QUANTA Lite h-ttg IgA ELISA 708760 (ludzka transglutaminaza tkankowa) Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM ttg IgA to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał IgA przeciwko transglutaminazie tkankowej (endomysium) w surowicy człowieka. Wykrywanie tych przeciwciał stanowi pomoc w diagnozowaniu określonych enteropatii związanych z nadwrażliwością na gluten, takich jak celiakia i opryszczkowe zapalenie skóry. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Celiakia i opryszczkowe zapalenie skóry, dwie rozpoznane formy enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten (GSE) charakteryzują się przewlekłym zapaleniem błony śluzowej przewodu pokarmowego oraz spłaszczeniem nabłonka lub pozytywną atrofią mikrokosmków. 1,2 Nadwrażliwość na gluten spowodowana jest nietolerancją glutenu - białka występującego w pszenicy, ryżu i jęczmieniu. Pacjenci z celiakią mogą cierpieć na biegunkę, dolegliwości układu pokarmowego, niedokrwistość, zmęczenie, problemy psychiczne oraz mogą u nich występować inne skutki uboczne lub mogą nie wykazywać żadnych objawów. 2 Opryszczkowe zapalenie skóry jest chorobą skóry związaną z GSE. Wszyscy pacjenci GSE mają podwyższony poziom ryzyka zachorowania na chłoniaka. 3 Dieta bezglutenowa kontroluje GSE i związane z nią ryzyko. Odkrycie w latach 50 ubiegłego wieku faktu, że gluten wywołuje celiakię umożliwiło leczenie, dzięki zastosowaniu w przypadku pacjentów diety bezglutenowej. Po opracowaniu metody polegającej na wykonywaniu biopsji jelita przez jamę ustną, lekarze byli w stanie określić, czy u pacjenta występuje atrofia mikrokosmków. Atrofia mikrokosmków z pozytywnymi wynikami testów serologicznych może występować w przypadku innych chorób, jednak GSE można wykazać na podstawie pierwotnych kryteriów Europejskiego Towarzystwa Gastroenterologii Pediatrycznej i Żywienia (ESPGAN). Te kryteria wymagają około roku żmudnych badań z: a) pierwszą biopsją jelit dającą wynik pozytywny, b) 6 miesiącami na diecie bezglutenowej, c) drugą biopsją jelit z wynikiem negatywnym, d) 6-miesięcznym testem prowokacji glutenem e) trzecią biopsją jelit z wynikiem pozytywnym. Opracowanie testów surowicy dla trzech różnych przeciwciał izotypu IgA 3 umożliwiło przygotowanie szybszych, poprawionych kryteriów ESPGAN dotyczących celiakii, zgodnie z opracowaniem z 1990 r. 2 Te testy obejmują testy na obecność przeciwciał IgA przeciw endomysium (EMA), 4 przeciwciała IgA przeciwko gliadynie (AGA) i przeciwciał IgA przeciwko retikulinie R1 (ARA). Zmodyfikowane kryteria ESPGAN wymagają: a) pojedynczej biopsji jelita z wynikiem pozytywnym oraz b) wykazania przynajmniej dwóch z trzech przeciwciał klasy IgA wymienionych powyżej. Od tamtego czasu wiele badań wykazało, że testy IgA EMA mają swoistość na poziomie powyżej 99% dla GSE oraz wyższą czułość niż badania ARA lub AGA. 5-13 W związku z tym, że przeciwciała IgA EMA znikają, gdy pacjenci z celiakią lub opryszczkowym zapaleniem skóry stosują się do diety bezglutenowej, testy na te przeciwciała również pomagają w sprawdzaniu przestrzegania diety przez pacjentów. 4,5,12 Ostatnio zidentyfikowano, że antygenem endomysialnym jest enzym sieciujący białka, znany pod nazwą transglutaminazy tkankowej (ttg). 14,15 Swoiste dla antygenów procedury ELISA z zastosowaniem ttg stanowią rzetelną i obiektywną metodę stanowiącą alternatywę dla tradycyjnych immunofluorescencyjnych badań z użyciem jako podłoża cienkich skrawków przełyku naczelnych. 14-19 Badanie ELISA może być przystosowane do dużych jak i małych ilości próbek od pacjentów. W ciągu ostatnich dwóch lat przy użyciu techniki rekombinacji wytworzono antygen ludzkiego ttg. Rekombinowany antygen ludzki może mieć pewne zalety w porównaniu do bardziej tradycyjnego antygenu wątroby świnki morskiej. 