Kontrola ekspresji genów przez hipoksję Wykład 9 Biochemia stresu oksydacyjnego Literatura: Grzegorz Bartosz Druga twarz tlenu Barry Halliwell & John Gutteridge Free radicals in biology and medicine
Hipoksja fizjologiczne i biochemiczne mechanizmy reakcji na niedobór tlenu Biochemiczne mechanizmy regulacji aktywności czynnika transkrypcyjnego HIF-1: rola hydroksylacji i hydroksylaz prolinowych.
dolne drogi oddechowe górne drogi oddechowe UKŁAD ODDECHOWY CZŁOWIEKA Funkcje układu oddechowego: Zapewnia wymianę gazową między organizmem a otoczeniem Oczyszcza, ogrzewa i nawilża wdychane powietrze Pomaga w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej Pobiera tlen i przekazuje go do krwi, a odbiera z niej i usuwa z organizmu dwutlenek węgla
dolne drogi oddechowe górne drogi oddechowe UKŁAD ODDECHOWY CZŁOWIEKA Funkcje układu oddechowego: Zapewnia wymianę gazową między organizmem a otoczeniem Oczyszcza, ogrzewa i nawilża wdychane powietrze Pomaga w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej Pobiera tlen i przekazuje go do krwi, a odbiera z niej i usuwa z organizmu dwutlenek węgla
WENTYLACJA PŁUC Wymianę gazową w płucach warunkuje sprawne współdziałanie układów wentylacyjnego i krążeniowego Układ wentylacyjny płuc ma za zadanie usuwać dwutlenek węgla i dostarczać tlen do pęcherzyków płucnych Krążenie płucne zapewnia ciągły przepływ krwi przez układ naczyń włosowatych płuc, dzięki temu nadmiar dwutlenku węgla przenoszony jest do pęcherzyków płucnych, a tlen przechodzi z pęcherzyków płucnych do krwi Mechanika oddychania polega na cyklicznych ruchach oddechowych klatki piersiowej na zasadzie pracy pompy ssącej, które poprzez zmianę ciśnienia powodują przepływ powietrza do płuc i z płuc na zewnątrz, czyli powodują ich wentylację
WYMIANA GAZOWA Wymiana gazowa w płucach odbywa się dzięki różnicy ciśnień tlenu i dwutlenku węgla we krwi tętniczej i żylnej
WYMIANA GAZOWA CA CO 2 + H 2 O <=> H + + HCO 3 - Anhydraza węglanowa (CA) katalizuje odwracalną reakcję powstawania jonu wodorowęglanowego HCO 3 - z wody i dwutlenku węgla.
Ciśnienie parcjalne tlenu w różnych tkankach i narządach jest różne 21% ~0.1-1.5 % ~15-20% ~5 % ~14 % ~0.5-2.5 % Brahimi-Horn et al., 2007
HIPOKSJA Stan kliniczny, w którym utlenowanie tkanek jest niewystarczające Może występować zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych Może dotyczyć całego organizmu lub ograniczać się do jednego narządu http://www.diffusionpharma.com/?page_id=15
Uszkodzenie mięśnia sercowego Wrodzone wady serca Choroby układu oddechowego Choroby układu krążenia
RODZAJE HIPOKSJI Wyróżniamy 5 rodzajów hipoksji: 1. anoksyczna (hipoksyczna) - zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach 2. histotoksyczna - spowodowana zahamowaniem procesów utleniania w tkankach, najczęściej w wyniku zatruć (np. cyjankiem potasu, tlenkiem węgla) 3. zastoinowa (krążeniowa) - spowodowana przez spowolniony przepływ krwi przez narządy 4. wysokościowa - niedotlenienie tkanek podczas pobytu na znacznych wysokościach nad poziomem morza 5. anemiczna - w wyniku zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. po krwotoku lub zatruciu tlenkiem węgla, zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych
HIPOKSJA HIPOKSYCZNA Zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach spowodowane: niskim ciśnieniem parcjalnym tlenu w powietrzu atmosferycznym zaburzeniami oddychania (choroby serca lub płuc) obecnością ciał obcych w drogach oddechowych obturacją oskrzeli copyright 1999-2010 Getty Images, Inc.
