Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (2) 2009 SZYBKI TEST DO IDENTYFIKACJI BAKTERII CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SSP. SEPEDONICUS WŁODZIMIERZ PRZEWODOWSKI, AGNIESZKA BARNYK Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie Zakład Nasiennictwa i Ochrony Ziemniaka w Boninie 76-009 Bonin 3 wlodzimierz.przewodowski@tu.koszalin.pl I. WSTĘP Wykrywanie i identyfikacja bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka stwarza wiele trudności, co często pociąga za sobą ogromne straty gospodarcze i ekonomiczne (Lee i wsp. 1997). Jak dotąd najskuteczniejszym sposobem ograniczania rozprzestrzeniana się bakteriozy pierścieniowej, jest szybka i trafna diagnostyka choroby oraz eliminacja porażonych roślin. Obecnie nie ma metody identyfikacji bakterii Cms, która dawałaby 100% pewność co do prawidłowej diagnozy. Dlatego zgodnie z przyjętymi wymogami fitosanitarnymi w identyfikacji tej bakterii stosuje się przynajmniej dwa testy oparte na różnych zasadach biologicznych wraz z testem patogeniczności na roślinie bioindykatorowej (OEPP/EPPO 2006). W związku z tym nadal istnieje zapotrzebowanie na nowe, szybkie i sprawdzone metody detekcji tego groźnego patogena. Praca prezentuje nowy immunofiltracyjny test do szybkiej i specyficznej identyfikacji czystych szczepów bakterii Cms opracowany z wykorzystaniem materiałów oraz znaczników stosowanych w nowoczesnej diagnostyce. II. MATERIAŁ I METODY Przygotowanie materiałów i znaczników bakterii Cms Do opracowania testu wykorzystano złoto koloidalne jeden z najczulszych markerów stosowanych coraz częściej w diagnostyce bakteriologicznej (Geddes i wsp. 2003). Koloid złota uzyskano poprzez redukcję kwasu chlorozłotowego cytrynianem sodu (Liu i wsp. 2003). Poprzez frakcjonowanie w polu grawitacyjnym oraz proces standaryzacji uzyskano jednorodny i powtarzalny roztwór nanocząsteczek złota o wielkości około 24 nm charakteryzujący się bardzo wysokim współczynnikiem absorpcji optycznej oraz wysoką adsorbcyjnością.
Szybki test do identyfikacji Cms 697 Właściwości optyczne oraz sorpcyjne uzyskanego roztworu złota koloidalnego wykorzystano do wytworzenia czułego i specyficznego znacznika optycznego bakterii Cms. W tym celu nanocząsteczki złota koloidalnego pokrywano przeciwciałami IgG anty-cms stosując zorientowany sposób immobilizacji. Fragmenty przeciwciał (r IgG łańcuch lekki + łańcuch ciężki) uzyskane przez traktowanie całych immunoglobulin przy pomocy czynnika redukującego (DTT ditiotreitol) osadzano na powierzchni nanocząsteczek złota za pośrednictwem wolnych grup sulfhydrylowych. Tak wytworzony koniugat stosowano następnie jako specyficzny i czuły znacznik bakterii Cms. Wykrywanie bakterii testem filtracyjnym Zasada tego testu polega na wybarwieniu komórek bakteryjnych złotem koloidalnym, koncentracji na małej powierzchni i obserwacji makro- lub mikroskopowej. W pierwszym etapie przygotowywano zawiesiny bakterii poprzez zbieranie ezą z pożywek bakterii tworzących kolonie charakterystyczne dla bakterii Cms. Dla ustalenia czułości metody sporządzano serie zawiesin bakterii Cms w 10 mm buforze fosforanowym ph 7,2 w koncentracji od 5 10 2 do 5 10 5 jtk/ml. Następnie pobierano po 100 µl każdej z zawiesin i dodawano po 20 µl koniugatu złota koloidalnego z fragmentami IgG anty-cms. Po 10 minutach zawiesiny bakterii z koniugatem przeciwciał ze złotem koloidalnym filtrowano na membranach antybakteryjnych umieszczonych w urządzeniu do blottingu próżniowego. Po 3-krotnym przemyciu buforem 1 PBS ph 7,4 z 0,05% Tween 20 oceniano obecność bakterii dwojako: makroskopowo poprzez intensywność barwy plam na powierzchni membrany lub obserwowano morfologię wybarwionych komórek bakteryjnych pod mikroskopem optycznym. Dla polepszenia czułości metody i polepszenia widoczności bakterii Cms, prowadzono redukcję jonów srebra na cząsteczkach złota koloidalnego osadzonych na komórkach bakteryjnych Liang i wsp. (2004). III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Dla pełnej identyfikacji bakterii Cms istotna jest selekcja czystych kultur patogena z tkanki ziemniaka. Znacznym ograniczeniem w izolacji bakterii Cms jest między innymi ich powolny wzrost w stosunku do występującej mikroflory endofitycznej charakteryzującej się szybszym tempem wzrostu oraz brak w pełni selektywnych pożywek ograniczających występowanie tych drobnoustrojów. Stąd dla polepszenia identyfikacji bakterii Cms podczas wzrostu na podłożach selektywnych i oddzielenia ich od innych towarzyszących im podczas wzrostu bakterii, opracowano prezentowany test filtracyjny. Zasada testu filtracyjnego z zastosowaniem złota koloidalnego polega na barwieniu znajdujących się w roztworze komórek bakterii przy pomocy koniugatu złota koloidalnego z poliklonalnymi przeciwciałami króliczymi skierowanymi na bakterie Cms i usunięciu nadmiaru niezwiązanego koniugatu przez filtrację mechaniczną. Nanocząsteczki złota koloidalnego skoniugowane z przeciwciałami anty-cms, specyficznie rozpoznają komórki bakteryjne tworząc na ich powierzchni barwną otoczkę, natomiast wykorzystanie niskoporowatych membran pozwala skoncentrować tak wy-