16,17,20 Dwiema kolejnymi innowacjami w zakresie serologii celiakii jest użycie natywnej ludzkiej transglutaminazy tkankowej wyizolowanej z krwinek czerwonych oraz użycie testów umożliwiających wykrywanie przeciwciał klasy IgG przeciwko transglutaminazie tkankowej. Użycie ttg natywnych ludzkich krwinek czerwonych zamiast antygenu świnki morskiej lub rekombinowanego antygenu ludzkiego zapewnia korzyści związane z ułatwieniem oczyszczania oraz umożliwia uzyskanie preparatów pozbawionych białek bakteryjnych, owadzich i innych zanieczyszczających białek. 21, 22, 23, 24 Testy ELISA z zastosowaniem ludzkiego antygenu ttg, które są przedstawiane w literaturze, cieszą się dobrą opinią w porównaniu z bardziej tradycyjnymi 16, 17, 20-23 testami bazującymi na antygenie świnki morskiej. Zestaw do wykrywania przeciwciał klasy IgG przeciw gliadynie jest już używany od jakiegoś czasu, przede wszystkim w celu zapewnienia pomocy w badaniu osób z niedoborem IgA. Liczne przeprowadzone badania wykazały przydatność kliniczną wykrywania przeciwciał klasy IgG przeciwko ttg. 17,20,21 W jednym badaniu czułość testu wzrosła z 91,5% dla jednego przeciwciała IgA do 98,5% gdy rozważano wyniki uzyskane dla obu przeciwciał IgA i IgG. 17 1
Zasada badania Antygen natywnej ludzkiej transglutaminazy tkankowej (h-ttg) izolowany ze świeżo pobranych erytrocytów wiąże się z dołkami płytki polistyrenowej w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego naturalnym stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał IgA przeciwko h-ttg z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgA. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgA znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgA znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem h-ttg (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał IgA przeciwko h-ttg, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola testu h-ttg IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej IgA przeciwko h-ttg, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Silnie pozytywna kontrola testu h-ttg IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej IgA przeciwko h-ttg, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgA, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgA, 1 fiolka zabarwienie żółte, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego powodu słabo pozytywna kontrola testu h-ttg IgA ELISA, wysoko pozytywna kontrola h-ttg IgA ELISA i kontrola negatywna testu ELISA powinny być użytkowane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny. 25 3. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 2
4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami testu h-ttg IgA ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgA HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgA 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, 200 300 i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3
3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA i kontroli negatywnej testu ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku przeciwciał IgA przeciwko ttg, z zastosowaniem jednostek umownych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli h-ttg IgA ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA oraz kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać 200 300 µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgA HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie 2. 5. Etap płukania: Powtórzyć etap 3. 6. Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Z każdą serią próbek należy przebadać słabo pozytywną kontrolę testu h-ttg IgA ELISA, silnie pozytywną kontrolę testu h-ttg IgA ELISA i kontrolę negatywną testu ELISA, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury są prawidłowe. 