679_43:A>T rpt5071794r 3887317_32:A>G rpt508114na 3747541_19:A>G 3747541_57:G>A 3596216_28:T>C 3593482_54:T>A 3882572_26:G>C 3590336_37:A>C 3595366_21:G>T 3596621_36:A>T 3597297_19:C>G 3739092_29:C>A 3353584_59:G>A 3363183_55:T>C 5223077_58:G>C 3357245_27:T>C 5202916_5:G>T 5200963_8:T>A 3750426_14:C>T 5220863_21:C>T 3739920_25:C>T 3586099_29:C>G 5044086_41:C>A 7104868_39:C>T 3592178_9:A>C rpt5056134r 3356973_56:A>G rpt509404na 7091268_51:A>G rpt09474r 3362957_8:G>C rpt5053294r 5221497_26:T>A 3596839_23:T>C 3362260_54:G>A 3365361_14:C>A 3362055_63:C>T 3576113_9:C>T 3350654_35:C>G 3350315_13:A>G 3363045_43:C>T 5213656_37:C>G 3602194_40:T>C 3362769_60:G>T 5204327_8:G>A 3576359_35:G>A 3596848_51:G>C 5227927_20:G>A 3596180_65:C>T 3343272_32:A>G 3363543_16:C>G 3363045_40:G>A 5501622_51:T>A 3601949_64:A>G 3598572_13:A>G 3600793_59:G>A 5215273_24:G>A 3733934_20:T>C 3730613_15:A>G 3600184_18:A>G 3579061_20:G>C 3576136_67:T>C 3356631_55:A>G 5216830_56:C>T 3743137_32:C>G 3596003_11:C>T 3909307_17:G>C 3585444_25:C>T 4486708_14:A>C 3361936_26:G>C 5221847_17:A>G 3596014_27:G>A 3750120_30:G>A 5208051_31:C>T 3749763_34:A>G 3603193_7:C>T 5214055_17:C>T 3593239_34:A>G 4500109_25:G>C 3586533_18:C>G 3586679_15:T>G 3583924_11:G>A 3354452_29:T>C 3731129_61:C>T 3595407_9:C>T 3907870_32:T>C 3578219_30:T>C 5504202_17:C>G 3344670_23:T>G 4485457_17:A>G 3341822_10:G>A 3351021_13:T>C 3363139_45:C>G 3602794_15:A>C 3346608_35:G>A 3362443_52:G>A 3363045_7:T>A 5037684_7:A>T 5035102_12:C>T 3907260_9:C>T 3355459_10:T>A 5502546_27:C>G 3595939_50:G>C 5210223_48:G>T 3353027_35:A>G 4486428_23:A>G 7358106_7:A>T 3348178_42:G>A 3595129_30:T>C 5211518_36:A>C 3889200_20:C>A 3591636_20:A>C 3597452_66:A>G 5505114_6:A>G 3354180_67:A>G 5217223_27:G>C 7466193_9:G>A 5200789_67:C>T 5494539_7:C>G 5221444_61:C>T wpt7428na 3363694_48:A>G rpt507481na 3735610_56:T>C rpt5091324r 3602776_49:G>T 3582283_19:G>A 5212315_22:C>A 5224930_14:T>G rpt5074514r rpt3904364r 5504169_8:A>C rpt508016na rpt509344na 5214360_16:C>G 3896499_47:A>G 3354214_62:G>A 3587070_59:T>A 3343911_46:A>C 3596511_8:T>C 3341919_64:G>C 3732321_25:C>T 3600063_8:G>A 3344681_7:T>C 5207975_8:T>G 3586446_37:A>T 3365142_13:T>C 5499718_16:G>C 5202624_7:A>G 3745941_7:C>T 3600939_49:G>C 5227993_10:C>G 3887173_45:T>A 5220329_41:A>C 3363896_37:C>G 5804104_26:T>G 3584335_7:C>T 3580380_7:C>G rpt5053904r 3746040_14:C>A 5500858_10:T>C 5800096_33:G>A rpt4023004r 5219895_14:G>T rpt5091734r 3743005_22:C>A 5044344_17:C>G 5499908_10:A>G 3597639_11:A>G 3596220_41:T>C 3593186_15:C>T 3597881_11:T>C 3586231_9:T>A 5207829_28:C>G 3590208_32:A>G 5805537_14:C>G 3342566_35:A>G 3341944_12:T>C 5215283_11:C>A 3586626_7:C>T 5804104_25:G>T 5218845_55:A>C 4486612_22:T>G 3597440_10:T>C 3729871_26:A>T 3356819_38:A>G 5499929_27:C>T rpt508284na 3588960_41:C>T rpt4109324r 3596589_34:A>T 3342306_11:C>T 3586243_13:G>C 5219773_14:G>C 3587126_18:A>C 7062588_26:C>T 3578680_26:C>T 4092653_32:T>G 5036932_6:T>C 3897745_8:A>G 3592379_37:C>A 3595249_22:T>G 7415696_6:A>G 5213784_33:C>G 5800554_25:A>G 3743577_17:G>A 3358948_15:G>A 3359885_13:C>T 6211665_11:A>C 3363026_42:G>C 3578786_10:T>G 3358360_16:C>G 7063643_21:C>T 3743944_14:G>C 5222312_17:T>C 3591484_24:G>A 3586117_35:G>A 3595158_38:C>G 5223591_7:C>A 3595907_56:A>G 5804983_16:A>G 3595631_35:A>C 3601904_43:T>C 3902186_23:A>G 3743774_26:G>C 3601749_62:C>G 3360876_18:G>A 3363242_14:T>C 3733203_14:A>G 5206174_46:C>G 5227197_66:G>A 3350901_7:C>T 3342757_8:T>C 3595416_46:C>A 3362915_43:G>A 3894395_28:C>T 3362423_6:T>A rpt402389na 3359295_48:C>A rpt3905924r 3739444_7:C>T 3592412_13:C>T 3343836_27:G>A 3354235_51:G>A rpt411168na 3360730_28:G>A 3347451_44:C>G 3356919_8:C>G 3887676_10:C>G 3597701_35:A>G 3596410_7:C>G 3348263_59:C>G 3348537_40:C>G 5227837_22:T>G 3596113_55:G>T 7105989_27:A>C 3909322_10:G>C 5037574_23:A>C 3346025_39:C>T 3349466_59:T>G 3353991_12:C>T 