BIOLOGIA KOMÓRKI MIKROSKOPIA W ŚWIETLE PRZECHODZĄCYM- BUDOWA I DZIAŁANIE MIKROSKOPU JASNEGO POLA, KONTRASTOWO- FAZOWEGO I Z KONTRASTEM NOMARSKIEGO

Transkrypt

1 BIOLOGIA KOMÓRKI MIKROSKOPIA W ŚWIETLE PRZECHODZĄCYM- BUDOWA I DZIAŁANIE MIKROSKOPU JASNEGO POLA, KONTRASTOWO- FAZOWEGO I Z KONTRASTEM NOMARSKIEGO

2 1. Zasada działania mikroskopu z kontrastem fazowym (KF) Mikroskop z kontrastem fazowym stereoskopowym jest szczególnie przydatny w obserwacjach preparatów cyto- i histologicznych komórek hodowanych in vitro. Umożliwia on obserwację przedmiotów fazowych tzn. nie wykazujących naturalnego kontrastu. Przedmioty fazowe - nie wykazują różnic w pochłanianiu światła, różnią się od otaczającego je środowiska współczynnikiem załamania lub grubością, promienie świetlne przechodzące przez nie ulegają tylko przesunięciu fazowemu, nie zmienia się ich amplituda Przedmioty amplitudowe - wykazują różnice w pochłanianiu światła, amplituda promieni świetlnych przez nie przechodzących ulega zmniejszeniu, co manifestuje się widoczną dla oka zmianą natężenia światła- naturalnym kontrastem obserwowanym w mikroskopie. Kontrast fazowy w mikroskopii polega na bezpośrednim przekształceniu zmian fazowych fali świetlnej w badanym preparacie na widoczne dla oka zmiany natężenia światła w obrazie mikroskopowym tego preparatu. Analizując przebieg promieni świetlnych w układzie optycznym mikroskopu KF (rys.1) oświetlających przedmiot fazowy, obserwuje się w płaszczyźnie ogniskowej obrazowej obiektywu wyraźne odgraniczenie światła dyfrakcyjnego S d od światła bezpośrednio przechodzącego przez preparat S b (rys.2). Od tego uzależniona jest techniczna realizacja kontrastu fazowego, ponieważ dzięki temu można w źrenicy wyjściowej obiektywu zmieniać fazę i amplitudę światła bezpośredniego bez oddziaływania na światło dyfrakcyjne i na odwrót. Kontrast fazowy polega na wytworzeniu między światłem bezpośrednim i dyfrakcyjnym dodatkowej różnicy fazy ψ = 90 o, a także na zmniejszeniu natężenia światła bezpośredniego, ponieważ efektywnie interferują fale świetlne zgodne lub przeciwne w fazach i o takich samych amplitudach. Do takiej modulacji światła bezpośredniego służy płytka fazowa. Pierścień fazowy składa się z 2 warstw: substancji dielektrycznej (kriolit lub fluorek magnezu) zmieniającej fazę światła i substancji metalicznej (Cr, Al) osłabiającej jego natężenie. Płaszczyzna obrazowa obiektywu I S b S b S d Płytka fazowa Płaszczyzna ogniskowej obrazowej obiektywu Źrenica wyjściowa obiektywu S d Rys.2. Typowy rozkład natężenia światła bezpośredniego i dyfrakcyjnego w źrenicy wyjściowej obiektywu; przedmiot fazowy strukturalnie złożony płaszczyzna przedmiotowa obiektywu - przedmiot fazowy Kondensor źródło światła Rys.1. Zasada kontrastu fazowego 2