698 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (2) 2009 znakowane bakterie z dużej objętości na małej powierzchni dając możliwość jednoczesnej analizy wielu próbek przy minimalnym nakładzie kosztów. Sposób znakowania bakterii Cms poprzez bezpośredni kontakt w roztworze komórek bakteryjnych i koniugatu przeciwciał anty-cms ze znacznikiem złotem koloidalnym, pozwala na bardzo szybki kontakt biomolekuł z bakteriami i specyficzne wybarwienie komórek bakterii Cms. Jednocześnie niewybarwione zostają inne bakterie znajdujące się w roztworze (rys. 1a, b). a) b) Rys. 1. Bakterie Cms znakowane koniugatem IgG anty-cms Au widziane makroskopowo w postaci barwnych plam na membranie antybakteryjnej przed (a) oraz po (b) redukcji jonami srebra Fig. 1. Cms immunostained by anty-cms IgG conjugated with Au visible macroscopicaly as couloured dots on anibacterial membrane before (a) and after (b) reduction with silver ions Wybarwione i skoncentrowane w ten sposób komórki bakterii Cms oceniano makroskopowo stwierdzając obecność bakterii nieuzbrojonym okiem w postaci barwnych plam na powierzchni membran (rys. 2). Rys. 2. Widok bakterii C. michiganensis subsp. sepedonicus po znakowaniu koniugatem ze złotem koloidalnym i amplifikacji srebrem na membranie antybakteryjnej. Zdjęcie wykonano przy pomocy skaningowego mikroskopu elektronowego JEOL JSM-5500 przy powiększeniu 6 500 razy Fig. 2. A view of C. michiganensis subsp. sepedonicus after immunostaining by IgG conjugated with colloidal gold and silver aplification on anibacterial membrane. The picture was made using scannig electron microscope JEOL JSM-5500 (enlarged 6 500 fold)
Szybki test do identyfikacji Cms 699 Uzyskany sygnał optyczny (czułość ok. 5 10 4 jtk/ml) polepszano dodatkowo przez redukcję jonów srebra na złocie koloidalnym (czułość ok. 5 10 3 jtk/ml) (rys. 1b). Pozwoliło to na uzyskanie większej czułości opracowanego testu oraz dało możliwość obserwacji wyraźnego kształtu obserwowanych komórek przy pomocy klasycznego mikroskopu optycznego. Test filtracyjny na membranach niskoporowatych pozwolił na detekcję ok. 5 000 jtk/ml (tab. 1). Bakterie skoncentrowane na filtrach pozostają na powierzchni i są łatwo dostrzegalne po wyznakowaniu różnymi metodami. Tabela 1. Wyniki oceny makroskopowej testu filtracyjnego z zastosowaniem koniugatów IgG anty-cms ze złotem koloidalnym oraz mikroporowatych membran antybakteryjnych Table 1. Results of macroscopical evaluation of filtration test using colloidal gold IgG anti- Cms conjugates and microporous antibacterial membranes Sposób znakowania Labelling Koncentracja bakterii Cms [jtk/ml] Concentration of Cms [cfu/ml] 5 10 5 10 5 5 10 4 10 4 5 10 3 10 3 5 10 2 0 Znakowanie koniugatem złota koloidalnego z IgG anty-cms Labelling with colloidal gold IgG anty-cms conjugate Amplifikacja srebrem Silver amplification + wyraźne zabarwienie; +/ ślady zabarwienia; brak zabarwienia + contrast colour; +/ weak colour; no colour + + + + + + + +/ Wytworzony test filtracyjny okazał się szybki, specyficzny i dorównywał czułością metodzie ELISA. Po amplifikacji sygnału optycznego, obecność bakterii Cms można było dostrzec tzw. gołym okiem. Możliwa jest również bezpośrednia obserwacja morfologii komórek bakteryjnych pod mikroskopem optycznym. IV. LITERATURA Geddes C.D., Cao H., Lakowicz J.R. 2003. Enhanced photostability of ICG in close proximity to gold colloids. Spectrochimica Acta Part A 59: 2611 2617. Lee I.-M., Bartoszyk I.M., Gundersen D.E., Mogen B., Davis R.E. 1997. Nested PCR for Ultrasensitive Detection of the Potato Ring Rot Bacterium, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Appl. Environ. Microbiol. 63 (7): 2625 2630. Liang R.-Q., Tan C.-Y., Ruan K.-Ch. 2004. Colorimetric detection of protein microarrays based on nanogold probe coupled with silver enhancement. J. Immunol. Met. 285: 157 163. Liu F.-K., Ker C.-J., Chang Y.-C., Ko F.-H., Chu T.-C., Dai B.-T. 2003. Microwave Heating for the Preparation of Nanometer Gold Particles. Jpn. J. Appl. Phys. 42: 4152 4158.
700 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (2) 2009 OEPP/EPPO. 2006. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Bull. OEPP/EPPO Bull. 36: 99 109. WŁODZIMIERZ PRZEWODOWSKI, AGNIESZKA BARNYK RAPID TEST FOR IDENTIFICATION OF CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SSP. SEPEDONICUS SUMMARY Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus is a quarantine bacterium especially difficult for detection and diagnostics. The main reason is that infection caused by Cms often occurs in a latent form. The most efficient way of Cms elimination is its early detection. This work presents new immunofiltration test for fast and specific identification of pure strains of Cms developed with application of materials and markers used in modern diagnostics. Key words: Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, colloidal gold, immunoassay