3904762_8:T>A 4093213_52:C>T 3740731_39:G>T 4095515_33:G>A 3581425_65:C>G 3581425_50:T>G 3602137_19:C>G 3355972_33:A>G 3578478_12:T>G 5803170_47:C>G 3365194_16:G>A rpt5070954r 7089115_18:A>C 3353704_31:A>G 3903147_14:T>A 3596403_56:A>G 3588691_58:A>G 4490527_13:G>A 3587062_35:C>T 3745001_56:A>C 3360469_51:C>G 5202943_64:G>A 3745145_37:A>G rpt400844na rpt509262na 3888959_26:G>T rpt4011694r 3594905_46:C>A rpt507812na 3583415_50:A>C 3350713_35:A>C 3364044_37:G>A rpt4008204r 3741848_5:C>T 3352755_61:T>C 3586519_55:G>T 7093797_9:C>A 3900742_26:A>G 5208950_23:G>A 5501270_56:A>T 3597723_28:T>C 3579025_27:G>C 5137856_14:C>T 5212404_30:A>G 3908681_22:G>A 3889003_25:G>A 3580596_46:T>C 3580625_36:A>C 7416030_35:G>C 3603104_6:C>T 5214540_23:A>G 3592560_14:T>C 3744387_49:G>A 4489597_26:G>T 3595459_47:G>A 3585379_29:G>C 3359109_6:A>T 5203400_6:T>A 7415931_9:G>T 4488577_18:T>C 3585524_9:T>G 3359109_17:A>G 3583151_36:T>C 3596607_35:G>C 3596907_29:G>C 3735782_34:T>A 4493680_17:G>A 3359109_9:T>G wpt0654na 3883215_8:A>T 3602027_19:G>C 3353960_12:G>C 5214337_52:C>A 5214337_44:A>C 3350419_16:C>T 3742738_43:C>G 3576093_26:G>C 3593379_11:G>A 3745028_30:T>C 3345488_20:G>T 3596501_31:G>C 3744409_58:T>C 3602027_54:C>T rpt5057754r 3742525_64:C>T rpt5065934r 5213836_66:A>G 3750408_14:C>G 3601714_53:A>T 5047079_47:G>T 3583063_31:A>G 3354744_21:G>A 5219870_5:T>C 5217778_56:G>T rpt79061b 4R 3356770_17:G>A rpt3985124r 3354307_11:G>C 3910014_36:C>A 5212540_18:G>C 3365179_32:A>G 3365041_64:C>G 3595257_32:A>G 5503971_36:G>A 3599316_36:G>A 3361762_14:G>A 3599316_44:G>A 3591076_26:A>C 3354333_38:T>C 3592698_55:T>C 4102521_13:G>C rpt69464r 3584836_22:G>A rpt4007474r rpt508585na wpt98204r 4491037_12:T>C rpt5083504r 3359083_8:T>C rpt5065344r wpt4130na wpt74984r 4494337_28:T>G rpt5077384r 3363911_20:C>T 5803433_24:T>C 5803433_15:A>G 3593875_67:C>A 3355573_52:G>A 3356797_18:G>A 5500219_11:G>A 3739661_37:C>T 3595968_23:G>A rpt5066864r 5213830_10:G>A 3733348_28:T>C rpt5084594r rpt401280na rpt4009964r rpt5066184r rpt5065084r rpt5082604r rpt4021574r 3350270_56:T>C rpt3987634r rpt509261na rpt5054173r rpt4019554r 3744722_66:C>G rpt3895994r rpt5059044r wpt40626b rpt5060894r rpt5096374r rpt4110234r rpt3987114r 3907706_57:A>C rpt4004844r rpt4011834r rpt3907874r 5220531_59:G>T rpt5072894r rpt4015444r 5212155_22:C>A 5499121_35:T>C 3597212_42:G>A 3577758_40:C>T 3356950_45:C>T rpt4010484r rpt5092434r rpt4024244r 3584909_25:T>C 3361521_11:T>G 6211875_10:T>C 5223903_45:G>T 5047363_58:C>G 3361359_29:T>A 3583391_45:G>A rpt4015894r 3597064_49:T>C rpt5094484r 3897712_42:T>C rpt401353na 3585935_39:C>T rpt5093534r 3737914_26:C>T rpt5052444r rpt5086934r rpt5091884r 3895688_16:G>A 3581497_65:T>G 4489885_14:G>A 3346102_65:T>C rpt5075494r 3593941_17:G>C 3597283_14:T>C 3736870_20:C>G 3361359_38:T>C rpt5068294r 5206143_54:G>C rpt5052294r 3744337_10:T>C rpt5084664r 3362325_25:T>C 3597283_22:G>T 3596698_31:G>A 3587928_21:G>A 3743145_18:G>A 5218395_8:C>G 3896164_28:G>A 3579497_62:G>C 3353932_36:C>T 3362379_29:A>C rpt389827na 3365314_20:T>G 3352585_42:C>T rpt4112812r 3348679_31:C>T rpt5085424r MbH24 rpt5091654r 3588567_40:C>T rpt5063304r rpt398699na rpt3986564r rpt505207na rpt4003084r rpt505760na rpt506696na rpt389352na d505904 rpt390649na rpt5061464r rpt5064444r rpt5054404r rpt410941na rpt4013084r rpt3998414r rpt4010704r 3889467 rpt411107na rpt3905504r rpt5086384r rpt4021594r rpt4003104r 3353799_34:C>G d390763 rpt5084544r SCSz23L500 d508800 4R Rys.3 Mapa chromosomu 4R w populacji [S305P x Gonello 249-1]F2 6

