MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 253-258 Joanna Siennicka, Agnieszka Trzcińska DIAGNOSTYKA WIRUSOWYCH ZAKAŻEŃ OŚRODKOWEGO UKŁADU NERWOWEGO ANALIZA WYNIKÓW RUTYNOWYCH BADAŃ LABORATORYJNYCH Zakład Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: doc. dr hab. B. Litwińska Przedstawiono zestawienie wyników rutynowych badań laboratoryjnych w kierunku neuroinfekcji o etiologii wirusowej, wykonanych w laboratorium Zakładu Wirusologii NIZP-PZH w latach 2006-2007. Wirusowe zakażenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) przebiegają najczęściej pod postacią ZOMR - zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (meningitis), ZM zapalenia mózgu (encephalitis), bądź ZRK - zapalenia rdzenia kręgowego (myelitis). Możliwe są również inne zespoły kliniczne, wynikające z zajęcia różnych rejonów OUN (6). Spośród patogenów wirusowych wykazujących neurotropizm należy wymienić przede wszystkim herpeswirusy (HSV, CMV, VZV, EBV, HHV-6 i 7), wirusy odry, różyczki, nagminnego zapalenia przyusznic (nzp), odkleszczowego zapalenia mózgu (kzm), wścieklizny i HIV. W 2005 roku zarejestrowano w Polsce 2 806 przypadków ZM i ZOMR, które w większości (52,4%) przypadków miały podłoże wirusowe (9). Szacuje się, że za około 1000-1600 stwierdzanych rocznie przypadków ZOMR odpowiadają głównie enterowirusy, przede wszystkim ECHO oraz Coxackie A i B, podczas gdy 600-700 przypadków ZM związanych jest głównie z kzm i HSV (6). Potwierdzenie wirusowej etiologii zakażenia OUN i rozpoznanie czynnika patogennego może mieć zasadnicze znaczenie dla postępowania terapeutycznego, szczególnie w obliczu dostępnej obecnie chemioterapii przeciwwirusowej. Celem pracy była analiza wyników uzyskanych w ramach rutynowych badań próbek materiału klinicznego dostarczanych do Zakładu Wirusologii NIZP-PZH w celu diagnostyki zakażenia OUN. MATERIAŁ I METODY W okresie 24 miesięcy (od stycznia 2006 r. do grudnia 2007 r.) skierowano do Zakładu Wirusologii NIZP-PZH 729 zleceń na badania w kierunku neuroinfekcji u pacjentów w wieku od 3 dni do 83 lat (średnia 34,64+/-20,89). Materiały, płyn mózgowo-rdzeniowy (pmr) w liczbie n=277 oraz pmr łącznie z surowicą (n=452) nadesłano z 82 ośrodków medycznych w Polsce. Zgodnie z profilem badań wykonywanych w laboratorium Zakładu Wirusologii NIZP-PZH, w nadsyłanych materiałach prowadzono oznaczenia w kierunku
254 J. Siennicka, A. Trzcińska Nr 3 11 zakażeń wirusowych: HSV, CMV, EBV, VZV, HHV-6, HHV-7, wirusem kzm, odry, nzp, różyczki i enterowirusami. Badania przeprowadzano metodą ELISA, PCR i metodą izolacji wirusa w hodowli komórkowej. Obecność przeciwciał w klasie IgM i IgG w surowicy oraz obecność przeciwciał IgG w pmr oznaczano w przypadku HSV, CMV, EBV, VZV, enterowirusów, wirusa nzp, kzm, odry i różyczki. Wykrywanie DNA patogenu w pmr prowadzono w przypadku HSV, CMV, EBV, VZV, HHV-6 i HHV-7. Ponadto, w przypadku HSV oznaczano intratekalną syntezę przeciwciał klasy IgG, określając stosunek wirusowo-swoistych do całkowitych IgG w surowicy i pmr pacjenta (antibody index - AI). Zastosowane kryteria laboratoryjnego potwierdzenia zakażenia to: pozytywny wynik badania pmr metodą PCR i/lub obecność przeciwciał klasy IgM w surowicy; pozytywny wynik izolacji wirusa z pmr; wartość współczynnika AI>1,5. Rodzaj wykonywanych oznaczeń był ściśle uzależniony od informacji zawartych w