Małgorzata B. Gawlik, Elżbieta Twardowska, Małgorzata Trawa, Maciej Gawlik

BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XL, 2007, 3, str. 279 285 Małgorzata B. Gawlik, Elżbieta Twardowska, Małgorzata Trawa, Maciej Gawlik WPŁYW KWASU SALICYLOWEGO NA RÓWNOWAGE PRO-/ANTYOKSYDACYJNA W WARUNKACH WYSOKICH STE ŻEŃ GLUKOZY W KRWINKACH CZERWONYCH CZŁOWIEKA W BADANIACH IN VITRO Katedra Toksykologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Kierownik: prof. dr hab. J. Brandys W przeprowadzonych badaniach ludzkie erytrocyty inkubowano z buforem zawieraja cym glukozę w zakresie stęż. 72,9 354,1 mg %. Po upływie 18 godz. oceniano zmiany równowagi pro-/antyoksydacyjnej mierza c poziom powstałego MDA oraz zmiany w aktywności SOD. Dalsza inkubacja zawiesiny krwinek z kwasem salicylowym powodowała zmiany w aktywności SOD oraz wzrost protekcji krwinek przed dodatkowym czynnikiem utleniaja cym którym w zastosowanym eksperymencie był nadtlenek kumenu. Wysokie stężenie glukozy hamowało ten efekt. Hasła kluczowe: hiperglikemia, cukrzyca, krwinki czerwone człowieka, stres oksydacyjny, kwas salicylowy. Key words: hyperglycemia, diabetes, human red blood cells, oxidative stress, salicylic acid. Cukrzyca należy do grupy chorób metabolicznych powiązanych z utrzymującą się, patologicznie podwyższoną hiperglikemią, wynikającą z upośledzenia regulacyjnego wpływu insuliny. Efektem długotrwałej ekspozycji na hiperglikemię jest stres oksydacyjny (1, 2, 3, 4). Glukoza reaguje z białkami i lipoproteinami na drodze nieenzymatycznej glikacji oraz ulega autoksydacji, co prowadzi do powstania wolnych rodników. Działanie wolnych rodników jest neutralizowane przez naturalny system obrony antyoksydacyjnej. System ten złożony jest z wielu czynników o charakterze enzymatycznym i nieenzymatycznym, które hamują oksydację cząsteczek oraz struktur komórkowych. Jednym z istotnych czynników bariery antyoksydacyjnej jest miedzio i cynko zależna dysmutaza ponadtlenkowa (Cu, ZnSOD). W prewencji i terapii schorzeń naczyń krwionośnych, które występują jako powikłania cukrzycy ma zastosowanie kwas acetylosalicylowy (5, 6). Wykazano, że powstający z niego kwas salicylowy ma zdolność usuwania wolnych rodników tlenowych i hydroksylowych oraz powoduje hamowanie zależnej od COX generacji anionorodnika ponadtlenkowego (7). Wpływa także na zwiększenie poziomu katalazy. Anionorodnik ponadtlenkowy spontanicznie utlenia tlenek azotu wy-

280 M.B. Gawlik i inni Nr 3 twarzany przez śródbłonek do form nieaktywnych, obniżając naczyniorozkurczowy potencjał czynnościowy (5, 8, 9). Jednak wyniki niektórych badań wskazują na to, że salicylany nie zmiatają, a biorą udział w tworzeniu wolnych rodników (10, 11, 12, 13). Stąd w przedstawionej pracy podjęto próbę oceny własności pro-/antyoksydacyjnych kwasu salicylowego w modelu in vitro z zastosowaniem krwinki czerwonej człowieka, narażonej na działanie różnych stężeń glukozy. Krwinki