Rys.4. Krzywa LOD wskazująca na przypuszczalną lokalizację genu/genów kontrolujących męską płodność w mieszańću [S305P x Gonello 249-2]F2. Ocena fenotypowa roślin odmiany Gonello F1 dała w większości wyniki zgodne dla obu klonów. Sporadycznie zdarzały się różnice w ocenie wzrokowej pylenia obu klonów, które tylko w kilku przypadkach przekraczały 1 punkt w skali bonitacyjnej Geigera i Morgensterna (1975). Ogółem oceniono wzrokowo 280 genotypów, z czego 279 w oparciu o dwa klony, a 1 tylko w pojedynczej wersji (jedna z klonowanych roślin obumarła). Ocena osadzania ziaren pod izolatorami została wykonana dla 277 genotypów (w pozostałych przypadkach zaizolowane kłosy zotały utracone na skutek warunków pogodowych doszło do uszkodzenia lub zerwania izolatora lub obłamania zaizolowanego kłosa). Ogółem uzyskano dane ze znacznie większej liczby roślin niż początkowo zakładano, co wynika z zaskakująco małej liczby utraconych roślin w czasie procesu klonowania. Klonowanie roślin żyta polega na mechnicznym rozrywaniu krzewiącej się rośliny w warunkach polowych i przeważnie wiąże się ze stratami wynikającymi ze słabej regeneracji uszkodzonych roślin połączonej z atakiem chorób. W sprawozdawanym sezonie wegetacyjnym warunki pogodowe były na tyle korzystne, że prawie 99% wysianych roślin zostało scharakteryzowanych przy użyciu obu zaplanowanych metod oceny męskiej płodności. Zgodność wyników z obu metod oceny była bardzo duża współczynnik korelacji pomiędzy wynikami wyniósł 0,899. Wśród badanych roślin odmiany uprawnej Gonello F1 najliczniejszą grupe stanowiły rośliny o przywróconej w pełni płodności stanowiły one około jedną trzecią badanej grupy osobników. Stosunkowo często spotykane były w badanej odmianie rośliny męskosterylne, szczególnie takie, u których objawy męskiej steryności były na poziomie graniczącym z częściową płodnością (ocena 3 w skali Geigera i Morgensterna). Liczne były również osobniki o bardzo słabych objawach płodności (ocena 4 w skali). Ogólnie oceniając rozkład cechy w badanej grupie genotypów miał charakter bimodalny, w którym dwie kategorie fenotypów występują najczęściej: rośliny w pełni męskopłodne oraz rośliny z pogranicza form męskosterylnych i częściowo męskopłodnych (rys.5). Do analiz genotypowych wybrano 95 osobników charakteryzujących się stabilnością fenotypową w obrębie badanych klonów oraz zgodnością wyników oceny płodności wykonanej przy użyciu dwóch metod (ocena wzrokowa pylenia i ocena zawiązywania ziaren pod izolatorami). Uzyskano dane obejmujące 31500 markerów DArTseq-SNP. Przy ocenie grup obejmujących skrajne fenotypy (męskopłodne i męskosterylne) żaden z otrzymanych markerów nie wykazał pełnej zgodności z badaną cechą fenotypową. 7

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 82 66 48 28 26 10 11 6 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Płodność (skala 9-stopniowa) Rys.5. Wyniki wzrokowej oceny pylenia roślin odmiany Gonello F1 Dyskusja (opisać jak w publikacji) Lokalizacja genu Rfc1 na długim ramieniu chromosomu 4RL, która została określona na podstawie badań w obrębie populacji mapującej [544xDS2]RIL jest w pełni zgodna z wcześniejszymi doniesieniami (Stojałowski i in. 2004; 2011). Niestety, podobnie jak we wcześniej publikowanych pracach, nie udało się zidentyfikować markerów molekularnych bardzo blisko sprzężonych z badanym genem. Najbliższe zidentyfikowane markery znajdują się w odległości około 2cM od genu Rfc1. Taka odległość markerów od genu pozwala na podejmowanie prób zastosowania ich do oceny materiałów hodowlanych, ale jest niewystarczająca do realizacji działań zmierzających do sklonowania poszukiwanego genu. Z drugiej strony, opisane powyżej prace są tylko etapem kilkuletniech badań o kompleksowym charakterze i po zintegrowaniu z danymi dla innych populacji mogą się przyczynić w sposób istotny do stworzenia wysokozagęszczonej i wysokorozdzielczej mapy genetycznej określającej położenie genu Rfc1. Analiza fenotypowa populacji [S305P x Gonello 249-1]F2 wskazuje na bimodalny rozkład cechy często spotykany przy badaniach mieszańców żyta z cytoplazmą Pampa (Geiger i Miedaner 1996; Miedaner i in. 2000; Kociuba i Stojałowski 2009). Rozkład