2. Uwaga: w związku z tym, że słabo pozytywna kontrola testu h-ttg IgA ELISA, silnie pozytywna kontrola testu h-ttg IgA ELISA i kontrola negatywna ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie mają one zastosowania w metodach badań związanych z rozcieńczeniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA, która musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA. b. Wstępnie rozcieńczona silnie pozytywna kontrola testu h-ttg IgA ELISA musi mieć absorbancję wyższą niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej nie może przekraczać 0,2. c. Absorbancja słabo pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA musi być przynajmniej dwukrotnie wyższa od absorbancji kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA oraz silnie pozytywna kontrola testu h-ttg IgA ELISA mają monitorować występowanie poważnych nieprawidłowości związanych z odczynnikami. Silnie pozytywna kontrola testu h-ttg IgA ELISA nie zapewni precyzji na poziomie wartości granicznej testu. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie NCCLS C24-A. 4
Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność dla każdej próbki można następnie obliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA. Wynik jest mnożony przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA występującej na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x Słabo pozytywna kontrola testu h-ttg IgA ELISA (jednostki) gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu h-ttg IgA ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny <20 Słabo pozytywna 20 30 Od średnio do silnie pozytywnego >30 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał IgA przeciwko h-ttg i sugeruje możliwość występowania pewnych enteropatii związanych z nadwrażliwością na gluten, takich jak celiakia i opryszczkowe zapalenie skóry. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgA przeciwko h-ttg, lub że ich poziom jest poniżej wartości granicznej badania. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki zostały uzyskane przy użyciu zestawu INOVA QUANTA Lite h-ttg IgA ELISA. Wartości IgA przeciwko h-ttg uzyskane przy użyciu analiz innych producentów nie mogą być używane zamiennie. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgA nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Wynik negatywny przeciwciał IgA przeciwko h-ttg u nieleczonego pacjenta nie wyklucza całkowicie enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten. Ten wynik można często wyjaśnić występującym względnie często w celiakii selektywnym niedoborem IgA. Firma INOVA oferuje zestaw h-ttg IgG do badania takich pacjentów (QUANTA Lite h-ttg IgG). 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność testu QUANTA Lite h-ttg IgA ELISA do wykrywania przeciwciał IgA przeciwko ludzkiej transglutaminazie tkankowej został oceniony poprzez porównanie z innym testem wykrywającym przeciwciała IgA przeciwko ttg, jak również przez porównanie wyników z rzeczywistą diagnozą kliniczną w ramach dwóch zewnętrznych badań klinicznych i jednego badania wewnętrznego. Normalny zakres To badanie obejmujące zakres normalny przeprowadzono w laboratorium badawczym firmy INOVA Diagnostics. Przebadano łącznie 185 próbek. Przebadano łącznie 102 próbki pochodzące od mężczyzn. Wiek dawców mieścił się w zakresie od 6 do 60 lat, ze średnią wieku wynoszącą 34 lata. Przebadano łącznie 83 próbek pochodzących od kobiet w wieku od 7 do 63 lat ze średnią wieku wynoszącą 31 lat. Gdy 185 wspomnianych próbek badano przy zastosowaniu zestawu QUANTA Lite h-ttg IgA jedynie jedna próbka (0,5%) dała wynik pozytywny. Wynik tej jednej próbki (20 jednostek) mieścił się tuż nad wartością graniczną. Poza tą jedną słabo pozytywną próbką, kolejna próbka o największej reaktywności dała wynik 11,5 jednostek a większość wartości była jednocyfrowa. Średnia wartość we wspomnianej grupie próbek pochodzących od osób zdrowych wynosiła 4,4 jednostki. 5