czerwone ze względu na budowę błony komórkowej zbliżoną strukturalnie do błon komórek śródbłonka stanowią dogodny model w badaniach efektów działania wolnych rodników. W błonach krwinek czerwonych występują duże stężenia nienasyconych kwasów tłuszczowych, które pod wpływem czynników utleniających generują wiele produktów, których obecność świadczy o zaistniałym stresie oksydacyjnym. Jednym z takich produktów jest łatwo mierzalny dialdehyd malonowy (MDA). Krwinki czerwone biorą również udział w transporcie niektórych leków jak np. kwasu salicylowego (8, 14). W prezentowanych badaniach in vitro oceniono wpływ glukozy i kwasu salicylowego na potencjał antyoksydacyjny krwinki czerwonej człowieka, którego miarą była aktywność SOD oraz poziom MDA. Oceniono także podatność na peroksydację badanych krwinek eksponowanych na działanie glukozy i kwasu salicylowego. Zmiana podatności krwinek na utlenianie wywoływane przez utleniacze zewnętrzne, może być uważana za miarę właściwości pro-/antyoksydacyjnych czynników obecnych w układzie, w tym przypadku kwasu salicylowego w warunkach eksperymentu. W badaniach zastosowano utleniacz, nadtlenek kumenu, związek efektywnie inicjujący procesy peroksydacji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych błony komórkowej, wynikiem czego jest wzrost powstawania MDA (15). Proces ten może być zahamowany przez czynniki o charakterze antyoksydacyjnym. CZE ŚĆ DOŚWIADCZALNA Odczynniki: glukoza, odczynnik Drabkina prod. POCH Gliwice, kwas salicylowy prod. Aldrich, dialdehyd malonowy prod. Merck, kwas tiobarbiturowy, bufor fosforanowy z chlorkiem sodu (PBS) prod. Sigma, epinefryna, prod. ICN. Aparatura: spektrofotometr Genesis 2PC prod. Spectronic, wirówka laboratoryjna MPW-350R prod. MPW Med. Instruments. Badanie wpływu glukozy i kwasu salicylowego na aktywność SOD i poziom MDA W badaniach wykorzystano trzykrotnie przemyte solą fizjologiczną ludzkie erytrocyty pochodzące od zdrowych osób zebrane w jednorodną pulę. Przygotowano roztwory glukozy w buforze PBS. Stężenie cukru zmierzono z zastosowaniem spektrofotometrycznej metody o-toluidynowej. Otrzymane roztwory glukozy mieszano z erytrocytami uzyskując serie prób o hematokrycie równym 40%. Stężenie heksozy w buforze nad erytrocytami w 4 seriach prób wynosiło 72,9; 126,2; 280,1 i 354,1 mg %. Imitowały one kolejno: prawidłowy poziom glukozy w krwi, przekroczoną glikemie, oraz poziom występujący w cukrzycy (16). Każda seria składała się z 15 niezależnych prób. Wszystkie próby inkubowano przez 18 godz. w temp. 37 C bez dostępu światła delikatnie mieszając. Po tym czasie 5 prób z każdej serii zawierającej określone stężenie glukozy wirowano z przyśpieszeniem 1000 g. W warstwie buforowej oznaczano stężenie glukozy, a w erytrocytach oznaczano poziom MDA z wykorzystaniem metody spektrofotometrycznej wg Stocks a (17) i aktywność SOD wg metody opartej na hamowaniu samoutleniania adrenaliny do adrenochromu (18).