skierowaniu przesyłanym wraz z materiałami. WYNIKI Skierowania na badania laboratoryjne w większości analizowanych przypadków (62,4%) nie zawierały rozpoznania klinicznego, lub jedynie informację, że celem badania jest potwierdzenie neuroinfekcji. W pozostałych przypadkach badania wykonywano u osób, u których rozpoznano ZM (13,4%), ZOMR (11,1%), ZOMR i ZM (4,4%), ZR (1,0%), ZM i ZR (0,6%), oraz u pacjentów (7,1%), u których stwierdzono między innymi zespół Guillain-Barre, otępienie, SSPE, SM, demencję, leukoencefalopatię, demielinizację OUN, wrodzone CMV, wieloogniskową neuropatię, porażenie nerwu VII, zapalenie nerwu II, obrzęk mózgu, ospę wrodzoną, padaczkę. Tabela I. Wyniki badań laboratoryjnych potwierdzających zakażenie wirusowe u pacjentów diagnozowanych w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH w latach 2006-2007 w kierunku neuroinfekcji. Liczba przypadków Czynnik Rozpoznanie kliniczne Kryterium potwierdzenia patogenny (jeśli podane) 48 kzm IgM 48/48 ZOMR, ZM, ZOMR i ZM 40 HSV AI>1,5 PCR 25/40 12/40 ZOMR, ZM, ZOMR i ZM, demencja, PML, zmiany w mózgu AI>1,5 i PCR IgM 1/40 2/40 1 HSV/odra IgM 1/1 Brak danych 1 HSV/VZV AI>1,5, IgM 1/1 Brak danych 2 CMV IgM 1/2 ZM, wrodzone CMV PCR 1/2 3 EBV PCR 3/3 Brak danych 2 enterowirusy Izolacja 1/2 ZM IgM 1/2 1 nzp IgM 1/1 ZM 1 odra IgM 1/1 SSPE 5 VZV IgM PCR i IgM 3/5 2/5 ZOMR, ZM, ZR
Nr 3 Diagnostyka zakażeń wirusowych OUN 255 Tabela II. Metody potwierdzające zakażenie wirusowe u pacjentów diagnozowanych w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH w latach 2006-2007 w kierunku neuroinfekcji. metoda Liczba wykonanych Liczba wyników % wyników oznaczeń pozytywnych pozytywnych Oznaczanie miejscowej syntezy IgG 187 27 14,4 PCR w pmr 316 20 6,3 ELISA (obecność IgM w surowicy) 610 63 10,3 Izolacja wirusa w pmr 1 1 100 Spośród 729 skierowań z prośbą o potwierdzenie podejrzenia zakażenia wirusowego większość dotyczyła diagnostyki w kierunku zakażenia HSV (59,7%) i kzm (35,8%), zlecanych jako pojedyncze badania lub łącznie z oznaczeniami dla innych patogenów. Znaczny odsetek (13,9%) zleceń dotyczył badania w kierunku 3 i więcej patogenów wirusowych. Potwierdzenie zakażenia wirusowego uzyskano u 104 (14,3%) spośród 729 badanych pacjentów. Najwyższą liczbę potwierdzeń uzyskano w stosunku do zakażenia wirusem odkleszczowego zapalenia mózgu (Tabela I), gdzie na 261 zleconych badań w 48 (18,4%) przypadkach uzyskano pozytywny wynik oznaczeń IgM w surowicy pacjentów. Stosując podane powyżej kryteria, zakażenie HSV rozpoznano u 40 (9,2%) spośród 435 pacjentów, u których zlecono badania w tym kierunku. Metody, przy użyciu których uzyskano najwyższą liczbę potwierdzeń (Tabela II) to określanie miejscowej syntezy przeciwciał klasy IgG w OUN (14,4%) i obecności IgM w surowicy (10,3%). Mając do dyspozycji jedynie płyn mózgowo-rdzeniowy (n=277 przypadków), potwierdzenie wirusowej etiologii zakażenia uzyskano w 13 (4,7%) przypadkach: metodą PCR w pmr dla HSV (n=9), CMV (n=1), EBV (n=1), VZV (n=1), oraz w jednym przypadku metodą izolacji wirusa Coxackie B. Należy podkreślić, że w większości przypadków (54,5%) jednostka przysyłająca do badania jedynie pmr, w skierowaniu zlecała oznaczenia przeciwciał, najczęściej dla kzm (n=83), z reguły jako pojedyncze badanie (n=77). Spośród 452 przypadków, w których do badania przysłano zarówno pmr, jak i