MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 11-17 Wpływ Lactobacillus casei na tworzenie biofilmu przez enteroagregacyjne szczepy Escherichia coli izolowane od osób z zespołem jelita nadwrażliwego Influence of Lactobacillus casei on biofilm formation by enteroaggregative Escherichia coli strains isolated from irritable bowel syndrome (IBS) Barbara Andrzejewska, Beata Magdalena Sobieszczańska Katedra i Zakład Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu W pracy badano wpływ probiotycznego szczepu Lactobacillus casei na biofilm tworzony przez enteroagregacyjne szczepy Escherichia coli (EAEC). Wykonane oznaczenia wykazały, że zależnie od stężenia, probiotyczny szczep L. casei hamował tworzenie biofilmu przez większość (>80%) badanych szczepów EAEC, choć nieliczne szczepy (18%) tworzyły biofilm niezależnie od obecności i stężenia probiotycznego szczepu L. casei. Słowa kluczowe: enteroagregacyjne E. coli, Lactobacillus casei, biofilm ABSTRACT Introduction: Many pathogenic bacterial species have the ability to biofilm formation. In our study we determined the influence of Lactobacillus casei on biofilm formation by enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) strains obtained from irritable bowel syndrome patients. Methods: The ability of EAEC isolates to biofilm formation was assessed in the presence of various concentrations of the probiotic L. casei strain in an a semi- quantitative microtitre plate assays under culture conditions, similar to those prevailing in the human intestine. Results: Depending on the concentrations L. casei inhibited biofilm formation of the majority (> 80%) of the EAEC strains. Concentration of 4.5 x10 7 cfu/ml of L. casei was the most effective inhibitory dose, although a few strains (approximately 18%) formed the biofilm regardless of the presence and concentration of the probiotic L. casei strain. Conclusion: The inhibitory effect of L. casei on biofilm formation at most of studied EAEC strains suggest that L. casei may reduce the risk of developing persistent intestinal infections in humans. Key words: enteroaggregative E. coli, Lactobacillus casei, biofilm
12 B. Andrzejewska, B.M. Sobieszczańska Nr 1 WSTĘP Enteroagregacyjne E. coli (EAEC) są czynnikiem etiologicznym ostrych i przewlekłych biegunek u dzieci i osób dorosłych. Charakterystyczny, agregacyjny typ adhezji do komórek nabłonka nie tylko odróżnia EAEC od innych patogennych szczepów E. coli, ale i stanowi podstawę ich identyfikacji. EAEC są niezwykle zróżnicowaną grupą patogennych pałeczek E. coli, które poza nielicznymi, swoistymi czynnikami wirulencji tj. fimbriami agregacyjnymi AAF (ang. aggregative adherence fimbriae) prezentują różne toksyny rozpowszechnione wśród innych patogenów jelitowych np.: enterotoksynę ciepłostałą EAST1 (ang. enteroaggregative heat stable enterotoxin 1), cytotoksynę Pet, (ang. plasmid-encoded toxin), toksyny shiga (13, 14, 17) Dodatkową, istotną w przewlekłych zakażeniach przewodu pokarmowego cechą EAEC jest ich zdolność tworzenia biofilmu. Biofilm jest strukturą przestrzennie i funkcjonalnie zróżnicowaną, złożoną z drobnoustrojów ściśle przylegających do kolonizowanej powierzchni. Bakterie tworzące biofilmy są odporne na działanie antybiotyków w porównaniu do bakterii w formie planktonu. Zakażenia związane z biofilmem często mają przewlekły charakter i są trudne do eradykacji (4). Wiele badań wykazało korzystny, prozdrowotny wpływ szczepów bakterii probiotycznych na zakażenia i choroby przewodu pokarmowego (9, 11). Zespół jelita