3 BUDOWA MIKROSKOPU Nie składaj mikroskopu! Zapoznaj się z budową i przeznaczeniem następujących elementów (porównaj: instrukcja Mikroskop z kontrastem fazowym stereosokpowym MB 30S, str.5-8): Statyw mikroskopu (pokrętło ruchu zgrubnego, pokrętło ruchu drobnego) - oświetlacz (lustro oświetlacza, oprawa żarówki oświetlacza, dźwignia diafragmy pola) - zasilacz oświetlacza Kondensor (w gnieździe wspornika) (pokrętki centrujące kondensor, pokrętło przesuwu kondensora, wkręt zaciskowy kondensora), pierścieniowa przesłona kondensorowa, Diafragma aperturowa Kondensor ma dysk rewolwerowy, który zawiera 1 otwór przelotowy oraz 4 przesłony pierścieniowe różniące się wymiarami przeźroczystych pierścieni, które dopasowane są do pierścieni fazowych w odpowiadających im obiektywach. Przesłony te służą do ustawienia oświetlenia w kontraście faz. Przesłona pierścieniowa to dwie szklane płytki (jedna ze szklanych płytek pokryta jest czarną substancją, w której jest wykonany przezroczysty pierścień), między którymi zaklejone są dodatkowo dwa półkoliste polaroidy. Polaroidy są tak skonstruowane, aby drgania przechodzącego przez nie światła zachodziły w kierunkach do siebie prostopadłych. Polaryzacja światła jest konieczna w celu uzyskania efektu stereoskopii. Stolik krzyżowy (pokrętki przesuwu stolika, dźwignia zaciskowa) Rewolwer obiektywowy Obiektywy z wbudowanymi płytkami fazowymi zawierającymi pierścienie fazowe Łącznik z półfalówką i soczewką Bertranda (dźwignia do włączania półfalówki, pokrętka do włączenia soczewki Bertranda, pokrętka ruchu ogniskującego soczewkę Bertranda).Soczewka Bertranda jest elementem pomocniczym mikroskopu KF, służy do obserwacji źrenicy wyjściowej obiektywu i scentrowania obrazu pierścieniowej przesłony kondensorowej z pierścieniem płytki fazowej. Przysłona kondensora jest optycznie sprzężona z pierścieniem fazowym obiektywu: bezpośredni obraz pierścieniowego otworu kondensorowego tworzy się na pierścieniu fazowym Dwuoczna nasadka okularowa (pierścień dioptryjny, polaryzatory) polaryzatory umieszczone w nasadce okularowej służą do wygaszania spolaryzowanego światła wychodzącego z przesłony kondensorowej Okulary W celu uzyskania obrazów ostrych i bez zniekształceń stosuje się w układach optycznych diafragmy (pola i aperturowa) ograniczające szerokości kątowe wiązek świetlnych wchodzących do danego układu (wycina się w ten sposób z wiązki promienie pozaosiowe, pozostawiając przyosiowe) 3

4 USTAWIENIE MIKROSKOPU DO PRACY a. złożyć mikroskop (wg instrukcji, str. 9) b. ustawić kondensor na pozycji 0 c. maksymalnie otworzyć diafragmy pola i aperturową, d. wyłączyć soczewkę Bertranda, e. wyłączyć polaryzatory w nasadce dwuocznej f. przygotować preparat i umieścić na stoliku mikroskopu g. zogniskować mikroskop na badanym preparacie h. ustawić oświetlenie mikroskopu wg zasady Köhlera do obserwacji w jasnym polu (patrz instrukcja obsługi, str.9) i. ustawić mikroskop do obserwacji kontrastowo-fazowej stereoskopowej (wg załączonej instrukcji str.9 i 10) Ryc. 1. Typowy obraz komórki w mikroskopie jasnego pola (A), w mikroskopie kontrastowofazowym (B), w mikroskopie interferencyjno-polaryzacyjnym (C) i w mikroskopie fluorescencyjnym (D) PRZYGOTOWANIE PREPARATÓW MIKROSKOPOWYCH Przygotowanie szkiełek przedmiotowych i nakrywkowych - dokładnie z obu stron wymyć szkiełka watą, zanurzoną w alkoholu, nawiniętą na pęsetę - dokładnie wytrzeć szkiełka gazą - na odtłuszczone szkiełka podstawowe nałożyć a) skórkę łuski spichrzowej cebuli w kropli 0,9% NaCl przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym; b) wazelinowy odcisk palca - na palec nabrać odrobinę wazeliny, wytrzeć palec gazą, a następnie zrobić odcisk palca na szkiełku podstawowym; preparatu nie przykrywać szkiełkiem nakrywkowym; c) nabłonek błony śluzowej jamy ustnej - palcem zeskrobać odrobinę nabłonka błony śluzowej jamy ustnej, a następnie przenieść go na czyste szkiełko podstawowe, nie przykrywać szkiełkiem nakrywkowym; preparaty oglądać w kontraście fazowym i w jasnym polu pod różnymi powiększeniami Wszystkie preparaty, w tym również te gotowe z utrwalonymi komórkami obserwować w kontraście fazowym i w jasnym polu pod różnymi powiększeniami 4