HIPOKSJA HISTOTOKSYCZNA Zahamowanie czynności enzymów biorących udział w reakcjach wykorzystujących tlen (mimo dostępności tlenu tkanki nie są zdolne do jego wykorzystania, co wywołuje sytuację analogiczną do jego braku). cyjanek (CN - ) siarkowodór (H 2 S) azydek tlenek węgla (CO) Działanie trujące polega na blokowaniu procesu oddychania na poziomie komórkowym poprzez nieodwracalną inhibicję oksydazy cytochromowej, będącej kluczowym enzymem łańcucha oddechowego (kompleks IV) i fosforylacji oksydacyjnej. T. F. Cummings, Occupational Medicine 2004
HIPOKSJA ZASTOINOWA Powstaje wskutek niedokrwienia Może być przykładem hipoksji przewlekłej Uwarunkowana spowolnionym przepływem krwi przez narządy, np. w następstwie niewydolności mięśnia sercowego, wstrząsu, zakażenia lub oderwanej blaszki miażdżycowej blokującej światło naczynia Może prowadzić do uszkodzeń serca, wątroby, mózgu i nerek ischemic stroke udar niedokrwienny http://www.elements4health.com/oxygen-during-stroke-canreduce-damage-to-brain-tissue.html
HIPOKSJA WYSOKOŚCIOWA Choroba wysokościowa (choroba d'acosty, ang. acute mountain sickness, ASM) - Z reguły pojawia się na wysokościach powyżej 2500 m n.p.m., gdzie dostępność tlenu w powietrzu zaczyna być za mała na potrzeby organizmu człowieka Początkowo dochodzi do wzrostu ciśnienia krwi i tętna, a w dalszej kolejności do spadku ciśnienia krwi, co skutkuje omdleniem Zwiększa się ilość erytrocytów we krwi co powoduje jej zagęszczenie Może dojść do obrzęku płuc i obrzęku mózgu, a w przypadku braku interwencji lekarskiej ASM może zakończyć się zgonem Profilaktyka stopniowa, powolna aklimatyzacja i adaptacja do warunków panujących na dużych wysokościach Image courtesy Photographer: Jörg Jahn Agency: Dreamstime.com
HIPOKSJA ANEMICZNA zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. przez zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych pod wpływem dużego krwotoku Niewystarczające stężenie hemoglobiny (Hb) w krwinkach czerwonych, co powoduje zmniejszoną zawartość tlenu we krwi Odpowiedź organizmu: Stymulacja produkcji czerwonych krwinek
HIPOKSJA ANEMICZNA Odpowiedź organizmu: Stymulacja produkcji czerwonych krwinek Erytropoetyna (EPO) glikoproteinowy hormon peptydowy, którego główną funkcją jest stymulacja różnych etapów erytropoezy, co prowadzi do zwiększenia produkcji erytrocytów przez szpik kostny.
OBJAWY NIEDOTLENIENIA Niedotlenienie objawia się różnie w zależności od prędkości pojawiania się, stopnia obniżenia prężności tlenu oraz od możliwości rekompensowania niedoboru tlenu Znaczne niedotlenienie pojawiające się nagle (np. dekompresja kabiny samolotu) wywołuje utratę przytomności w ciągu 15-20 sekund, a po upływie ok. 5 minut prowadzi do nieodwracalnego zniszczenia tkanki mózgowej Ostre niedotlenienie objawia się zaburzeniami koordynacji ruchowej, niewyraźną mową, może również prowadzić do utraty przytomności Przy niedotlenieniu przewlekłym (choroba serca lub płuc, długotrwałe przebywanie na wysokości 3500-6000 m n.p.m.) pojawia się duszność, trudności w oddychaniu, występuje oddech typu Cheyne'a-Stokesa (cykle narastających a następnie zmniejszających się ruchów oddechowych powtarzane w nieregularnych odstępach) Klinicznie objawy niedotlenienia: sinica (widoczna najlepiej na wargach, płatkach usznych i pod płytkami paznokciowymi), tachykardia oraz wzrost częstości i głębokości oddychania
