ROLA SYGNALIZACJI MIĘDZYKOMÓRKOWEJ W ODPOWIEDZI NA PROMIENIOWANIE ULTRAFIOLETOWE

Politechnika Śląska Wydział Automatyki, Elektroniki i Informatyki Aleksandra Krzywoń Autoreferat rozprawy doktorskiej: ROLA SYGNALIZACJI MIĘDZYKOMÓRKOWEJ W ODPOWIEDZI NA PROMIENIOWANIE ULTRAFIOLETOWE Promotor Dr hab. inż. Krzysztof Fujarewicz, Prof. Pol. Śl. Promotor pomocniczy Dr Magdalena Skonieczna Gliwice, 2015

1. Wprowadzenie Promieniowanie ultrafioletowe, którego głównym źródłem na Ziemi jest Słońce, oprócz dobroczynnego wpływu na zdrowie człowieka wywołuje działanie szkodliwe, prowadząc do indukcji nowotworów skóry takich jak rak podstawnokomórkowy i płaskonabłonkowy czy czerniak złośliwy. Ryzyko zachorowania na czerniaka wzrasta wraz ze wzrostem ekspozycji na promieniowanie UV ze sztucznych źródeł do opalania w solarium oraz wystawieniem skóry o jasnej karnacji na działanie promieni słonecznych [1,2,3]. Ponadto obserwuje się wzrost zachorowań na czerniaka w obszarach, gdzie warstwa ozonowa Ziemi uległa destrukcji (szczególnie obszary nad Australią), w wyniku czego może docierać do Ziemi promieniowanie UVC, które działa silnie mutagennie na DNA, RNA i białka [4,5,6]. Promieniowanie UV dzielimy na trzy główne zakresy: UVA (320-400 nm), UVB (295-320 nm) i UVC (100-295 nm). Wszystkie trzy pasma promieniowania UV różnią się miedzy sobą efektem biologicznego działania oraz właściwościami fizycznymi [7,8]. Promieniowanie UVA dociera w ok. 90-95% do powierzchni Ziemi, UVB w ok. 5%, a promieniowanie UVC jest zatrzymywane przez warstwę ozonową [9, 10]. Pod wpływem promieniowania UVB i UVC tworzą się dimery pirymidyn dimery tymidynowe lub tyminy z cytozyną i 6,4-fotoprodukty, a promieniowanie UVA działa głównie poprzez wywoływanie stresu oksydacyjnego w komórkach [11,12]. Promieniowanie UV, które jest znanym czynnikiem etiologicznym nowotworów skóry indukuje w komórkach różne uszkodzenia materiału genetycznego (mutacje, zmiany struktury nukleotydów oraz ich oksydacyjne uszkodzenia) [13,14]. Dlatego wydaje się ważnym badanie wpływu promieniowania UV na komórki skóry człowieka z uwzględnieniem efektu sąsiedztwa, który pojawia się w komórkach, które nie były bezpośrednio napromieniowane lecz otrzymały sygnały (głównie uszkadzające) wysyłane przez komórki napromieniowane. Efekt sąsiedztwa jest dobrze poznany w przypadku promieniowania jonizującego, jednakże wiedza na temat efektu sąsiedztwa w przypadku promieniowania UV jest bardzo niewielka zarówno na poziomie komórkowych jak i molekularnym a w obrębie tkanek i całego organizmu jest zupełnie niezbadany [4].

