Czy diagnostyka molekularna zakażeń grzybiczych ma znaczenie praktyczne? Anita Hryncewicz-Gwóźdź

Czy diagnostyka molekularna zakażeń grzybiczych ma znaczenie praktyczne? Anita Hryncewicz-Gwóźdź

Diagnostyka mikologiczna klasyczna

Badanie bezpośrednie Zeskrobiny ze zmian skórnych Zeskrobiny z materiału pod płytką paznokciową Widoczne nici grzybni Włosy Widoczne zarodniki o układzie endothrix lub ectothrix. Fluorescencja w lampie Wood a (UV 366nm)

Lampa Wooda (UV 366nm) M. canis zielona fluorescencja Możliwy nieprawidłowy odczyt: nie myć głowy przed badaniem, prawidłowe zaciemnienie pomieszczenia w którym przeprowadza się badanie. Inne substancje mogą powodować fluorescencję: dezodoranty, mydła, maści z petrolum Obecność Malassezia żółta fluorescencja

Badanie bezpośrednie

Badanie bezpośrednie - włos Układ zarodników ectothrix Układ zarodników endothrix

Hodowla Podłoże podstawowe- Sabourauda (pepton, glukoza, agar, chloramfenikol, aktidion) obserwacja 14 do 28 dni. Podłoże DTM (dermatophyt test medium) 1. Cechy makroskopowe hodowli 2. Cechy mikroskopowe 3. Dodatkowe testy umożliwiające różnicowanie gatunków

Test ureazowy na podłożu Chritensena T mentagrophytes zmienia barwę podłoża na czerwoną T rubrum nie zmienia barwy podłoża (uwaga: zanieczyszczenia bakterie zmieniają barwę podłoża)

Test włosowy T mentagrophyes - wynik dodatni T rubrum wynik ujemny

Podłoże płynne Sabourauda T. rubrum rośnie na dnie T. mentagrophytes rośnie na powierzchni (zanieczyszczenie pleśniowe rosną na powierzchni)

Podłoże ziemniaczane intensywniejsze zabarwienie podłoża przez T. rubrum

Czas niezbędny do wykonania badania mikologicznego metodą klasyczną Hodowla do 4 tygodni Testy dodatkowe ok. 1 tydzień Długi okres oczekiwania na wynik badania Możliwość kontaminacji przez grzyby środowiskowe w trakcie hodowli i wykonywania testów dodatkowych

Diagnostyka mikologiczna molekularna Krótki czas trwania badania - kilka godzin. Wysoka specyficzność i czułość.

Metody molekularne Określanie gatunku grzyba uzyskanego w hodowli na podłożach laboratoryjnych Wykrycie obecności grzyba w materiale uzyskanym od pacjenta Typowanie genetyczne szczepów np. T. rubrum w celach epidemiologicznych

Metody molekularne w diagnostyce dermatofitów Sekwencjonowanie DNA ustalenie gatunku grzyba z hodowli PCR amplifikacja fragmentów DNA wykrycie obecności grzyba w materiale biologicznym, ustalenie gatunku grzyba z hodowli Inne metody jak RFLP, RAPD typowanie genetyczne szczepów w obrębie gatunku

Sekwencjonowanie DNA Umożliwia ustalenie gatunku grzyba z hodowli (w przypadku trudności identyfikacji gatunku metodami klasycznymi brak charakterystycznych struktur grzybni, brak zarodników) Sekwencjonowanie fragmenu 28S rybosomalnego DNA GenBank database MicroSeq D2 Fungal database

PCR amplifikacja fragmentów DNA Powielanie wybranego fragmentu łańcucha DNA przy użyciu specyficznych starterów. Możliwe jest wykrycie obecności w badanym materiale minimalnych ilości poszukiwanego odcinka DNA. Detekcja produktu amplifikacji: elektroforeza produktu amplifikacji w żelu agarozowym i określenie jego wielkości na podstawie wysokości położenia prążka w żelu.