surowicę pacjenta, potwierdzenie etiologii wirusowej uzyskano w 91(20,1%) przypadkach. DYSKUSJA Zakażenia ośrodkowego układu nerwowego są trudnym problemem diagnostycznym zarówno dla klinicystów jak i mikrobiologów (2). Dlatego też wydaje się, że wypracowanie zasad kompleksowej diagnostyki i współpracy między ośrodkami klinicznymi a laboratorium może przyczynić się do zmniejszenia tych trudności. Mając na względzie dane epidemiologiczne za rok 2005 (9), należy zwrócić uwagę, że etiologiczny czynnik aseptycznego zapalenia OUN ustalono jedynie w 3% przypadków ZOMR i 20% ZM. Przyjmując, że liczba rozpoznawanych przypadków w Polsce jest mniej więcej stała, należy zaznaczyć, że w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH diagnozowana jest ich znaczna część (około 25%). Z zebranych danych epidemiologicznych wynika, że za większość rozpoznanych zakażeń odpowiedzialny jest wirus kzm i HSV (9), co pozostaje w zgodzie z wynikami prezentowanej tu analizy, gdzie większość zlecanych i potwierdzonych przypadków dotyczyła tych dwóch patogenów.
256 J. Siennicka, A. Trzcińska Nr 3 Jak wspomniano powyżej, znajomość możliwości diagnostycznych danego laboratorium jest bardzo istotnym elementem procesu diagnostyki neuroinfekcji. Wiadomo jednocześnie, że badanie metodą PCR staje się metodą z wyboru w diagnostyce wielu zakażeń wirusowych. W przypadku neuroinfekcji stwierdzenie to jest szczególnie prawdziwe w stosunku do zakażeń herpeswirusami (1). Należy zauważyć, że zakres badań diagnostycznych wykonywanych w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH obejmuje wykonywanie oznaczeń metodą PCR dla wszystkich herpeswirusów neurotropowych. Jednocześnie należy zauważyć, że odsetek potwierdzeń uzyskiwanych w wyniku badania metodą PCR wyniósł jedynie 6,3%. Jednocześnie odsetek potwierdzeń etiologicznego udziału HSV w neuroinfekcji uzyskanych na drodze oznaczania miejscowej syntezy wirusowo-swoistych przeciwciał klasy IgG w OUN wyniósł 14,4%. Należy zaznaczyć, że diagnostyka oparta o wyznaczanie wartości współczynnika AI, w świetle opracowanych pierwotnie przez Tourtellotte (10) i rozwiniętych przez Reibera (7) zasad wymaga ilościowego wyznaczenia 2-3 parametrów w 2 materiałach diagnostycznych równoczasowo pobranej surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym. Taki sposób diagnostyki ma niewątpliwie duże znaczenie w przypadku zakażeń herpeswirusowych, w których seroprewalencja jest bardzo wysoka, a ze względu na zdolność tych wirusów do ustalania latencji, możliwe są częste zakażenia nawrotowe. Natomiast w przypadku zakażeń takich jak kzm, przyjęto, że obecność przeciwciał klasy IgM w surowicy pacjenta wykazującego zespół objawów neurologicznych jest wystarczającym dowodem na udział tego patogenu w obserwowanym procesie patologicznym. Podobne kryteria rozpoznania przyjęto w stosunku do zakażeń, dla których w momencie opracowywania niniejszej analizy niedostępne były wyniki badania metodą PCR. Doceniając zalety metody PCR należy jednakże mieć na względzie również jej ograniczenia. I tak na przykład, pozytywny wynik badania zarówno dla EBV, jak i HHV-6 należy interpretować ostrożnie, ze względu na możliwość obecności materiału genetycznego tych patogenów w pmr bez bezpośredniego związku przyczynowo-skutkowego zakażenia z obserwowanym stanem patologicznym (1,2,3). Ponadto, przy zlecaniu