Ćwiczenie 2 Część teoretyczna: I. POSIEWY MIKROBIOLOGICZNE Posiew mikrobiologiczny to przeniesienie drobnoustrojów z hodowli lub badanego materiału do jałowej pożywki. Zaszczepioną pożywkę umieszcza się w cieplarce, w określonych, stałych warunkach temperatury i natlenienia, zapewniając rozwój hodowanym mikroorganizmom. Celem posiewu może być: - odświeżenie hodowli drobnoustrojów (m. in. przesiewy szczepów muzealnych w celu utrzymania ich żywotności i aktywności - izolacja czystych kultur z badanego materiału - diagnostyka wyizolowanych szczepów w celu określenia ich przynależności do gatunku, rodzaju lub określonej grupy drobnoustrojów (posiewy te obejmują badania morfologiczne, fizjologiczne, biochemiczne, prowadzone na różnych podłożach) - stwierdzenie stanu mikrobiologicznego produktu (jałowość, jakość mikroflory) - oznaczenie liczby drobnoustrojów w materiale - przygotowanie inokulatów do prowadzenia hodowli w warunkach doświadczalnych czy też do celów przemysłowych. Zachowanie warunków jałowości przy wykonywaniu przesiewów (naczynia, sprzęt, pożywki, pomieszczenia), najlepiej w przeznaczonym do tego pomieszczeniu komorze laminarnej. Posiew wykonuje się przy palniku gazowym, opalając wyloty naczyń i pipet w płomieniu, a także wyżarzając używane igły i ezy. Posiewu drobnoustrojów wykonuje się ezą, igłą lub pipetą, niekiedy przy pomocy jałowych tamponów z waty, gazy, szklanych głaszczek. Za pomocą ezy posiewy na podłoża płynne (zanurzając ezę i wymywając komórki) i stałe (punktowo, albo pocierając powierzchnię rysowo lub koliście). 1
II. TYPY WZROSTU NA PODŁOŻU STAŁYM - drobnoustroje mogą rozwijać się na płytkach, słupkach i skosach - kolonie tworzone są przez bakterie na podłożach stałych, to widoczne gołym okiem skupiska komórek, rozwijają się najczęściej z pojedynczych komórek bakterii - w stałych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami (cechy diagnostyczne) - wzrost na podłożu na szalce Petriego obserwacja po mikroskopem lub lupą cechy kolonii: a) wymiary: średnica w mm b) kształt: punktowy, okrągły, owalny, soczewkowaty, wydłużony, rozlany, rizoidalny (rysunek mrozu na szybie), nieregularny, strzępiasty c) barwa: bezbarwne, białe, żółte, itp. d) profil (wyniosłość): płaska, wyniosła, pęcherzykowata, brodawkowata, kraterowata e) powierzchnia: gładka i błyszcząca, matowa, szorstka, pomarszczona, pylista, skórzasta f) struktura: luźna, mazista, zwarta g) charakter brzegu: regularny, nieregularny, rozlany, strzępiasty, falisty, ząbkowane h) zdolność barwienia podłoża kolonie tego samego gatunku w różnych fazach wzrostu: kolonie typu S (smooth gładki) gładka powierzchnia, równe brzegi R (rough szorstki) szorstka powierzchnia, pofałdowana, nierówne brzegi przejściu bakterii z fazy S do fazy R towarzyszy zmiana składu polisacharydów bakterie chorobotwórcze w fazie S są zjadliwe, w fazie R łagodne. 2
