Piekarski R. i inni: Ocena komórek NKT u dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1 Vol. 12/2013 Nr 1(42) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Ocena komórek NKT u dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1 Natural Killer T Cells (NKT) in Children with New Onset Type 1 Diabetes 1 Robert Piekarski, 1 Leszek Szewczyk, 2 Agnieszka Bojarska-Junak, 2 Jacek Roliński 1 Klinika Endokrynologii i Diabetologii Dziecięcej UM, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie Adres do korespondencji: dr n. med. Robert Piekarski, Klinika Endokrynologii i Diabetologii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, 20-093 Lublin, ul. Chodźki 2, e-mail: r.piekarski@wp.pl Słowa kluczowe: cukrzyca typu 1, komórki NKT Key words: type 1 diabetes, Natural Killer T Cells (NKT) STRESZCZENIE/ABSTRACT Wstęp. Komórki NKT (natural killer T cells) są heterogenną grupą komórek odgrywającą istotną rolę w odpowiedzi immunologicznej, wpływając na czynność m.in. komórek dendrytycznych, limfocytów T, B, Tregs poprzez wydzielane liczne cytokiny. Wydaje się, że dzięki wydzielanemu profilowi cytokin Th2-podobnym mogą pełnić funkcję ochronną przed chorobami o podłożu autoimmunologicznym, w tym cukrzycy typu 1. Celem naszego badania była ocena krążących NKT (TCR Vα24-JαQ) u dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1 w porównaniu do dzieci zdrowych. Materiał i metody. Do badań włączono grupę 32 dzieci w wieku średnio 10 ± 5 lat, ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1. Analizowano odsetek komórek inkt+/cd3+ wśród limfocytów CD3 oraz odsetek inkt3+/cd161+, inkt+/cd4+ i NKT+/CD8+ wśród komórek inkt. Wyniki. We krwi dzieci chorych na cukrzycę typu 1 stwierdzono, że średni odsetek inkt+/cd3+/cd161+ wynosił 51,11 ±19,60% i był istotnie niższy (p<0,05) niż w grupie dzieci zdrowych 76,56±16,7%. Wnioski. Wykazane różnice analizowanych populacji komórek układu immunologicznego zachęcają do bardziej szczegółowej analizy zaobserwowanych zależności, bowiem wydają się wskazywać na pewne zaburzenia badanej populacji komórek u dzieci z cukrzycą typu 1, co może mieć znaczenie w patogenezie tej choroby. Endokrynol. Ped. 12/2013;1(42):9-16. Introduction. NKT cells (natural killer T cells) are a heterogeneous group of cells that plays an important role in the immune response affecting the activity including dendritic cells, T cells, B cells, Tregs through several secreted cytokines. It seems that by their production of Th2 cytokines, NKT may have a protective role against autoimmune diseases, including type 1 diabetes. The aim of our study was to evaluate circulating natural killer T cells (NKT) in children with new onset type 1 diabetes and comparison to a group of healthy children. Materials and methods. The study group comprised 32 children, mean age 10 ± 5 years, with newly diagnosed type 1 diabetes. We analyzed the percentage of inkt+/cd3+/cd161+, inkt+/cd4+ and inkt+/cd8+ cells. Results. In the blood of children with type 1 diabetes the average percentage of inkt+/cd3+/cd161+ was 51.11 ±19.60% and was significantly lower (p <0.05) than in healthy children 76.56 ± 16.7%. Conclusions. The demonstrated differences of the analyzed 9
Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 12/2013;1(42):9-16 population of immune system cells encouraging more detailed analysis of the observed dependence, because they seem to indicate certain disturbances in investigated population of cells in children with type 1 diabetes. Pediatr. Endocrinol. 12/2013;1(42):9-16. Wstęp Cukrzyca typu 1 jest chorobą o podłożu autoimmunizacyjnym, w której inicjacji jak i modulowaniu odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko antygenom komórek β wysp trzustkowych ważną rolę odgrywa wiele różnych populacji komórek immunokompetentnych. W ujęciu klasycznym cukrzyca typu 1 należy do chorób autoimmunologicznych, w których odpowiedź ze strony układu immunologicznego ogranicza się do konkretnego narządu, a właściwie grupy komórek, gdzie w lokalnych węzłach chłonnych autoreaktywne limfocyty CD4 + ulegają aktywacji, stymulując odpowiedź Th1 i w efekcie apoptozę komórek beta wysp trzustki na drodze mechanizmów zależnych od limfocytów cytotoksycznych, komórek NK, makrofagów [1]. Wiadomo obecnie, że w patogenezie zaburzeń w cukrzycy bardzo ważną rolę odgrywają limfocyty T regulatorowe i ostatnio intensywnie badane Th17 [2, 3]. Coraz więcej jest dowodów na potencjalny udział w rozwoju insulitis, a później cukrzycy innej interesującej populacji limfocytów T komórek NKT [4, 5]. Limfocyty T natural killer (NKT) to specyficzna populacja limfocytów o potencjalnej roli immunoregulatorowej zależnej w przeciwieństwie do konwencjonalnych limfocytów T od prezentacji antygenów lipidowych lub glikolipidowych w kontekście cząsteczki CD1d [6]. Dlatego też komórki NKT są główną subpopulacją limfocytów T rozpoznającą własne lub obce antygeny lipidowe, które nie są rozpoznawane przez klasyczne limfocyty. Stanowią stosunkowo nieliczną (ok. 0,01 0,1%) subpopulację limfocytów we krwi obwodowej człowieka, którą wyróżnia ekspresja klasycznego receptora dla limfocytów T (TCR) αβ oraz markerów typowych dla komórek NK, takich jak CD161 [7]. W przeciwieństwie do klasycznych limfocytów łańcuch α TCR charakteryzuje się stałą budową Vα24-Jα18 u człowieka i Vα14-Jα18 u myszy, ograniczona jest również liczba łańcuchów TCRβ Vβ11 u człowieka oraz Vβ2, Vβ7 i Vβ8.2 u myszy [8]. Komórki NKT wykazują z reguły fenotyp komórek aktywowanych lub komórek pamięci, poprzez wydzielane liczne cytokiny: IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-13, IL-17,IL-21, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF oraz chemo- kiny wpływając na czynność m.in. komórek dendrytycznych, limfocytów T, B, Tregs, mogą pobudzać odporność komórkową przeciwko nowotworom, mikroorganizmom zakaźnym, ale wydaje się również, że dzięki wydzielanemu profilowi cytokin Th2-podobnym paradoksalnie mogą również hamować reakcje komórkowe związane z chorobami autoimmunologicznymi, w tym cukrzycy typu 1 i reakcję odrzucania przeszczepu [7, 9, 10]. NKT (inkt) były opisywane jako potencjalnie immunoregulatorowe limfocyty w cukrzycy typu 1 i innych chorobach autoimmunologicznych [11]. Obserwacje z badań na mysim modelu cukrzycy t.1 wskazywały na ważną rolę inkt w patogenezie tej choroby [12, 13]. Celem naszego badania była ocena krążących inkt (TCR Vα24-JαQ) u dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1 w porównaniu do dzieci zdrowych. Materiał i metody Do badań włączono grupę 32 dzieci w wieku średnio 10 ± 5 lat ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1. Między 14 a 21 dniem od