tego rodzaju wskazuje na udział większej liczby genów, wśród których można wytypować geny o największym znaczeniu przypuszczalnie mogą to być geny z chromosomu 4R (Miedaner i in. 2000; Stracke i in. 2003; Hackauf i in. 2012) lub 1R (Wricke 1993). Rezultaty analizy Interval Mappling, z uwagi na brak zgodności badanej cechy z rozkładem normalnym należy traktować jako orientacyjne (Miedaner i in. 2000), ale wydaje się, iż odnotowane, ekstremalnie wysokie, wartości parametru LOD w sposób raczej jednoznaczny wskazują, że w badanym materiale kluczową rolę odgrywa gen Rfp1 z chromosomu 4R. Badania wykonane w obrębie odmiany Gonello F1 stanowią wstęp do mapowania asocjacyjnego. Pełniejsza analiza uzyskanych wyników będzie możliwa po rozszerzeniu badań na niespokrewnione materiały hodowlane. Na obecnym etapie badań można stwierdzić, że wybór do badań roślin odmiany Gonello F1 pozwala na wytypowanie genotypów w pełni męskosterylnych i w pełni męskopłodnych. Przywracanie płodności w obrębie badanych klonów roślin było względnie stabilne, szczególnie w obrębie form o skrajnych fenotypach. Jest to zgodne z obserwacjami Geigera i in. (1995), którzy wskazują, że wpływ środowiska na płodność roślin żyta jest szczególnie istotny w obrębie form z częściowo przywróconą płodnością, a formy wyraźnie męskopłodne i sinie męskosterylne są raczej fenotypowo stabilne w różnych środowiskach. 8

Wnioski (opisać jak w publikacji) Potwierdzono lokalizację najważniejszych genów restorerowch dla systemów CMS-Pampa (Rfp1) i CMS-C (Rfc1) na długim ramieniu chromosomu 4R. Precyzyjne określenie czy geny Rfp1 i Rfc1 są zlokalizowane w tym samym miejscu, czy też są ze sobą tylko blisko sprzężone, wymaga prowadzenia dalszych badań pozwalających na stworzenie zitegrowanych map genetycznych o wysokiej rozdzielczości. 3. 2. Temat badawczy 2 Identyfikacja mitochondrialnych czynników wywołujących męską sterylność w cytoplazmie Pampa i porównanie ich z genetycznymi determinantami warunkującymi męską niepłodność w cytoplazmie CMS-C. Cel tematu badawczego 2 Proszę podać cel (jak w szczegółowym opisie) i napisać, czy cel został osiągnięty, ew. w jakim stopniu; jeśli cel nie został osiągnięty w całości podać przyczyny. Podjęcie prób zidentyfikowania mitochondrialnych genetycznych czynników wywołujących męską sterylność w cytoplazmie Pampa i porównanie ich z determinantami warunkującymi męską niepłodność w cytoplazmie CMS-C cel osiągnięty Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Wytworzone w 2014 roku ekstrakty mtdna wykorzystano do utworzenia bibliotek i poddania ich analizom sekwencjonowania DNA przy zastosowaniu technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Techniki te pozwalają na wygenerowanie bardzo licznych danych, które jednak charakteryzują się stosunkowo niewielką długością otrzymanych sekwencji DNA. To z kolei powoduje, że na dalszych etapach niezbędne jest poddanie otrzymanych danych specjalistycznemu opracowaniu bioinformatycznemu. Spośród możliwych technik do analiz wybrano technikę firmy Ilumina opartą o urządzenie HiSeq 2000. Analizy sekwencyjne wykonano w ramach zlecenia na urządzeniu Illumina HiSeq 2000 w firmie GenoMed (Warszawa, Polska). Bibliotekę DNA do analizy sekwencyjnej utworzono ligując fragmenty DNA z odpowiednimi adaptorami i w ten sposób etykietując każdą z badanych prób stosownym barkodem pozwalającym na przypisanie uzyskanych danych zbiorczych do określonego obiektu badawczego. Dodawanie etykiet wykonano w sposób standardowy dla analiz na aparatach HiSeq 2000 (zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia). Analizy tak stworzonej biblioteki pozwoliły na otrzymanie licznych danych sekwencyjnych o długości maksymalnej 100 nukleotydów dla każdego z pojedynczych odczytów. Po wykonaniu w/w analizy dokonano wstępnego opracowania bioinformatycznego danych