- drobnoustroje na podłożu skośnym: posiane rysowo lub ruchem falistym nie tworzą kolonii określa się wzrost i jego intensywność: obfity, skąpy, słaby uwzględnia się i inne cechy diagnostyczne: barwa, powierzchnia itp. charakter wzrostu na skosie jednolity, rozlany, postrzępiony, pierzasty i in. - drobnoustroje w hodowli kłutej ocenia się niektóre właściwości drobnoustrojów (np. ruchliwość, upłynnienie żelatyny) ocenia się charakter upłynnienia - np. wzdłuż nakłucia, kraterowaty, całkowity. Kolonia to skupisko bakterii widoczne gołym okiem, wyrosłe najczęściej z jednej komórki. W standardowych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami, uwzględnianymi w diagnostyce. Obserwacje koloni przeprowadza się przy pomocy lupy lub binokularu biorąc pod uwagę: o wielkość ( w milimetrach) oraz kształt koloni, np. okrągły, nieregularny, rozgałęziony, nitkowaty: Niektóre bakterie mogą nie tworzyć pojedynczych kolonii, lecz zarastać całe podłoże, dając wzrost mgławicowy, rozlany (Proteus), inne tworzą kolonie rozpełzające się po powierzchni podłoża (Bacillus). o brzeg koloni: gładki, falisty regularny lub nieregularny, płatowaty regularny lub nieregularny, ząbkowany regularny lub nieregularny, nitkowaty: o powierzchnia koloni: gładka i pomarszczona; może być lśniąca lub matowa: o barwa koloni i jej przejrzystość: przeźroczysta, mętna, opalizująca, nieprzeźroczysta oraz zdolność do wytwarzania pigmentu zabarwiającego otoczenie koloni: zabarwione, niezabarwione. Na przykład Sarcina lutea i Pseudomonas herbicola tworzą kolonie żółte, Staphylococcus aureus pomarańczowo-złote; Serratia marcescens krwisto-czerwone; Azotobacter ciemno brązowe, Pseudomonas fluorescens seledynowe fluoryzujące. Ponadto wytwarzane przez pseudomonady 3
barwniki dyfundują do podłoża zmieniając kolor na zielonkawy, niebieskawy, fioletowy, niekiedy fluoryzujący; o konsystencja: struktura: zwarta, drobnoziarnista, gruboziarnista, luźna; o profil koloni ponad powierzchnię pożywki: płaski; wyniosły; soczewkowaty niski, soczewkowaty wysoki; pępkowaty. Z praktycznego punktu widzenia rozróżnia się następujące typy kolonii powierzchniowych: S (smooth gładki) o gładkim brzegu, powierzchni wypukłej bez wzniesień i wgłębień. Jest to cecha charakterystyczna dla kolonii młodych i prowadzonych na agarze odżywczym, a także zjadliwych form bakterii chorobotwórczych, R (rought szorstki) o brzegu nierównym, płatowatym lub nitkowatym i szorstkiej powierzchni. Bakterie tworzące takie kolonie układają się w długie nici lub łańcuszki. Kolonie takie tworzą niezjadliwe formy bakterii, chociaż te same bakterie wytwarzające kolonie gładkie, są chorobotwórcze G (gonidial gonidialny) kolonie bardzo drobne o średnicy 1 mm tworzone przez drobne bakterie M (mucoid śluzowaty) kolonie gładkie o powierzchni śluzowatej, błyszczącej, wytwarzane przez bakterie ze śluzową otoczką L (L-formy) powstają spontanicznie lub w niesprzyjających warunkach środowiskowych. Kolonia taka składa się z komórek bardzo drobnych przesączalnych, poprzez formy ziarniste i pałeczkowate, do form olbrzymich o średnicy dochodzącej do 10 μm. 4
III. MIKROSKOP BUDOWA I TECHNIKA MIKROSKOPOWANIA Okular (a), tubus (b), rewolwer obiektywowy (c), obiektyw (d), statyw (e), stolik przedmiotowy (f), przysłona aperturowa (g), kondensor (h), pokrętło podnośnika kondensora (i), oświetlacz (j), podstawa (k), pokrętło ruchu drobnego (l), pokrętło ruchu zgrubnego (ł) BUDOWA MIKROSKOPU ŚWIETLNEGO a) części mechaniczne: - podstawa (zawiera oświetlacz) - statyw - tubus - stolik mikroskopowy 5