2. Cel rozprawy doktorskiej i hipoteza badawcza Głównym celem rozprawy doktorskiej było zbadanie na ludzkich komórkach skóry prawidłowych (NHDF- fibroblasty) i nowotworowych (Me45- czerniak) czy występuje efekt sąsiedztwa w tych komórkach, czy jest on zależny od pasma promieniowania UV (UVA, UVB i UVC), oraz czy ma charakter destrukcyjny czy protekcyjny. W oparciu o badania Dr hab. Marii Wideł, Prof. Pol. Śl. dotyczących efektu sąsiedztwa po ekspozycji na promieniowanie jonizujące [15] przypuszczano, że normalne fibroblasty mogą wywierać efekt ochronny wobec napromieniowanych komórek czerniaka także przez UV. W konsekwencji może on promować przeżycie uszkodzonych/zmutowanych komórek skóry. Hipoteza badawcza zakłada istnienie wzajemnej sygnalizacji pomiędzy komórkami napromieniowanymi promieniowaniem UV i sąsiadującymi z nimi komórkami nienapromieniowanymi, konsekwencją czego jest ochrona komórek napromieniowanych przez komórki nienapromieniowane określana mianem odwrotnego efektu sąsiedztwa. W celu zweryfikowania powyższej hipotezy badawczej wykonywano badania na komórkach (Me45- czerniak, NHDF- fibroblasty) w systemie koinkubacji w różnych kombinacjach komórek napromienianych trzema pasmami: UVA, UVB i UVC z komórkami nienapromienianymi. Taki układ pozwala na regulowane w czasie dłuższe lub krótsze sąsiedztwo komórek i w pewnym stopniu odpowiada sytuacji w tkance, w której różne typy komórek koegzystują obok siebie. Stworzono także model matematyczny, którego głównym celem było wykrycie efektu sąsiedztwa poprzez odróżnienie wzajemnego oddziaływania procesów życiowych dwóch populacji komórkowych rosnących we wspólnym środowisku od właściwego efektu sąsiedztwa wywołanego promieniowaniem UV. 3. Metody i techniki badawcze W badaniach efektu sąsiedztwa wykorzystywano system koinkubacji komórek napromienionych z nienapromienionymi (dołki z insertami). System ten polega na koinkubacji komórek przeznaczonych do napromienienia w studzienkach 6- dołkowych płytek z komórkami nienapromienianymi rosnącymi w odpowiednich wkładkach- insertach zawieszonych w studzienkach. Dno insertu stanowi transparentna błona o wielkości porów 0,4 µm, która umożliwia dyfuzję składników medium hodowlanego i cząsteczek sygnałowych, ale

nie pozwala na bezpośredni kontakt komórek napromieniowanych z nienapromieniowanymi (Rysunek 1). Rysunek 1. Schemat pokazujący sposób badania efektu sąsiedztwa w układzie koinkubacji komórek napromieniowanych z nienapromieniowanymi W badaniach efektu sąsiedztwa wykorzystano cztery układy eksperymentalne, w których napromieniowane fibroblasty koinkubowano z nienapromieniowanymi fibroblastami (NHDF vs NHDF); napromieniowane komórki czerniaka koinkubowano z nienapromieniowanymi komórkami czerniaka (Me45 vs Me45) lub z fibroblastami (Me45 vs NHDF), oraz napromieniowane komórki czerniaka inkubowano samodzielnie (Me45). Do oceny uszkodzeń powstałych przez promieniowanie ultrafioletowe, jak i indukowanych w komórkach bystander przeprowadzono badania na poziomie komórkowym (analiza aktywności proliferacyjnej, indukcję apoptozy i nekrozy, przedwczesne starzenie komórek tzw. senescencję), badania stresu oksydacyjnego (reaktywne formy tlenu i azotu, potencjał błony mitochondrialnej), oraz testy na poziomie molekularnym (w celu poszukiwania cząsteczek sygnałowych efektu sąsiedztwa cytokin prozapalnych -interleukiny 6 i 8).

