P R A C A O R Y G I N A L N A Acta Haematologica Polonica Original Article 2006, 37, Nr 1 str. 61 65 JADWIGA SAWECKA 1, JOANNA SKULIMOWSKA 1, JERZY WINDYGA 2, JERZY KOŚCIELAK 1 Inwersja intronu 1 genu czynnika VIII u pacjentów chorych na ciężką hemofilię A Inversion of intron 1 of Factor VIII gene in patients with severe hemophilia A 1 Z Zakładu Biochemii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie Kierownik: doc. dr hab. Ewa Zdebska 2 Z Zakładu Hemostazy i Zakrzepie Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie Kierownik: dr n. med. Jerzy W. Indyga SŁOWA KLUCZOWE: Hemofilia A - Czynnik VIII - Inwersja intronu 1 - Inwersja intronu 22 KEY WORDS: Hemophilia A Factor VIII Intron 1 inversion Intron 22 inversion STRESZCZENIE: Zbadano 56 pacjentów z ciężką postacią hemofilii A na obecność inwersji intronu 1 genu czynnika VIII przy użyciu metody multipleks PCR. Poprzednio wykazano, że pacjenci ci nie mieli inwersji intronu 22. Inwersję intronu 1 wykryto tylko u jednego pacjenta. Uwzględniając wszystkich pacjentów zbadanych na obecność inwersji w intronie 1 i 22 genu czynnika VIII częstość występowania inwersji intronu 1 wynosi 0,9%. SUMMARY: 56 patients with severe hemophilia A were screened for inversion of intron 1 of Factor VIII gene, employing multiplex PCR. Previously, all of these patients were found negative for inversions of intron 22. Only one patient with inversion of intron 1 was found. Taking into account all patients with severe hemophilia A who were examined for inversions of intron 1 and 22, the prevalence of inversion of intron 1 of Factor VIII gene in our sample of hemophiliacs amounts to 0,9%. WSTĘP Czynnik VIII czyli globulina antyhemofilowa, jest kodowana przez duży gen o długości 186 kb składający się z 26 eksonów poprzedzielanych intronami. W intronach 1 i 22 znajdują się dodatkowe sekwencje nukleotydowe, których kopie znajdują się również poza genem czynnika VIII od strony telomeru. W przypadku intronu 22 jest to dodatkowy gen oznaczony jako F8A, a w intronie 1 jest to sekwencja o długości ok. 1041 nukleotydów oznaczana jako intl h-1. Na zewnątrz [61]
62 J. SAWECKA, J. SKULIMOWSKA, J. WINDYGA, J. KOŚCIELAK genu znajdują się na ogół dwie kopie genu F8A (proksymalna i dystalna) w odległości ok. 400 i 500 kb oraz jedna kopia sekwencji homologicznej do sekwencji intl h-1 w odległości ok. 140 kb od 5' końca genu. Zewnątrzgenowa kopia sekwencji intl h-1 różni się od wewnątrzgenowej jednym nukleotydem i jest oznaczana jako intl h-2. Przeciwna orientacja kopii wewnątrz i zewnątrzgenowych umożliwia zajście pomiędzy nimi homologicznej rekombinacji, co prowadzi do przerwania ciągłości genu czynnika VIII i jest przyczyną ciężkiej hemofilii A. W reakcji tej powstają dwa różne chimeryczne mrna (1). Inwersje intronu 22 po raz pierwszy opisane w 1993 r. stanowią najczęściej występującą przyczynę zachorowań na ciężką hemofilię A (2). Stąd też inwersje te są badane w diagnostyce hemofilii w pierwszej kolejności. W Polsce wdrożyliśmy metodę oznaczania inwersji intronu 22 w roku 2000 (3). Określiliśmy też częstość występowania tej mutacji w populacji polskiej na materiale 113 chorych. U 57 z nich choroba była spowodowana inwersją intronu 22, w tym u 47 chorych zidentyfikowano inwersję typu 1 [dystalna], u 10 typu 2 [proksymalna] (4). W roku 1996 Brinke i wsp. wykryli drugą dużą rearanżację zachodzącą w obrębie genu czynnika VIII, tym razem w intronie 1. Mutacja ta również powoduje ciężką postać hemofilii A (1). Celem prezentowanej pracy było wdrożenie metody oznaczania inwersji intronu 1 genu czynnika VIII i otrzymanie wstępnych danych na temat występowania tej mutacji u pacjentów z hemofilią A w