Nr 3 Kwas salicylowy a równowaga pro/antyoksydacyjna 281 Pozostałe 10 prób z każdej serii zawiesin erytrocytów wirowano z przyśpieszeniem 500 g i część buforu znad krwinek przenoszono do probówek, w których mieściła się sucha pozostałość kwasu salicylowego, jaka została po odparowaniu metanolu z roztworu o odpowiednim stężeniu. Bufor wraz z kwasem salicylowym powtórnie łączono z krwinkami. W badanych zawiesinach erytrocytów stężenie kwasu salicylowego wynosiło 30 mg %. Przygotowane zawiesiny krwinek zawierające lek inkubowano przez 10 min. (5 prób z każdej serii) i 30 min. (5 prób z każdej serii). Po tych czasach, zawiesiny wirowano (1000 g) i w erytrocytach oznaczano poziom MDA i aktywność SOD. Badanie podatności erytrocytów po inkubacji z glukozą i kwasem salicylowym na peroksydację lipidów indukowaną nadtlenkiem kumenu Kolejne, niezależnie przygotowane zawiesiny krwinek w identyczny sposób jak opisano powyżej (poddane przez 18 godz. działaniu glukozy w różnych stężeniach, do których następnie dodano kwas salicylowy o stęż. 30 mg % i inkubowano przez kolejne 10 i 30 min.) wirowano (1000 g), odrzucano bufor i krwinki przemywano trzykrotnie solą fizjologiczną. Z uzyskanych erytrocytów przygotowywano ich 10% zawiesinę w buforze PBS. Do każdej zawiesiny w celu inicjacji peroksydacji lipidów błony erytrocytów dodawano 25 μl nadtlenek kumenu (66 mm) i inkubowano przez 1 godz. w temp. 25 C. W zawiesinie erytrocytów oznaczano poziom MDA przed i po ekspozycji na zastosowany utleniacz. Ocena statystyczna wyników Porównania pomiędzy badanymi próbami wykonano z zastosowaniem testu t odpowiednio dla prób zależnych i niezależnych z wykorzystaniem programu komputerowego STATISTICA. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Hiperglikemia to stan, w którym stężenie glukozy ulega podwyższeniu głównie wskutek upośledzenia regulacyjnego wpływu insuliny. Przekroczenie stężenia glukozy w osoczu na czczo powyżej 6,1 mmol/dm 3 (110 mg/dl) aż do osiągnięcia wartości 7,0 mmol/dm 3 (126 mg/dl) określany jest mianem hiperglikemii. W przedstawionym badaniu krwinki poddane były działaniu glukozy o stężeniu prawidłowym (72,9 mg %) o stężeniu imitującym przekroczoną glikemię (126,2 mg %) i o znacznym przekroczeniu imitującym poziom występujący w cukrzycy (280,1 i 354,1 mg %). Po 18 godz. inkubacji krwinek w roztworach glukozy obserwowano hemolizę (mierzoną poziomem hemoglobiny metodą Drabkina w buforze nad krwinkami) nie przekraczającą 5%. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w poziomie hemolizy pomiędzy badanymi seriami. Krwinki czerwone zawieszone w buforze zawierającym glukozę w zakresie stężeń od 72,9 do 354,1 mg % w okresie 18 godz. inkubacji zużywały cukier, którego poziom w tym czasie obniżył się o ok. 50% (ryc. 1). Ryc. 1. Stężenie glukozy w buforze przed i po 18-godzinnej inkubacji z krwinkami. Fig. 1. The level of glucose in the buffer before and after 18-h incubation with erythrocytes.

282 M.B. Gawlik i inni Nr 3 Przedstawione poniżej wyniki z oznaczeń stężenia MDA i aktywności SOD przypisano do odpowiednich wyjściowych stężeń glukozy jakie były w buforze przed rozpoczęciem inkubacji. Pod wpływem 18 godz. oddziaływania glukozy, także na poziomie prawidłowej glikemii, w krwinkach czerwonych stwierdzono podwyższony poziom peroksydacji lipidów, czego wynikiem jest istotny wzrost poziomu MDA, w porównaniu do oznaczanego w chwili rozpoczęcia inkubacji. Poziom tego markera jest podobny, niezależny od stężenia glukozy w badanych zawiesinach (ryc. 2). Ryc. 2. Wpływ glukozy i kwasu salicylowego na powstawanie MDA w zawiesinie krwinek. Fig. 2. Effect of glucose