nadwrażliwego (IBS, ang. irritable bowel syndrome) jest czynnościowym zaburzeniem jelit, które charakteryzuje się okresowym lub przewlekłym bólem brzucha, powiązanym z biegunką lub zaparciami. IBS dotyczy około 10 15% osób dorosłych, choć szacuje się, że rzeczywista liczba chorych może być wyższa, gdyż wielu ludzi lekceważy dokuczliwe objawy i nie zgłasza się do lekarza. Pomimo, że IBS nie powoduje żadnych zmian histopatologicznych w obrębie błony śluzowej jelit, znacznie obniża komfort życia osób cierpiących na IBS (5, 12, 16). Etiopatogeneza IBS pozostaje jak dotychczas niejasna. Prawdopodobnie do rozwoju tego zaburzenia przyczynia się wiele czynników, które ostatecznie prowadzą do upośledzenia funkcji motoryczno sensorycznej jelit. Wśród czynników mogących wpływać na rozwój IBS rozważa się czynniki psychospołeczne (stres), predyspozycje genetyczne, czynniki zakaźne oraz zmiany w składzie mikroflory jelita. (5, 12, 16). Biorąc pod uwagę dysbiozę oraz przewlekły stan zapalny błony śluzowej jelita w patogenezie IBS, kuracja probiotykami wydaje się stanowić idealne rozwiązanie terapeutyczne. Wykazano, że suplementacja diety chorych z IBS preparatami probiotycznymi łagodzi objawy kliniczne, szczególnie biegunkę. Korzystny efekt terapeutyczny w IBS wykazano w przypadku bakterii z rodzajów Bifidobacterium, Lactobacillus oraz E. coli DSM 17252. Wyniki dotychczasowych badań są jednak niewystarczające, aby jednoznacznie określić rzeczywisty skutek stosowania probiotyków w czynnościowych schorzeniach jelit (5). Celem przeprowadzonych badań była ocena wpływu probiotycznego szczepu Lactobacillus casei na szczepy EAEC izolowane od osób dorosłych z zespołem jelita nadwrażliwego (IBS) oraz szczepy EAEC od dzieci z biegunką i dorosłych osób zdrowych, stanowiące grupy porównawcze.
Nr 1 Tworzenie biofilmu przez E. coli 13 MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Do badań wykorzystano 59 archiwalnych szczepów E. coli, należących do patotypu enteroagregacyjnych E. coli (EAEC): 36 szczepów pochodziło od chorych z IBS (średni wiek 43 lata), rozpoznanym na podstawie tzw. Kryteriów Rzymskich II w Klinice Gastroenterologii i Hepatologii we Wrocławiu; 12 szczepów (grupa odniesienia) pochodziło od dzieci z biegunką (średni wiek 3 lata) hospitalizowanych w II Katedrze i Klinice Pediatrii, Gastroenterologii i Żywienia we Wrocławiu oraz 11 szczepów (grupa odniesienia) EAEC uzyskano od zdrowych osób dorosłych (średni wiek 43 lata). Do wszystkich oznaczeń dołączono niepatogenny szczep referencyjny E. coli K12 C600. Przynależność badanych szczepów do patotypu EAEC została uprzednio określona na podstawie testu adhezji in vitro do komórek nabłonka linii HEp-2. Lactobacillus casei. Jako szczep probiotyczny w badaniach wykorzystano liofilizowane kultury bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus casei DN 114 001 (4x10 8 cfu/ ml) stosowany w komercyjnie dostępnych preparatach BIOTYK oraz Actimel. Szczep probiotyczny hodowano w bulionie tryptozowo- sojowym (TSB) pod parafiną przez 48 godzin w temperaturze 37 C. Oznaczanie zdolności badanych szczepów do tworzenia biofilmu wg Stepanović i wsp. (15) z modyfikacjami. Wszystkie badane szczepy E. coli hodowano w bulionie Luria (LB) przez 24 godziny w temperaturze 37 C. Następnie 1 ml hodowli odwirowywano (25 000 x g; 5 min). Namnożony szczep probiotyczny L. casei wirowano przy 25 000 x g przez 5min. Uzyskane osady pałeczek E. coli oraz probiotyku zawieszano w podłożu minimalnym M9 z glukozą (M9/G) do uzyskania zawiesiny o gęstości 3x10 8 cfu/ml. Z uzyskanych