a następnie interpretacji wyników (np. PCR versus intratekalna synteza IgG) zawsze należy brać pod uwagę czas trwania zakażenia, mając na względzie fakt, że oznaczanie syntezy wirusowo-swoistych przeciwciał w OUN ma wartość retrospektywną. Niektórzy autorzy (4) zalecają równoległe wykonywanie oznaczeń metodą PCR i określania intratekalnej syntezy w celu zwiększenia prawdopodobieństwa określenia czynnika etiologicznego zakażenia. Znamiennym wydaje się fakt znacznie wyższego odsetka rozpoznania wirusowego czynnika etiologicznego w przypadku zlecenia badania w kierunku określonego patogenu niż w sytuacji, kiedy zlecano wykonanie oznaczeń dla 3 i więcej wirusów (14,8% versus 10,9%), podobnie jak w przypadku badania jedynie pmr w porównaniu do wyników uzyskiwanych na podstawie oznaczeń prowadzonych w parze materiałów (4,7% versus 20,1%).Wpływ na wyniki w tym ostatnim przypadku miał przede wszystkim zakres zlecanych badań. Jako że obecność przeciwciał klasy IgG w pmr sama w sobie jest mało informatywna, zlecenie oznaczenia obecności jedynie przeciwciał (co dotyczyło połowy przypadków, w których badaniu podlegał tylko pmr) należy uznać za nieporozumienie. Osobnego omówienia wymagają przypadki współistnienia zakażeń. W prezentowanej analizie sytuacja ta dotyczyła 2 pacjentów. W surowicy pierwszego pacjenta, 21-letniej osoby pochodzącej z Rzeszowa, stwierdzono obecność przeciwciał klasy IgM zarówno dla HSV, jak i wirusa odry, przy równoczesnej obecności IgG w surowicy i nieobecności
Nr 3 Diagnostyka zakażeń wirusowych OUN 257 przeciwciał tej klasy dla obu wirusów w płynie mózgowo-rdzeniowym. Prawdopodobnym wytłumaczeniem tego faktu, może być supresyjne działanie wirusa odry (5), co mogło być przyczyną reaktywacji zakażenia HSV. W drugim przypadku, u pacjenta w wieku 38 lat z Warszawy stwierdzono intratekalną syntezę przeciwciał anty-hsv (AI=1,69) oraz obecność przeciwciał klasy IgM anty-vzv w surowicy. Nie wykonywano oznaczeń metodą PCR. Podobne przypadki były opisywane w literaturze. Schulze i wsp. (8), którzy poddali retrospektywnej analizie wyniki badania 1155 par materiałów (pmr/surowica) stwierdzili, że znaczny odsetek pacjentów, u których potwierdzono zakażenie VZV i/lub HSV (na podstawie oznaczeń inratekalnej syntezy IgG) wykazuje pozytywny wynik syntezy dla obu patogenów (11 z 55 pacjentów). Stwierdzona u omawianego pacjenta koinfekcja mogła być wynikiem załamania odporności na skutek zakażenia VZV, lub stanem po przebyciu, nawet w odległej przeszłości neuroinfekcji o etiologii HSV. PODSUMOWANIE 1. Diagnostyka laboratoryjna neuroinfekcji z podejrzeniem etiologii wirusowej wymaga ścisłej współpracy ośrodka klinicznego z laboratorium. 2. Przesłanie do badania pary materiałów (płyn mózgowo-rdzeniowy i równoczasowo pobrana surowica) w znacznym stopniu zwiększa prawdopodobieństwo określenia czynnika etiologicznego. 