i z uzyskanych sekwencji usunięto sekwencje adaptorowe (użyte do etykietowania prób w tworzonej bibliotece) oraz sekwencje o niskiej jakości. Uzyskane dane użyto do wstępnego składania w sekwencje konsensusowe o długości przekraczającej oryginaną długość 100 nukleotydów. Pełniejsza analiza bioinformatyczna uzyskanych danych jest zaplanowana w czasie kontynuowania badań. Wyniki (opisać). Odczyty sekwencyjne dla każdego z badanych obiektów zostały wykonane dwukierunkowo, dzięki czemu uzyskano po dwa zbiory danych dla każdej z cytoplazm (cytoplazmy normalna, CMS-C i CMS-P). Wszystkie odczyty miały oryginalnie długość po 100 nukleotydów. Ich ilość dla każdego z badanych obiektów była inna najmniej danych uzyskano dla cytoplazmy normalnej nieco ponad 4,4 miliona (tab.1). Ponad 5,5 miliona odczytów otrzymano dla cytoplazmy Pampa, a dane dla cytoplazmy C zawierały ponad 11,5 miliona krótkich sekwencji. Po usunięciu ze zbioru danych sekwencji o niskiej jakości oraz zawierające sekwencje adaptorowe, część z uzyskanych sekwecji uległa skróceniu. Długości pojedynczych sekwencji dla każdego z badanych obiektów mieściły się w granicach od 36 do 100 nukleotydów (tab.1), przy czym dominującą grupę stanowiły odczyty o długościach maksymalnych we wszystkich analizowanych sześciu zbiorach danych średnia długość odczytu wynosiła ponad 95 nukleotydów. O wysokiej jakości technicznej zgromadzonych danych świadczy znikomy udział nukleotydów niezidentyfikowanych (N) było ich od 137 do 2641 w obrębie danych liczących od kilku do 9

kilkunastu milionów odczytów, co we wszystkich przypadkach nie przekraczało wartości 0,1% (tab.1). Udział nukelotydów adeninowych i tyminowych w odczytanych sekwencjach był zbliżony we wszystkich trzech badanych cytoplazmach i wynosił po około 21%, a nukleotydy cytozynowe i guaninowe występowały z częstotliowścią zbiżoną do 29% (tab.1) 10

Tabela 1. Ogólna charkaterystyka danych o sekwencjach mtdna trzech badanych cytoplazm żyta Cytoplazma Plik Liczba Długość odczytów Liczba odczytów (udział %) odczytów min max średnia Odch. A C G T N Std. Normalna A 4 401 997 36 100 97,5 9,5 92 483 674 (21,6%) 122 355 508 (28,5%) 122 020 021 (28,4%) 92 236 679 (21,5%) 137 (0,0%) B 4 401 997 36 100 96,7 11,1 91 651 735 (21,5%) 121 410 637 (28,5%) 121 472 371 (28,5) 91 131 892 (21,4%) 1 061 (0,0%) CMS-C A 11 606 273 36 100 97,3 9,7 239 176 902 (21,2%) 326 094 023 (28,9%) 323 872 801 (28,7%) 240 520 607 (21,3%) 291 (0,0%) B 11 606 273 36 100 95,8 12,4 237 453 445 (21,4%) 319 169 701 (28,7%) 320 783 332 (28,8%) 234 746 677 (21,1%) 2 641 (0,0%) CMS-P A 5 778 245 36 100 97,3 9,8 117 747 580 (20,9%) 163 457 144 (29,1%) 162 695 459 (28,9%) 118 219 254 (21,0%) 137 (0,0%) B 5 778 245 36 100 96,4 11,5 116 902 905 (21,0%) 161 768 727 (29,0%) 161 930 389 (29,1%) 116 483 645 (20,9%) 1 361 (0,0%) 11

Dyskusja (opisać jak w publikacji) Izolacja DNA mitochondrialnego żyta jest najefektywniejsza, gdy materiał biologiczny stanowią etiolowane 10-14 dniowe kiełki, ale nawet tak przygotowany materiał, jak i skrupulatnie przeprowadzone procedury wirowań w gradientach stężeń nie gwarantują całkowitego odseparowania innych frakcji DNA obecnych w komórkach (Tudzynski i in. 1986). Preparaty mtdna użyte do analiz sekwencjonowania wysokoprzepusytowego charkateryzowały się dobrą jakością i uzyskano bogate zbiory danych charakteryzujących się marginalnym udziałem nukleotydów niezidentyfikowanych. Z uwagi na małe długości pojedynczych odczytów problemem może być poprawna analiza bioinformatyczna danych zidentyfikowanie sekwencji innych niż mitochondrialne oraz właściwe złożenie ich w dłuższe ciągi (tzw. contigi). Podobne trudności napotkali Ogihara i in. (2006) przy opracowywaniu sekwencji mitochondrialnego DNA pszenicy zwyczajnej. Należy oczekiwać, że weryfikacja poprawności ułożenia danych w całość wymagać