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Cel molekularny amplifikacji: Rybosomalne DNA Gen kodujący syntazę chityny Gen kodujący topoizmerazę II Sekwencje mikrosatelitarne Real time PCR

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Rybosomalne DNA Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC. Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J Clin Microbiol. 2007 Apr;45(4):1200-4. Trichophyton rubrum Turenne CY, Sanche SE, Hoban DJ, Karlowsky JA, Kabani AM. Rapid identification of fungi by using the ITS2 genetic region and an automated fluorescent capillary electrophoresis system. J Clin Microbiol. 1999 Jun;37(6):1846-51.

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Gen kodujący syntazę chityny Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC. Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J Clin Microbiol. 2007 Apr;45(4):1200-4. Dermatofity Kano R, Hirai A, Muramatsu M, Watari T, Hasegawa A. Direct detection of dermatophytes in skin samples based on sequences of the chitin synthase 1 (CHS1) gene. J Vet Med Sci. 2003 Feb;65(2):267-70.

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Gen kodujący topoizmerazę II Kanbe T, Suzuki Y, Kamiya A, Mochizuki T, Fujihiro M, Kikuchi A. PCR-based identification of common dermatophyte species using primer sets specific for the DNA topoisomerase II genes. J Dermatol Sci. 2003 Aug;32(2):151-61.

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Sekwencje mikrosatelitarne (tandemowe powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronukleotydowych sekwencji zwanych motywami) Kardjeva V, Summerbell R, Kantardjiev T, Devliotou-Panagiotidou D, Sotiriou E, Gräser Y. Forty-eight-hour diagnosis of onychomycosis with subtyping of Trichophyton rubrum strains. J Clin Microbiol. 2006 Apr;44(4):1419-27. Brasch J, Beck-Jendroschek V, Gläser R. Fast and sensitive detection of Trichophyton rubrum in superficial tinea and onychomycosis by use of a direct polymerase chain reaction assay. Mycoses. 2011 Sep;54(5):e313-7.

Opracowanie metody wykrywania dermatofitów w materiale od pacjenta, dla rutynowej diagnostyki labolatoryjnej Mała ilość etapów procedury ograniczenia ryzyka kontaminacji Prostota wykonania możliwość wdrożenia do laboratorium

Dostępne zestawy do wykrywania grzybów w materiale klinicznym Statens Serum Institut (Dania) Biotype Diagnostic GmbH (Niemcy)

Statens Serum Zestaw zawiera odczynniki wystarczające na przeprowadzenie 100 multipleksowych reakcji PCR. Institut

Duplex PCR Wykrywa: Dermatofity (pan-dermatophytes) Trichophyton rubrum. Przeznaczony do badania zakażenia paznokci stóp

Zastosowanie testu umożliwia wykrycie w materiale biologicznym DNA dermatofitów i Trichophyton rubrum w ciągu 5 godzin. Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC. Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J Clin Microbiol. 2007 Apr;45(4):1200-4.

Mieszanina starterów zawiera dwie pary starterów które zapoczątkowują amplifikację genów: syntetazy 1 chityny w celu wykrycia obecności dermatofitów ITS1 (internal transcribed spacer) w celu wykrycia T. rubrum

1 2 3 4 5 6 7 Wewnętrzna kontrola(~660 bp) Pan-dermatophytes (366 bp) T. rubrum (203 bp) studzienka 1: Marker molekularny DNA100 bp 2: DNA genomowe dermatofitów (Kontrola 1) 3: DNA genomowe dla T. rubrum (Kontrola 2) 4: materiał z paznokcia dodatni w kierunku dermatofitów 5: materiał z paznokcia dodatni w kierunku dermatofitów 6: materiał z paznokcia dodatni w kierunku T. rubrum 7: materiał z paznokcia ujemny. Badana próbka paznokcia pozytywna w kierunku T. rubrum daje najczęściej silny sygnał na wysokości 203 par zasad i słabszy (bądź zerowy) sygnał na wysokości 366 par zasad z powodu wysokiej liczby kopii regionu ITS1 w porównaniu z regionem chs1.