Swoistość i wrażliwość względna W celu określenia czułości i swoistości testu przebadano ogółem 257 próbek z zastosowaniem zarówno testu QUANTA Lite h-ttg IgA jak i innego, dostępnego na rynku testu do wykrywania przeciwciał przeciwko ttg. Poniżej zostały przedstawione wyniki: h-ttg + - + 51 4* Wrażliwość względna 92,7% świnka morska Swoistość względna 91,6% wątrobowa ttg - 17** 185 Skuteczność względna 91,8% * w 2 z nich nie wykazano przeciwciał IgA przeciwko endomysium i gliadynie. ** Większość z tych pacjentów miało zdiagnozowaną celiakię lub występowało u nich podejrzenie tej choroby, a w poprzednich testach ich wyniki serologiczne były słabe lub negatywne. Swoistość i wrażliwość kliniczna Zestaw do oznaczania przeciwciał IgA QUANTA Lite h-ttg został przebadany w ramach jednego zewnętrznego i jednego wewnętrznego badania klinicznego. Poniższa tabela podsumowuje wyniki obu zewnętrznych i wewnętrznych badań klinicznych. Grupa pacjentów Nr Liczba pozytywnych (%) Normalne 185 1* (0,5) Próbka od pacjenta z celiakią 24 24 (100) Próbka od pacjenta z celiakią (dziecko) 11 10 (91) Próbka od cierpiącego na celiakię pacjenta z niedoborem przeciwciał IgA 16 0 Wrzodziejące zapalenie okrężnicy 14 0 Choroba Leśniowskiego-Crohna 6 1** (17) Niedokrwistość złośliwa 6 0 Przewlekłe aktywne zapalenie wątroby 9 0 Próbka od pacjentów cierpiących na mieszaną chorobę tkanki łącznej z autoprzeciwciałami 55 0 * Ta 1 próbka dała wynik słabo pozytywny, który wynosił 20 jednostek. ** Ta 1 próbka dała wynik słabo pozytywny (23 jednostki). Taki sam słabo pozytywny wynik (22 jednostki) dała przy zastosowaniu zestawu QUANTA Lite ttg z wykorzystaniem antygenu wątrobowego świnki morskiej. Reaktywność krzyżowa W celu dokonania dalszej oceny swoistości zestawu QUANTA Lite h-ttg IgA przebadano próbki pochodzące ogółem 90 pacjentów z problemami ze strony przewodu pokarmowego jak również od pacjentów o wysokich mianach autoprzeciwciał powiązanych z chorobami tkanki łącznej. Ogółem przebadano 14 próbek surowic pochodzących od pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy, 6 od pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna, 6 od pacjentów z niedokrwistością złośliwą oraz 9 od pacjentów z aktywnym zapaleniem wątroby. Przebadano również grupę surowic pochodzącą z kolekcji surowic wykorzystywanych do wytwarzania innych zestawów ELISA do oznaczania autoprzeciwciał firmy INOVA. Przebadano ogółem 55 surowic, w tym 8 SS-A-pozytywnych, 6 SS-B-pozytywnych, 9 Smpozytywnych, 11 RNP-pozytywnych, 13 Scl-70-pozytywnych i 8 Jo-1-pozytywnych. Spośród tych 90 próbek tylko jedna, pochodząca od pacjenta z chorobą Leśniewskiego-Crohna, dała wynik pozytywny. W przypadku tego pacjenta uzyskano jedynie wynik słabo pozytywny (23 jednostki) pod względem przeciwciał IgA przeciwko h-ttg. Próbka ta, badana z zastosowaniem zestawu ttg wykorzystującym materiał pochodzący od świnki morskiej, dała również wynik pozytywny (22 jednostki). Z wyjątkiem tej jednej próbki dającej wynik słabo pozytywny, żadna z próbek nie dała wyniku powyżej 8 jednostek. Precyzja i powtarzalność Precyzja i powtarzalność badania zostały przebadane przez przeprowadzenie sześciu powtórzeń każdej silnie pozytywnej, słabo pozytywnej i negatywnej próbki w sześciu oddzielnych badaniach. Średnia reakcyjność wyników silnie pozytywnych wyniosła 132,6, słabo pozytywnych wyniosła 25,0, a średnia wartość negatywnych wyników wyniosła 13,4 jednostki. Poniżej znajduje się podsumowanie odchylenia standardowego oraz współczynnika zmienności dla każdej próbki. Negatywny Silnie pozytywna Słabo pozytywna SD CV SD CV SD CV Łącznie 1,05 7,8% 3,76 2,8% 0,66 2,6% W ramach serii 0,65 4,8% 3,01 2,3% 0,69 2,8% Pomiędzy seriami 0,78 5,8% 3,21 2,4% 0,44 1,8% 6