będzie wykonania dodatkowych eksperymentów z udziałem metody PCR i prawdopodobnie również wykonania sekwencjonowań metodą Sangera, dzięki czemu możliwe będzie zweryfikowanie poprawności analizy bioinformatycznej `na podstawie dłuższych pojedynczych odczytów sekwencyjnych, niż te, które można uzyskać w urządzeniach Ilumina HiSeq 2000. Przyjmując, że mtdna żyta powinno mieć wielkość porównywalną do tego co Ogihara i in. (2006) zaobserwowali u pszenicy, tj. około 400 tys. nukleotydów, można stwierdzić, że nawet najmniej liczne dane, które otrzymano dla cytoplazmy normalnej powinny dawać pokrycie genomu mitochondrialnego na poziomie 1000x. Taka ilość danych stanowi dobrą bazę do prób całościowego scharakteryzowania genomów mitochondrialnych badanych trzech cytoplazm żyta. Wnioski (opisać jak w publikacji) Uzyskano dane sekwencyjne, które szacunkowo pokrywają mtdna żyta około 1000-krotnie. Łączny udział nukleotydów cytozynowych i guaninowych w mtdna wszystkich badanych źródeł cytoplazmy u żyta wynosi około 58%. 3. 3. Temat badawczy 3 Określenie frekwencji alleli płodności dla cytoplazmy C i P w populacjach żyta ozimego. Cel tematu badawczego 3 Proszę podać cel (jak w szczegółowym opisie) i napisać, czy cel został osiągnięty, ew. w jakim stopniu; jeśli cel nie został osiągnięty w całości podać przyczyny. Określenie frekwencji roślin męskopłodnych i męskosterylnych w mieszańcach między źródłami CMS-C i CMS-P a ośmioma polskimi populacjami żyta cel osiągnięty Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Badania nad frekwencją alleli sterylności/płodności realizowano poprzez krzyżowania w izolowanych szkółkach typu top-cross i (w kolejnych latach) ocenę wzrokową płodności uzyskanych mieszańców przy zastosowaniu skali bonitacyjnej opracowanej przez Geigera i Morgensterna (1975). W 2015 roku określono męską płodność u mieszańców między męskosterylnymi źródłami CMS-C i CMS-P a ośmioma populacjami żyta z polskiej hodowli. Rośliny wysiano punktowo w rozstawie 20x20 cm na polu doświadczalnym ZUT w Szczecinie (ponad 90 roślin każdego z mieszańców). W celu uzyskania mieszańców do oceny w kolejnym roku badań, wysiano cztery izlolowane szkółki hodowlane typu top-cross z męskosterylnymi wersjami linii 541 z cytoplazmą P i C oraz zapylaczami w postaci polskich populacji żyta oraz sześć namiotów foliowych z roślinami populacji zagranicznych wraz z męskosterylnymi roślinami testerów. Wyniki (opisać) W roku 2015 oceniono męską płodność 2106 pojedynczych roślin mieszańcowych. Badane mieszańce zostały otrzymane w poprzednim sezonie wegetacyjnym w rezultacie zapylenia męskosterylnych wersji linii 541 z cytoplazmami C i P pyłkiem pochodzącym z 9 polskich populacji żyta: 4 zarejestrowanych odmian uprawnych i 5 populacji hodowlanych. Z uwagi na straty roślin w czasie sezonu wegetacyjnego dla dwóch kombinacji mieszańcowych: [541C x Horyzo] i [541P x Dańkowskie Amber] liczba ocenionych roślin była mniejsza niż 90. We wszystkich pozostałych 12

kombinacjach mieszańcowych (8 mieszańców z cytoplazmą C i 8 z cytoplazmą Pampa) ilość ocenionych roślin była większa niż 100. W przybliżeniu połowę przebadanych osobników stanowiły rośliny z cytoplazmą Pampa i CMS-C (tab. 2). Najliczniej (po około 730 roślin) reprezentowane były rośliny zaliczone do klas fenotypowych: 9 rośliny w pełni męskopłodne, bardzo silnie pylące oraz 3 rośliny męskosterylne, ale o niezbyt silnych objawach męskiej sterylności (tab.2). Rośliny wykazujące objawy bardzo głębokiej sterylności (1 w skali Gegera i Morgensterna) nie pojawiały się, gdy obecna była cytoplazma C, przy obecności cytoplazmy Pampa zidentyfikowano 36 takich roślin. Rośliny o najsilniejszych objawach płodności identyfikowane były ponad dziesięć razy częściej w mieszańcach z cytoplazmą C. Relacje między źródłami CMS stają się lepiej widoczne po połączeniu dziewięciu