5 Obserwacja obiektów biologicznych w dyferencjalnym (różnicowym) polu interferencyjnym Mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny jest przyrządem opartym na podobnej zasadzie działania co mikroskop kontrastowo-fazowy. Jednak w porównaniu z mikroskopem kontrastowo-fazowym znajduje on znacznie szersze zastosowanie. Oprócz możliwości obserwacji obiektów fazowych pozwala on dokonywać licznych pomiarów, między innymi przesunięcia fazowego, grubości obiektów, współczynnika załamania światła, stężenia substancji, zawartości suchej masy w komórkach oraz wielu innych wielkości fizycznych. Zasada działania mikroskopu interferencyjnego opiera się na pomiarze przesunięcia fazowego światła przechodzącego przez dany obiekt w stosunku do środowiska o innym współczynniku załamania, np. tła. To przesunięcie fazowe jest proporcjonalne do współczynnika załamania światła. Jedną z odmian mikroskopu interferencyjnego, znajdującą obecnie szerokie zastosowanie w biologii komórki jest mikroskop interferencyjny o kontraście różnicowym Nomarskiego (DIC). Ten układ optyczny uwidacznia struktury różniące się współczynnikiem załamania światła, wykorzystując bardzo nieznaczne przesunięcie w fazie interferujących promieni świetlnych, rzędu zdolności rozdzielczej obiektywu mikroskopowego. Wytwarzane w ten sposób obrazy sprawiają wrażenie trójwymiarowości. Elementami charakterystycznymi tego mikroskopu są: 1. Głowica interferencyjna, która mieści w sobie 3 pryzmaty dwójłomne oraz analizator. Oprócz możliwości włączania do układu optycznego mikroskopu pryzmaty mogą być przesuwane w dwóch kierunkach: a) równoległym do osi optycznej mikroskopu, co umożliwia uzyskanie jednorodnego pola interferencyjnego oraz zmiany szerokości prążków interferencyjnych w polu widzenia b) prostopadłym, co umożliwia zmianę faz między interferującymi falami świetlnymi oraz pomiar różnicy drogi optycznej w badanym obiekcie 2. Kondensor z przysłona szczelinową 3. Polaryzator 4. Filtry interferencyjne 5. Mikroskop pomocniczy, służący do obserwacji źrenicy wyjściowej obiektywu i regulacji mikroskopu z urządzeniem polaryzacyjno-interferencyjnym 5

6 Wykonanie ćwiczenia: Uwaga! W nawiasach podane są numery stron instrukcji obsługi mikroskopu. Zapoznać się z częściami mikroskopu polaryzacyjno-interferencyjnego (str ). Przygotowanie mikroskopu do pracy metodą dyferencjalną (str 32) 1.Włączyć pryzmat 1. 2.Skrzyżować polaroidy (tzn. polaryzator ustawić na x, a analizator na 45 ) 3.Ustalić szerokość przesłony szczelinowej kondensora tak, aby z pierwszego prążka barwnego wycinała tylko barwę purpurową. Prążek ten sprowadza się na obraz szczeliny, przesuwając pryzmat dwójłomny za pomocą pokrętki przesuwu poprzecznego pryzmatu. 4.Jeżeli szczelina pokrywa dokładnie purpurową część prążka interferencyjnego, to pole widzenia obserwowane przez okular powinno być całkowicie zabarwione również na kolor purpurowy. 5.Jeżeli pole widzenia nie jest całkowicie zabarwione na kolor purpurowy tzn. że pryzmat dwójłomny nie znajduje się w odpowiedniej odległości od ogniska obiektywu. Należy wówczas pokręcić pierścieniem moletowanym w jednym lub drugim kierunku, aż do uzyskania pola widzenia zabarwionego jednorodnie. 6.Jeżeli w czasie wykonywania tych czynności barwa purpurowa będzie zanikać należy delikatnie przesunąć pryzmat w kierunku prostopadłym do osi optycznej, przy użyciu pokrętki śruby mikrometrycznej. 7.Przygotować preparaty, a następnie porównać ich obrazy z otrzymanymi przy użyciu mikroskopu jasnego pola i mikroskopu kontrastowo-fazowego. ZAKRES MATERIAŁU OBOWIĄZUJĄCY DO ĆWICZEŃ: - podstawowe pojęcia optyki, charakterystyka fali świetlnej; - budowa mikroskopu świetlnego jasnego pola - powiększenie, zdolność rozdzielcza mikroskopu, apertura numeryczna, - rodzaje mikroskopów świetlnych - budowa i zasada działania mikroskopu kontrastowo-fazowego - budowa i zasada działania mikroskopu polaryzacyjno-interferencyjnego (metoda prążkowa i metoda dyferencjalna) - załamanie, interferencja i dyfrakcja światła oraz prawa dotyczące tych zjawisk - dwójłomność, polaryzacja światła, skręcenie płaszczyzny polaryzacji. ZALECANA LITERATURA: M. Pluta Mikroskopia optyczna rozdz. 8. Mikroskopia fazowo-kontrastowa. L. Appel, R. Kowalczyk - Mikroskop. Budowa i użytkowanie. B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część I, panel 1.1 dostępny podręcznik fizyki doświadczalnej (dział optyka- mikroskopy) instrukcje dołączone do ćwiczenia 6