Reakcja komórek na obniżone ciśnienie parcjalne tlenu 1) Odpowiedź ostra poprzez aktywację kanałów jonowych wrażliwych na tlen; w komórkach dochodzi do szeregu zmian związanych z pobudliwością, kurczliwością i funkcjami wydzielniczymi 2) Odpowiedź przewlekła poprzez wzrost ekspresji czynników transkrypcyjnych indukowanych niedotlenieniem (HIFs ang. hypoxia inducible factors), które z kolei zmieniają ekspresję genów kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy tlenu i ułatwiające adaptację komórek do hipoksji Lopez-Barneo, J Appl Physiol, 2004
ODPOWIEDŹ OSTRA Kłębek szyjny (łac. glomus caroticum; ang. carotid body) chemoreceptor obwodowy, okrągły twór o średnicy około 4-6 milimetrów, leżący w rozwidleniu tętnicy szyjnej wspólnej. Jest unaczyniony przez gałązkę tętnicy szyjnej zewnętrznej a unerwiony jest przez gałązkę nerwu językowo-gardłowego. Ma właściwości chemorecepcyjne, jest wrażliwy na zwiększanie się stężenia dwutlenku węgla (hiperkapnia) spadek ciśnienia tlenu (hipoksja) kwasicę które pobudzając kłębek szyjny, doprowadzają do skurczu tętnic, zwolnienia akcji serca oraz hiperwentylacji. http://www.smkdds.com/cms/index.php?q=book/export/html/206
Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - model membranowy Reakcja komórek kłębka szyjnego na zmniejszone ciśnienie parcjalne tlenu depolaryzacja Lopez-Barneo et al., Eur Respir J, 2008
Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - model membranowy HIPOKSJA Zamknięcie kanału K + O 2 Depolaryzacja komórek kłębka typu I EGZOCYTOZA NEURO- TRANSMITERA Prawdopodobnie neurotransmiterem pobudzającym zakończenia nerwowe jest acetylocholina Pobudzenie zakończenia nerwowego Otwarcie kanałów Ca 2+ zależnych od potencjału
Model membranowy Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - model mitochondrialny potencjał oksydoredukcyjny Lahiri S et al., Progr Bioph Mol Biol, 2006
HIF-1 w roli łącznika? Postuluje się różne mechanizmy łączące zmiany zachodzące w mitochondriach oraz depolaryzację błony komórkowej i/lub uwalnianie neurotransmitera. Uważa się, iż jednym z czynników łączących te dwa zjawiska może być czynnik transkrypcyjny HIF-1, który odgrywa istotną rolę w utrzymaniu homeostazy tlenowej.
HIF-1 w roli łącznika? Komórki hodowane w warunkach obniżonego stężenia tlenu i w obecności inhibitorów łańcucha oddechowego w mitochondriach wykazują obniżoną aktywność czynnika HIF-1α. Baby, S.M. et al., communicated, 2005 U myszy pozbawionych jednego allelu genu Hif1α (Hif1α +/- ) dochodzi do upośledzenia depolaryzacji komórek kłębka w odpowiedzi na nagłą hipoksję i do braku poprawy wentylacji płuc. CIH ang. chronic intermittent hypoxia tzw. przerywana, przewlekła hipoksja, naśladująca epizody hipoksji obserwowane u chorych z zespołem bezdechu sennego Peng, YJ et al., J Physiol, 2006
HIF-1 HIF-1α + HIF-1β
CZYNNIKI INDUKOWANE NIEDOTLENIENIEM (HYPOXIA INDUCIBLE FACTORS HIFs) Badania poświęcone elementowi odpowiedzi na hipoksję (hypoxia response element - HRE) w genie erytropoetyny doprowadziły do odkrycia czynnika transkrypcyjnego HIF-1 przez Semenza G.L. w 1991 roku Mol. Cell. Biol. 12: 5447-5454. HIF-1 reguluje ekspresję wielu genów, m. in. erytropoezy, angiogenezy, enzymów szlaku glikolitycznego HIF-2 ma szczególne znaczenia dla stymulacji produkcji erytropoetyny w wątrobie Rola biologiczna HIF-3 nie jest do końca poznana, przy czym wiadomo, że przynajmniej jeden wariant splicingowy negatywnie reguluje ekspresję HIF-1 i HIF-2
AKTYWACJA I DEGRADACJA HIF-1α HIF-1β & Mole et al., IUBM, 2001