rozpoznania cukrzycy po wcześniejszym wyprowadzeniu z ketozy i uzyskaniu względnego wyrównania glikemii dokonano analizy badanych populacji komórek przy pomocy cytometrii przepływowej. Grupę odniesienia stanowiło 20 zdrowych dzieci. Wszystkie osoby w czasie badań oraz w okresie miesiąca poprzedzającego badania nie wykazywały cech infekcji, nie przyjmowały leków mających wpływ na układ immunologiczny, nie miały też wykonywanej transfuzji krwi. Z badań zostały wykluczone osoby podające w wywiadzie choroby alergiczne. Protokół badania został zaakceptowany przez lokalną Komisję Bioetyczną. Pacjenci oraz ich rodzice wyrazili zgodę na badania. U wszystkich badanych dzieci badano poziom C-peptydu metodą elektrochemiluminescencji dla pośredniej oceny funkcji jeszcze czynnych komórek beta wysp trzustki oraz miano przeciwciał przeciw dekarboksylazie kwasu glutaminowego (a-gad) i przeciw fosfatazie tyrozyny (IA2) metodą ELISA firmy Immunotech, potwierdzając autoimmunologiczne podłoże cukrzycy. 10
Piekarski R. i inni: Ocena komórek NKT u dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1 Parametry immunologiczne: oceniany odsetek komórek inkt+/cd3+ wśród limfocytów CD3 oraz inkt+/cd3+/cd161+, inkt+/cd4+ i inkt+/cd8+ wśród komórek inkt poddano analizie w cytometrze przepływowym FACSCalibur (Becton Dickinson) przy pomocy programu CellQuest Pro. Izolacja komórek mononuklearnych z krwi obwodowej Krew obwodową rozcieńczono zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej PBS bez soli wapnia i magnezu (Biochrome AG, Niemcy) w proporcji 1:1. Rozcieńczoną krew nawarstwiono na preparat Gradisol L (Aqua Medica, Polska) o ciężarze właściwym 1,077 g/ml. Komórki wirowano w gradiencie gęstości przez 20 minut przy przyspieszeniu 700xg. Uzyskane komórki płukano dwukrotnie w roztworze PBS bez Ca 2+ i Mg 2+. Następnie oceniono ich ilość w komorze Neubauera i żywotność za pomocą błękitu trypanu (0,4% Trypan Blue Soulution, Sigma, Niemcy). Żywotność poniżej 90% dyskwalifikowała komórki z dalszych badań. Oznaczanie odsetka limfocytów NKT Do oznaczenia odsetka komórek NKT użyte zostały przeciwciała przeciwko następującym antygenom: CD3PE, CD4PE, CD8PE-Cy-5, CD161PE- Cy-5, anty- inkt PE-Cy-5. Zawiesinę wyizolowanych komórek rozdzielano do poszczególnych probówek w ilości 2x10 6 komórek w 100 μl PBS na każdą próbkę. Do zawiesiny komórek mononuklearnych dodawano 20 μl przeciwciał monoklonalnych w odpowiednich kombinacjach. Po dokładnym wymieszaniu przeprowadzano 20 min. inkubację w ciemności w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji komórki płukano dwukrotnie w PBS w czasie 5 min. przy przyspieszeniu 250 xg. Po odwirowaniu komórki poddawano analizie cytometrycznej. Wyniki podano jako odsetek limfocytów inkt+/cd3+ wśród limfocytów CD3 (Rycina 1) oraz odsetek inkt+/cd3+/cd161+, inkt+/ CD4+ i inkt+/cd8+ wśród komórek inkt. Równocześnie przeprowadzano standardowe kliniczne monitorowanie przebiegu cukrzycy (badanie lekarskie, ocena glikemii, ketonemii, glikacji białek, dobowego zapotrzebowania na insulinę). Analiza statystyczna Analizę statystyczną otrzymanych wyników przeprowadzono przy pomocy programu STATI- STICA 10 PL. Zgodność rozkładu poszczególnych zmiennych w obrębie grup z rozkładem normalnym sprawdzono przy pomocy testu W Shapiro-Wilka. Ponieważ badane zmienne nie miały rozkładu