4. Omówienie wybranych wyników Wszystkie trzy pasma promieniowania UV wywołują zmiany w nieeksponowanych fibroblastach (NHDF) i komórkach czerniaka (Me45) będących w sąsiedztwie komórek napromieniowanych poprzez obniżenie przeżycia oraz wzrostu apoptozy i nekrozy, jednakże z różna efektywnością, która zależy od typu koinkubowanych komórek i pasma promieniowania UV. Najsilniejszy efekt sąsiedztwa zaobserwowano pod wpływem promieniowania UVB w nienapromieniowanych komórkach czerniaka (25% komórek apoptotycznych i nekrotycznych) koinkubowanych z napromieniowanymi komórkami tej samej linii (Rysunek 2). Najsłabszy w przypadku koinkubacji napromieniowanych promieniowaniem UVA komórek czerniaka z nienapromieniowanymi fibroblastami (4% komórek apoptotycznych i nekrotycznych) (Rysunek 3c). Za inicjatory uszkadzającego efektu sąsiedztwa możemy uważać reaktywne formy tlenu i rodnika ponadtlenkowego, których poziom zaraz po napromieniowaniu jest wyższy w komórkach bystander niż w komórkach bezpośrednio napromieniowanych (Rysunek 4 i Rysunek 5). W przypadku koinkubacji napromieniowanych promieniowaniem UVA komórek czerniaka z nienapromieniowanymi fibroblastami obserwujemy odwrotny efekt sąsiedztwa w którym nienapromieniowane fibroblasty chronią napromieniowane komórki czerniaka, konsekwencją czego jest obniżenie indukcji apoptozy i nekrozy oraz wzrost przeżywalności komórek czerniaka. Mechanizm działania odwrotnego efektu sąsiedztwa pod wpływem promieniowania UVA może polegać na tym, że sygnały emitowane przez napromieniowane komórki czerniaka mogą aktywować systemy antyoksydacyjne w nienapromieniowanych fibroblastach czego konsekwencją jest obniżenie poziomu reaktywnych form tlenu (ROS), a tym samym nienapromieniowane fibroblasty mogą pobudzać napromieniowane komórki czerniaka do obrony przed bezpośrednim działaniem promieniowania, bowiem sygnalizacja jest dwukierunkowa.

Rysunek 2. Procent komórek apoptotycznych i nekrotycznych indukowanych promieniowaniem UVB; Me45 IR, komórki napromieniowane czerniaka; Me45 BY, komórki koinkubowane ( bystander ) czerniaka. Wyniki są średnimi ± odchylenie standardowe z trzech niezależnych eksperymentów. * oznacza istotność statystyczną (p< 0,05, test t- Studenta) pomiędzy badanymi próbkami a kontrolą. Rysunek 3. Procent komórek apoptotycznych i nekrotycznych indukowanych promieniowaniem UVA; Me45 IR, komórki napromieniowane czerniaka; NHDF IR, komórki napromieniowane fibroblastów; Me45 BY, komórki koinkubowane ( bystander ) czerniaka; NHDF BY, komórki koinkubowane ( bystander ) fibroblastów. Wyniki są średnimi ± odchylenie standardowe z trzech niezależnych eksperymentów. * oznacza istotność statystyczną (p< 0,05, test t- Studenta) pomiędzy badanymi próbkami a kontrolą.

Rysunek 4. Poziom ROS w komórkach napromieniowanych promieniowaniem UVA; CT, komórki kontrolne; IR, komórki napromieniowane promieniowaniem UVA; BY, komórki bystander ; NHDF komórki fibroblastów; Me45 komórki czerniaka. Wyniki są średnimi ± odchylenie standardowe względem 100 % kontroli z trzech niezależnych eksperymentów. * oznacza istotność statystyczną (p< 0,05, test t- Studenta) pomiędzy badanymi próbkami a kontrolą. Rysunek 5. Poziom anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach napromieniowanych promieniowaniem UVA; CT, komórki kontrolne; IR, komórki napromieniowane promieniowaniem UVA; BY, komórki bystander. Wyniki są średnimi ± odchylenie standardowe względem 100 % kontroli z trzech niezależnych eksperymentów. * oznacza istotność statystyczną (p< 0,05, test t- Studenta) pomiędzy badanymi próbkami a kontrolą