REGULACJA HIFα HIPOKSJA NORMOKSJA HIF-1 HYDROKSYLAZY PROLINOWE O 2 CO 2 2-KETOGLUTARAN Fe 2+ BURSZTYNIAN HIF-1 OH OH pvhl stabilizacja zależna od ubikwityny degradacja w proteasomach e.g. VEGF
HIF-1α protein is stabilized in hypoxia Acker & Plate 2007
CZYNNIKI INDUKOWANE NIEDOTLENIENIEM HIFs to heterodimer zbudowany z podjednostek: HIF i HIF O 2 + 2-ketoglutaran PHDs CO 2 + bursztynian FIH-1 P402 P564 N803 p300 N-TAD C-TAD P402 P564 N803 HIF-1α bhlh PAS ODD TAD p300 P405 P531 N847 HIF-2α bhlh PAS ODD TAD p300
Prolyl hydroxylases are iron-dependent dioxygenases involved in HIF-1α degradation PHD1 hydroxylacja P402 & P564 PHD2 - hydroxylacja P402 & P564 PHD3 - hydroxylacja P564 kofaktory: tlen, żelazo, α-ketoglutaran, kwas askorbinowy
AKTYWACJA I DEGRADACJA HIF-1α Lahiri S et al., Progr Bioph Mol Biol, 2006
ODPOWIEDŹ PRZEWLEKŁA Utrzymanie optymalnej dostawy tlenu Erytropoeza Erytropoetyna Transport żelaza Transferyna Receptor transferyny Ceruloplazmina O 2 HIF-1 Kontrola układu naczyniowego Angiogeneza VEGF VEGFR-1 PAI-1 Napięcie ściany naczyń inos endotelina-1 oksygenaza hemowa -1 (HO-1) Regulacja proliferacji i żywotności Zatrzymanie cyklu komórkowego p21 Autofagia BNIP3 Czynniki wzrostowe IGF-1 białka wiążące IGF-1 i 3 (IGFBP-1 i 3) Metabolizm energetyczny komórki Glikoliza LDH kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) aldolaza A i C Transport glukozy transporter glukozy 1 i 3 (GLUT1 i 3) Inne białka Dehydrogenaza fosfo-3-glicerolu
Zmiany metaboliczne w komórce niedotlenionej HIF-1 wzrost ekspresji transporterów glukozy GLUT1 oraz GLUT3; wzrost ekspresji enzymów glikolitycznych; wzrost ekspresji dehydrogenazy mleczanowej A (LDH-A); wzrost ekspresji dehydrogenazy pirogronianowej (PDK); zmiana w podjednostce COX (COX4-1 na COX4-2); W odpowiedzi na niedotlenienie, wzrost aktywności HIF-1 prowadzi do zwiększonego transportu glukozy do komórek, nasilenia glikolizy, konwersji pirogronianu do mleczanu, autofagia mitochondriów proces adaptacyjny służący ochronie komórki przed skutkami stresu i śmiercią Cadenas et al., cardiovasc Res, 2010
HIF-1 vs HIF-2 HIF-1 HIF-2 Element odpowiedzi na hipoksję (HRE) 5 -A/GCGTG-3 kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) dehydrogenaza mleczanowa (LDH) anhydraza węglanowa IX (CAIX) BNIP-3 VEGF adrenomedullina GLUT-1,-3 erytropoetyna Oct-4 (Oct-3/4) CYCLIN D1 TWIST1 TGF-
HIF-1 vs HIF-2 HIF-1 ulega ekspresji w wielu różnych tkankach i narządach, natomiast ekspresja HIF-2 jest ograniczona do następujących: płuca serce nerki śródbłonek naczyniowy
HIF-1 vs HIF-2 HIF-2α jest stabilizowany w wyższych stężeniach tlenu akumulacja HIF-2α w niedokrwionych organach wskazuje, iż czynnik ten może odgrywać istotną rolę w procesie adaptacji do hipoksji w warunkach hipoksji (1% O 2 ), HIF-1α ulega przejściowej stabilizacji i powoduje szybką odpowiedź tkanek na hipoksję, natomiast HIF-2α ulega stopniowej, powolnej akumulacji i powoduje późną odpowiedź tkanek na hipoksję Patel and Simon, Cell Death and Differentiation 2008 Lorenz Poellinger, communicated Smolenice 2010
HIPOKSJA W LABORATORIUM
INNE SPOSOBY STYMULACJI HIFs HIPOKSJA NORMOKSJA HIF-1 stabilizacja HYDROKSYLAZY PROLINOWE O 2 CO 2 2-KETOGLUTARAN DMOG Fe 2+ BURSZTYNIAN HIF-1 OH OH pvhl Deferoksamina CoCl 2 zależna od ubikwityny degradacja w proteasomach e.g. VEGF
DMOG (Dimethyloxaloylglycine) Inhibitor kompetycyjny wrażliwych na tlen hydroksylaz prolinowych (PHDs) Stabilizuje ekspresję HIF w warunkach normalnego (fizjologicznego) ciśniania parcjalnego tlenu Powszechnie stosowany jako czynnik naśladujący hipoksję DMOG 2-ketoglutaran