normalnego, do analizy użyto testów nieparametrycznych U Manna Whitneya do oceny różnic pomiędzy grupami i współczynnika korelacji rang Spearmana do oceny zależności pomiędzy zmiennymi. Otrzymane wyniki przedstawiono jako: medianę i wartość najmniejszą szeregu statystycznego (Min.) oraz wartość największą szeregu statystycznego (Maks.). Wyniki jako istotne statystycznie przyjmowano przy poziomie istotności p 0.05. Wyniki Charakterystyka kliniczna dzieci: Nie wykazano istotnej statystycznie różnicy pomiędzy dziećmi z nowo rozpoznaną cukrzycą a dziećmi zdrowymi w zakresie takich parametrów, jak wiek, płeć, BMI. W grupie dzieci z nowo rozpoznaną cukrzycą średni poziom HbA1c wynosił 9,2 ± 1,8 %, stwierdzono u nich obniżony poziom C-peptydu śr. 0,58 ± 0,31 ng/ml oraz wyraźnie podwyższone miana przeciwciał a-gad 348,32 ± 584,61 UI/ml i przeciwciał a-ia2 397,17 ± 379,28 UI/ml. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w odsetku komórek inkt+/cd3+ pomiędzy dziećmi chorymi na cukrzycę typu 1 a grupą dzieci zdrowych. Przykładową analizę cytometryczną ocenianej populacji komórek u jednego z badanych dzieci ilustruje rycina 1. Nie stwierdzono również istotności statystycznej w odsetku komórek inkt+/cd4+ oraz inkt+/cd8+ między badanymi grupami. Jednak, we krwi dzieci chorych na cukrzycę typu 1 stwierdzono, że średni odsetek komórek inkt+/ CD3+/CD161+ wynosił 51,11 ±19,60% i był istotnie niższy (p<0,05) niż w grupie dzieci zdrowych 76,56±16,7% (ryc. 2). Analizie zostały poddane także zależności pomiędzy parametrami immunologicznymi a wybranymi parametrami laboratoryjnymi. Stwierdzono w grupie dzieci z nowo rozpoznaną cukrzycą statystycznie znamienną dodatnią korelację pomiędzy odsetkiem komórek inkt+/cd3+/cd161+ a poziomem C-peptydu (R=0,47, p<0,05) (ryc. 3). Dyskusja Cukrzyca typu 1 jest chorobą o podłożu autoimmunizacyjnym, w której odpowiedź immunologiczna skierowana przeciwko antygenom komórek β wysp trzustkowych doprowadza do ich zniszczenia 11
Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 12/2013;1(42):9-16 Ryc. 1. Przykład analizy cytometrycznej komórek inkt+/cd3+ u pacjenta z cukrzycą typu 1. W oparciu o układ współrzędnych FSC/SSC tworzono bramkę limfocytarną (R1) w obrębie której dokonywano akwizycji min. 100 000 komórek na pojedynczą analizowaną próbkę. W grupie limfocytów z bramki R1 wyodrębniano populację CD3+ (bramka R2) poprzez jej uwidocznienie w układzie współrzędnych SSC/CD3 PE. Pośród komórek CD3-dodatnich określenono odsetek limfocytów inkt+/cd3+ (prawy górny kwadrant) Fig. 1. The cytometric analysis of inkt+/cd3+ cells within inkt in patient with type 1 DM. Identification of inkt+/cd3+ cells was made according to characteristic of morphological features for lymphocytes (forward scatter/side scatter) (gate R1) and then after selection of cells with expression of CD3 (gate R2) and inkt+/cd3+ (phenotype of cells inkt +CD3+) Ryc. 2. Odsetek komórek inkt+/cd3+/cd161+ w świeżo rozpoznanej cukrzycy w porównaniu do dzieci zdrowych Fig 2. Percentage of inkt+/cd3+/cd161+ cells in new onset type 1 DM in comparison to healthy children 12