Reakcji multipleks-pcr, w skład której wchodzi mieszanina starterów zaprojektowanych dla genów specyficznych dla różnych gatunków lub rodzajów grzybów. Dermatofity, drożdże i grzyby pleśniowe

Epidermophyton floccosum Microsporum canis Microsporum gypseum T. rubrum T. interdigitale T. spp. Arthroderma benhamiae Candida spp. C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. krusei C. guilliermondii C. parapsilosis Trichosporon cutaneum Scopulariopsis brevicaulis Aspergillus spp. A. fumigatus A. flavus A. niger A. Versicolor

Mieszanina wielu par starterów

Porównanie metod klasycznej i molekularnej

Porównanie PCR i metody klasycznej 118 pacjentów z onychomykozą Duplex PCR Pan-dermatophytes T. rubrum KOH 38.1 % 22.9 % hodowla PCR 42.4 % 41.5 % Wzrost wykrywalności 4.3 % 18.6 % Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC. Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J Clin Microbiol. 2007 Apr;45(4):1200-4.

Porównanie PCR i metody klasycznej PCR + Hodowla + Duplex PCR 107 próbek z paznokci Kliniczne podejrzenie grzybicy 77 (72%) 63 T.rubrum 14 pan-dermatophytes 57 (53%) 38 (35%) dermatofity 19 niedermatofity Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 37% Chandran NS, Pan JY, Pramono ZA, Tan HH, Seow CS. Complementary role of a polymerase chain reaction test in the diagnosis of onychomycosis. Australas J Dermatol. 2013 May;54(2):105-8. Singapore

Porównanie PCR i metody klasycznej Duplex PCR 177 próbek z paznokci Kliniczne podejrzenie grzybicy Hodowla 59 (34%) PCR 78 (44%) Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 10% Kondori N, Abrahamsson AL, Ataollahy N, Wennerås C. Comparison of a new commercial test, Dermatophyte-PCR kit, with conventional methods for rapid detection and identification of Trichophyton rubrum in nail specimens. Med Mycol. 2010 Nov;48(7):1005-8. Göteborg,Sweden

Porównanie PCR i metody klasycznej 120 próbek z paznokci Kliniczne podejrzenie grzybicy KOH Hodowla PCR 35 (29,2%) 12 (10%) PCR pan-dermatophyt Gen topoizomerazy II 48 (40%) Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 30% Luk NM, Hui M, Cheng TS, Tang LS, Ho KM. Evaluation of PCR for the diagnosis of dermatophytes in nail specimens from patients with suspected onychomycosis. Clin Exp Dermatol. 2012 Apr;37(3):230-4. Hong Kong

Porównanie PCR i metody klasycznej Nested PCR Sekwencjonowanie fragmentu 28S rdna Hodowla+ Hodowla + PCR+ Hodowla PCR+ Hodowla- Głowa 23 14 12 18 Skóra 10 6 3 5 Paznokcie 23 20 4 9 W 7 przypadkach przy pomocy PCR zweryfikowano błedne rozpoznanie gatunku ocenianego na podstawie hodowli Verrier J, Krähenbühl L, Bontems O, Fratti M, Salamin K, Monod M. Dermatophyte identification in skin and hair samples using a simple and reliable nested polymerase chain reaction assay. Br J Dermatol. 2013 Feb;168(2):295-301. Lausanne, Switzerland

Porównanie PCR i metody klasycznej PCR pan-dermatophyt PCR gatunek Multiplex PCR Przebadano 107 próbek ze skóry gładkiej, głowy, paznokci z podejrzeniem grzybicy KOH Hodowla PCR Pan- dermatophyt PCR gatunek Multiplex PCR Pandermatophyt Multiplex PCR gatunek 42 28 45 45 45 41 Wrocław Praca doktorska Katarzyna Kalinowska

Możliwości diagnostyczne z użyciem dostępnych komercyjnie testów PCR Materiał biologiczny dermatofity. Dermatophyte PCR KIT, MycoDermQS PCR Amplification KIT T. rubrum Dermatophyte PCR KIT. Wysoka przydatność w rozpoznaniu grzybicy paznokci stóp (T. rubrum jest najczęstszym patogenem), MycoDermQS PCR Amplification KIT E. floccosum, M. canis M. gypseum T. rubrum, T. interdigitale, Trichophyton spp. MycoDermQS PCR Amplification KIT. Znaczna ilość gatunków dermatofitów brak możliwość detekcji przy zastosowaniu dostępnych komercyjnie testów opartych na metodzie PCR

Opracowywanie dalszych testów PCR Diagnostyka grzybicy skóry owłosionej głowy większa wrażliwość Trichophyton niż Microsporum na terbinafinę. Brillowska-Dabrowska A, Swierkowska A, Lindhardt Saunte DM, Arendrup MC. Diagnostic PCR tests for Microsporum audouinii, M. canis and Trichophyton infections. Med Mycol. 2010 May;48(3):486-90. Brillowska-Dabrowska A, Michałek E, Saunte DM, Nielsen SS, Arendrup MC. PCR test for Microsporum canis identification. Med Mycol. 2013 Aug;51(6):576-9.