- śruba makrometryczna zakres przesuwu kilkadziesiąt mm, pełny obrót śruby przesuwa układ o 18 mm - śruba mikrometryczna zakres przesuwu 2 mm, skok 0,1 mm - pokrętła śrub b) części optyczne: - aparat oświetlający (zwany aparatem Abbego) kondensor i przysłona irysowa (diafragma), kondensor zbudowany jest z 2-3 soczewek silnie skupiających światło na preparacie, a w konsekwencji na soczewce czołowej obiektywu przesłona irysowa reguluje ilość światła wpadającego do kondensora - oświetlenie aparatu - obiektywy: jest ich zwykle od 3 do 5, umieszczone są w tzw. rewolwerze powiększenia: 5, 10, 20, 40, 60, 100 razy (opisane na obudowie) zbudowany jest z kilku lub kilkunastu soczewek skupiających sklejonych balsamem kandyjskim, umieszczonych w metalowej oprawce, najbliższa preparatu to soczewka czołowa obiektywy suche (powietrzne) i zanurzeniowe (immersyjne) obiektywy suche (5-60 razy) duże mikroorganizmy (algi, grzyby i pierwotniaki) obiektywy zanurzeniowe (100 razy) barwione preparaty bakteryjne i inne obiekty wymagające dużego powiększenia zasada działania - obiektyw suchy promienie trafiają do ośrodka optycznie rzadszego (powietrza) ulegają w nim załamaniu oraz odbiciu i nie wszystkie trafiają do soczewki czołowej obiektywu - obiektyw immersyjny przestrzeń robocza pomiędzy preparatem a soczewka czołową wypełnia płyn immersyjny (olejek cedrowy, rycynowy), o współczynniku załamania światła zbliżonym do szkła, promienie świetlne przechodząc przez preparat trafiają na ośrodek optycznie jednorodny, nie następuje zatem zjawisko rozproszenia światła, wszystkie promienie świetlne dochodzą do obiektywu - okulary zbudowane są z soczewek płasko-wypukłych i powiększają na zasadzie lupy mają powiększenia od 2 do 30 razy 6
soczewka bliżej oka to soczewka oczna, ta bliżej obserwowanego przedmiotu to soczewka polowa stosuje się okulary Huygensa i Ramsdena mikroskopy binokularne (dwa okulary) i monokularne (jeden okular) może być dodatkowa soczewka należy o niej pamiętać przy obliczaniu powiększenia mikroskopu ZASADA DZIAŁANIA MIKROSKOPU - promienie świetlne (lusterko lub źródła światła sztucznego) zostają skierowane ze źródła światła poprzez aparat Abbego na preparat - wiązka światła z aparatu Abbego przechodzi najpierw przez otwór przysłony irysowej, a następnie zostaje skupiona w soczewkach kondensora - z kondensora światło przechodzi przez otwór w stoliku na preparat, przy tym przejściu część promieni ulega ugięciu na preparacie, a część przechodzi nie zmieniona dalej do ośrodka znajdującego się między preparatem a soczewką czołową obiektywu - promienie ugięte na preparacie i promienie oświetlenia tła trafiają do obiektywu powstaje pierwsze powiększenie przedmiotu (obraz rzeczywisty, powiększony i odwrócony) - z obiektywu obraz trafia do okularu, otrzymujemy obraz powiększony, prosty i pozorny PARAMETRY CHARAKTERYZUJĄCE MIKROSKOP: Powiększenie mikroskopu iloczyn powiększenia obiektywu i okularu, liczby oznaczające powiększenie wyryte są na wymienionych elementach Zdolność rozdzielcza mikroskopu określa, jak blisko siebie mogą leżeć dwa punkty, aby patrząc na nie przez mikroskop można je było widzieć jako punkty oddzielne, zależy ona wyłącznie od obiektywu D = λ/2an D najmniejsza odległość między punktami λ długość fali światła AN apertura numeryczna obiektywu apertura numeryczna określa zdolność układu optycznego do przyjmowania światła AN = n sinα n współczynnik załamania światła środowiska między preparatem a obiektywem α kąt aperturowy utworzony przez skrajny promień wchodzący do soczewki czołowej obiektywu a jego osią optyczną im krótsza jest fala światła i im większą aperturę liczbową posiada obiektyw, tym większa jest zdolność rozdzielcza mikroskopu apertura numeryczna dla obiektywów suchych poniżej 1,0 apertura numeryczna dla obiektywu immersyjnego - powyżej 1,0 (1,2-1,6) 7