and salicylic acid on MDA formation in the red blood cells suspension. Kwas salicylowy, główny metabolit kwasu acetylosalicylowego powstający na drodze jego hydrolizy, wiąże się z albuminami osocza i działa w obrębie tkanek do których zostanie przetransportowany. Wyniki badań in vitro wskazują, że substancja ta szybko przenika do krwinek czerwonych i stan równowagi osiągany jest w czasie 1 5 min. (14). W środowisku buforu, po osiągnięciu stanu równowagi kwas salicylowy mniej więcej równomiernie rozmieszcza się pomiędzy bufor i krwinki. Dodanie kwasu salicylowego w stężeniu terapeutycznym do zawiesiny krwinek poddanych 18 godz. działaniu glukozy o normalnym i wysokim stężeniu glukozy nie wpłynęło znacząco na poziom MDA przez kolejne 10 i 30 min. inkubacji (ryc. 2). Zwiększenie aktywności SOD jest jednym z mechanizmów przeciwutleniającego działania kwasu salicylowego i jego pochodnych (5, 6). Uzyskane wyniki w przedstawionych badaniach własnych dotyczące aktywności SOD w krwinkach poddanych działaniu glukozy mogą świadczyć, że enzym ten odgrywa istotną rolę w ochronie erytrocytów poddanych działaniu glukozy (4, 19). Aktywność tego enzymu istotnie zmniejszyła się w zawiesinach krwinek zawierających glukozę w zakresie stęż. od 126,2 do 280,1 mg % w porównaniu zarówno do aktywności enzymu w tej samej zawiesinie krwinek przed rozpoczęciem inkubacji jak i w stosunku do zawiesiny z prawidłowym stężeniem glukozy. Najwyższe badane stężenie glukozy 354,1 mg % spowodowało istotny spadek aktywności SOD w porównaniu do aktywności enzymu w tej samej zawiesinie krwinek, ale w przeciwieństwie do pozostałych grup z podwyższonym stężeniem glukozy spowodowało wzrost w stosunku do zawiesiny z prawidłowym stężeniem glukozy (ryc. 3). W erytrocytach poddanych 18 godz. działaniu glukozy w zakresie stężeń od 72,9 do 126,2 mg % oraz kwasu salicylowego o stęż. 30 mg % przez kolejne 10 min. doszło do znamiennego wzrostu aktywności SOD w stosunku do erytrocytów, na które oddziaływała tylko glukoza. Dłuższa 30 min. inkubacja

Nr 3 Kwas salicylowy a równowaga pro/antyoksydacyjna 283 Ryc. 3. Wpływ glukozy i kwasu salicylowego na aktywność SOD w krwinkach czerwonych. Fig. 3. Effect of glucose and salicylic acid on SOD activity in red blood cells. krwinek z kwasem salicylowym spowodowała, że aktywność SOD istotnie zmalała w porównaniu do oznaczanej po 10 min. inkubacji. W zawiesinie erytrocytów narażonych na 18 godz. oddziaływanie glukozy w stężeniu początkowym 280,1 mg % i poddanej przez kolejne 10 i 30 min. inkubacji z kwasem salicylowym stwierdzono istotny wzrost aktywności SOD w porównaniu do zawiesiny narażonej tylko na działanie glukozy. Inkubacja z kwasem salicylowym krwinek narażonych na wysokie stężenie glukozy 354,1 mg % nie spowodowała znaczących zmian w aktywności SOD w stosunku do krwinek narażonych tylko na działanie glukozy. Obserwowane zmiany w aktywności SOD mogą świadczyć o tym, że kwas salicylowy wpływa na barierę antyoksydacyjna komórki w zakresie zmian potencjału enzymatycznego w zależności od stężenia glukozy. Wzrost aktywności SOD w stosunku do erytrocytów narażonych na niższe stężenia glukozy wskazuje na wyraźną poprawę potencjału obronnego komórki pod wpływem kwasu salicylowego. W warunkach eksperymentu zmiana ta nie miała charakteru trwałego. Po dłuższym czasie inkubacji zanotowano spadek aktywności enzymu. Wyższe stężenia glukozy mogą tłumić ochronny efekt działania SOD. W zastosowanym stężeniu i reżimie czasowym ekspozycji, kwas salicylowy nie podwyższył znamiennie poziomu MDA w stosunku do zawiesin krwinek z glukozą bez względu na jej stężenie. Świadczy to, że