Schemat diagnostyki mikologicznej z wykorzystaniem metod klasycznych i molekularnych opracowany przez Brillowską-Dabrowską A.

Znaczenie metod molekularnych Metody molekularne łącznie z metodami klasycznymi powinny być wykorzystywane w laboratoriach mikologicznych Wykorzystanie metod molekularnych może prowadzić do zmniejszenia ilości próbek badanych metodami klasycznymi. W przyszłości laboratorium mikologiczne które będzie wykonywało badania bezpośrednie, hodowle i będzie korzystało z metod molekularnych umożliwi szybką i poprawną identyfikacje gatunkową.

Przypadki kliniczne, w których dla oznaczenia gatunku dermatofita zastosowano metodę molekularną

Grzybica głowy z towarzyszącymi rozsianymi zmianami grudkowo-krostkowymi Przypadek kliniczny 5 letnia dziwczynka W krótkim czasie rozwinął się kerion Celsi w okolicy ciemieniowo skroniowej W wywiadzie nie podawano kontaktu z dziećmi lub zwierzętami z zakażeniem grzybiczym

Grzybica głowy z towarzyszącymi rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi Przypadek kliniczny Po miesiącu utrzymywania się zmian na skórze owłosionej głowy pojawiły się wykwity rumieniowe, grudkowe i krostkowe na twarzy

Grzybica głowy z towarzyszącymi rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi Przypadek kliniczny następnie na tułowiu i kończynach

Grzybica głowy z towarzyszącymi rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi Przypadek kliniczny Badanie mikologiczne ze zmiany w skórze owłosionej głowy dodatnie Bezpośrednie: zarodniki o układzie endothrix T. tonsurans (hodowla, metoda PCR) Dermatofit antropofilny Wywołuje grzybicę głowy PCR for T. tonsurans (173 bp) J. Brasch (najczęstszy czynnik etiologiczny grzybicy głowy w USA i Wielkiej Brytanii) Leczenie Terbinafina 125 mg/dobę przez 12 tygodni

Tinea incognito Przypadek Tinea Gladiatorum 23 letni pacjent Skierowany do Kliniki Dermatologicznej z podejrzeniem Erythema gyratum repens Trenował zapasy Pierwsze zmiany rumieniowo złuszczające w okolicy skroniowej pojawiły się rok wcześniej. Leczone miejscowo preparatami przeciwgrzybiczymi (bez diagnostyki mikologicznej). Nawrót zmian zlokalizowanych na skórze owłosionej głowy i ramionach.

Tinea incognito Przypadek Podejrzewano podłoże alergiczne zmian skórnych. Pacjentowi ordynowano leczenia kortykosteroidam miejscowe i ogólne. Stopniowo zmiany uległy dalszemu rozsiewowi, zajmowały tułów, twarz i kończyny.

Tinea incognito Przypadek Badanie mikologiczne: dodatnie T. tonsurans. Dermatofit antropofilny Wywołuje zakażenie skóry owłosionej głowy (najczęstszy czynnik etiologiczny grzybicy głowy w USA i Wielkiej Brytanii) W Polsce stanowi 4,6% dermatofitów (w Europie 1%) Zakażenia wśród sportowców trenujących zapasy. Terapia: terbinafina 4 tygodni, miejscowo preparaty azolowe. PCR dla T. tonsurans (173 bp)

Podsumowanie Zastosowanie procedur wykorzystujących metody klasyczne i molekularne w laboratoriach mikologiczych skrócą czas oczekiwania na wynik badania i zwiększą ich czułość. Metody molekularne są pomocne w oznaczeniu gatunku grzyba uzyskanego w hodowli (w przypadkach wątpliwych - pleomorfizm). Typowanie genetyczne szczepów dermatofitów umożliwi prowadzenie dokładniejszych badan epidemiologicznych.