MODEL IN VITRO Human Microvascular Endothelial Cells (HMEC-1) ważna funkcja w procesie angiogenezy unieśmiertelniona linia komórkowa produkują VEGF w ilościach możliwych do oznaczenia dostępnymi testami ELISA produkują duże ilości IL-8
AKTYWACJA HIFs W HMEC-1 Western blot HIF-1α HIF-2α normoxia hypoxia α-tubulin normoxia hypoxia α-tubulin control DMOG 500 µm HIF-1α α-tubulin control DMOG 500 µm HIF-2α α-tubulin
AKTYWACJA HIFs W HMEC-1 HIF-1α α-tubulin control AdGFP 100 MOI 10 50 100 AdHIF-1α (MOI) HIF-2α α-tubulin control AdGFP 100 MOI 10 50 100 AdHIF-2α (MOI)
luciferase activity HIF1α activity [% of control] AKTYWACJA HIFs W HMEC-1 Badanie aktywności genu reporterowego HRE luciferaza EMSA 0 30 1h 3h 6h 12h 24h HIF-1 HRE hypoxia response element element odpowiedzi na niedotlenienie [relative units] 3 2 1 0 HIFs # control 250 1000 # DMOG ( M) TransAm ELISA 800 600 400 200 0 DMOG 250 μm # control DMOG DMOG + DMOG + Wild type Mutated competitor competitor # p<0,05 vs control, *p<0,05 vs cells treated with DMOG *
VEGF mrna [relative expression] Aktywacja HIFs zwiększa ekspresję VEGF VEGF promoter activity [% of control] VEGF mrna [relative expression] Badanie aktywności genu reporterowego 1500 * VEGF promotor lucyferaza 1000 * 500 Real-time PCR 0 AdGFP AdHIF-1α AdHIF-2α 3 * 20 * 2 1 10 0 AdGFP AdHIF-1α 0 AdGFP AdHIF-2α *p<0,05 vs AdGFP Florczyk et al., in preparation
control 3h DMOG 3h Aktywacja HIFs zwiększa ekspresję VEGF control 6h DMOG 6h VEGF protein [% of control] control 12h DMOG 12h control 24h DMOG 24 h VEGF protein [% of control] Northern blot ELISA 500 # 400 300 VEGF 200 100 ELISA 800 * 0 normoxia hypoxia 600 * 400 200 0 AdGFP AdHIF-1α AdHIF-2α # p<0,05 vs normoxia, *p<0,05 vs AdGFP Florczyk et al., in preparation
INNE SPOSOBY STYMULACJI HIFs HYPOXIA PROLYL HYDROXYLASES HIF-1 O 2 CO 2 Fe 2+ 2-OXOGLUTARATE SUCCINATE NORMOXIA HIF-1 OH OH pvhl stabilization Deferoksamina CoCl 2 proteasomal degradation e.g. VEGF
CoCl 2 AKTYWUJE HIF Increase in HIF- protein levels by cobalt stimulation in osteoblast-like cells Kim at al., Cytokine. 2002
luciferase activity [% of control] CoCl 2 zwiększa aktywność HRE oraz aktywację promotora VEGF VEGF promoter luciferase HRE luciferase HRE 400 * * 300 200 100 0 control CoCl 2 250 M Loboda A et al., 2006
Deferoksamina lek stosowany w przedawkowaniu żelaza, chelatujący o dużym powinowactwie do jonów żelaza i glinu. Wskazania ostre zatrucie żelazem leczenie nadmiaru żelaza w organizmie rozpoznawanie poziomu żelaza i glinu w ustroju zatrucie glinem schorzenia układu kostnego zależne od glinu
REAKTYWNE FORMY TLENU vs HIF-1 Guzy and Schumacker, Exp Physiol, 2006
REAKTYWNE FORMY TLENU vs HIF-1 Hipoteza redystrybucji tlenu Hipoteza reaktywnych form tlenu (RFT) zakłada, iż mitochondrialna oksydaza cytochromowa mająca większe powinowactwo do tlenu niż do PHDs i FIH-1 w warunkach hipoksji zmniejsza dostępność tlenu dla tych enzymów, hamując ich aktywność, co prowadzi do stabilizacji HIF-α. zakłada, iż zwiększenie produkcji O 2 przez mitochondrialny kompleks III podczas hipoksji prowadzi do zwiększenia poziomu RFT w cytoplaźmie, które bezpośrednio lub pośrednio hamują aktywność PHDs i FIH-1 zwiększając poziom HIF-α. Stachurska A et al, Postępy Biochemii, 2010