5. Modelowanie matematyczne efektu sąsiedztwa Celem modelowania efektu sąsiedztwa było odróżnienie efektów przebywania komórek we wspólnym środowisku od efektów wywołanych promieniowaniem UV. Populacje dwóch komórek (jedna rosnąca w dołku, druga rosnąca w insercie), które zużywają wspólne zasoby pokarmowe umierają na skutek braku pożywienia oraz na skutek wzrostu stężenia produktów metabolizmu (toksyn). Takiego wzajemnego wpływu dwóch populacji komórek nie nazywamy efektem sąsiedztwa a jedynie wzajemnym wpływem procesów życiowych komórek znajdujących się we wspólnym środowisku. Efektem sąsiedztwa nazywamy oddziaływanie komórek napromieniowanych na sąsiadujące komórki nienapromieniowane. Modelowanie podzielono na trzy etapy: model pojedynczej populacji komórek (Etap 1) model wzajemnego wpływu procesów życiowych (Etap 2) model efektu sąsiedztwa pod wpływem promieniowania ultrafioletowego (Etap 3) Każdy kolejny etap modelowania powstawał poprzez rozszerzenie poprzedniego modelu o kolejne równania i parametry w taki sposób, że parametry, które zostały otrzymane w poprzednich etapach pozostały niezmienione, a estymowano jedynie nowe parametry. Pierwszym etapem modelowania było znalezienie prostego modelu, który uwzględnia podstawowe procesy życiowe komórek oraz jest zdolny do predykcji wzrostu pojedynczej populacji komórek w różnych warunkach środowiskowych takich jak różna objętość medium hodowlanego oraz różna liczba początkowa komórek (Rysunek 6 Etap 1). Drugi etap polegał na rozszerzeniu modelu pojedynczej populacji komórek, tak aby ukazywał wpływ procesów życiowych dwóch nienapromieniowanych populacji komórek (model wzajemnego wpływu procesów życiowych), które żyją we wspólnym środowisku oraz sprawdzenie czy model dopasowuje się do danych eksperymentalnych (Rysunek 6 Etap 2). Ostatni etap polegał nie tylko na zamodelowaniu efektu sąsiedztwa (B), ale w pierwszej kolejności do jego wykrycia. Występowanie efektu sąsiedztwa (klasycznego- komórki napromieniowane uszkadzają komórki nienapromieniowane i odwrotnego- ochrona komórek napromieniowanych przez komórki nienapromieniowane) wykazano poprzez stwierdzenie braku dopasowania modelu otrzymanego na etapie 2 do danych eksperymentalnych. Potwierdziło to istnienie efektu

sąsiedztwa (B), w związku z czym uzupełniono model o dodatkowe elementy opisujące ten efekt (Rysunek 6 Etap 3). populacja komórek (rosnąca w dołkach) Etap 1 A populacja komórek (rosnąca w dołkach) populacja komórek (rosnąca w insertach) Etap 2 UV A populacja komórek (rosnąca w dołkach) B populacja komórek (rosnąca w insertach) Etap 3 Rysunek 6. Schemat etapów modelowania efektu sąsiedztwa pod wpływem promieniowania UV. A- wzajemny wpływ procesów życiowych, B- efekt sąsiedztwa 6. Model efektu sąsiedztwa pod wpływem promieniowania ultrafioletowego W modelu efektu sąsiedztwa pod wpływem promieniowania UV estymowane są tylko trzy parametry, które są powiązane z promieniowaniem UV a mianowicie y p oznaczający sumaryczny wpływ toksyn, które powstają na skutek zużywania składników pożywki przez komórki napromieniowane i toksyn powstających w wyniku promieniowania UV, λ IR oznaczający akumulację toksyn pochodzących od promieniowania UV i naturalnych procesów życiowych komórek napromieniowanych oraz κ IR oznaczający wpływ toksyn pochodzących od promieniowania UV i naturalnych procesów życiowych komórek na tempo wzrostu komórek napromieniowanych promieniowaniem UV. Pozostałe parametry zostały wyestymowane w poprzednich etapach modelowania.

Model efektu sąsiedztwa pod wpływem promieniowania ultrafioletowego: { dx IR dt dx BY dt = [α IR (1 x IR B IR V x BY B BY V ) κ IRy p ] x IR = [α BY (1 x IR B IR V x BY B BY V ) κ BYy p ] x BY dy p dt = λ IR V x IR + λ BY V x BY gdzie ( λ BY = 1 ) x IR - wielkość populacji komórek napromieniowanych promieniowaniem UV rosnących w dołku x BY - wielkość populacji komórek nienapromieniowanych (komórek bystander ) rosnących w insercie y p - sumaryczny wpływ toksyn które powstają na skutek zużywania składników pożywki przez komórki napromieniowane i toksyn powstających w wyniku promieniowania UV V - objętość medium hodowlanego λ IR - akumulacja toksyn pochodzących od promieniowania UV i naturalnych procesów życiowych komórek napromieniowanych λ BY - akumulacja toksyn pochodzących z naturalnych procesów życiowych komórek nienapromieniowanych (komórek bystander ) κ IR - wpływ toksyn pochodzących od promieniowania UV i naturalnych procesów życiowych komórek na tempo wzrostu komórek napromieniowanych promieniowaniem UV κ BY - wpływ toksyn pochodzących z naturalnych procesów życiowych komórek na tempo wzrostu komórek nienapromieniowanych (komórek bystander ) α IR - wzrost komórek napromieniowanych promieniowaniem UV α BY - wzrost komórek nienapromieniowanych (komórek bystander ) B IR - wyczerpywanie składników odżywczych przez komórki napromieniowane B BY - wyczerpywanie składników odżywczych przez komórki nienapromieniowane (komórki bystander )