zawiesin badanych szczepów E. coli oraz L. casei w dołkach 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej sporządzano następujące mieszaniny: 150 μl E. coli + 50 μl L. casei; 100 μl E. coli + 100 μl L. casei; 50 μl E. coli + 150 μl L. casei oraz 200 μl zawiesiny pałeczek E. coli bez probiotyku i 200 μl zawiesiny L. casei bez E. coli. Kontrolę negatywną, nastawianą do każdego eksperymentu, stanowiło podłoże M9/G bez bakterii. Płytki inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37 C w wilgotnej atmosferze Tabela I. Zdolność badanych szczepów EAEC do tworzenia biofilmu w obecności probiotycznego szczepu L. casei. Badane szczepy EAEC IBS n=36 L(%) Szczepy tworzące biofilm 28 (77,8%) Tworzenie biofilmu nie 7 hamowane przez L. casei (25%) Tworzenie biofilmu hamowane przez 11 L. casei, zależnie od stężenia (39,3%) Tworzenie biofilmu hamowane przez L. casei, niezależne od stężenia n liczba szczepów 10 (35,7%) Pochodzenie szczepów Zdrowi n=11 L(%) 9 (81,8%) 0 (0%) 8 (88,9%) 1 (11,1%) Biegunka n=12 L(%) 9 (75%) 2 (22,2%) 1 (11,1%) 6 (66,7%)
14 B. Andrzejewska, B.M. Sobieszczańska Nr 1 Ryc 1. Wpływ stężeń badanego szczepu probiotycznego L. casei na hamowanie biofilmu tworzonego przez badane szczepy EAEC. wzbogaconej w 5% CO 2, tj. w warunkach mikroaerofilnych, zbliżonych do tych, panujących w jelicie człowieka. Po inkubacji oceniano gęstość hodowli bakterii w utworzonych biofilmach, mierząc absorbancję OD 620 nm (spektrofotometr ASYS UVM340). Następnie płytki płukano w soli fizjologicznej (225 μl/dołek) a związane z biofilmem bakterie wybarwiano przez 10 min 200 μl 0,1% roztworu fioletu krystalicznego w wodzie. Po dwukrotnym odpłukaniu barwnika wodą destylowaną, barwnik rozpuszczano w 200 μl 30% roztworu kwasu octowego w metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odczytu natężenia barwy dokonywano przy OD 590 nm. Zdolność tworzenia biofilmu wskazywała wartość absorbancji czterokrotnie przewyższająca wartość absorbancji dla kontroli negatywnej. Dla każdego szczepu E. coli oznaczenie powtarzano co najmniej dwu trzykrotnie. Statystyczna analiza wyników. Uzyskane wyniki badań analizowano testem χ 2 Pearsona z poprawką Yatesa. Wartości P 0,05 przyjmowano za statystycznie istotne. WYNIKI Wśród 59 przebadanych szczepów EAEC, 46 (77,97%) tworzyło biofilm w warunkach doświadczenia tj. temperaturze 37 0 C, atmosferze mikroaerofilnej, wzbogaconej w 5% CO 2. Spośród 46 szczepów tworzących biofilm: 8 (17,4%) szczepów tworzyło biofilm niezależnie od obecności i stężenia probiotycznego szczepu L. casei, w przypadku 20 (43,5%) szczepów nastąpiło zahamowanie tworzenia biofilmu zależne od stężenia L. casei, natomiast w przypadku 18 (39,1%) szczepów nastąpiło zahamowanie tworzenia biofilmu w obecności L. casei, niezależnie od jego stężenia. Statystyczne znamienne różnice w hamowaniu tworzenia biofilmu zależne od stężenia probiotycznego szczepu L. casei dotyczyły szczepów EAEC
Nr 1 Tworzenie biofilmu przez E. coli 15 izolowanych z przypadków IBS oraz od osób zdrowych. Zależnie od stężenia L. casei częściej hamował tworzenie biofilmu przez szczepy EAEC od osób zdrowych niż szczepy izolowane z IBS (P=0.01). Analiza statystyczna wpływu probiotycznego szczepu L. casei na tworzenie biofilmu przez szczepy EAEC z pozostałych grup nie wykazała istotnych różnic (P>0.05). Podsumowanie wyników przedstawiono w tabeli I. Wpływ stężeń badanego szczepu probiotycznego L. casei na hamowanie tworzenia biofilmu EAEC przedstawiono na wykresie 1. Stężenie 4,5x10 7 cfu/ml L. casei najskuteczniej hamowało tworzenie biofilmu przez badane szczepy EAEC. DYSKUSJA IBS jest częstym zaburzeniem czynnościowym przewodu pokarmowego. Terapia IBS zwykle dobierana jest indywidualnie, w zależności od profilu objawów pacjenta. W leczeniu stosuje się wiele grup leków, m.in. leki rozkurczowe, przeciwbiegunkowe, antydepresanty oraz antybiotyki (1, 10). Ze względu na prawdopodobny wpływ stanu zapalnego w obrębie błony śluzowej jelita oraz dysbiozy na rozwój IBS, coraz większą uwagę poświęca się stosowaniu w leczeniu preparatów probiotycznych. Wiedza na temat skuteczności probiotyków w IBS jest ograniczona. Dotychczas przeprowadzono nieliczne, randomizowane badania kliniczne [2]. Wśród przeprowadzonych w ostatnich latach 42 badań klinicznych, skupionych na wpływie bakterii z rodzajów: Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Streptococcus oraz Bacillus na kliniczny przebieg IBS, 34 wykazały korzystny efekt bakterii probiotycznych na przebieg IBS. Spośród probiotyków testowanych u osób z IBS, najskuteczniejsze wydają się preparaty zawierające szczep Bifidobacterium infantis 35624, co potwierdziły wyniki niezależnie przeprowadzanych badań (3, 7, 18). Skuteczność B. infantis prawdopodobnie wynika z redukcji stanu zapalnego błony śluzowej jelit. Inne bakterie probiotyczne (L. acidophilus SCD 2012,2013; L. paracasei B2106, L. plantarum 299V) również łagodzą objawy IBS, ale ich skuteczność w porównaniu do B. infantis 35624 jest mniejsza. Dla kontrastu, rezultaty niektórych badań klinicznych świadczą z kolei o braku skuteczności szczepów probiotycznych (L. casei GG, L. plantarum DSM 9843, L. salivarius UCC4331) w leczeniu IBS (3, 8). Biorąc pod uwagę zainteresowanie stosowaniem preparatów probiotycznych w terapii IBS zaskakująco mało jest publikacji naukowych, wyjaśniających przyczyny skutecznego bądź nieskutecznego działania probiotyków (2, 3). W pracy zbadano wpływ probiotycznego szczepu L. casei na zdolność szczepów EAEC, izolowanych z przewlekłych i ostrych zakażeń przewodu pokarmowego, do tworzenia biofilmu. Zdolność tworzenia biofilmu in vitro przez większość (82,61%) badanych szczepów EAEC była zahamowana w obecności probiotycznego szczepu L. casei, jednak najczęściej hamujący wpływ probiotyku zależał od jego stężenia. Nieliczne szczepy (17,39%) tworzyły biofilm niezależnie od obecności i stężenia probiotycznego szczepu L. casei. Podobne wyniki uzyskali Miyazaki i wsp. (6), którzy badali wpływ 9 szczepów z rodzaju Lactobacillus, Bifidobacterium oraz Enterococcus na wzrost, adhezję i zdolność tworzenia biofilmu przez szczepy EAEC. W doświadczeniach badacze wykorzystali supernatanty otrzymane z hodowli probiotyków oraz 3 szczepy EAEC. Badane supernatanty hodowli szczepów probiotycznych hamowały wzrost szczepów EAEC. Biofilm utworzony przez szczepy EAEC po dodaniu supernatantu L. casei ss. casei lub L. casei ss. rhamnosus był grubszy w porównaniu do
16 B. Andrzejewska, B.M. Sobieszczańska Nr 1 biofilmu utworzonego przez kontrolny szczep EAEC bez probiotyku. Obserwacja w mikroskopie elektronowym wykazała, że L. casei ss. casei stymuluje komórki znajdujące się wewnątrz biofilmu do produkcji śluzu. Supernatanty uzyskane z hodowli L. acidophilus, Bifidobacterium i Enterococcus nie wpływały na zdolność tworzenia biofilmu przez badane szczepy EAEC. Badania własne wykazały brak wpływu L. casei na zdolność tworzenia biofilmu przez 9 (17,39%) szczepów EAEC tworzących biofilm in vitro. PODSUMOWANIE Wykonane badania wykazały, że probiotyczny szczep L. casei hamował rozwój biofilmu EAEC w większości (>80%) przypadków, co sugeruje jego korzystne oddziaływanie w przewlekłych zakażeniach przewodu pokarmowego wywoływanych przez patotyp enteroaggregacyjnych szczepów E. coli. PIŚMIENNICTWO 1. Basseri RJ, Weitsman S, Barlow GM, Pimentel M. Antibiotics for the treatment of irritable bowel syndrome. Gastroenterol Hepatol 2011; 7: 455-60. 