zdolność rozdzielcza mikroskopu immersyjnego 0,2 μm (dł. fali 0.55 μm) zdolność rozdzielcza dla mikroskopu optycznego 0,2 μm Odległość robocza odległość pomiędzy soczewką czołową obiektywu a preparatem w momencie prawidłowego ustawienia ostrości obrazu, w miarę zwiększania powiększenia odległość robocza maleje. Przestrzeń robocza przestrzeń pomiędzy soczewką czołową obiektywu a preparatem w chwili najlepszego widzenia. TECHNIKA WYKONYWANIA PREPARATU BAKTERIOLOGICZNEGO 1. Na szkiełko podstawowe na środek nanosimy przy pomocy ezy 1-2 kropli płynu fizjologicznego. 2. Pobieramy materiał bakteriologiczny i przenosimy go do płynu fizjologicznego. 3. Robimy rozmaz. 4. Suszymy na wolnym powietrzu. 5. Trzymając szkiełko w szczypcach Corneta, utrwalamy rozmaz przesuwając go trzykrotnie przez płomień palnika. 6. Studzimy szkiełko. 7. Przystępujemy do barwienia. 8
IV. BARWIENIE Barwniki substancje organiczne naturalnego pochodzenia lub też związki sporządzone syntetycznie, które adsorbują się lub rozpuszczają w substratach, dając trwałe połączenia barwne. Barwniki dzielimy na: kwaśne (eozyna, fuksyna kwaśna, zieleń jasna) jonem barwnym jest anion oraz zasadowe (błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczki, fuksyna zasadowa) jonem barwnym jest kation. Do barwienia drobnoustrojów przeważnie stosuje się barwniki zasadowe, wynika to z budowy i składu chemicznego, powierzchniowych warstw komórki drobnoustrojów, a także zawartości kwasów nukleinowych. Barwienie bakterii zależy: - od stanu fizykochemicznego barwnika i odbarwiacza, - natury barwionych drobnoustrojów, - zewnętrznych czynników natury fizycznej i chemicznej wspierających proces barwienia. Celem barwienia jest: - odróżnienie bakterii od składników otoczenia, - rozróżnienie poszczególnych grup drobnoustrojów między sobą, - odróżnienie pewnych szczegółów w budowie komórki, - wykazanie zmian czynnościowych w komórce. Metody barwienia drobnoustrojów: - barwienie proste polega na wprowadzeniu do komórki jednego barwnika, stosuje się je rzadko, ponieważ daje informacje jedynie o kształcie komórki, - barwienie złożone stosuje się kilka barwników w mieszaninie lub po sobie oraz odbarwiacze, - barwienie pozytywne obserwujemy zabarwione komórki na bezbarwnym tle, - barwienie negatywne obserwujemy niezabarwione drobnoustroje na zabarwionym tle. Utrwalanie preparatów Utrwalenie przerywa zachodzące w komórkach procesy fizjologiczne i pozwala zachować strukture komórek, zapobiegając zmianom pośmiertnym. Ma na celu: - zabicie komórek drobnoustrojów; - przyklejenie się komórek do powierzchni szkiełka nie spłukuje ich barwnik ani woda, - odsłonięcie w ścianach komórkowych martwych mikroorganizmów związków, z którymi łączy się barwnik. Utrwalanie możemy wykonywać metodą: - termiczną wyschnięty preparat przeprowadzamy 3-krotnie w pozycji poziomej (rozmazem do góry) przez płomień palnika (część nie świecąca) - chemiczną do badania struktur komórkowych, przy użyciu 60-70% alkoholu, 10% formaliny, sublimatu lub mieszaniny eteru i alkoholu (1:1). W tym celu na wysuszony rozmaz nalewa się odpowiedni odczynnik. Po 5 10 min zlewa się utrwalacz, suszy na powietrzu i barwi jedną z 9