Polsce. MATERIAŁ I METODY Materiał od chorych (krew) pochodził z Zakładu Hemostazy i Zakrzepie Instytutu Hematologii i Transfuzjologii. Genomowy DNA izolowano standardowymi metodami z zastosowaniem 6M NaCL do odbiałczania preparatów DNA. Reakcję PCR wykonywano metodą Bagnalla i wsp. (5). Jako starterow do powielania fragmentów DNA użyto syntetycznych nukleotydów umożliwiających namnożenie fragmentów obejmujących wewnątrz i zewnątrzgenowa sekwencję DNA występującą w intronie 1 (odpowiednio intl h-1 i intl h-2). Przeprowadzano dwie reakcje amplifikacji DNA stosując po trzy startery w każdej z nich. Do detekcji inwersji intronu 1 używano czterech starterow o następującej sekwencji nukleotydowej: dla int. lh-1: (9F) 5'- GTTGTTGGGAAT- GGTTACGG, (9cR) 5'- CTAGCTTGAGCTCCCTGTGG, int lh-2(f) 5'- GGCAG- GGATCTTGTTGGTAAA; dla int.lh-2: int lh-2(r) 5'- TGGGTGATATAAGCTG- CTGAGCTA oraz (9F) i int lh-2(f). Namnożone w reakcji PCR DNA analizowano elektroforetycznie. Rozdział elektroforetyczny prowadzono w temperaturze pokojowej w 6% żelu poliakryloamidowym przy stałym natężeniu 25 ma przez ok. 60 min. Żele barwiono metodą srebrową. Z wielkości uzyskanych fragmentów DNA wnioskowano o wystąpieniu inwersji intronu 1 u chorych.
WYNIKI Inwersja intronu 1 genu czynnika VIII u pacjentów chorych na ciężką hemofilię A 63 Ogółem zbadano 56 pacjentów. U jednego pacjenta stwierdzono obecność mutacji inwersyjnej w intronie 1 (Ryc. 1, ścieżka 2,4). U pozostałych pacjentów (Ryc. 1, ścieżka 1, 3) choroba była spowodowana innym rodzajem mutacji. Ryc. 1. Elektroferogram produktów PCR pacjentów z inwersją i bez inwersji intronu 1 genu czynnika VIII. 0 drabina DNA; 1 i 3 pacjent bez inwersji intronu 1; 2 i 4 pacjent z inwersją intronu 1; 1 i 2 intl h-1; 3 i 4 intl h-2 Fig. 1. Electrophoretogram of PCR products of inverted and non inverted intron 1 of Factor VIII gene. 0 DNA ladder; 1 and 3 patient with non inverted intron 1; 2 and 4 with inverted intron 1; 1 and 2 intl h-1; 3 and 4 intl h-2 DYSKUSJA Do wykrywania mutacji w hemofilii A wdrożono metodę oznaczania inwersji intronu 1 genu czynnika VIII. Jest to druga co do częstości mutacja powodująca ciężką postać hemofilii A po inwersji intronu 22. Według literatury inwersje intronu 22 występują w około połowie przypadków ciężkiej postaci hemofilii A (2). Inwersja intronu pierwszego występuje znacznie rzadziej od inwersji intronu 22. Pierwsze badania z Wielkiej Brytanii prowadzone przez Bagnalla i wsp. wskazywały, że inwersja intronu 1 stanowi przyczynę choroby u ok. 5% pacjentów z ciężką postacią
64 J. SAWECKA, J. SKULIMOWSKA, J. WINDYGA, J. KOŚCIELAK hemofilii A (5). Podobne rezultaty uzyskano w badaniach populacji hiszpańskiej (6), włoskiej (7), nieco niższe w czeskiej 4,3% (8) i hinduskiej 3,75% (9). Jednak późniejsze badania przeprowadzone na większej liczbie pacjentów wskazywały, że w Wielkiej Brytanii i we Włoszech częstość występowania inwersji intronu 1 jest niższa i wynosi ok. 1,8 1,7% (10, 11), a w Indiach jeszcze niższa 1,24% (12). Częstość występowania inwersji intronu 1 w Iranie wynosiła 2% (13). W niniejszej pracy zbadaliśmy inwersję intronu 1 u 56 pacjentów z ciężką hemofilią A, u których nie stwierdziliśmy obecności inwersji intronu 22 (4). Obecność mutacji inwersyjnej intronu 1 wykazano tylko u jednego pacjenta. Uwzględniając wszystkich przebadanych chorych, w tym również pacjentów z inwersją intronu 22 (4) prewalencja inwersji intronu 1 wynosi więc 0,9%. Podobne wyniki uzyskano w Argentynie. Na 64 przebadanych pacjentów jeden miał inwersję intronu 1 (14). U 43 pacjentów na Węgrzech nie stwierdzono obecności mutacji inwersyjnej intronu 1 (15). Wprowadzenie oznaczania inwersji intronu 