Na rysunku 7 przestawiono wyniki symulacji komunikacji międzykomórkowej komórek napromieniowanych promieniowaniem UVA (koinkubowanych z nienapromieniowanymi komórkami tej samej linii (napromieniowane komórki fibroblastów koinkubowane z komórkami nienapromieniowanych fibroblastów). Rysunek 7. Wyniki dopasowania modelu efektu sąsiedztwa pod wpływem promieniowania ultrafioletowego do danych eksperymentalnych. Krzywe wzrostu napromieniowanych promieniowaniem UVA komórek NHDF koinkubowanych z nienapromieniowanymi komórkami NHDF Powstały model efektu sąsiedztwa pod wpływem promieniowania UV uwzględnia jedynie destrukcyjny wpływ efektu sąsiedztwa nie uwzględnia efektu ochronnego. Model ochronnego efektu sąsiedztwa wymaga estymacji parametru λ BY, który w modelu efektu sąsiedztwa pod wpływem promieniowania UV był przyjęty jako 1. W modelu ochronnego efektu sąsiedztwa parametr ten odpowiada za zmniejszanie przez komórki bystander emisji toksyn pochodzących od napromieniowanych komórek. 7. Podsumowanie Promieniowanie UV (UVA, UVB i UVC) wywołuje destrukcyjne zmiany w komórkach nienapromieniowanych będących w sąsiedztwie komórek bezpośrednio napromieniowanych, jednakże w przypadku koinkubacji komórek Me45 z NHDF obserwujemy efekt ochronny fibroblastów względem napromieniowanych promieniowaniem UVA komórek czerniaka. Istnienie odwrotnego (ochronnego) efektu sąsiedztwa wywoływanego przez nienapromieniowane fibroblasty w napromieniowanych komórkach innej linii może mieć

poważne konsekwencje zdrowotne, ponieważ w warunkach in vivo fibroblasty zlokalizowane w skórze właściwej koegzystujące z melanocytami i keratynocytami skóry mając zdolność modulacji bezpośrednich efektów indukowanych przez promieniowanie UVA mogą promować przeżycie uszkodzonych keratynocytów lub melanocytów prowadzące do niestabilności genetycznej a w konsekwencji do transformacji nowotworowej. Wyniki modelowania pokazały, że prostymi mechanizmami tj. naturalnymi procesami życiowymi komórek powodującymi wyczerpywanie się składników pokarmowych oraz śmiercią komórek w wyniku narażenia na toksyny pochodzące od promieniowania można zamodelować klasyczny efekt sąsiedztwa (komórki napromieniowane uszkadzają komórki nienapromieniowane). Taki model sprawdza się w przypadku promieniowania UVA (gdy koinkubujemy komórki tej samej linii), UVB i UVC. W przypadku promieniowania UVA, gdzie obserwujemy efekt ochronny model wymaga estymacji parametru λ BY, który odpowiada za zmniejszanie ilości toksyn przez komórki nienapromieniowane bystander pochodzące od napromieniowanych komórek. 8. Bibliografia [1] Grimes D.R.: Ultraviolet radiation therapy and UVR dose models. Med. Phys., 2015; 42: 440-455 [2] Rastogi R.P., Richa, Kumar A., Tyagi M.B., Sinha R.P.: Molecular mechanisms of ultraviolet radiation-induced DNA damage and repair. J. Nucleic Acids, 2010; 592980 [3] Sorrell J., Caplan A.I.: Fibroblast heterogenity: more than skin deep. J. Cell Sci., 2004; 117: 665-675 [4] Widel M.: Bystander Efect Induced by UV radiation; why should we be interested? Postepy Hig. Med. Dosw., 2012; 66:829-837 [5] Boni R., Schuster C., Nehrfo B., Burg G.: Epidemiology of skin cancer., Neuro. Endocrinol. Lett., 2002; 23: 48-51 [6] Pattison D.I., Davies M.J.: Actions of ultraviolet light on cellular structures. EXS., 2006;131-159 [7] Widel M., Krzywon A., Gajda K., Skonieczna M., Rzeszowska-Wolny J. : Induction of bystander effects by UVA, UVB, and UVC radiation in human fibroblasts and the implication of reactive oxygen species. Free Radic. Biol. Med.,2014; 68: 278-287