nie wykazuje on w zaistniałych warunkach właściwości prooksydacyjnych. Biorąc pod uwagę stosunkowo krótki czas oddziaływania leku na erytrocyty trudno odnieść te wynik do badań wskazujących na brak działania antyoksydacyjnego albo wręcz prooksydacyjnego kwasu (10). Interesujący jest wynik badań, który może potwierdzać, że funkcjonowanie w erytrocytach mechanizmów antyoksydacyjnych uaktywnionych przez działanie glukozy i kwasu salicylowego po usunięciu tych czynników ze środowiska krwinek, zostawia ślad w postaci zwiększonej odporności komórek na działanie dodatkowego czynnika utleniającego jakim był nadtlenek kumenu (ryc. 4). Punkt odniesienia

284 M.B. Gawlik i inni Nr 3 w tych badaniach stanowił układ składający się z zawiesiny erytrocytów w buforze z fizjologicznym stężeniem glukozy poddany działaniu nadtlenku kumenu. Ilość powstającego w tym układzie MDA przyjęto za wartość 1. Stężenie glukozy 126,2 i 280,1 mg % nie spowodowało zwiększenia podatności na oksydowalność błon erytrocytów w porównaniu do erytrocytów poddanych działaniu glukozy o stężeniu 72,9 mg %. Dopiero stężenie glukozy o wartości 354,1 mg % istotnie zmniejszyło odporność na działanie nadtlenku kumenu. Ryc. 4. Podatność na peroksydację lipidów pod wpływem nadtlenku kumenu krwinek czerwonych narażonych uprzednio na działanie glukozy i kwasu salicylowego. Fig. 4. Susceptibility of glucose- and salicylic acid-preexposed erythocytes to cumene peroxide-induced lipid peroxidation. Działanie utleniające nadtlenku kumenu w stosunku do badanych erytrocytów poddanych 18 godz. działaniu glukozy w zakresie stęż. 72,9 280,1 mg % zostało istotnie obniżone, jeżeli na krwinki dodatkowo oddziaływał kwas salicylowy w stęż. 30 mg % przez okres 30 min. Krótsza 10 min. inkubacja z kwasem salicylowym wpłynęła protekcyjnie na krwinki znajdujące się w otoczeniu glukozy w stęż. 126,2 i 280,1 mg %, a nie zadziałała protekcyjnie na zawiesinę z prawidłowym stężeniem glukozy. Działanie antyoksydacyjne kwasu salicylowego w stosunku do erytrocytów narażonych na działanie utleniające nadtlenku kumenu nie miało znaczenia w przypadku erytrocytów narażonych na glukozę o stęż. 354,1 mg %. W pewnym przybliżeniu możemy stwierdzić, że zawiesiny krwinek z glukozą, które wykazały zwiększenie aktywności SOD pod wpływem kwasu salicylowego są również mniej podatne na inicjację peroksydacji za pośrednictwem nadtlenku kumenu. Wobec istnienia różnic w obserwowanych efektach, zarówno dla różnych stężeń glukozy jak i czasu narażenia na kwas salicylowy, wydaje się interesujące zbadanie kinetyki zmian markerów stresu oksydacyjnego, co może mieć znaczenie praktyczne w leczeniu osób z cukrzycą.

Nr 3 Kwas salicylowy a równowaga pro/antyoksydacyjna 285 M.B. G a w l i k THE IN VITRO EFFECTS OF SALICYLIC ACID ON PRO-/ANTIOXIDATIVE BALANCE IN HUMAN RED BLOOD CELLS AT HIGH GLUCOSE CONCENTRATIONS Summary In vitro effects of glucose and salicylic acid on the antioxidant system in human red blood cells were studied. The suspensions of erythrocytes in phosphate-buffered saline containing glucose at 72.9; 126.2; 280.1 and 354.1 mg % were incubated at 37 C for 18 hours. After that, 30 mg% salicylic acid was added to each sample and then the samples were incubated for a further 10 and 30 min. The levels of MDA and the activity of SOD were measured before and after the incubation. Samples of erythrocytes after incubation with glucose and salicylic acid prepared as described above were oxidized with cumene hydroperoxide for 1 hour. Erythrocyte susceptibility to peroxidation was assessed by the determination of MDA level and SOD activity. The results suggest