Nanoskalowa funkcjonalizacja powierzchni biomateriałów do kontaktu z krwią

Nanoskalowa funkcjonalizacja powierzchni biomateriałów do kontaktu z krwią Bogusław Major* Wykorzystanie metod inżynierii materiałowej i biologii do funkcjonalizacji powierzchni biomateriałów staje się kierunkiem aktualnie realizowanych badań w obszarze inżynierii biomedycznej. Kontakt materiału z krwią może zainicjować procesy takie jak przykładowo tworzenie skrzeplin, które stanowić będą zagrożenie dla życia. Badania realizowane w Instytucie Metalurgii i Inżynierii Materiałowej PAN skoncentrowane są na modyfikacji i funkcjonalizacji powierzchni materiałów polimerowych, głównie poliuretanu (PU). Eksperymenty polegają na funkcjonalizacji powierzchni z zastosowaniem materiałów porowatych wytwarzanych przez elektroprzędzenie oraz półporowatych uzyskanych na drodze osadzenia wielowarstwowych powłok z polielektrolitów organicznych. Docelowym efektem działalności badawczej realizowanej w IMIM PAM w obszarze nowe materiały biomedyczne jest doprowadzenie do architektury powłoki, o właściwościach biomimetycznych, zbliżonej do struktury tkanki naczyniowej z finalną powłoką komórek śródbłonka, umożliwiającą zapobieganie agregacji płytek krwi. Koncepcją badań jest odtworzenie struktury naturalnej tkanki naczyniowej (rys. 1) na sztucznym rusztowaniu. Fibroblast Współdziałanie odpowiedniego rusztowania, komórek i sygnału stymuluje komórki efektywnego wzrostu, które mogą znacznie zmniejszyć inwazyjność biomateriałów po implantacji. Dostateczna podaż składników odżywczych do wszczepionych komórek jest głównym wyzwaniem do zaprojektowania udanej konstrukcji rusztowania. Nowe rozwiązania budowane są na bazie kolagenu jako łożyska naczyniowego. Powszechnie Strona światla naczynia krwionośnego Warstwa komórek śródbłonka Gładkie komórki mięśniowe Warstwa infima Warstwa media Warstwa adventitia Rys. 1. Struktura przekroju naturalnej tkanki naczyniowej; warstwa wewnętrzna zawiera komórki śródbłonka [1] znane właściwości komórek śródbłonka (EC-endothelium cells) działają jako bariera pomiędzy krwią i biomateriałem i mogą czynnie hamować zakrzepicę. Współpraca kultury ludzkiej komórki śródbłonka HUVEC komórki uzyskiwane z żyły pępowinowej ( HUVEC human umbilical vein endothelial cells) i komórek mięśni gładkich (UVSMC umbilical smooth muscle cells) jest podstawą konstrukcji. W przypadku analogów tkankowych, ważne jest, aby zwrócić uwagę na konieczność spełnienia wszystkich wymogów odnośnie mechanizmów regulacyjnych. Prace badawcze, które są w toku, koncentrują się na projektowaniu nowych biomateriałów z powierzchnią funkcjonalną. Stosunkowo stare, ale nadal aktualne podejście w literaturze [1, 2], proponuje włączenie fibronektyny, jako głównego składnika macierzy pozakomórkowej (ECM external cellular matrix), wprowadzonej w ramach śródbłonka. ECM nie jest tylko statycznym rusztowaniem, jest to dynamiczne, bogate w informacje źródło wejścia do komórek. Pomysł na odbudowę blaszki podstawnej opiera się na trzech założeniach: (i) porowatym rusztowaniu, (ii) zaadsorbowanej fibronektynie (FN) jako wyściółce śródbłonka, oraz (iii) zaadsorbowanym kolagenie na drugiej stronie materiału porowatego w komórkach mięśniowych. FN jest istotnym składnikiem 14

TECHNIKI ŚRODOWISKO I METODY ECM wokół i pod wielu komórkami, a bogata macierz w FN dostarcza substraty do adhezji i migracji w fazie rozwoju, gojenia się ran, oraz zaopatruje w inne ważne substancje. Posiada również wpływ na wiele funkcji komórkowych; w tym proliferację, przeżycie i zróżnicowania. Kolagen to grupa białek występujących w naturze i stanowi 1 do 2 % tkanki mięśniowej dlatego został wybrany do eksperymentów. Badania, które są w realizacji obejmują materiały porowate i półporowate, z funkcyjnymi powierzchniami wytwarzanym na drodze metod inżynierii materiałowej takich jak: osadzanie laserem impulsowym, osadzanie magnetronowe, elektroprzędzenie oraz