3. Zakres zlecanych oznaczeń (np. synteza przeciwciał w OUN versus PCR) powinien uwzględniać dynamikę procesu chorobowego. J. Siennicka, A. Trzcińska CENTRAL NERVOUS SYSTEM VIRAL INFECTIONS ANALYSIS OF ROUTINE LABORATORY RESULTS SUMMARY The most of registered in Poland cases of encephalitis and meningitis have viral aetiology. Confirmation of viral central nervous system (CNS) infection and diagnosis of pathogenic agent is critical for therapeutic treatment, especially if antiviral chemotherapy is available. The aim of this work was analysis of routine laboratory results obtained in Laboratory of Department of Virology NIZP-PZH by examination of materials obtained from 82 medical canters in Poland in aim of CNS infection confirmation. Materials, cerebrospinal fluid (CSN) n=277, and CSN together with serum (n=452) were obtained from patients aged from 3 days to 83 years. Accordingly with the range of tests performed in Laboratory of Department of Virology NIZP-PZH, obtained samples were examinated for 11 viral infections: HSV, CMV, EBV, VZV, HHV-6, HHV-7, TBE, measles, mumps, rubella and enteroviruses. Confirmation of viral infection was obtained in 104 out of 729 tested patients (14,3%). The highest number of confirmations was obtained in case of TBE infection (18,4%) and HSV (9,2%). The methods gave the highest number of confirmations were testing of intrathecal IgG synthesis (14,4%) and presence of IgM in serum (10,3%). If test was conducted only with CSF, confirmation of viral infection was obtained in 13 cases (4,7%). In conclusions it was ascertained that testing CSF and serum samples together greatly increase possibility of etiological agent detection and a range of ordered tests (i.e. intrathecal synthesis versus PCR) should account dynamics of pathological process.
258 J. Siennicka, A. Trzcińska Nr 3 PIŚMIENNICTWO 1. Bovin G. Diagnosis of herpesvirus infections of central nervous system. HERPES.. 2004; 11(Suppl 2): 48-56. 2. Calvario A, Bozzi A, Scarasciulli M i inni. Herpes Consensus PCR test: a useful diagnostic approach to the screening of viral diseases of the central nervous system. J Clin Virol. 2002;25 (Suppl 1):71-8. 3. Davies NW, Brown LJ, Gonde J i inni. Factors influencing PCR detection of viruses in cerebrospinal fluid of patients with suspected CNS infections. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2005;76(1):82-7. 4. Fomsgaard A, Kirkby N, Jensen IP, Vestergaard BF. Routine diagnosis of herpes simplex virus (HSV) encephalitis by an internal DNA controlled HSV PCR and an IgG-capture assay for intrathecal synthesis of HSV antibodies. Clin Diagn Virol. 1998;9:45-56. 5. Kerdiles YM, Sellin CI, Druelle J, Horvat B. Immunosuppression caused by measles virus: role of viral proteins. Rev Med Virol. 2006;16:49-63. 6. Lipkowski D. Wirusowe zakażenia ośrodkowego układu nerwowego. W: Choroby zakaźne i pasożytnicze. Red. J. Cianciara, J. Juszczyk. Czelej sp. z o.o. 2007, str:212-221. 7. Reiber H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-csf barrier function and to dysfunction in neurological diseases. J Neurol Sci. 1994;122:189-203. 8. Schultze D, Weder B, Cassinotti P i inni. Diagnostic significance of intrathecally produced herpes simplex and varizella-zoster virus-specific antibodies in central nervous system infections. Swiss Med Wkly. 2004;134:700-4. 9. Stefanoff P, Rosińska M. Zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i zapalenia mózgu w 2005. Przegl Epidemiol. 2007; 61:225-34. 10. Tourtellotte W. On cerebrospinal fluid immunoglobulin-g (IgG) quotients in multiple sclerosis and other diseases. A review and a new formula to estimate the amount of IgG synthesized per day by the central nervous system. J Neurol Sci. 1970;10:279-304. Otrzymano: 21 VII 2008 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii NIZP-PZH