klas bonitacyjnych w kategorie fenotypowe (rośliny męskosterylne, częściowo płodne i męskopłodne) oraz przekalkulowaniu liczebności roślin w tych kategoriach na ich procentową frekwencję (tab.3). Można tutaj wyraźnie zauważyć wyraźną różnicę pod względem obecności genotypów dopełniających i restorerowych dla dwóch badanych źródeł CMS. Udział genotypów dopełniających dla cytoplazmy C jest we wszystkich badanych populacjach niewielki (od kilku do najwyżej kilkunastu procent), a efektywne restorery stanowią mniej więcej 70-80% w każdej z badanych populacji. (tab.3). W przypadku mieszańców z cytoplazmą CMS-Pampa dominują formy nie przywracające płodności w większości badanych populacji stanowiły one od 70 do ponad 90 % genotypów Tabela 2 Płodność mieszańców między męskosterylnymi źródłami cytoplazm CMS-P i CMS-C, a polskimi populacjami żyta ozimego (liczebność roślin w poszczególnych klasach fenotypowych). Populacja CMS Męskosterylne Częściowo płodne Męskopłodne Suma 1 2 3 4 5 6 7 8 9 D. Diament C 0 0 16 3 8 8 12 11 64 122 P 2 8 52 16 13 6 4 6 17 124 D. Amber C 0 1 15 11 4 7 5 9 75 127 P 1 4 29 12 9 6 4 6 14 85 Armand C 0 0 12 2 1 4 3 7 74 103 P 7 19 66 9 4 9 2 2 4 122 Horyzo C 0 1 6 3 4 6 4 2 39 65 P 5 16 132 7 6 2 0 1 0 169 Szk.46 C 0 0 12 5 4 1 7 12 67 108 P 2 11 61 10 5 5 2 2 9 107 Szk.84 C 0 0 9 9 10 7 5 13 63 116 P 7 17 60 19 4 5 1 3 2 118 Szk.85 C 0 1 8 7 1 2 5 8 99 131 P 4 21 87 5 2 2 0 2 2 125 Szk.94 C 0 0 21 5 3 5 4 11 114 163 P 3 14 62 14 6 4 1 3 4 111 Szk.98 C 0 0 17 0 0 3 1 7 81 109 P 5 10 64 7 5 2 2 2 4 101 Ogółem 36 123 729 144 89 84 62 107 732 2106 w tym z CMS-C 0 3 116 45 35 43 46 80 676 1044 w tym z CMS-P 36 120 613 99 54 41 16 27 56 1062 13

Tabela 3 Odsetek roślin ocenionych jako męskosterylne (MS), częściowo płodne (CP) i męskopłodne (MP) wśród mieszańców między męskosterylnymi wersjami linii 541, a populacjami żyta. Populacja Cytoplazma MS CP MP D. Diament CMS-C 13,11 15,57 71,31 CMS-P 50,00 28,23 21,77 D. Amber CMS-C 12,60 17,32 70,08 CMS-P 40,00 31,76 28,24 Armand CMS-C 11,65 6,80 81,55 CMS-P 75,41 18,03 6,56 Horyzo CMS-C 10,77 20,00 69,23 CMS-P 90,53 8,88 0,59 Szk.46 CMS-C 11,11 9,26 79,63 CMS-P 69,16 18,69 12,15 Szk.84 CMS-C 7,76 22,41 69,83 CMS-P 71,19 23,73 5,08 Szk.85 CMS-C 6,87 7,63 85,50 CMS-P 89,60 7,20 3,20 Szk.94 CMS-C 12,88 7,98 79,14 CMS-P 71,17 21,62 7,21 Szk.98 CMS-C 15,60 2,75 81,65 CMS-P 78,22 13,86 7,92 Ogółem CMS-C 11,40 11,78 76,82 CMS-P 72,41 18,27 9,32 Jedynie w odmianach Dańkowskie Diament i Dańkowskie Amber udział genotypów dopełniających był nieco mniejszy (40-50%), należy jednak zaznaczyć, że ta ostatnia odmiana była w 2015 roku reprezentowana przez stosunkowo mało liczną grupę ocenionych roślin (tab.2). Dyskusja (opisać jak w publikacji) Niewielka częstotliwość występowania w europejskich populacjach żyta genotypów skutecznie przywracających płodność w systemie CMS Pampa była sygnalizowana już pod koniec XX wieku (Geiger i in. 1995; Miedaner i in 1997), ale doniesienia te miały dość ogólnikowy charakter. W polskich populacjach żyta obserwowano znaczący udział restorerów dla cytoplazmy C (Łapiński i Stojałowski 1997), ale tutaj również badania nie miały charakteru kompleksowego i pozwalały na jedynie ogólną charakterystykę materiałów hodowlanych. Uzyskane wyniki zasadniczo są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, a ukazują istnienie pewnych różnic między populacjami, szczególnie w odniesieniu do cytoplazmy Pampa. Odmiana Horyzo zawierała ekstremalnie mało genotypów restorerowych dla systemu CMS-P (mniej niż 1%), podczas gdy u dwóch odmian: Dańkowskie Diament i Dańkowskie Amber udział form przywracających płodność był nieporównywalnie większy (powyżej 20%). Można domniemywać, że większy udział genotypów restorerowych w odmianie Dańkowskie Diament może mieć związek z występowaniem w tej odmianie roślin z