[8] Paul N.D., Gwynn- Jones D.: Ecological roles of solar UV radiation: towards an integrated approach. Trends iecol. Evol. 2003; 18:48-55 [9] Gupta A., Avci P., Dai T., Huang Y.Y. Hamblin M.R.: Ultraviolet Radiation in Wound Care: Sterilization and Stimulation. Adv. Wound Care., 2013; 8: 422-437 [10] Amaro- Ortiz A., Yan B., D' Orazio J. A.: Ultraviolet radiation, aging and the skin: prevention of damage by topical camp manipulation. Molecules., 2014; 19: 6202-6219 [11] de Gruijl F.R.: Action spectrum for photocarcinogenesis, Recent Results Cancer Res., 1995; 139: 21-30 [12] Cadet J., Douki T., Ravanat J.L., Di Mascio P.: Sensitized formation of oxidatively generated damage to cellular DNA by UVA radiation. Photochem. Photobiol. Sci., 2009; 8: 903-911 [13] Pfeifer G.P., Besaratinia A.: UV wavelength-dependent DNA damage and human nonmelanoma and melanoma skin cancer. Photochem. Photobiol. Sci., 2012; 11: 90-97 [14] de Gruijl F.R.: Action spectrum for photocarcinogenesis. Recent Results Cancer Res., 1995; 139: 21-30 [15] Widel M., Przybyszewski W.M., Cieslar- Pobuda A., Saenko Y.V., Rzeszowska-Wolny J.:Bystander normal human fibroblasts reduce damage response in radiation targeted cancer cells through intercellular ROS level modulation. Mutat. Res., 2012; 731: 117-124 9. Publikacje autora Pełne artykuły naukowe: 1. Widel M., Krzywon A., Gajda K., Skonieczna M., Rzeszowska-Wolny J. : Induction of bystander effects by UVA, UVB, and UVC radiation in human fibroblasts and the implication of reactive oxygen species. Free Radic. Biol. Med.,2014; 68: 278-287 (Impact Factor 5.73; Punktacja MNiSW 40) 2. Poleszczuk J., Krzywon A., Forys U., Widel M.: Connecting radiation-induced bystander effects and senescence to improve radiation response prediction. Radiat. Res., 2015; 183: 571-577 (Impact Factor 2.91; Punktacja MNiSW 30)

3. Widel M., Lalik A., Krzywon A, Poleszczuk J, Fujarewicz K, Rzeszowska-Wolny J.: The different radiation response and radiation induced bystander effects in colorectal carcinoma cells differing in p53 status. Mutat. Res., 2015; 778: 61-70 (Impact Factor 3.68; Punktacja MNiSW 35) Doniesienia konferencyjne: 1. Krzywon A., Wideł M.: Bystander effect induced by UVC in normal and cancer cells. XV Gliwice Scientific Meetings., 2011; p 82 2. Poleszczuk J., Krzywoń A., Lalik A., Skonieczna M., Wideł M.: The p53 positive colorectal carcinoma cells are more vulnerable to radiation induced senescence than p53 knockout counterparts; possibile implication for bystander effect. XV Gliwice Scientific Meetings., 2011; p 102 3. Skonieczna M., Cieślar- Pobuda A., Krzywoń A., Biernacki K., Hudy D., Student S., Wideł M.: Reactive oxygen and nitrogen species mediate DNA damage in irradiation exposed and non- exposed bystander cells. 6 th DNA Repair Workshop., 2012; p 35 4. Krzywoń A., Wideł M., Skonieczna M., Rzeszowska- Wolny J.: DNA damage induced by UVC radiation and bystander signals in cancer and normal cells. 6 th DNA Repair Workshop., 2012; p 49 5. Krzywon A., Poleszczuk J., Widel M.: Different response to ionizing radiation and bystander signals of p53 positive and knockout colorectal carcinoma cells is dependent on sensitivity to apoptosis and senescence induction- 47th Congress of Polish Biochemical Society; Acta Biochimica Polonica., 2012; p128 6. Krzywon A., Widel M.: Damaging bystander effect induced in cancer and normal cells by UVC- irradiation. 42nd European Environmental Mutagen Society., 20 12; p 107 7. Krzywon A., Skonieczna M., Widel M: Bystander effect induced by UVA, UVB and UVC radiation in normal human dermal fibroblasts. XIV International PhD Workshop OWD., 2012; p 310-313 8. Krzywoń A., Gajda K., Skonieczna M., Widel M.: Searching for molecular signals of bystander effect induced by UVA, UVB and UVC radiation. XVI Gliwice Scientific Meetings., 2012; p 75 9. Krzywoń A.: Popromienny efekt sąsiedztwa po ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe; Zarządzanie dużą infrastrukturą badawczą cz.ii; projekty naukowe wokół Śląskiej Biofarmy., 2012; p 17 10. Gajda K., Skonieczna M., Student S., Hudy D., Biernacki K., Krzywoń A., Ślęzak- Prochazka I., Rzeszowska-Wolny J.: Changes of reactive oxygen species and nucleic acid modifications during cell cycle progression. 48th Congress of the Polish Biochemical Society, Acta Biochimica Polonica., 2013; p 6

11. Krzywon A., Widel M., Skonieczna M., Gajda K., Rzeszowska-Wolny J.: Reactive oxygen species and nitro gen species as mediators of bystander effect induced by UVC radiation in human malignant melanoma cells. 48th Congress of the Polish Biochemical Society, Acta Biochimica Polonica., 2013; p 67 12. Biernacki K., Hudy D., Skonieczna M., Gajda K., Krzywoń A., Wideł M., Rzeszowska- Wolny J. Induction of reactive oxygen species in normal human fibroblasts cocultivated with irradiated melanoma cells 48th Congress of the Polish Biochemical Society. Acta Biochimica Polonica., 2013; p 69 13. Krzywon A.: Induction of bystander effect in human malignant melanoma cells by diffrent spectrum of ultraviolet radiation. XV International PhD Workshop OWD., 2013: 434-437 14. Krzywoń A., Wideł M, Rzeszowska-Wolny J.: Bystander effect induced by UVA, UVB and UVC radiation in human malignant melanoma cells; implication of reactive oxygen species in normal and cancer cells. XV Gliwice Scientific Meetings., 2013; p 82 15. Kurasz K., Łakomiec K., Krzywon A., Fujarewicz K.: Bystander effect induced by ultraviolet radiation: mathematical model. Proc. Bringing Maths to Lif., 2014; p 29 16. Skonieczna M., Gajda K., Biernacki K., Hudy D., Krzywon A., Student.S, Ślęzak- Prochazka I., Widel M., Rzeszowska-Wolny J.: Reactive oxygen species and nitric oxide in irradiated and irradiation-induced bystander cells. 23 Biennial Congress of the European Association for Cancer Research., 2014; p 127 17. Kurasz K., Łakomiec K., Krzywon A., Fujarewicz K.: Mathematical model of bystander effect. Acta Biochimica Polonica., 2014; p 94-95 18. Krzywon A., Widel M., Rzeszowska-Wolny J.: Moleculat signals of bystander effect induced by UVB radiation in human malignant melanoma cells. XVIII Gliwice Scientific Meetings., 2014; p.101 19. Kala S., Krzywon A., Rzeszowska-Wolny J.: Proliferation and apoptosis in melanoma cells exposed to UV radiation. XVIII Gliwice Scientific Meetings., 2014; p 1 20. Krzywon A., Widel M., Rzeszowska-Wolny J.: Bystander efect induced by UVA radiation in human malignant melanoma cells. 1st Congress of Biochemistry, Cell Biology, Biophysics and Bioinformatics., 2014; p 44