Emilia Wójtowicz Markery molekularne i ich wykorzystanie w hodowli roślin W pracach genetyczno hodowlanych wykorzystuje się różne typy markerów (wyznaczników), pozwalających na szybką identyfikacje genotypów, co znacznie skraca cykl hodowlany i obniża koszty. Należą do nich markery morfologiczne, cytologiczne, oraz stosowane w ostatnich latach coraz częściej markery molekularne. Markery molekularne mają przewagę nad pozostałymi, gdyż umożliwiają identyfikację różnic i podobieństw niezależnie od wieku badanych obiektów. Do analiz wystarczają bardzo małe próbki materiału, zatem nie ma potrzeby niszczenia całego organizmu. Poza tym markery molekularne dziedziczą się zgodnie z genetyką mendlowską i nie podlegają wpływom środowiska. Pierwszymi wykorzystywanymi markerami molekularnym były różne formy białek strukturalnych i funkcjonalnych (izoenzymy) (Bednarek i Chwedorzewska, 2001). Umożliwiają one badanie struktury genetycznej populacji, oszacowanie stopnia heterozygotyczności i polimorfizmu, analizę stopnia podobieństwa genetycznego, jak również potwierdzenie czystości genetycznej lub mieszańcowości (Masojć, 2007). Jednak niewielka liczba loci izoenzymatycznych jest utrudnieniem w ich szerszym zastosowaniu (Broda, 2000). W ciągu ostatnich lat największego znaczenia nabrały markery DNA (Bednarek i Chwedorzewska, 2001). Są to fragmenty kwasu deoksyrybonukleinowego uzyskane w formie prążków na żelach lub membranach, będące efektem końcowym reakcji enzymatycznych lub hybrydyzacji (Wolko i in., 1999). Markery DNA odgrywają obecnie zasadniczą rolę we wszystkich aspektach hodowli roślin, od identyfikacji genów odpowiedzialnych za określone cechy do kierowania programami krzyżowań (Schulman, 2007). Przegląd technik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Jedną z pierwszych metod, która umożliwiła identyfikację markerów DNA była technika analizy polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych - RFLP (Masojć, 2007). Metoda ta opiera się na zróżnicowanym rozmieszczeniu w genomie specyficznych sekwencji DNA o długości 4-6 nukleotydów, rozpoznawanych i przecinanych przez specyficzne enzymy restrykcyjne. Powstałe po cięciu fragmenty hybrydyzują z wyznakowaną radioaktywnie sondą molekularną (Bostein i in., 1980). Polimorfizm markerów RFLP może wynikać ze zmian sekwencji nukleotydów w miejscach restrykcyjnych oraz z modyfikacji we fragmentach ulegających hybrydyzacji z sondą (Wolko i Kruszka, 1997). Metoda ta była używana do mapowania genomów (Malyshev i in. 2003), lokalizacji QTL (Jordan i in., 2004) oraz analizy pokrewieństwa genetycznego (Bautsta i in. 2001).
Markery VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Markery VNTR oparte są na analizie sekwencji minisatelitarnych powtarzających się motywów sekwencyjnych o długości 11-60 pz, występujących w genomach (Nybom i Kraft, 1995). Motywy te wykazują duże zróżnicowanie pod względem długości, która zależy od liczby powtórzeń podstawowego motywu (Masojć, 2007). Polimorfizm minisatelitarnych loci wykrywany jest poprzez trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi, które rozpoznają sekwencje otaczające te regiony. Dalsze etapy analizy przebiegają z zastosowaniem sond, komplementarnych do minisatelitarnego DNA, a w końcowym wyniku uzyskuje się profile molekularne, unikalne dla analizowanego osobnika (Sztuba Solińska, 2005). Opracowanie łańcuchowej reakcji polimerazy PCR (Polymerase Chain Reaction) stworzyło możliwość powstania kolejnych metod analizy molekularnej. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Markery RAPD bazują na reakcji PCR z wykorzystaniem krótkiego (9-11 nukleotydów) startera o przypadkowej sekwencji (Williams i in., 1990). Startery przyłączają się w wielu miejscach badanego DNA prowadząc do amplifikacji kilku lub kilkunastu różnych fragmentów (Wolko i in., 2001). Polimorfizm markerów RAPD wynika z mutacji miejsc przyłączania starterów oraz z inercji/delecji w obrębie powielanych podczas PCR fragmentów. Ze względu na dużą liczbę różnych sekwencji starterów metoda ta stała się szczególnie przydatna do poszukiwania markerów ważnych cech użytkowych (Masojć, 2007). Jej wadą jest wysoka wrażliwość na zmiany warunków reakcji (Devos i Gale, 1992), jak również dominujący charakter dziedziczenia uzyskanych markerów - nie umożliwiają rozróżnienia osobników hetero- i homozygotycznych (Wolko i in.,1997). SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) Sposobem odróżnienia homo- i heterozygot jest przekształcenie markerów RAPD sprzężonych z konkretną cechą na markery SCAR (Paran i Michelmore, 1993). Jest to zadanie pracochłonne i wymaga dużego nakładu kosztów, jednak umożliwia otrzymanie specyficznych dla danej cechy markerów. Ich uzyskanie polega na wycięciu produktu RAPD z żelu i jego zsekwencjonowaniu, a następnie zaprojektowaniu na podstawie otrzymanej sekwencji specyficznych starterów o długości 20-24 nukleotydów. Startery te uczestniczą w amplifikacji jednego fragmentu o długości odpowiadającej wyjściowemu odcinkowi DNA (Masojć, 2007). Powielanie DNA przy użyciu tych markerów jest bardziej specyficzne i prowadzi do poprawy powtarzalności reakcji PCR (Nair i in. 1996). Technika ta była wykorzystywana m.in. do identyfikacji genów determinujących płeć papai (Deputy i in., 2002). SSR (Simple Sequence Repeat) Markery SSR zwane również markerami mikrosatelitarnymi, bazują na obecności w genomie sekwencji mikrosateliatrnych, w których motyw powtarzalny ma długość 1-4
nukleotydów. Każdy odcinek mikrosatelitarny sąsiaduje z unikatowymi sekwencjami, które wykorzystuje się do projektowania specyficznych starterów, wiążących się po obu stronach mikrosatelity (Masojć, 2007). Zaletą markerów SSR jest ujawnianie wysokiego polimorfizmu oraz kodominujący sposób dziedziczenia (Koreth i in., 1996). W związku z tym markery te znalazły szerokie zastosowanie w mapowaniu genomów, identyfikacji odmian, określaniu stopnia heterozygotyczności oraz jako markery cech o znaczeniu rolniczym (Powell i in., 1996). ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) W metodzie ISSR amplifikacji ulega fragment DNA obecny pomiędzy dwoma identycznymi sekwencjami mikrosatelitarnmi, skierowanymi w przeciwnych kierunkach. W technice tej używany jest jeden starter o długości 16-25 nukleotydów. Startery mogą być zakotwiczone na końcu 3 albo 5. Oznacza to obecność kilku dowolnych nukleotydów (Zietkiewicz i in., 1994), co gwarantuje ich przyłączanie do końców sekwencji mikrosatelitarnej na matrycowym DNA. Gdy używany jest starter niezakotwiczony ma on tendencję do poślizgów na matrycy DNA, co prowadzi do powstawania smug między prążkami na żelu (Pradeep - Reedy i in., 2002). ISSR jest prostą, szybką, wydajną techniką i charakteryzuje się wysoką powtarzalnością (Zietkiewicz i in., 1994). Markery ISSR mają charakter dominujący (Gupta i in., 1994), jednak w niektórych przypadkach mogą segregować w sposób kodominujący, a zatem umożliwiać rozróżnienie homozygot i heterozygot (Wu i in., 1994). Były one z powodzeniem wykorzystywane do oceny polimorfizmu (Bornet i Branchard, 2004), jak również do mapowania (Kojima i in., 1999). SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Technika SNP polega na amplifikacji fragmentu genomu za pomocą reakcji PCR a następnie sekwencjonowaniu powstałego produktu. Po zsekwencjonowaniu fragmentów należących do różnych osobników porównuje się je ze sobą w celu identyfikacji różnic w sekwencji (miejsc SNP). Markery te pozwalają na wykrycie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w obrębie całej sekwencji analizowanego fragmentu DNA (Brookes, 1999). Wadą tej metody jest wysoki koszt analiz, natomiast ogromną zaletą możliwość obserwacji bardzo dużego polimorfizmu analizowanej sekwencji na poziomie pojedynczych nukleotydów (Alberts i in., 2002). Metoda SNP jest wykorzystywana m.in. do identyfikacji mutacji punktowych (Tyrka i in., 2004). AFLP (Amplified Fragmeny Leght Polymorphism) Techniki generujące tzw. markery mieszane wykorzystują właściwości zarówno enzymów restrykcyjnych, jak i reakcji PCR (Bednarek i Chwedorzewska, 2001). Do tej grupy należą markery AFLP (Vos i in., 1995).W metodzie tej wyizolowany i oczyszczony DNA trawi się dwoma enzymami restrykcyjnymi. Jeden z nich rozpoznaje sekwencje dłuższe i dlatego przecina DNA rzadziej, drugi rozpoznaje krótsze fragmenty - cięcia restrykcyjne wprowadzane są częściej (Morgante i Vogel, 1994). Otrzymane produkty liguje się z tzw.
adaptorami, czyli fragmentami dwuniciowego DNA o określonej sekwencji, które posiadają lepkie końce komplementarne do miejsc restrykcyjnych. Następnie przeprowadza się wstępną reakcję PCR (Paglia i Morgante, 1998), z użyciem starterów komplementarnych do sekwencji adaptorów i miejsc restrykcyjnych oraz zawierającymi jeden selektywny nukleotyd na końcu 3. W celu ograniczenia liczby generowanych produktów w kolejnym etapie amplifikacji selektywnej stosuje się startery o takiej samej sekwencji jak w poprzednim, ale posiadają one 2-4 nukleotydy selektywne na końcu 3 (Masojć, 2007). System ten był on wykorzystywany zarówno w mapowaniu (Singrun i in., 2004) jak określaniu stopnia zróżnicowania genetycznego genomów roślin(vos i in.,1995). SAMPL (Selectively Amplified Microsatelite Polimorphic Loci) SAMPL to system markerów molekularnych, który łączy elementy metody SSR i AFLP. Początkowe etapy przebiegają tak samo jak w technice AFLP. Otrzymane po wstępnej amplifikacji fragmenty DNA stanowią matrycę dla właściwej reakcji PCR. Używane są w niej dwa startery: jeden wiążący się z końcem fragmentu zawierającego sekwencję rozpoznawaną przez rzadziej tnący enzym, drugi komplementarny do sekwencji DNA mikrosatelitarnego. Dzięki zastosowaniu takiej kombinacji powielane są odcinki DNA pochodzące od fragmentów zawierających sekwencję pomiędzy dwoma enzymami, enzymem a mikrosatelitą oraz dwoma mikrosatelitami. Markery SAMPL mogą dziedziczyć się w sposób dominujący lub kodominujący (Tosti i Negri, 2002) i są wykorzystywane m.in. do identyfikacji polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych (Morgante i Vogel, 1994). CAPS (Clevaed Amplified Polymorphic Sequence) Technika CAPS (Konieczny i Ausubei, 1993) jest oparta na reakcji PCR połączonej z trawieniem restrykcyjnym. Pierwszy etap to klasyczna reakcja PCR, do której startery konstruowane są na podstawie znanych sekwencji. Amplifikowany produkt jest następnie trawiony jednym lub kilkoma enzymami restrykcyjnymi i rozdzielany na żelu agarozowym. System CAPS jest alternatywnie określony jako PCR-RFLP i służy do identyfikacji zmienności w sekwencji DNA, gdy amplifikowane fragmenty DNA nie dają się rozróżnić pod względem długości. Pozwala na rozróżnienie alleli hetero- i homozygotycznych (Sztuba- Solińska, 2005). Wykorzystywane były często do identyfikacji genów warunkujących określone cechy (Chełkowski i in., 2003; Varshney i in., 2004) oraz do oceny zróżnicowania genetycznego (Barth i in., 2002). Markery molekularne są wykorzystywane w hodowli roślin głównie do: - określania stopnia podobieństwa materiałów wyjściowych - rejestracji nowych odmian wzór prążków służy do identyfikacji odmiany co ułatwia ochronę praw autorskich - ustalania genetycznej czystości nasion i jednorodności klonów - eliminowania z kolekcji (banków genów) powtarzających się genotypów zarejestrowanych pod różnymi nazwami.
- prowadzenia selekcji w oparciu o markery sprzężone z cechami ważnymi pod względem gospodarczym Dobre markery molekularne powinny być jednocześnie wysoce informatywne i wiarygodne, a koszty ich otrzymania powinny być możliwie jak najmniejsze. Powinny zatem cechować się silnym polimorfizmem, kodominującym charakterem dziedziczenia, wysoką frekwencją i równomiernym rozłożeniem w genomie, dużą powtarzalnością oraz prostą i szybką metodą wykrywania. Dodatkowo powinny wykazywać neutralność selekcyjną (czyli brak sprzężenia z niekorzystnymi genami) (Masojć, 2007). Markery molekularne stały się niezbędnym narzędziem w nowoczesnej hodowli roślin. Stosowane są w kolejnych etapach tworzenia nowych odmian roślin uprawnych, których prawidłowy przebieg umożliwia powodzenie prowadzonych prac hodowlanych (Sztuba Solińska, 2005). Piśmiennictwo: 1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, R., Roberts, K., and Walker, P. (2002). Molecular Biology of the Cell, 4th ed. Garland Publishing, New York. 2. Barth S., Melchinger A. R., Lubberstedt T., 2002. Genetic diversity in Arabidopsis thaliana L. Heynh. Investigated by cleaved amplification polymorphic sequence (CAPS) and inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. Mol. Ecol. 11, 495 505. 3. Bautista N. S., Solis R., Kamijima O., Ishii T., 2001. RAPD, RFLP and SSLP analyses of phylogenetic relationships between cultivated and wild species of rice. Genes Genet. Syst. 76, 71 79. 4. Bednarek P.T., Chwedorzewska K. 2001. Markery molekularne, ich charakterystyka genetyczna oraz wybrane zastosowania w analizie genetycznej roślin. Biotechnologia 1(52): 9-34. 5. Bornet B., Branchard M. 2004. Use of ISSR fingerprints to detect microsatellites and genetic diversity in several related Brassica taxa and Arabidopsis thaliana. Hereditas 140: 245 248. 6. Bostein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. 1980. Constructions of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331. 7. Broda Z. 2000. Diagnostyka molekularna w badaniach zmienności genetycznej roślin. Hodowla roślin i nasiennictwo 4: 36-37. 8. Brookes A. J., 1999. The essence of SNPs. Gene 234, 177 186.
9. Chełkowski J., Golka L., Stępień Ł., 2003. Application of STS markers for leaf rust resistance genes in near-isogenic lines of spring wheat cv. Thatcher. J. Appl. Genet. 44, 323 338. 10. Deputy J. C., Ming R., Ma H., Liu Z., Fitch M. M.,Wang M., Manshardt R., Stiles J. I. 2002., Molecular markers for sex determination in papaya (Carica papaya L.). Theor. Appl. Genet. 106,107 111. 11. Devos K.M., Gale M.D. 1992. The use of random amplified polymorfic DNA markers in wheat. Theor. Appl. Genet. 84: 573-578. 12. Gupta M., Chyi Y.S., Romero - Severson J., Owen J.L. 1994. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple - sequence repeats. Theor. Appl. Genet. 89: 998-1006. 13. Jordan D. R., Casu R. E., Besse P., CarrollB. C., Berding N., Mcintyre C. L., 2004. Markers associated with stalk number and suckering in sugarcane, colocate with tillering and rhizomatousness QTLs in sorgium. Genome 47, 988 993. 14. Kojima T., Nagaoka T., Noda K., OgiharaY., 1998.Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers in Einkorn wheat in relation to that of markers. Theor. Appl. Genet., 96, 37 45. 15. Konieczny, A., and Ausubei, F.M. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR based markers. Plant J. 4: 403 410. 16. Koreth J., O Leary J. J., McGee J. O., 1996. Microsatellites and PCR genomic analysis. J. Path.178:239-248. 17. Malyshev S. V., Korzun V. N., Zaben kova K. I., Voilokov, A. V., Berner A., Kartel N. A., 2003. Comparitive molecular-genetic mapping of genomes of ryse (Secale cereale L.) and other cereals. Tsitol. Genet. 37, 9 20. 18. Masojć P. 2007. Ustalanie tożsamości genetycznej. Biotechnologia roślin, Red. 19. Morgante M., Vogel J., 1994. Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms U.S. Patent Appl 08/326456. 20. Nair S., Kumar A., Srivastava M. N., Mohan M., 1996. PCR- based DNA marjers linced to a gall midge resistance gene Gm4t has potential for marker-aided selection in rice. Theor. Appl. Genet. 92:660-665. 21. Nybom, H. & Kraft, T. 1995. Application of DNA fingerprinting to the taxonomy of European blackberry species. Electrophoresis 16: 1731 1735.
22. Paglia G., Morgante M., (1998), Molecular Breeding, 4, 173-177. 23. Paran I, Michelmore RW 1993. Development of reliable PCR-based markers linked to downy resistance genes in lettuce. Theor Appl Genet 85: 985-993. 24. Powell W., Machray G., Provan J. 1996. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends Pl. Science. 1:215-222. 25. Pradeep Redy M., Sarla N., Siddiq E.A. 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its applications in plant breeding. Euphytica 128: 26. Schulman A.H. 2007. Molecular markers to assess genetic diversity. Euphytica 158: 313-321. 27. Sinrun CH., Hsam S. L., Zeller F. J., Wenzel G., MohlerV., 2004. Localization of a novel recessive powdery mildew resistance gene from commo wheat line RD30 in the terminal region of chromosome 7AL. Theor. Appl. Genet. 109, 210 214. 28. Sztuba Solińska J. 2005. Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli roślin. Kosmos 54: 227 239. 29. Tosti N., Negri V., (2002), Genome, 45, 268-275. 30. Tyrka M., Błaszczyk L., ChełkowskiI J., Lind V., Kramer I., Weilepp M., Wiśniewska H., Ordon F., 2004. Development of the single nucleotide polymorphism marker of the wheat Lr1 leaf rust resistance gene. Cell. Mol. Biol. Lett. 9, 879 889. 31. Varshney A., Mohapatra T., Sharma R. P., 2004. Development and validation of CAPS and AFLP markers for white rust resistance gene in Brassica juncea. Theor. Appl. Genet. 109, 153 159. 32. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Plot J., Peleman J., Kupier M., Zebau M. 1995. AFLP a new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res.23:4407-4414. 33. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K. J., Rafalski J. A, Tingey S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markcrs. Nucl. Acid. Res. 18:6531-6535. 34. Wolko B., Irzykowska L., Święcicki W. K. 1999. AFLP i SSR systemy markerowe przydatne w hodowli roślin. Postępy Nauk Rolniczych 2: 59-70. 35. Wolko B., Kruszka K. 1997. Markery molekularne w badaniach zmienności genetycznej roślin. Postępy Nauk Rolniczych 3.
36. Wolko Ł., Witułka-Wall H., Siemieniako B.,Wolko B., Słomki R. 2001. Poszukiwanie markerów cech użytkowych metodą RAPD-PCR. Przykłady analiz DNA. Red.R. Słomski. Poznań 158-165. 37. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) - anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176-183.