Piekarski R. i inni: Ocena komórek NKT u dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1 Ryc. 3. Korelacja odsetka komórek inkt+/cd3+/cd161+ z stężeniem peptydu c we krwi dzieci chorych na cukrzycę typu 1 Fig. 3. Correlation between a percentage of inkt+/cd3+/cd161+ cells and C-peptide in children with type 1 DM i bezwzględnego niedoboru insuliny. W jej patogenezie biorą udział czynniki genetyczne [14] i immunologiczne, począwszy od zaburzenia centralnych mechanizmów autotolerancji [15] poprzez aktywację komórek dendrytycznych (DC), które w lokalnych węzłach chłonnych aktywują autoreaktywne limfocyty T [16, 17], do zaburzenia immunoregulacji ze strony limfocytów T regulatorowych (Tregs) [18]. Ten opis zaburzeń immunologicznych, doprowadzających w końcu do zniszczenia komórek beta wysp trzustkowych przez różne populacje komórek efektorowych i w efekcie do rozwoju cukrzycy typu 1, wydaje się wciąż niewystarczający. Obiektem zainteresowania naszych badań była populacja komórek tzw. inkt, łącząca cechy klasycznych limfocytów T (obecność TCR) z komórkami NK (obecność antygenu CD161) [19]. Dotychczas w literaturze ukazało się niewiele doniesień określających udział inkt w rozwoju cukrzycy typu 1, jednak te nieliczne mogą wskazywać na potencjalne zaangażowanie tych komórek w hamowaniu rozwoju procesu autoimmunologicznego w obrębie wysp trzustki. Pierwsze prace opierające się na modelu mysim cukrzycy (myszy NOD) wskazywały zarówno na zaburzenia odsetka, jak i funkcji komórek inkt [20,21]. Badacze wykazali zmniejszony odsetek komórek inkt u myszy NOD, które ponadto cechowały się zmniejszoną sekrecją dwóch cytokin IL-4 (stymulacja komórek przy udziale TCR) oraz INFγ (stymulacja komórek IL-12) [22]. Potwierdzeniem potencjalnej roli komórek inkt w hamowaniu rozwoju cukrzycy u myszy NOD była praca badaczy Lehuen i wsp. [23], którzy dokonali transferu oczyszczonych komórek inkt od transgenicznych myszy z nadekspresją genu kodującego Vα14 TCR, uzyskując u biorców zahamowanie procesu autoimmunologicznego na poziomie insulitis. Własne badania kliniczne przeprowadzone na populacji dzieci z nowo rozpoznaną cukrzycą również mogą sugerować potencjalną rolę tych komórek w patogenezie cukrzycy typu 1. 13
Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 12/2013;1(42):9-16 Wydaje się, że komórki inkt mogą korzystnie regulować odpowiedź immunologiczną na drodze różnych uzupełniających się mechanizmów: hamowania odpowiedzi Th1 poprzez wpływ hamujący różnicowanie autoreaktywnych L T, skierowanych przeciwko komórkom beta wysp trzustki, stymulacje klonalnej anergii autoreaktywnych L T, stymulację różnicowania w kierunku Th2, a ponadto przez stymulację i rekrutację tolerogennych komórek dendrytycznych czy wreszcie pobudzanie dojrzewania limfocytów T regulatorowych [4]. Dowodem na udział komórek inkt w polaryzacji odpowiedzi immunologicznej w kierunku Th2 są prace, w których zastosowanie powtarzanych iniekcji α-galaktozyloceramidu (α-galcer) zwiększało istotnie odsetek aktywowanych inkt, wydzielających również zwiększone ilości IL-4 i IL-13, co wiązało się z prewencją rozwoju cukrzycy [24 26]. Jednakże zaobserwowany przez Shi i wsp. [27] wczesny początek rozwoju cukrzycy u myszy transgenicznych CD1d - nie wiązał się z zaburzeniem równowagi Th1/Th2, wskazując na inny mechanizm regulacji odpowiedzi immunologicznej indukowanie energii autoreaktywnych L T, które były niezdolne do proliferacji i różnicowania w kierunku Th1 [27, 28]. Co więcej Novak i wsp. udowodnili, że in vitro inkt hamują różnicowanie limfocytów