1 będzie miało znaczenie praktyczne w diagnostyce hemofilii A (w tym w diagnostyce prenatalnej), gdyż pozwoli uniknąć długotrwałych badań rodzinnych opartych na analizie sprzężeń genetycznych oraz konieczności sekwencjonowania całego genu czynnika VIII. Większe znaczenie praktyczne ma oznaczenie inwersji w intronie 22, która w Polsce występuje u 50% pacjentów z ciężką postacią hemofilii A (4). PIŚMIENNICTWO 1. Brinke A, Tagliavacca L, Naylor J, Green P, Giangrandę P, Gianelli F. Two chimaeric transcription units result from an inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene and a region reportedly affected by reciprocal translocations in T-cell leukaemia. Hum Mol Genet 1996; 5: 1945 1951. 2. Naylor JA, Brinke A, Hassock S, Green PM, Gianelli F. Characteristic mrna abnormality found in the half the patients with severe hemophilia A is due to large DNA inversions. Hum Molec Genet 1993; 2: 1773 1778. 3. Sawecka J, Skulimowska J, Kościelak J. Mutacje inwersyjne u pacjentów chorych na ciężką hemofilię A. Acta Haematol Poi 2000; 31: 47 50. 4. Sawecka J, Skulimowska J, Windyga J, Łopaciuk S, Kościelak J. Prevalence of the intron 22 inversion of the factor VIII gene and inhibitor development in Polish patients with severe hemophilia A. Arch Immunol Ther Exp 2005; 53: 352 356. 5. Bagnall RD, Waseem N, Green PM, Gianelli F. Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a freąuent cause of severe hemophilia A. Blood 2002; 99: 168 174. 6. Tizzano EF, Cornet M, Baiget M. Inversion of intron 1 of the factor VIII gene for direct molecular diagnosis of hemophilia A. Haematologica 2003; 88: 118 120. 7. Riccardi F, Tagliaferri A, Manotti C, Pattacini C, Neri TM. Intron 1 Factor VIII gene inversion in a population of Italian hemophilia A patients. Blood 2002; 100: 3432. 8. Habart D, Kalabova D, Hrachovinova I, Vorlova Z. Significant prevalence of the intron 1 factor VIII gene inversion among patients with severe hemophilia A in the Czech Republic. J Thromb Haemost 2003; 1: 1323 1324. 9. Ahmed R, Kannan M, Choudry VP, Saxena R. Mutation reports: intron 1 and 22 inversions in Indian haemophilics. Ann Hematol 2003; 82: 546 547. 10. Cumming AM. The factor VIII gene intron 1 inversion mutation: prevalence in severe hemophilia A patients in the UK. J Thromb Haemost 2004; 2: 205 206.
Inwersja intronu 1 genu czynnika VIII u pacjentów chorych na ciężką hemofilię A 65 11. Salviato R, Belvini D, Radossi P, Tagariello G. Factor VIII gene intron 1 inversion: lover than expected prevalence in Italian haemophiliac severe patients. Haemophilia 2004; 10: 194 196. 12. Shetty S, Ghosh K, Mohanty D. Major disorganization of factor VIII gene as a cause of severe haemophilia A in Indian patients. Am J Hematol 2004; 76: 96. 13. Lari GR, Enayat MS, Arjang Z, Lavergne JM, Ala F. Identification of intron 1 and 22 inversion mutations in the factor VIII gene of 124 Iranian families with severe haemophilia A. Haemophilia 2004; 10: 410 411. 14. Rossetti LC, Candela M, Bianco RP, de Tezanos Pinto M, Western A, Goodeve A, Larripa IB, De Brasi CD. Analysis of factor VIII gene intron 1 inversion in Argentinian families with severe haemophilia A and a review of the literaturę. Blood Coagulation Fibrynolysis 2004; 15: 569 572. 15. Andrikovics H, Klein I, Bors A, Nemes L, Marosi A, Varadi A. Tordai A. Analysis of large structural changes of factor VIII gene, involving intron 1 and 22, in severe hemophilia A. Haematologica 2003; 88: 778 784. Praca wpłynęła do Redakcji 31.01.2006 r. i została zakwalifikowana do druku 8.03.2006 r. Adres Autorów: Dr Jadwiga Sawecka Zakład Biochemii Instytut Hematologii i Transfuzjologii ul. Chocimska 5 00-957 Warszawa