cytoplazmą Pampa (Stojałowski i in. 2008). Trzeba jednak zaznaczyć, że wyciąganie wiarygodnych wniosków z przeprowadzonych badań będzie możliwe dopiero po przeprowadzeniu obserwacji w zróżnicowanych warunkach środowiska, ponieważ może ono w sposób znaczący wpływać na rezulataty fenotypowej oceny męskiej płodności roślin żyta (Geiger i in. 1995). Wnioski (opisać jak w publikacji) We wszystkich ocenionych populacjach przeważały genotypy przywracające męską płodność w systemie CMS-C. Większość przebadanych populacji zawierała niewiele form restorerowych, ale zaobserwowano pod tym względem wyraźne zróżnicowanie w niektórych populacjach genotypy przywracające płodność były prawie nieobecne, a w niektórych stanowiły ponad 20% osobników. Ogólnie oceniane populacje żyta składają się z genotypów, które przeważnie utrzymują męską sterylność w cytoplazmie Pampa, ale przywracają płodność w systemie CMS-C. 14

3. 4. Temat badawczy 4 Ocena zdolności kombinacyjnej linii męskosterylnych z cytoplazmą C na tle linii zawierających cytoplazmę Pampa. Cel tematu badawczego 4 Proszę podać cel (jak w szczegółowym opisie) i napisać, czy cel został osiągnięty, ew. w jakim stopniu; jeśli cel nie został osiągnięty w całości podać przyczyny. Ocena zdolności kombinacyjnej wybranych linii męskosterylnych z cytoplazmą C (na tle linii zawierających cytoplazmę Pampa) cel osiągnięty Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Ocena zdolności kombinacyjnej linii męskosterylnych została wykonywana w doświadczeniach polowych dwupowtórzeniowych założonych równolegle w trzech miejscowościach metodą wzorcową. Jako wzorce wykorzystano dwie odmiany mieszańcowe: Stakkato F1 i KWS Bono F1. Testerem dla badanych linii męskosterylnych (niezależnie od typu sterylizującej cytoplazmy) była populacja syntetyczna SR27. Oceną objęto 23 linie męskosterylne z cytoplazmą C i 12 linii z cytoplazmą Pampa. Dodatkowo, poza odmianami wzorcowymi z hodowli niemieckiej, w doświadczeniu wysiano też jako obiekty badawcze dwie odmiany mieszańcowe wyhodowane w Polsce (Tur F1 i Gradan F1). Wielkość poletek doświadczalnych do zbioru: 5m 2. Oceniono plon i podstawowe cechy użytkowe (wysokość, wyleganie, odporność na choroby). Wyniki (opisać) Prawie wszystkie badane linie dawały mieszańce plonujące wyraźnie gorzej niż odmiany wzorcowe (tab.4). Jedynie jedna linia z cytoplazmą Pampa - S518P/13 skrzyżowana z syntetykiem SR27 dała plon porównywalny z odmianami KWS Bono F1 i Stakkato F1. Dwie linie z cytoplazmą C oraz trzy z cytoplazmą Pampa dały mieszańce plonujące na poziomie zbliżonym do odmian z polskiej hodowli (Tur F1 i Gradan F1) ich plony mieściły się w granicach 90-95% plonu odmian wzorcowych. Wśród mieszańców najsłabiej plonujących w doświadczeniu znalazły się cztery wytworzone w oparciu o linie wsobne cytoplazmą C i jeden z cytoplazmą Pampa. Wśród pozostałych analizowanych w doświadczeniu cech obserwowane zróznicowanie nie miało wyraźnego związku ze źródłem cytoplazmy sterylizującej. Najwyższe z badanych genotypów, których wysokość przekkraczała 160cm posiadały cytoplazmę C, ale ta sama cytoplazma była też obecna w mieszańcu, którego wysokość nie dochodziła do 140cm. Co interesujące mniejsza wysokość nie zawsze przekładała się na większą odporność na wyleganie (tab.4). W roku 2015 na doświadczeniach nie zaobserwowano porażenia przez mączniaka, za to dość silne było porażenie przez rdzę brunatną. Mieszańce z obiema cytoplazmami charakteryzowały się podobnym zróżnicowaniem jeśli idzie o podatność na rdzę, ale różnice między najlepszymi i najsłabszymi genotypami nie przekraczały 2 punktów w 9-stopniowej skali bonitacyjnej. Żaden z badanych mieszańców nie był odporny na rdzę najlepsze obiekty, w tym odmiany uprawne ocenione zostały na niewiele więcej niż 5 punktów w skali, najbardziej podatne uzyskały oceny poniżej 4 (tab.4). 15