Th1 nawet w warunkach braku w mikrośrodowisku cytokin promujących odpowiedź Th2, jak IL-4, IL- 10, IL-13, wskazując również na istotne znaczenie kontaktu bezpośredniego inkt z komórkami prezentującymi antygen czy Tregs [29]. Przyjmuje się, że działanie supresorowe inkt wymaga obecności powierzchniowych molekuł, jak CD1d, CTLA4, OX40 czy PD1-L [30]. Przedstawione wyżej zaburzenia populacji inkt oraz potencjalnej roli tych komórek w hamowaniu rozwoju cukrzycy w modelu zwierzęcym umożliwiły zapoczątkowanie podobnych badań u ludzi. Nasze obserwacje również mieszczą się w tym nurcie badawczym. Pierwsze prace, w których identyfikowano komórki inkt jako CD4 - CD8 - Vα24-JαQ L T, podobnie jak w modelu mysim, wskazywały na zaburzenia odsetka NKT, jak również zaburzenia funkcji tych komórek wyrażające się w postaci zmniejszonej sekrecji IL-4 w wyniku stymulacji przy udziale TCR [31]. Podobne wyniki dotyczące nie tylko chorych na cukrzycę typu 1, ale i osób z grupy ryzyka zachorowania na cukrzycę, otrzymali Kukreja i wsp [32]. Co więcej, analiza wewnątrzkomórkowej zawartości cytokin, po uprzedniej stymulacji komórek Vα24 + CD3 + przy pomocy jonomycyny i PMA, wykazała nieprawidłową syntezę zarówno IL-4, jak i INFγ. Uzyskane przez nas wyniki są zbieżne z wymienionymi pracami. Otrzymano bowiem istotnie statystycznie zmniejszenie odsetka limfocytów inkt o fenotypie NKT+/CD3+/CD161+ we krwi obwodowej dzieci z nowo rozpoznaną cukrzycą typu 1, co może przemawiać za ich udziałem w patogenezie tej jednostki chorobowej. Potwierdzeniem tej hipotezy może być wykazanie przez nas istotnej statystycznie korelacji między odsetkiem komórek inkt a poziomem C-peptydu, wskazującej na wyższe poziomy C-peptydu u dzieci z cukrzycą typu 1, u których odsetek badanych komórek był wyższy. Z drugiej jednak strony Lee i wsp. nie stwierdzili zaburzeń dotyczących NKT u dorosłych pacjentów z cukrzycą typu 1[33]. Jednakże autorzy użyli innych przeciwciał do detekcji inkt: tetramery CD1d-αGalCer połączono z przeciwciałami anty- Vα24 i anty-vβ11. Podobnie w badaniu wykonanym na populacji japońskiej Oikawa i wsp. niespodziewanie wykazali wyższy odsetek komórek Vα24 + Vβ11 + CD3 + wśród limfocytów CD3 + w porównaniu do zdrowych równolatków. Co ciekawe, odsetek komórek NKT korelował negatywnie z czasem trwania choroby [34]. Prezentowane wyżej rozbieżności wyników, dotyczące potencjalnego znaczenia inkt w patogenezie cukrzycy typu 1, mogą wynikać z różnych przyczyn. Po pierwsze, prezentowane wyniki pochodziły z różnych populacji zarówno pod względem wieku pacjentów, jak i pochodzenia etnicznego. Po drugie, autorzy wykorzystali różne markery w celu oceny fenotypu komórek inkt, a ponadto stosowali różne schematy oceny wydzielania cytokin. Wydaje się również prawdopodobne, że badania przeprowadzone na materiale pochodzącym z krwi obwodowej mogą nie oddawać wiernie zaburzeń stwierdzanych w lokalnym ognisku zapalnym, obejmującym w przypadku cukrzycy o podłożu autoimmunologicznym mikrośrodowisko wysp trzustki. W podsumowaniu biorąc pod uwagę obiecujące wyniki powstałych na modelu mysim (myszy NOD) badań cukrzycy typu 1 dotyczących roli komórek inkt w tej jednostce chorobowej, należy mieć nadzieję, ze w niedalekiej przyszłości znajdą one zastosowanie w leczeniu cukrzycy o podłożu autoimmunologicznym u ludzi. Jednakże na obecnym etapie z uwagi na rozbieżności wyników wymagane są dalsze obserwacje umożliwiające zgłębienie biologii tej jakże obiecującej populacji 14
Piekarski R. i inni: Ocena komórek NKT u dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1 komórek i zastosowanie w immunoterapii chorób autoimmunologicznych. Wnioski 1. U dzieci z nowo rozpoznaną cukrzycą stwierdzono obniżony odsetek komórek inkt. 2. Stwierdzono dodatnią korelację między wartościami C-peptydu a odsetkiem komórek NKT. 3. Wykazane różnice analizowanych populacji komórek układu immunologicznego zachęcają do bardziej szczegółowej analizy zaobserwowanych zależności, bowiem wydają się wskazywać na pewne zaburzenia badanej populacji komórek u dzieci z cukrzycą typu 1, co może mieć znaczenie w patogenezie tej choroby. REFERENCES/PIŚMIENNICTWO [1] Hoyne G.F. Mechanisms that regulate peripheral immune responses to control organ-specific autoimmunity. Clin. Dev. Immunol., 2011, doi:10.1155/2011/294968. [2] Thompson J.A., Perry D., Brusko T.M.: Autologous regulatory T cells for the treatment of type 1 diabetes. Curr. Diab. Rep., 2012:12, 623-632. [3] Shao S., He F., Yang Y. et al.: Th17 cells in type 1 diabetes. Cell Immunol., 2012:280, 16-21. [4] Novak J., Griseri T., Beaudoin L., Lehuen A.: Regulation of type 1 diabetes by NKT cells. Int. Rev. Immunol., 2007:26, 49-72. [5] Fletcher M.T., Baxter A.G.: Clinical application of NKT cell biology in type 1 (autoimmune) diabetes mellitus. Immunol. Cell Biol., 2009:87, 315-323. [6] Benlagha K., Weiss A., Beavis A. et al.: In vivo identification of glycolipid antigen-specific T cells using fluorescent CD1d tetramers. J. Exp. Med., 2000:191, 1895-1903. [7] Godfrey D.I., MacDonald H.R., Kronenberg M. et al.: NKT cells: what s in a name? Nat Rev. Immunol., 2004:4, 231-237. [8] Bendelac A., Savage P.B., Teyton L.: The biology of NKT Cells. Annu. Rev. Immunol., 2007:25, 297-336. [9] Matsuda J.L., Mallevaey T., Scott-Browne J., Gapin L.: CD1d-restricted inkt cells, the Swiss-Army knife of the immune system. Curr. Opin. Immunol., 2008:20, 358-368. [10] Crowe N.Y., Coquet J.M., Berzins S.P. et al Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. J. Exp. Med., 2005: 202, 1279-1288. [11] Novak J., Lehuenb A.: Mechanism of regulation of autoimmunity by inkt cells. Cytokine, 2011:53, 263-270. [12] Scheuplein F., Rissiek B., Driver J.P.: A recombinant heavy chain antibody approach blocks ART2 mediated deletion of an inkt cell population that upon activation inhibits autoimmune diabetes. J. Autoimmun., 2010:34, 145-154. [13] Ly D., Tohn R., Rubin B. et al: An alpha-galactosylceramide C20:2 N-acyl variant enhances anti-inflammatory and regulatory T cellindependent responses that prevent type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol., 2010:160, 185-198. [14] Davies J.L., Kawaguchi Y., Bennett S.T. et al.: A genome-wide search for human type 1 diabetes susceptibility genes. Nature, 1994: 371, 130-136. [15] Egwuagu C.E., Charukamnoetkanok P., Gery I.: Thymic expression of autoantigens correlates with resistance to autoimmune disease. J. Immunol., 159(1997), 3109-3112. [16] Morel P.A., Vasquez A.C., Feili-Hariri M., Immunobiology of DC in NOD mice. J. Leukoc. Biol., 1999:66, 276-280. [17] Calderon B., Suri A., Miller M.J., Unanue E.R.: Dendritic cells in islets of Langerhans constitutively present beta cell-derived peptides bound to their class II MHC molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008:105, 6121-6126. [18] Brusko T.M., Putnam A.L., Bluestone J.A.: Human regulatory T cells: role in autoimmune disease and therapeutic opportunities. Immunol. Rev., 2008 Jun:223, 371-390. [19] Bendelac A., Rivera M.N., Park S.H. et al.: Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function, Annu. Rev. Immunol., 1997:15, 535-562. [20] Godfrey D.I., Kronenberg M.: Going both ways: Immune regulation via CD1ddependent NKT cells, J. Clin. Invest., 2004:114, 1379-1388. [21] Gombert J.M., Herbelin A., Tancrede-Bohin E. et al: Early quantitative and functional deficiency of NK1+-like thymocytes in the NOD mouse, Eur. J. Immunol., 1996:26, 2989-2998. [22] Falcone M., Yeung B., Tucker L. et al: A defect in interleukin 12-induced activation and interferon gamma secretion of peripheral natural killer T cells in nonobese diabetic mice suggests new pathogenic mechanisms for insulin-dependent diabetes mellitus. J. Exp. Med., 1999:190, 963-972. [23] Lehuen A., Lantz O., Beaudoin L.et al.: Overexpression of natural killer T cells protects Va14- Ja281 transgenic nonobese diabetic mice against diabetes, J. Exp. Med., 1998:188, 1831-1839. [24] Sharif S., Arreaza G.A., Zucker P. et al.: Activation of natural killer T cells by a-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes, Nat. Med., 2001:7, 1057-1062. 15
Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 12/2013;1(42):9-16 [25] Hong S., Wilson M.T., Serizawa I. et al.: The natural killer T-cell ligand a-galactosylceramide prevents autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice. Nat. Med., 2001:7, 1052-1056. [26] Oki S., Chiba A., Yamamura T. et al.: The clinical implication and molecular mechanism of preferential IL-4 production by modified glycolipid-stimulated NKT cells. J. Clin. Invest., 2004:113, 1631-1640. [27] Shi F.D., Flodstrom M., Balasa B. et al.: Germ line deletion of the CD1 locus exacerbates diabetes in the NOD mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001:98, 6777-6782. [28] Beaudoin L., Laloux V., Novak J. et al: NKT cells inhibit the onset of diabetes by impairing the development of pathogenic T cells specific for pancreatic b cells. Immunity, 2002:17, 725-736. [29] Novak J., Beaudoin L., Griseri T. et al.: Inhibition of T cell differentiation into effectors by NKT cells requires cell contacts. J. Immunol., 2005:174, 1954-1961. [30] Sakaguchi S. Naturally arising CD4ţ regulatory t cells for immunologic selftolerance and negative control of immune responses. Annu. Rev. Immunol., 2004:22, 531-562. [31] Wilson S.B., Kent S.C., Horton H.F. et al.: Multiple differences in gene expression in regulatory Vα 24Jα Q T cells from identical twins discordant for type 1 diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000:97, 7411-7416. [32] Kukreja A., Cost G., Marker J. et al.: Multiple immuno-regulatory defects in type-1 diabetes. J. Clin. Invest., 2002:109, 131-140. [33] Lee P.T., Putnam A., Benlagha K. et al.: Testing the NKT cell hypothesis of human IDDM pathogenesis. J. Clin. Invest., 2002:110, 793-800. [34] Oikawa Y., Shimada A., Yamada S. et al.: High frequency of Vα24(+) Vβ11(+) T-cells observed in type 1 diabetes. Diabetes Care, 2002:25, 1818-1823. 16