Piśmiennictwo 1. Meuweisse GW. Diagnostic criteria in celiac disease. Acta Paediatr Scand 59: 461, 1970. 2. Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J, Shmerling DH, Visakorpi JK. Revised criteria for diagnosis of celiac disease: Report of working group of Euorpean Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood 65: 909-911, 1990. 3. Chorzelski TP, Beutner EH, Zalewski TK, et al. editors. Serologic diagnosis of celiac disease. Boca Raton (FL): CRC Press; 1990. 4. Chorzelski TP, Sulej J, Tcherzewska H, et al. IgA class endomysium antibodies in dermatitis herpetiformis and celiac disease. Ann NY Acad Sci 420: 325-334, 1983. 5. Volta U, Molinar N, De Franchis R, et al. Correlation between IgA antiendomysial antibodies and subtotal villous atrophy in dermatitis herpetiformis. J Clin Gastroenterol 14: 298-301, 1992. 6. Valdimarsson T, Franzen L, Grodzinsky E, Skogh T, Strom M. Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science 41: 83-87, 1996. 7. Unsworth FJ. Serologic diagnosis of gluten sensitive enteropathy. J Clin Path 49: 704-711, 1996. 8. Volta U, Molinaro M, Fusconi M, Cassani F, Bianchi FB. IgA antiendomysial antibody test: A step forward in celiac disease screening. Digestive Diseases and Science 36: 752-756, 1991. 9. Wilfang S, Knauss M, Stern M. IgA endomysiumantikorper. Montsschr Kinderkeilkd 140: 639-645, 1992. 10. Muscart-Lemone F, Van den Broek J, Cadranel S, Colombel JF. Serologic aspects of celiac disease. Acta Gastro-Enterologica Belgica 55: 200-208, 1992. 11. Grodzinsky E, Hed J, Skogh T. IgA antiendomysium antibodies have a high predictive value for celiac disease in asymptomatic patients. Allergy 49: 593-597, 1994. 12. Sategna-Guidetti C, Pulitano R, Grosso S, Ferfoglia G. Serum IgA antiendomysium antibody titers as a marker of intestinal involvement and diet compliance in adult celiac sprue. J Clin Gastroenterol 17: 123-127, 1993. 13. Catassi C. Screening of coeliac disease. In: Maki M, Collin P, Visakorpi JK. editors. Coeliac disease. Tampere (Finland): Coeliac Disease Study Group; p. 23-33, 1997. 14. Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: 797-801, 1997. 15. Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al. Autoantibodies in coeliac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: 851-852, 1997. 16. Sardy M, et al. Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of gluten-sensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, 1999. 17. Sblattero D, et al. Human recombinant tissue transglutaminase ELISA : an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, 2000. 18. Beutner EH, et al. A case of dermatitis herpetiformis with IgA endomysial antibodies but negative direct immunofluorescent findings. J Am Acad Dermatol 43: 329, 2000. 19. Sugai E, et al. Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Am J Gastro 95: 2318-2322, 2000. 20. Lampasona V, et al. Tissue transglutaminase and combined screening for coeliac disease and type 1 diabetesassociated autoantibodies. Lancet 352:1192-1193, 1998. 21. Hansson T, et al. Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, 2000. 22. Andersson AS, et al. Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, 2000. 23. Axiö-Frekricksson UB, et al. Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, 2000. 24. Signorini M, et al. Human erythriocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization. Biological Chemistry 369: 275, 1988. 25. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone 7
Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (krajowa) 877-829-4745 Pomoc techniczna (międzynarodowa) 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Niemcy Tel.: +49-6894-581020 Faks.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628760POL Czerwiec 2011 Wersja 0 8