podanych metod. Używając sublimatu lub formaliny należy preparat dobrze przemyć wodą i wysuszyć. POSŁUGIWANIE SIĘ MIKROSKOPEM IMMERSYJNYM: 1. Umieścić kroplę olejku cedrowego na szkiełko przedmiotowe z preparatem. 2. Kondensor podnieść maksymalnie do góry. 3. Odszukać obiekt immersyjny. 4. Patrząc z boku mikroskopu wyszukujemy obiektyw immersyjny (pow. 100x). 5. Śrubą makrometryczną zanurzamy obiektyw w olejku (patrząc z boku mikroskopu). 6. Regulujemy światło. 7. Przy pomocy śruby makrometrycznej szukamy obrazu. 8. Śrubą mikrometryczną regulujemy ostrość. V. MORFOLOGIA BAKTERII: 1. Formy kuliste - ziarniak micrococcus, - dwoinka diplococcus, - czwórniak tetragenes, - sześcianka sarcina, - paciorkowiec streptococcus, - gronkowiec staphylococcus. 2. Formy cylindryczne - laseczka bacillus, - pałeczka bacterium. 3. Formy spiralne i inne - przecinkowiec vibrio, - śrubowiec spirillum, - krętek spirocheta, - maczugowiec corynebacterium - forma nitkowata (promieniowce) 10
VI. IZOLACJA SZCZEPÓW BACILLUS Z GLEBY Wstęp: Jedną z cech, charakterystyczną dla bakterii należących do rodzaju Bacillus jest ich zdolność, do tworzenia wyspecjalizowanych komórek nazywanych sporami, które są bardzo odporne na ciepło, wysychanie i promieniowanie UV. Spory mogą trwać przez bardzo długi czas w środowisku, aż do momentu zmiany warunków na korzystne do ich rozwoju. Wtedy spory kiełkują w formę wegetatywną. Podstawy racjonalne: Ponieważ spory są zarówno odporne, jak i aktywowane do kiełkowania przez ciepło, gotowanie próbki gleby w bulionie odżywczym, spowoduje zabicie praktycznie wszystkich bakterii oraz będzie stymulować wzrost sporów Bacillus. Zjawisko to nazywane jest szokiem cieplnym. Inkubacja ogrzanego bulionu pozwoli sporom na wykiełkowanie i wytworzenie komórek wegetatywnych. Komórki te uformują kolonie Bacillus na płytkach z agarem odżywczym. Część praktyczna: 1. Analiza wzrostu kolonii na podłożu stałym (szalka Petriego) a) zabrać hodowlę z ubiegłego tygodnia (szalka Petriego posiew metodą odciskową) ze wskazanego miejsca b) nie otwierać szalek c) w oparciu o informacje z części teoretycznej instrukcji, określić typ wzrostu wybranej koloni drobnoustrojów (posługiwać się mikroskopem stereoskopowym, lupą, linijką i własnym okiem ), 11
każda osoba analizuje swoją kolonię d) informacje zanotować 2. Przeszczepianie kolonii z podłoża stałego na skos bulionowy (wyprowadzenie czystej kultury drobnoustrojów) a) praca w warunkach sterylnych b) wybraną we wcześniejszym doświadczeniu kolonię drobnoustrojów przesiać na skos bulionowy w probówce zgodnie z prezentacją prowadzącego. 3. Izolacja Bacillus z gleby a. Napełnić łaźnię wodną do połowy objętości i podgrzewać na palniku aż do momentu zagotowania. b. Dodać w warunkach jałowych (przy palniku) około 1-2 gramów gleby (około pół łyżeczki) do probówki z bulionem odżywczym. c. Zatkać probówkę i umieścić ją w gorącej łaźni wodnej na 10-12 minut. Upewnij się, że poziom wody w łaźni znajduje się ponad powierzchnia bulionu odżywczego, tak aby całość probówki uległa jednakowemu podgrzaniu. d. Wyciągnąć probówkę z łaźni wodnej i schłodzić. e. Inkubować probówkę w temperaturze 32 C przez tydzień. 4. Obliczyć powiększenie mikroskopu świetlnego dla obiektywu o powiększeniu 100x i okularu o powiększeniu 16x (sprawozdanie 1). 12