bezprądowe osadzenie z polielektrolitów [3]. Koncentrują się one głównie na wpływie morfologii powierzchni i wielkości porów na adsorpcję białka. Część prac badawczych dotyczy nie tylko materiałów naczyniowych, ale nowej generacji zastawek serca. Uważamy, iż funkcjonalizacja powierzchni powinna doprowadzić do odpowiedniego zachowania się komórek, dając bioinżynierowi okazję do łatwego sterowania aktywacją lub dezaktywacją komórek. Naszym celem jest uzyskanie śródbłonka na powierzchni dedykowanej do interakcji krew-materiał. Wykorzystanie macierzy pozakomórkowej (ECM), jak i biomimetyczna modyfikacja powierzchni implantów układu sercowo-naczyniowego, jest obiecującą metodą poprawy hemozgodności. Ideą działania jest wpływ na adhezję i proliferację komórek [1-3]. Cienkie powłoki na podłożu polimerowym są wytwarzane z zastosowaniem techniki hybrydowej, w oparciu o procesy fizyczne [3-6]. Celem jest odtworzenie struktury naturalnego naczynia, gdzie śródbłonek powstaje jako cienka warstwa komórek, które w wewnętrznej powierzchni naczyń krwionośnych tworzą warstwę buforową pomiędzy krążącą krwią w świetle naczynia, a jego ścianką (Rys. 1) [1]. Podłoże jest przygotowane do stabilizacji polimeru, z którego biomateriał jest wykonywany i stworzenie warunków na powierzchni do adsorpcji białka. Dlatego też początkowo zastosowano metody fizyczne, takie jak trawienie plazmą, plazmowe osadzania nieorganicznych filmów i plazmowe wszczepienia funkcjonalnych cząsteczek (np. aminy, grupy karboksylowe) w powłoki [3]. Diagnostyka strukturalna realizowana metodami rentgenografii strukturalnej (XRD) oraz skaningowej (SEM) i transmisyjnej (TEM) mikroskopii elektronowej na cienkich foliach przygotowanych skoncentrowaną wiązką jonów galu (metoda FIB focused ion beam), oraz laserowej mikroskopii konfokalnej (CLSM) i akustycznej mikroskopii skaningowej (SAM) ma na celu kompleksowy, wieloskalowy opis morfologii powierzchni, analizę właściwości fizycznych oraz mechanicznych. Cienkie filmy stanowiące warstwę buforową na podłożu PU wytwarzane są przy użyciu metody hybrydowej, opartej o rozpylanie magnetronowe i osadzanie laserem impulsowym (metoda PLD pulsed laser deposition) [4-6], a kanały migracyjne z wykorzystaniem odparowania metodą ablacji laserowej [7]. Odpowiedź komórek na obciążenia mechaniczne w warunkach ich oddziaływania z implantowanym materiałem jest ważnym elementem determinującym powodzenie implantu [8-11]. Zjawiska te występują szczególnie w systemach naczyniowych oraz mięśniowych. Komórki budujące naczynia krwionośne 15

poddawane są ciśnieniu pulsacyjnemu przepływającej krwi. W celu określenia sił mechanicznych oddziaływujących na komórki naczyniowe wprowadzonych zostało kilka dynamicznych testów in vitro. Większość z nich oparta jest o relację pomiędzy adhezją komórek a naprężeniem ścinającym występującym pomiędzy komórką a powierzchnią biomateriału [11]. Z fizyko-chemicznego punktu widzenia, bio-adhezja dotyczy trzech składowych: komórek, stałego podłoża i ciekłego medium. W ostatnim dwudziestoleciu, liczne eksperymentalne i teoretyczne prace dotyczyły adhezji komórek [8-12]. Z biologicznego punktu widzenia zrozumienie mechanizmów molekularnych podczas adhezji komórek oraz ich przemieszczania na drodze rolowania i poślizgu na pasywnych i reaktywnych podłożach należy do wiodących zagadnień. Wynika to z wielu funkcji organizmów żywych zależnych od tych właściwości. Z fizycznego punktu widzenia, nawet pasywna odpowiedź komórek na zewnętrze obciążenie wprowadza nowe zjawiska do podstawowej wiedzy w zakresie tradycyjnych materiałów. Istotną i podstawową rolę odgrywają zjawiska bio-adhezji zachodzące na kontakcie; słabe i niekowalentne wiązania pomiędzy komórkami a podłożem oraz zróżnicowane oddziaływania błony cytoplazmy lub ich osnowy międzykomórkowej. Pomiary siły tych wiązań stanowią główne zadanie w bio- logii komórkowej, ze względu na możliwość identyfikacji czynników