that salicylic acid does not change the level of MDA in erythrocyte suspensions exposed to glucose within the studied concentration range. The activity of SOD in these suspensions depended on the concentration of glucose and the time of incubation with salicylic acid. Susceptibility to lipid peroxidation of red blood cells exposed to glucose dropped under the influence of salicylic acid within the glucose concentration range of 126.2-280.1 mg%. PIŚMIENNICTWO 1. Baynes J.W., Thorpe S.R.: Role of oxidative stress in diabetic complications. Diabetes, 1999; 48: 1-9. 2. Tohoku J.: Lipid peroxidation and resistance to oxidation in patients with type 2 Diabetes Mellitus. J. Exp. Med., 2004; 203: 211-8. 3. Piconi L., Quagliaro L., Ceriello A.: Oxidative stress in diabetes. Clin. Chem. Lab. Med., 2003; 41: 1144-49. 4. Sushil K.J.: Hyperglycemia can cause membrane lipid peroxidation and osmotic fragility in human red blood cells. J. Biol. Chem., 1989; 264: 21340-43. 5. American Diabetas Association. Aspirin therapy in diabetes. Diabetes Care 2003; 26: 87-88. 6. Czyż M., Watała C.: Aspiryna-molekularne mechanizmy działania kwasu acetylosalicylowego w organizmie. Postępy Hig. Med. Dośw., 2005; 59: 105-13. 7. Ghiseli A., Laurenti O., De Mattia G., Maiani G., Ferro-Luzzi A.: Salicylate hydroxylation as an early marker of in vivo oxidative stress in diabetic patients, Free Radic. Biol. Med., 1992; 13: 621-626. 8. Awtry E.H., Loscalzo J.: Aspirin. Circulation, 2000; 101: 1206-18. 9. Blatter-Garin M.C., Kalix B., De Pree S., James R.W.: Aspirin use is associated with higher serum concentrations of the anti-oxidant enzyme, paraoxonase-1. Diabetologia, 2003; 46: 593-594. 10. Durak I., Karaayvaz M., Çimen M.Y.B., Avci A., Çimen Ö.B., Büyükloçak S., Őztürk H.S., Özbek H., Kaçmaz M.: Aspirin impairs antioxidant system and causes peroxidation in human erythrocytes and guinea pig myocardial tissue. Hum. Exp. Toxico,. 2001; 20: 34-37. 11. Kirkova M., Ivancheva E., Russanov E.: In vitro effects of aspirin on malondialdehyde formation and on activity of antioxidant and some metal-containg enzymes. Comp. Biochem. Physiol. Pharmacol. Toxicol., 1994; 108: 145-52. 12. Pihan G., Regillo C., Szabo S.: Free radicals and lipid peroxidation in ethanol or aspirin induced gastric mucosal injury. Dig. Dis. Sci., 1987; 32: 1395-401. 13. Orhan H., Sahin G.: In vitro effects of NSAIDS and paracetamol on oxidative stress-related parameters of human erythrocytes. Exp. Toxicol. Pathol., 2001; 53: 133-40. 14. Ohsako M., Matsumoto Y., Goto S.: Transport of aspirin and its metabolites through human erythrocyte membrane. Biol. Pharm. Bull., 1993; 16: 154-57. 15. van den Berg J.J.M., Op den Kamp J.A.F., Lubin B.H., Roelofsen B., Kuypers F.A.: Kinetics and site specifity of hydroperoxide- induced oxidative damage in red blood cells, Free Radical Biol. Med., 1992; 12: 487-498. 16. American Diabetas Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care 2005; 28: 37-42. 17. Stocks J., Offerman E.C., Modell C.B., Dormand T.L.: The susceptibility to autoxidation of human red cell lipids in health and disease. Br. J. Haemat., 1972; 23: 713-25. 18. Misra H.P., Fridovich I.: The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. J. Biol. Chem., 1972; 247: 3170-75. 19. Kotake M., Shinohara R., Kato K., Hayakawa N., Hayashi R., Uchimura K., Makino M., Nagata M., Kakizawa H., Nakagawa H., Nagasaka A., Itoh M.: Reduction of activity, but no decrease in concentration of erythrocyte Cu,Zn-superoxide dismutase by hyperglycaemia in diabetic patients. Diab. Med., 1998; 15: 668-71. Adres: 30-688 Kraków, ul. Medyczna 9.