HIPOTEZA REAKTYWNYCH FORMY TLENU ROS mogą hamować aktywność PHDs na kilka sposobów: mogą wpływać na szlaki przekazywania sygnału prowadząc do potranslacyjnych modyfikacji PHDs mogą modyfikować mostki disiarczkowe w PHDs mogą utleniać Fe 2+ zmniejszając jego dostępność dla PHDs HYDROKSYLAZY PROLINOWE O 2 CO 2 Fe 2+ α-ketoglutaran BURSZTYNIAN Stachurska A et al, Postępy Biochemii, 2010
REAKTYWNE FORMY TLENU vs HIF-1 TR reduktaza tioredoksyny Hagen T. Biochem Res Int. 2012
CYKL KWASU CYTRYNOWEGO vs HIF-1 Mitochondria mogą regulować aktywność HIF nie tylko przez RFT, ale również poprzez związki uczestniczące w cyklu kwasu cytrynowego, który ma miejsce w macierzy mitrochondrialnej. szczawiooctan HIF-1α fumaran PHDs bursztynian
Aktywacja HIF-1 niezależna od hipoksji Czynniki wzrostu: PDGF TGF-β HGF CoCl 2 trombina HIF-1α NO angiotensyna II CO LPS Cytokiny: IL-1 TNF-α siarkowodór Wiele z tych czynników może działać poprzez generację RFT
Siarkowodór aktywuje HIF-1 in vivo Caenorhabditis elegans 0,5% 50ppm Wzrost ekspresji HIF-1 i translokacja do jądra komórkowego (50ppm) (0,5%) Budde & Roth, Mol Biol Cell, 2010
Aktywacja HIF-1 przez tlenek węgla powietrze CO (250 ppm) Makrofagi RAW 264.7 Western blot EMSA Aktywność genu reporterowego po transfekcji phif-1α-luc Immunofluorescencja CO indukuje także ekspresję HIF-1 in vivo Tu: makrofagi pęcherzykowe wyizolowane z myszy C57Bl/6 po ekspozycji na CO lub powietrze przez 2 h CORM cząsteczka uwalniająca tlenek węgla, ang. carbon monoxide releasing molecule Chin BY, PNAS, 2007
NOWOTWORY vs HIPOKSJA 21% ~0.1-1.5 % ~15-20% ~5 % ~14 % ~0.5-2.5 %
NOWOTWORY vs HIPOKSJA
Wpływ HIF-1 na metabolizm niedotlenionej komórki nowotworowej W wyniku zwiększonej glikolizy w komórce wzrasta stężenie kwasu mlekowego, co prowadzi do obniżenia ph. HIF-1 przywraca prawidłową wartość ph poprzez: Indukcję ekspresji białka przezbłonowego monocarboxylate transporter 4 (MCT4), które transportuje cząsteczki kwasu mlekowego na zewnątrz komórki Indukcję ekspresji dwóch izoform anhydrazy węglanowej (CA IX i CA XII) CO 2 + H 2 O <=> H + + HCO 3 - Brahimi-Horn et al., Curr Opin Genet & Dev, 2010
Promieniooporność komórek nowotworowych
Nowotwory oporne na radioterapię Prawidłowe ciśnienie parcjalne tlenu w czasie naświetlania powoduje większą promieniowrażliwość niż jakiekolwiek inne efekty metaboliczne w komórce Niedotlenione komórki są ok. 3 razy mniej wrażliwe na fotonowe promieniowanie jonizujące. Wynikają stąd istotne implikacje kliniczne w radioterapii guzów, w których część słabo unaczyniona i tym samym niedotleniona jest znacznie mniej wrażliwa na napromienianie Przyczyną tego efektu jest fakt wiązania się tlenu z miejscem uszkodzenia DNA wywołanego promieniowaniem jonizującym (bezpośrednie oddziaływanie promieniowania na komórkę). Tlen, będąc najbardziej powinowatą elektronowo cząsteczką w komórce, reaguje nadzwyczaj szybko z wolnym elektronem wolnego rodnika, przez co utrwala uszkodzenie w strukturze DNA. W przypadku nieobecności tlenu wiele z powstałych uszkodzeń może być przywróconych do ich prawidłowej struktury, przez donację wodoru od niebiałkowych grup tiolowych w komórkach
Pośrednie oddziaływanie promieniowania jonizującego na komórkę (poprzez RFT) Reakcja Habera-Weissa Reakcja Fentona H 2 O OH. Uszkodzenia DNA OH. H. H 2 O 2 H 2 O 2 Reakcja Fentona Mutacje popromienne nie są skutkiem bezpośredniego uszkodzenia DNA przez promieniowanie jonizujące (lub pośredniego przez RFT) lecz działania układu, który dokonuje szybkiej, ale niedokładnej naprawy nici DNA w przypadku dużych jej uszkodzeń.