2. Brenner DM, Moeller MJ, Chey WD, Schoenfeld P S. The utility of probiotics in the treatment of irritable bowel syndrome: a systemic review. Am J Gastroenterol 2009; 104: 1033-49. 3. Clarke G, Cryan JF, Dinan T G, Quigley E M. Review article: probiotics for the treatment of irritable bowel syndrome- focus on lactic acid bacteria. Aliment Pharmacol Ther 2012; 35: 403-13. 4. Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15(2): 167-93. 5. Lee B. J, Bak Y-T Irritable bowel syndrome, gut microbiota and probiotics. J Neurogastroenterol Motil 2011; 17: 252-66. 6. Miyazaki Y, Kamiya S, Hanawa T i inni Effect of probiotic bacteria strains of Lactobacillus, Bifidobacterium, and Enterococcus on enteroaggregative Escherichia coli. J Infect Chemother 2010; 16: 10-8. 7. O Mohony L, McCarthy J, Kelly P i inni: Lactobacillus and Bifidobacterium in irritable bowel syndrome: symptoms responses and relationship to cytokine profiles. Gastroenterol 2005; 128: 541-51. 8. O Sullivan M A, O Morain CA. Bacterial supplementation in irritable bowel syndrome. A randomized double-blind placebo- controlled crossover study. Dig Liver Dis 2000; 32: 294-301. 9. O Toole PW, Cooney J. Probiotic bacteria influence the composition and function of the intestinal microbiota. Interdiscip. Perspect. Infect Dis 2008;Internet:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/pmc2648622/pdf/ipid2008-175285.pdf (accessed 12 October 2012). 10. Pimentel M, Lembo A, Chey WD i inni. Rifaximin therapy for patients with irritable bowel syndrome without constipation. N Engl J Med 2011; 364: 22-32. 11. Sanders M E. Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human health. J. Nutr. 2000; 130: 384-90. 12. Sobieszczańska BM. Badania potencjału chorobotwórczego wybranych patotypów Escherichia coli izolowanych od osób z zakażeniami przewodu pokarmowego. Rozprawa na stopień doktora habilitowanego. Akademia Medyczna we Wrocławiu, 2007, 5-6, 17-32, 60-76. 13. Sobieszczańska B M, Kowalska-Krochmal B. Enteroagregacyjne Escherichia coli (EAEC) nowa grupa chorobotwórczych szczepów Escherichia coli odpowiedzialnych za przewlekłe biegunki niemowląt. Adv Clin Exp Med. 2003; 12(5): 647-51.
Nr 1 Tworzenie biofilmu przez E. coli 17 14. Steiner TS, Lima AAM, Nataro JP. Enteroaggregative Escherichia coli produce intestinal inflammation and growth impairment and cause interleukin 8 release from intestinal epithelial cells. J Infect Dis 1998; 177: 88-96. 15. Stepanovic S, Vuković D, Dakić I i inni. A modified microtiter- plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J Microbiol Methods 2000; 40: 175-9. 16. Surdea-Blaga T., Baban A., Dumitrascu D. L. Psychosocial determinants of irritable bowel syndrome. World J Gastroenterol 2012; 18: 616-26. 17. Weintraub A. Enteroaggregative Escherichia coli: epidemiology, virulence and detection. J Med Microbiol 2007; 56: 4-8. 18. Whorwell PJ, Altringer L, Morel J i inni: Efficacy of an encapsulated probiotic Bifidobacterium infantis 35624 in women with irritable bowel syndrome. Am J Gastroenterol 2006; 101: 1581-90. Otrzymano: 27 XI 2012 r. Adres Autora: 50-368 Wrocław, ul. Chałubińskiego 4, Katedra i Zakład Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu