WYNIKI z realizacji zadania na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w roku Poszukiwanie wspólnych mechanizmów dziedziczenia płodności roślin z cytoplazmą CMS - C oraz z cytoplazmą ampa Temat badawczy Określenie na dwóch mapach genetycznych chromosomu RL lokalizacji głównych genów restorerowych dla obu systemów CMS. Cel tematu badawczego Proszę podać cel (jak w szczegółowym opisie) i napisać, czy cel został osiągnięty, ew. w jakim stopniu; jeśli cel nie został osiągnięty w całości podać przyczyny. Określenie na dwóch mapach genetycznych lokalizacji głównych genów restorerowych dla obu systemów CMS cel osiągnięty Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Materiałem badawczym w roku były dwie populacje mapujące wytworzone po skrzyżowaniu linii męskosterylnej z cytoplamą C i linii restorerowej Ot- oraz linii z cytoplazmą P zapylonej pyłkiem populacji IRAN IX. Z każdej populacji wytypowanych zostało do analiz 9 osobników o określonej w doświadczeniu polowym męskiej płodności (ocena fenotypowa na podstawie obserwacji wzrokowej przy zastosowaniu skali bonitacyjnej Geigera i Morgensterna oraz weryfikacja oceny na podstawie zawiązywania ziaren pod izolatorami z tomofanu). Zastosowano metodę oznaczeń GBS (ang. Genotyping by Sequencing) opartą o wykorzystanie technik NGS - sekwencjonowania nowej generacji (ang. Next Generation Sequencing). Metoda ta pozwala na uzyskanie w nowej generacji sekwenatorach DNA danych, które po analizie bioinformatycznej służą do genotypowania roślin generując duże ilości markerów molekularnych, głównie z kategorii SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism). Analizy GBS zostały zlecone w firmie Diversity Arrays Technology w Australii, która jako jedna z pierwszych zaoferowała wykonywanie tego rodzaju usług i z sukcesem zaadoptowała metodę do analiz genomu żyta. Poza analizami GBS w obrębie obu populacji mapujących wykonano ocenę polimorfizmu sześciu markerów opartych o metodę PCR (markery SCAR). Konstruowanie grup sprzężeń wykonywano przy użyciu programu JoinMap. wykorzystującego algorytm Regression Mapping (RM). Grupowanie wykonywano w oparciu o funkcję LOD, a dystanse na mapach określono w centymorganach (cm) przy zastosowaniu funkcji Kosambi. Wyniki (opisać) Wybrane do analiz genotypy dwóch populacji mapujących reprezentowały mniej więcej w połowie formy całkowicie męskosterylne, a w połowie formy z efektywnie przywrócona płodnością. Na obecnym etapie badań, przy wyborze osobników do genotypowania pominięto rośliny o słabych objawach męskiej płodności. Wyizolowane z roślin DNA poddano analizom zleconym w Diversity Arrays Technology LTD w Australii oraz wykorzystano do poszukiwań segregacji markerów opartych o metodę PCR (markery SCAR i COS). Wytypowano sześć markerów SCAR (dfr9, SCSzL, SCPM, BCS, BCS i SCSzL9) przydatnych do analiz porównawczych, z których dwa nie były dotąd publikowane (otrzymane w oparciu o ostatnio wykonane analizy sekwencyjne). Przy konstruowaniu map genetycznych wykorzystano również ponad markerów DArT oznaczonycych w każdej z populacji. Dodatkowo otrzymano dane o ponad markerach SNP. W celu wyselekcjonowania markerów bardzo ściśle związanych z genami przywracającymi płodność, przy tworzeniu grup sprzężeń wartość krytyczną LOD ustanowiono na bardzo wysokim poziomie:. W obrębie utworzonych grup sprzężeń w obu analizowanych populacjach poszukiwano tych, które zawierają geny restorerowe (Rfp i Rfc). W przypadku populacji opartej o cytoplazmę Pampa (P x IRAN IX) otrzymana grupa sprzężeń liczyła
markery, w populacji z cytoplazmą C (C x Ot-) było to aż 9 markerów (rys..). Ponieważ przyjęty poziom krytyczny LOD eliminował markery wykazujące mniej silny związek z cechą, nie wszystkie analizowane markery SCAR zostały włączone do grup sprzężeń.
CxOt- XdRs9 XdRs99 XdRs XdRs9b XdRs99 XdRs XdRs XrPt99 XdRs XrPt XdRs XrPt9 XdRs XdRs99 XdRs9 XdRs9a XdRs9 XdRs XdRs9 XdRs9 XdRs XdRs9 XdRs9 XdRs9 XdRs XdRs XdRs9 XdRs XdRs XdRs9 XdRs9b XdRs9 XdRs9 XdRs XdRs XdRs9a XdRs XdRs XdRs XdRs9 XdRsa XdRs9 XdRs9 XdRs9 XdRs XdRs XdRs XrPt XdRs XdRs9 XdRs9b XwPt XdRs XdRs XdRs9 XdRsa XdRs9 XwPt9 XdRs XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XdRsb XdRs XdRs9 XdRs XdRs9 XdRs9 XdRs XdRs XdRs XdRs XrPt9 XrPt9 XrPt9 XdRs XrPt XdRs9 XdRsb XdRs XrPt9 XrPt BCS XrPt9 SCSzL XrPt9 XrPt BCS XrPt99 XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt9 XrPt9 XrPt9 XrPt XdRs9 XrPt9 XdRs99 XwPt XrPt XdRs9 BCS XrPt XdRsb XrPt XdRsa XdRsb XdRs XrPt9 XrPt XrPt9 XdRs XrPt XdRs9 XdRs9 XdRs9 XrPt XrPt99 XrPt99 XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt9 XrPt XdRs XrPt XdRs dfr9 XrPt9 Rfc SCSzL XrPt XrPt9 XdRs XdRs9 XdRs9 XdRs XdRs9a XdRs99 XdRs9 XdRs XrPt9 XrPt XdRs9 XrPt99 XdRsa XdRs9 XdRs99 XdRs SCSzL9 XdRs XrPt9 XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XtPt XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt9 XrPt9 XrPt XrPt XrPt XrPt XdRs XtPt XdRs XdRs9 XrPt XrPt XrPt99 XdRs9 XdRs XdRs XdRs XrPt XdRs99b XdRs99a XrPt9 XdRs9 XdRs XdRs9 XdRs XdRsb XrPt9 XdRs XdRs XdRs XdRs XdRs XdRs XdRs9 XrPt XdRs XdRs9 XdRs9a XdRs9b XdRs XdRs9 XrPt99 XrPt9 XdRs9b XdRs XdRs9 PxIRAN-IX BCS XrPt XrPt XrPt99 XrPt XrPt XrPt9 XdRs XrPt XrPt XrPt XrPt9 XrPt9 XrPt XrPt9 XrPt XrPt9 XrPt XdRs XrPt XrPt XrPt9 XrPt99 XrPt XrPt99 XrPt XrPt XrPt BCS XrPt XrPt XrPt9 XrPt99 XrPt9 XdRs9b XrPt XrPt SCPM XrPt99 dfr9 XrPt XrPt XrPt Rfp XrPt9 XdRs XdRs9c XdRs9d SCSzL9 XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt XrPt9 XrPt9 XrPt XdRs9 XdRs9b XdRs SCSzL Rys... Mapa porównawcza fragmentu chromosomu RL zawierającego geny efektywnie przywracające płodność w systemach i
Utworzone mapy genetyczne obejmujące lokalizację genów Rfc i Rfp miały długość, odpowiednio: cm i cm. W grupie sprzężeń utworzonej w obrębie populacji mieszańca C x Ot- ponad połowę stanowiły markery SNP było ich aż. Na drugiej z map utworzonej przy zastosowaniu tych samych technik markerowych i przy zastosowaniu identycznej procedury ogólna liczba markerów była znacząco niższa, a markerów SNP było zaledwie 9. Tylko jeden makrer SNP został zlokalizowany na obu mapach genetycznych. Obecność na mapach niektórych wspólnych markerów DArT, SCAR i SNP pozwoliła na porównanie lokalizacji obu badanych restorerów (rys..). Temat badawczy Przygotowanie i kontrola jakości ekstraktów DNA mitochondrialnego do badań genetycznych czynników wywołujących męską sterylność w cytoplazmie Pampa i porównania ich z determinantami warunkującymi męską niepłodność w cytoplazmie. Cel tematu badawczego Proszę podać cel (jak w szczegółowym opisie) i napisać, czy cel został osiągnięty, ew. w jakim stopniu; jeśli cel nie został osiągnięty w całości podać przyczyny. Przygotowanie materiału badawczego do prób zidentyfikowania mitochondrialnych genetycznych czynników wywołujących męską sterylność w cytoplazmie Pampa i porównanie ich z determinantami warunkującymi męską niepłodność w cytoplazmie cel osiągnięty Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Na rok przewidziano wykonanie namnożenia linii blisko-izogenicznych (genotyp linii w trzech wersjach cytoplazmatycznych), weryfikację typu cytoplazmy w uzyskanych materiałach przy użyciu diagnostycznych markerów SCAR i przygotowanie materiału tkankowego (etiolowane kiełki) do izolacji mtdna. Rozmnożenia przeprowadzono w wazonach umieszczonych w szklarni i podłączonych do automatycznego systemu nawadniającego. W każdym wazonie o obj. dm wysiewano osiem ziaren. Wersja męskopłodna linii oznaczona jako N była reprodukowana poprzez samozapylenie pod izolatorami z tomofanu. Namnożenie linii w wersjach męskosterylnych wykonywano poprzez ręczne przenoszenie pyłku z wersji męskopłodnej na męskosterylną połączone ze wzrokową obserwacją poziomu sterylności zapylanych kłosów. Wyniki (opisać) W okresie strzelania w źdźbło z roślin rosnących w wazonach (tab..) pobrano fragmenty liści i wykonano analizy z zastosowaniem markerów SCAR: cox, nad i nad. Markery te pozwalają na identyfikację typu cytoplazmy u roślin żyta (Stojałowski i in. ). Analizy przeprowadzono w celu wykrycia ewentualnych zamieszań w materiałach hodowlanych, które z uwagi na podobieństwo fenotypowe rozmnażanych linii blisko-izogenicznych są trudne do wykrycia. Profile uzyskanych markerów SCAR potwierdziły właściwą tożsamość wszystkich rozmnażanych materiałów. Przyjęto, że do realizacji dalszych etapów badań niezbędne jest uzyskanie po minimum ziaren każdej wersji cytoplazmatycznej linii. Wymagana ilość nasion wersji z cytoplazmą normalną (N), którą reprodukowano na drodze samozapylenia została uzyskana w obrębie dwóch wazonów (tab...). Pozostałe wazony z roślinami linii N posłużyły jako źródło pyłku do rozmnożeń męskosterylnych wersji z cytoplazmą Pampa (P) i (C). Wszystkie kłosy rozmnażanych wersji były umieszczone w przeźroczystych izolatorach z tomofanu. Pełna męska sterylność każdego z zapylanych kłosów męskosterylnych była weryfikowana wzrokowo zgodnie z metodyką opracowaną przez Geigera i Morgensterna (9). W zależności od skuteczności ręcznych przepyleń z poszczególnych wazonów uzyskano od do ponad ziaren. Ogólnie, wymagana ilość nasion otrzymano dla każdej z rozmnażanych wersji cytoplazmatycznych linii (tab..) Uzyskane ziarna wymłócono ręcznie. Po odkażeniu w % podchlorynie sodu - ziaren każdego obiektu poddano kiełkowaniu przy całkowitym braku dostępu do światła. Po dniach otrzymane etiolowane kiełki (minimum g każdego z obiektów) ścięto, poddano homogenizacji i na drodze wirowań w buforach o wysokiej gęstości odseparowano frakcję mitochondriów.
Tabela.. Liczebności ziaren uzyskane przy reprodukcji trzech wersji cytoplazmatycznych linii wsobnej Obiekt (pokolenie) Wazon nr Liczba ziaren Ogólna liczba ziaren P (B) 9 9 C (B) 9 9 N (S) Temat badawczy Określenie frekwencji alleli płodności dla cytoplazmy C i P w sześciu polskich populacjach żyta ozimego. Cel tematu badawczego Proszę podać cel (jak w szczegółowym opisie) i napisać, czy cel został osiągnięty, ew. w jakim stopniu; jeśli cel nie został osiągnięty w całości podać przyczyny. Określenie frekwencji alleli płodności dla cytoplazmy C i P w sześciu polskich populacjach żyta ozimego cel osiągnięty Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Badania nad frekwencją alleli sterylności/płodności realizowano poprzez krzyżowania w izolowanych szkółkach typu top-cross i (w kolejnych latach) ocenę wzrokową płodności uzyskanych mieszańców przy zastosowaniu skali bonitacyjnej opracowanej przez Geigera i Morgensterna (9). W roku określono męską płodność u mieszańców między męskosterylnymi źródłami i a sześcioma populacjami żyta z polskiej hodowli. Rośliny wysiano punktowo w rozstawie x cm na polu doświadczalnym ZUT w Szczecinie (ponad roślin każdego z mieszańców). Ponadto, w celu uzyskania minimum mieszańców do oceny w kolejnym roku badań, wysiano cztery izlolowane szkółki hodowlane typu top-cross z męskosterylnymi wersjami linii z cytoplazmą P i C oraz zapylaczami w postaci populacji żyta oraz sześć namiotów foliowych z roślinami kolejnych populacji oraz męskosterylnych testerów. Wyniki (opisać) W roku oceniono dwa tysiące pojedynków - nie mniej niż po roślin w obrębie każdej z badanych kombinacji (źródło CMS x populacja). W przybliżeniu połowę przebadanych osobników stanowiły rośliny z cytoplazmą Pampa i (tab..). Najliczniej reprezentowane były rośliny zaliczone do klas fenotypowych: 9 rośliny w pełni męskopłodne, bardzo silnie pylące (ponad 9 roślin) oraz (ponad roślin) rośliny męskosterylne, ale o niezbyt silnych objawach męskiej sterylności (tab..). Rośliny wykazujące objawy bardzo głębokiej sterylności ( w skali Gegera i Morgensterna) prawie nie pojawiały się, gdy obecna była cytoplazma C (zaledwie zidentyfikowany przypadek). Przy obecności cytoplazmy Pampa liczebność tego rodzaju form była wyraźnie większa ( rośliny). Odwrotą zależność można zauważyć w obrębie roślin o najsilniejszych obajwach płodności rośliny w tej kategorii były ponad czterokrotnie częściej spotykane, gdy posiadały
cytoplazmę C. Faktem jest jednak, że w dwóch kombinacjach krzyżowań z udziałem źródła Pampa ta klasa fenotypów była dość licznie reprezentowana (Szk. i Szk.). Relacje między źródłami CMS stają się lepiej widoczne po połączeniu dziewięciu klas bonitacyjnych w kategorie fenotypowe (rośliny męskosterylne, częściowo płodne i męskopłodne) oraz przekalkulowaniu liczebności roślin w tych kategoriach na ich procentową frekwencję (tab..). Można tutaj wyraźnie zauważyć wyraźną różnicę pod względem obecności genotypów dopełniających i restorerujących dla dwóch badanych źródeł CMS. Udział genotypów dopełniających dla cytoplazmy C jest we wszystkich badanych populacjach znikomy, a efektywne restorery stanowią ponad trzy czwarte każdej z badanych populacji. (tab..). W przypadku genów współdziałających z systemem ampa zróżnicowanie badanych w roku populacji jest większe, ale ogólna tendencja wskazująca na niewielką frekwencję genów skutecznie przywracających płodność jest wyraźnie widoczna. Tabela. Płodność mieszańców między męskosterylnymi źródłami cytoplazm i, a polskimi populacjami żyta ozimego (liczebność roślin w poszczególnych klasach fenotypowych). Populacja CMS Męskosterylne Częściowo płodne Męskopłodne Suma 9 Szk. C 9 P 9 Szk.9 C 9 P Szk. C 9 P 9 Szk. C 9 P Szk./ C 9 9 P Szk.9/ C P 9 Ogółem 99 9 99 w tym z 9 99 w tym z 9
Tabela. Odsetek roślin ocenionych jako męskosterylne (MS), częściowo płodne (CP) i męskopłodne (MP) wśród mieszańców między męskosterylnymi wersjami linii, a populacjami żyta. Populacja Szk. Szk.9 Szk. Szk. Szk./ Szk.9/ Ogółem Cytoplazma MS,,,,,,,,,, 9,9,9 CP,,,,,9,,,,, 9,9, MP 9,, 9,9,,9,,,, 9,,,,,, 9,,,99 Temat badawczy Ocena zdolności kombinacyjnej dziesięciu linii męskosterylnych z cytoplazmą C na tle linii zawierających cytoplazmę Pampa. Cel tematu badawczego Proszę podać cel (jak w szczegółowym opisie) i napisać, czy cel został osiągnięty, ew. w jakim stopniu; jeśli cel nie został osiągnięty w całości podać przyczyny. Wstępna (jednoroczna) ocena ogólnej zdolności kombinacyjnej (OZK) linii męskosterylnych z cytoplazmą C i porównanie wyników z OZK linii zawierających cytoplazmę Pampa cel osiągnięty Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Ocena zdolności kombinacyjnej linii męskosterylnych została wykonywana w doświadczeniach polowych dwupowtórzeniowych założonych równolegle w trzech miejscowościach metodą wzorcową. Jako wzorce wykorzystano dwie odmiany mieszańcowe: Stakkato F i Brasetto F. Wielkość poletek doświadczalnych do zbioru: m. Oceniono plon i podstawowe cechy użytkowe (wysokość, wyleganie, odporność na choroby). Wyniki (opisać) Plonowanie wszystkich badanych mieszańców z cytoplazmą C mieściło się w przedziale 9% plonu wzorca (tab..). Większość porównywanych mieszańców z cytoplazmą Pampa plonowała wyraźnie lepiej. Dotyczyło to zarówno mieszańców eksperymentalnych uzyskanych przy zastosowaniu tej samej populacji syntetycznej SR, jak i zarejestrowanych odmian mieszańcowych produkowanych na bazie systemu. Wśród najlepiej plonujących obiektów znalazły się trzy mieszańce eksperymentalne (plon między, a % wzorca) oraz dwie odmiany wzorcowe Brasetto F i Stakkato F. Wśród obiektów mających cytoplazmę Pampa, których plon pozostawał na poziomie porównywalnym do badanych dziesięciu mieszańców z cytoplazmą C (poniżej 9% plonu wzorca) było osiem eksperymentalnych mieszańców i odmiana liniowo-populacyjna Gradan F. Badane w doświadczeniu obiekty wykazywały niewielkie zróżnicowanie pod względem wczesności i typ cytoplazmy nie miał na tę cechę istotnego wpływu (tab..). Wysokość roślin badanych mieszańców wahała się w dość szerokich granicach. Do najniższych form mierzących około cm należały dwie odmiany wzorcowe i jeden z mieszańców ekperymentalnych z cytoplazmą Pampa. Wszystkie mieszańce z cytoplazmą C
były wyższe, ale między nimi różnice były dość znaczące. Dwa z nich miały wysokość poniżej cm, czyli mniejszą niż średnia dla całego doświadczenia, sześć mieściło się w przedziale - cm, a dwa ostatnie (ZUT i ZUT) miały około cm i były najwyższymi formami wśród badanych (tab..). Wysokość roślin w niewielkim stopniu wpływała na skłonność do wylegania badanych mieszańców. Wyleganie w doświadczeniu było dość silne, a niskie odmiany wzorcowe nie były pod tym względem bardziej odporne od pozostałych badanych obiektów. Najlepszy wskaźnik odporności na wyleganie uzyskał średnio wysoki mieszaniec z linią ZUT9 mającą cytoplazmę C (tab..). Porażenie przez rdzę brunatną w całym doświadczeniu było bardzo silne. Jedynie cztery eksperymentalne mieszańce z cytoplazmą P wykazywały wyraźnie wyższą odporność (ocena powyżej ). Wśród nich dwa należały do grupy najlepiej plonujących. Odmiany wzorcowe i pozostałe badane obiekty były silnie porażone przez rdzę, a mieszańce z cytoplazmą C nie rózniły się pod tym względem od reszty genotypów (tab..). Mączniak występował w bardzo zróżnicowanym nasileniu, a wśród mieszańców z cytoplazmą C były zarówno te najsilniej porażone (ocena ), jak i najodporniejsze (ocena w skali 9-stopniowej).
Tabela. Średni plon ziarna oraz inne cechy użytkowe mieszańców F zaobserwowane w doświadczeniu z mieszańcami żyta założonym metodą wzorcową w trzech miejscowościach. Pogrubioną czcionką zaznaczono mieszańce z. Lp. Nazwa mieszańca Plon Plon Termin WysoWyleRdza Mączniak (kg/pol.) [% kłoszeni kość ganie brunatna wz.] a [dni od [cm]..] SP/A,,, SP/A,,,,, SP/A,9,,,, STAKKATO(Wz),,, 9,, BRASETTO(Wz), 99,,,,, SP/A,9 9,,,,, SP/A, 9,,, SP/A, 9,,,,,, 9 9B/A, 9,,,,, TUR, 9,,,,, SP/A, 9,,,,,, SP/A, 9,,,,,, B/A, 9,,, SP/A, 9,,,,, SP/A, 9,,,,, ZUT, 9,,,,, SP/A, 9,,, SP/A,,9,, 9 ZUT,,9,,, SP/A,,,,,,, ZUT,,,,,, ZUT9,9,,,,, ZUT9,,,,,,, B/A,,,,,,, ZUT,,,,,,, SP/A,,,,,, ZUT,,,,,, GRADAN,9,,,,, 9 ZUT,,,,,, ZUT,,,,,, SP/A,,,,,,, SP/A,,,, SP/A,,,,, ZUT,,,,, Średnia ogólna,,9 9,,9,, Średnia dla wzorców,,,,, Załączniki:. Stojałowski S., Hanek M., Bobrowska-Chwat A., Myśków B.,. Comparative mapping of major restorer genes in two sterility-inducing cytoplasms of rye. III Ogólnopolska Konferencja Genetyka i genomika w doskonaleniu roślin uprawnych od rośliny modelowej do nowej odmiany Program i streszczenia, Poznań, - listopada, ISBN 9----9 : oraz reprint posteru (-). 9
Załącznik