EKSPRESJA HIF-1 w RADIOTERAPII Dewhirst MW et al., Nature Rev Cancer, 2008
Próby wykorzystania drobnocząsteczkowych inhibitorów HIF-1 w terapii nowotworów Chetomin hamuje przyłączenie białka p300 koaktywatora czynnika transkrypcyjnego HIF HIF-1β & Mole et al., IUBM, 2001
VEGF [% of control] Próby wykorzystania drobnocząsteczkowych inhibitorów HIF-1 w terapii nowotworów HIF-1 HIF-1 CHETOMIN p300/cbp HIF-1 HIF-1 p300/cbp Chetomin hamuje przyłączenie białka p300 koaktywatora czynnika transkrypcyjnego HIF-1 p300/cbp HIF-1 TRANSCRIPTION 600 500 400 300 200 100 0 control # * * * DMOG 500 M 10 nm 30 nm 90 nm Wśród badanych inhibitorów są ponadto echinomycyna i syntetyczne poliamidy, które blokują wiązanie się HIF-1 z DNA, topotekan oraz inne nieselektywne inhibitory HIF-1. chetomin
Zahamowanie HIF-1 jako forma terapii anty-nowotworowej Mapy tlenowe pomogą w leczeniu nowotworów Dr hab. Martyna Elas Generatory tlenu Implantable Micro Oxygen Generator (IMOG) wszczepialny mikrogenerator tlenu IEEE Trans Biomed Eng. 2011 Nov;58(11):3104-11 An ultrasonically powered implantable micro-oxygen generator (IMOG). Maleki T, Cao N, Song SH, Kao C, Ko SC, Ziaie B. In this paper, we present an ultrasonically powered implantable micro-oxygen generator (IMOG) that is capable of in situ tumor oxygenation through water electrolysis. Such active mode of oxygen generation is not affected by increased interstitial pressure or abnormal blood vessels that typically limit the systemic delivery of oxygen to hypoxic regions of solid tumors. Wireless ultrasonic powering (2.15 MHz) was employed to increase the penetration depth and eliminate the directional sensitivity associated with magnetic methods. In addition, ultrasonic powering allowed for further reduction in the total size of the implant by eliminating the need for a large area inductor. IMOG has an overall dimension of 1.2 mm 1.3 mm 8 mm, small enough to be implanted using a hypodermic needle or a trocar. In vitro and ex vivo experiments showed that IMOG is capable of generating more than 150 μa which, in turn, can create 0.525 μl/min of oxygen through electrolytic disassociation. In vivo experiments in a well-known hypoxic pancreatic tumor models (1 cm (3) in size) also verified adequate in situ tumor oxygenation in less than 10 min.
PODSUMOWANIE Hipoksja to stan, w którym stopień utlenowania tkanek jest niewystarczający Związanie czynnika HIF-1 ze specyficzną sekwencją DNA (5 - (A/GCGTG-3 ), tzw. elementem odpowiedzi na niedotlenienie (HRE), oraz przyłączenie szeregu kofaktorów uruchamia transkrypcję wielu genów, których produkty białkowe są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy tlenu i ułatwiają adaptację komórek do hipoksji Wiele czynników może aktywować HIF-1 niezależnie od hipoksji, np. poprzez RFT, zmniejszając tym samym skuteczność terapii antynowotworowych
Zapraszam na wykład 10 Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej