ĆWICZENIE IV Temat I: Budowa i obsługa mikroskopu. Mikroskop umożliwia obserwację obiektów niewidocznych gołym okiem. Zwiększając kąt widzenia, pod którym obserwuje się badany obiekt, pomaga w wytworzeniu na siatkówce oka większego obrazu oglądanego przedmiotu. Powiększenia uzyskiwane przez mikroskopy wynoszą od kilkudziesięciu do kilkuset tysięcy razy. W zależności od sposobu uzyskiwania powiększenia wyróżniamy mikroskopy: świetlne (optyczne) elektronowe. W mikroskopach świetlnych powiększenie uzyskuje się dzięki układowi soczewek optycznych, w mikroskopie elektronowym uzyskuje się powiększony obraz, stosując zamiast fal świetlnych wiązkę elektronów odchylanych elektromagnesami. Budowa mikroskopu optycznego z jasnym polem widzenia 1 - okular, 2 - tubus, 3 - oś optyczna, 4 - statyw, 5 - tarcza obrotowa (rewolwer), 6 - obiektywy, 7 - stolik, 8 - kondensor, 9 - oprawka aparatu Abbego, 10 - przesłona, 11 - matówka, 12 - źródło światła, 13 - podstawa, 14 - pokrętło pionowego przesuwu aparatu Abbego, 15 - śruba makrometryczna, 16 - śruba mikrometryczna. Części mechaniczne - opis ważniejszych elementów podstawa - zapewnia stabilność przyrządu i jest wyposażona w źródło światła statyw - łączy wszystkie części mikroskopu, utrzymuje w stałej odległości układ optyczny obiektywów od okularów tubus - metalowa rurka przystosowana w górnej części do zakładania okularu, w dolnej zaś zakończona tarczą obrotową zwaną rewolwerem w której znajdują się obiektywy stolik mikroskopowy na którym umieszcza się oglądany preparat, wyposażony jest w urządzenie do przesuwania preparatu za pomocą pokręteł znajdujących się pod stolikiem śruba makrometryczna umożliwia znalezienie obrazu śruba mikrometryczna służy do ustawienia właściwej ostrości obrazów Części optyczne - opis ważniejszych elementów aparat oświetlający zwany aparatem Abbego znajduje się pod stolikiem i kieruje promienie światła od źródła światła do obiektywu. W skład aparatu wchodzi kondensor - zespół 2-3 soczewek silnie skupiających światło na preparacie, a w konsekwencji na soczewce czołowej obiektywu oraz przesłona irysowa (diafragma) regulująca ilość światła wpadającego do kondensora.
obiektywy - zbudowane z kilku soczewek i umieszczone na tarczy obrotowej zapewniające prawidłowe włączenie obiektywu w oś optyczną. Najczęściej stosowane obiektywy powiększają 5, 10, 40, 100 razy. Obiektywy dzielimy na suche i immersyjne. okulary - zbudowane z zespołu soczewek płasko-wypukłych powiększają na zasadzie lupy. Okulary umieszczone są w nasadce dwuocznej zwanej binokularem. Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia obiektywu i okularu. W przypadku nasadki dwuokularowej wynik mnoży się jeszcze przez powiększenie nasadki. Temat II. Morfologia grzybów Obserwacje mikroskopowe preparatów w kropli płaskiej z hodowli wybranych klas grzybów. Grzyby (Mycota) w przeciwieństwie do bakterii właściwych i promieniowców należą do organizmów eukariotycznych. Nie wykazują zróżnicowania na korzeń, łodygę i liście, a zatem zaliczamy je do plechowców. Plecha grzybów zbudowana jest ze strzępek (hyphae), które tworzą grzybnię (mycelium). Grzybnia może być podłożowa (substratowa lub wgłębna) i powierzchniowa (powietrzna). Grzybnia powierzchniowa często wytwarza chwytniki które służą do pobierania pokarmu jak i przytwierdzania się do podłoża. Grzybnia niektórych pasożytów roślin może wytwarzać strzępki - ssawki które wnikają do wnętrza komórek żywiciela. Znane są także grzyby nie tworzące grzybni, np. drożdże właściwe; wówczas plecha złożona jest bądź z pojedynczych komórek, bądź pączkując tworzy sznury pseudogrzybni (pseudomycelium). Średnica strzępek waha się w granicach 2-10 ľm. Strzępki bywają wielojądrowe bez przegród poprzecznych - komórczakowe (cenocetyczne) lub częściej wielokomórkowe z poprzecznymi przegrodami (saptae). Septy mają centralny por zapewniający przepływ cytoplazmy pomiędzy komórkami. Wytworami grzybni są różne elementy morfologiczne - formy przetrwalne: skleroty, ryzomorfy, wielopostaciowe owocniki; niekiedy tworzona jest tzw. pseudotkanka, złożona ze zbitej masy grzybni. A- strzępka komórczakowa (Zygomykotina) B- strzępka wielokomórkowa (Ascomycotina) Komórki grzybów otoczone są ścianą komórkową, u większości zbudowaną przeważnie z chityny z domieszką glukanu, celulozy bądź innych polimerów. Do ściany komórkowej od wewnątrz przylega plazmolemma - półprzepuszczalna lipoproteidowa błona cytoplazmatyczna otaczająca protoplast. Ma ona czynny udział w procesach transportu do i na zewnątrz komórki. Cytoplazma jest roztworem koloidalnym, mającym zdolność ciągłego ruchu. W cytoplaźmie zawieszone są organella komórkowe - jądro komórkowe, rybosomy, mitochondria, wakuole. W komórkach występują sybstancje zapasowe w postaci kropelek tłuszczu, ziaren glikogenu i wolutyny. W glebie grzyby występują w postaci grzybni, zarodników, przetrwalników, przy czym grzybnia szybko ulega lizie, zwłaszcza u gatunków nie wykazujących obecności brunatnego, melaninowego pigmentu. Brak chlorofilu i niezdolność do fotosyntezy determinują sposób odżywiania grzybów i rzutują na powiązania z innymi organizmami. Można zatem wyróżnić trzy podstawowe formy ich bytowania - symbiozę, pasożytnictwo i saprofityzm. Partnerami w symbiozie najczęściej bywają rośliny zielone, lecz zdarzają się także owady. Patogeniczność grzybów jest nagminnie spotykana i odnosi się tak do roślin, jak zwierząt i ludzi. Na podkreślenie zasługuje fakt, że symbioza i pasożytnictwo często występują w obrębie tego samego związku, granica między nimi nie jest stała. Grzyby, które wykorzystują związki organiczne ze szczątków roślinnych i zwierzęcych, należą do, saprofitów (roztoczy). Stanowią one najliczniejsza grupę.
Zdolność do zasiedlenia określonego podłoża wynika z możliwości syntezy enzymów rozkładających zawarte w nim związki. Organizmy o znacznej aktywności enzymatycznej charakteryzują się szerszym zasięgiem występowania. Czynnikami limitującymi pojawienie się różnych gatunków są także tempo wzrostu i zdolność do reprodukcji, właściwości antybiotyczne oraz czynniki fizyczne takie, jak: temperatura, odczyn, ciśnienie osmotyczne i wilgotność środowiska. Zasadniczymi siedliskami, w których bytują grzyby, są gleba, woda, powierzchnia roślin. Zgodnie z klasyfikacją Garreta wyróżnia się następujące grupy ekologiczne grzybów: I. grzyby związane z korzeniami: 1. mikoryzowe, 2. wyspecjalizowane pasożyty; II. grzyby bytujące w glebie: 1. nie wyspecjalizowane pasożyty, 2. saprofity: a. grzyby cukrowe wykorzystujące jako źródło węgla cukry proste, b. rozkładające ligninę, c. koprofilne - rozwijające się na nawozie, d. gatunki pasożytujące na organizmach zwierzęcych, szczególnie amebach i nicieniach. I. Klasa Zygomycetes - sprzężniaki. Obejmuje grzyby wyłącznie lądowe. Charakterystyczna jest dla nich grzybnia wielojądrowa. Przegrody poprzeczne formują się głównie dla oddzielenia organów rozmnażania. Rozmnażanie bezpłciowe odbywa się przy udziale zarodników sporangialnych, endogenicznych, wytwarzanych w zarodni (sporangium). W wyniku rozmnażania płciowego z zygoty formują się tzw. zygospory, kiełkujące po okresie spoczynku w strzępkę. Z racji swych grubych błon zarodniki te pełnią funkcję przetrwalników. Są diploidalne. a. stolony b. zarodnia c. kolummela d. zarodniki Rhizopus Mucor a. strzępek grzybni b. zarodnia c. kolummela d. zarodniki Część praktyczna Rhizopus sp. - (pow. 125 i 500x) preparat w kropli płaskiej.
Mucor sp. - (pow. 125 i 500x) preparat w kropli płaskiej. Obserwacja strzępek, ryzoidów i zarodni z zarodnikami. Rysunki grzybni, zarodni, zarodników. II. Klasa Ascomycetes - workowce właściwe (łącznie z Basidiomycetes tworzą grupę grzybów właściwych czyli wyższych). Do klasy tej, najliczniejszej pod względem liczby gatunków, należą głównie grzyby lądowe, o wielokomórkowej grzybni, której ściany zbudowane są z chityny i glukanu, a wyjątkowo z celulozy. Jedynie u drożdży najczęściej brak typowo wykształconych strzępek. Poszczególne odcinki grzybni są na ogół jedno- lub dwujądrowe. Charakterystyczny dla tej grupy jest sposób rozmnażania płciowego. W jego wyniku, powstają w różnie uformowanych owocnikach worki (ascus), zawierające najczęściej 8 lub wielokrotność tej liczby zarodników workowych (ascospora). U niektórych gatunków drożdży właściwych liczba zarodników w worku jest niższa (1-4) i nie jest stała. Rozmnażanie bezpłciowe odbywa się najczęściej przy udziale zarodników konidialnych, charakteryzujących się znacznym zróżnicowaniem morfologicznym. Chlamydospory to inna forma wegetatywnych spor, które są zwykle grubo obłonione, stąd ich rola w przetrwaniu warunków niekorzystnych dla gatunku. Wśród przedstawicieli tej klasy spotyka się zarówno organizmy saprofityczne, jak i patogeniczne dla roślin, zwierząt i ludzi. Rodzaj Saccharomyces charakteryzuje się rozmnażaniem wegetatywnym przez pączkowanie oraz wytwarzaniem okrągłych lub owalnych zarodników umieszczonych w workach. Niektóre gatunki, np. Saccharomyces cerevisiae czy Saccharomyces carlsbergensis zaliczane są do drożdży szlachetnych, charakteryzują się bowiem silnymi właściwościami fermentacyjnymi. w warunkach beztlenowych rozkładają dość duże ilości cukru na alkohol, który nie jest przez nie zużywany. Drożdże z rodzaju Saccharomyces dają na pożywkach płynnych osad opadający na dno, a na podłożach stałych tworzą białe lub kremowe kolonie. a). Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae (drożdże piekarskie) mają komórki owalne lub kuliste, występujące na podłożach płynnych pojedynczo lub podwójnie. Fermentują i asymilują większość cukrów. Mogą wykorzystywać etanol jako jedyne źródło węgla. Drożdże należące do tego gatunku używane są w przemyśle fermentacyjnym, a także do produkcji drożdży paszowych i spożywczych. Saccharomyces cerevisiae U gatunku Saccharomyces cerevisiae worki stanowią komórki nie różniące się od komórek wegetatywnych i zawierające od 1 do 4 (najczęściej 2) askospor.
Rozmnażanie się drożdży: (wg Palucha) I. Wegetatywnie: a) pojedyncza komórka b, c) pączkowanie d) worek z 4 zarodnikami e, f, g, h) podział jądra w czasie pączkowania II. Płciowo i, k, l) zlewanie się komórek (kopulacja) m) powstawanie zygoty n, o) powstawanie worka z 8 zarodnikami Część praktyczna Obserwacja komórek pączkujących Saccharomyces cerevisiae w preparatach przygotowanych z hodowli na podłożu wg Martina. Studenci przygotowują preparat w kropli płaskiej z dodatkiem błękitu metylenowego oraz liczą w trzech polach widzenia komórki zabarwione - martwe i bez zabarwienia - żywe (powiększenie 500x).Rysunek komórki pączkującej. Obserwacja worków z zarodnikami Saccharomyces cerevisiae w preparatach w kropli płaskiej przygotowanych z hodowli na podłożu wg Mc Clary (powiększenie 500x). Rysunek worka z zarodnikami b). Cheatonium sp. należy do Pyrenomycetates grzybów wytwarzających perytecja. Perytecjum ma własną ścianę. Maczugowate worki zawierają po 8 elipsoidalnych askospor, które wyrastają w dolnej części butelkowatego (gruszkowatego) owocnika i są przemieszane z wstawkami płonnymi. Owocniki otwierają się szczytowym kanałem przez który wyrzucane są zarodniki. Pokroje ogólne i budowa (w przekroju) owocników typowych dla Plectomycetes (kleistotecjum), Pyrenomycetes (perytecjum) i Discomycetes (apotecjum) (wg Schlegela)
Część praktyczna obserwacja otoczni (perytecjum) Cheatonium sp., pow 125 lub 500x. rysunek z opisem perytecjum. rysunek z opisem worka zarodnikowego z zarodnikami. III. Klasa Deuteromycetes (Fungi imperfecti) - grzyby niedoskonałe. W tej klasie zgrupowano wszystkie grzyby, które nie mają stadiów płciowych, oraz te, u których stadia takie nie zostały jeszcze stwierdzone. Stadia konidialne tych grzybów są bardzo podobne do dobrze znanych Ascomycetes. Do grupy tej włączano pierwotnie grzyby o strzępkach, wielokomórkowych, u których nie stwierdzono rozmnażania płciowego, a jedynie reprodukcję za pomocą bardzo różnie wykształconych konidiów. W miarę rozwoju badań mikologicznych u wielu spośród tych grzybów wykryto stadia płciowe. Organizmy takie przeklasyfikowano wówczas do odpowiedniej klasy naturalnej. Nie mniej ze względów praktycznych utrzymano nadal klasyfikację w obrębie grzybów niedoskonałych. Ogólnie biorąc, do klasy tej zalicza się stadia konidialne znacznej części workowców i niektórych podstawczaków. Deuteromycetes (Fungi imperfecti) reprezentowane są na ćwiczeniach przez dwa rodzaje - Fusarium sp i Oidium lactis. Rodzaj Fusarium, którego znajomość jest ważna z punktu widzenia ochrony roślin (patogen wielu roślin uprawnych), odznacza się bardzo typowymi wielokomórkowymi, sierpowatymi konidiami. Grzyby z rodzaju Oidium wytwarzają grzybnię wielokomórkową, rozpadającą się na jednokomórkowe fragmenty, zwane, oidiami. Fusarium sp. a. konidiofor b. konidia Oidium lactis a. fragment strzępki grzybni b. oidia Część praktyczna c). chlamydospory Fusarium sp. - obserwacja preparatu w kropli płaskiej powiększenie 500x. Narysować i opisać rysunek strzępek i konidiów,. Oidium lactis - obserwacja preparatu w kropli płaskiej powiększenie 500x. Narysować i opisać rysunek strzępek i oidiów.