determinujących zjawiska adhezyjne [8-11]. Uzyskane wyniki z przeprowadzonych badań mikrostrukturalnych stanowią podstawę do testów hydrodynamicznych przy użyciu komórek modelowych oraz krwi i określenia ich interakcji ze sztuczną powierzchnią. Problem agregacji płytek krwi do sztucznych powierzchni wprowadzanych do organizmu pacjenta jest bardzo istotny w realizowanej we współpracy z Fundacją Rozwoju Kardiochirurgii w Zabrzu oraz Collegium Medium Uniwersytetu Jagiellońskiego problematyce związanej z wieloletnim projektem strategicznym Polskie Sztuczne Serce oraz projektem CardioBioMat MNT Era-Net-MNT/15/2009 dotyczącym implantów naczyniowych [13, 14]. Materiały i ich diagnostyka strukturalna Cienkie nieorganiczne powłoki Przedmiotem badań były takie materiały jak: Ti, Ti+DLC, TiN; Ti(C,N) o małej oraz zwiększonej zawartości węgla; DLC lub PLC porowaty; oraz próby modyfikacji powierzchniowej podłoża (PU) przed nanoszeniem działem jonowym. Cienkie filmy wytworzone zostały z zastosowaniem metody hybrydowej. Główne parametry procesu przedstawia tabela 1. Rozpylaną tarczę dla powłok na bazie tytanu stanowił tytan metaliczny, a dla powłok na bazie węgla (DLC) tarcza grafitowa. Skład fazowy powłoki kontrolowany był przepływającą mieszanką gazową typu Ar+N 2 oraz Ar+N 2 +C 2 H 2, odpowiednio zastosowaną dla typu powłoki. Rozpylanie grafitu zachodziło w atmosferze Ar. Do wytworzenia cienkich powłok wykorzystano metodę hybrydową z rozpylaniem magnetronowym z prądem stałym (DC), tryb niesymetryczny. Tytan (o jakości medycznej) był wykorzystywany do powłok tytanowych (w atmosferze obojętnej), azotku tytanu (w atmosferze azotu) i powłok tlenku tytanu (atmosfera argon/tlen). Aby zapewnić jednolitą grubość na całej powierzchni pokrycia, podłoża obracone były podczas osadzania. Szczegółowy opis osadzania jest podany w [5, 6]. Powłoki uzyskiwano w Joanneum Research Forschungs-GmbH, Leoben, Austria, na aparaturze, która pozwalała na pokrycie polimerów w temperaturze pokojowej /3-osiowe podłoże/ podczas planetarnego obrotu. Jednym z głównych sukcesów było opracowanie warstw ceramicznych wykazujących elastyczne zachowanie. Niezwykłe i wyjątkowe właściwości materiału wynikały z otrzymania odpowiedniej struktury i właściwego mechanizmu zarodkowania cienkich filmów z fazy gazowej [4-6]. Mikrostruktura przekroju powłoki azotku tytanu jest przedstawiona na rys. 2. Proces osadzania powłoki prowadzony był w sposób zapewniający jej wytworzenie przy pierwotnym mechanizmie [4-6]. Pozwalało to na dobrą adhezję przy budowie nanokrystalicznej, dając przy Tabela 1. Parametry osadzania badanych materiałów Materiał DLC Ti TiN Ti+DLC top Ti(C,N) high C Przepływ gazu 30 sccm Ar 30 sccm Ar 25 sccm N2, 5 sccm Ar 30 sccm Ar 27.5 sccm Ar, 2.5 sccm C2H2 50 nm Powłoka Podłoże - poliuretan Rys. 2. Obraz TEM cienka powłoka TiN o właściwościach elastycznych, cienka folia uzyskana z wykorzystaniem wycinania wiązką jonów galu (metoda FIB) 16

TECHNIKI ŚRODOWISKO I METODY cienkiej powłoce właściwości elastyczne dla systemu: podłoże (PU)/powłoka ceramiczna [8, 9]. Badania defektów mikrostruktury z wykorzystaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz mikroskopii wysokorozdzielczej (HREM) pozwoliły na analizę obszaru powłoka/ podłoże (rys. 3 i 4 - góra). Liniowa analiza spektralna przeprowadzona została w celu badań rozkładu poszczególnych pierwiastków na grubości (rys. 4 - dół). Preparaty do badań TEM wytworzone zostały metodą FIB. Powłoki typu Ti(C,N) o dużej i małej zawartości węgla posiadały budowę nanokrystaliczną ujawniając formę mikrokolumnową narastającą wraz ze wzrostem grubości. Obszar kontaktu powłoka/ podłoże oparty był o kotwiczenie atomów i posiadał formę pseudo-dyfuzyjną, dając tym samym informację o dobrej adhezji (rys. 4). IMIM PAN dysponuje techniką skaningowej mikroskopii akustycznej (SAM- Scanning Acustic Microscopy). Generator fal o częstotliwości 120 MHz pozwala na tomograficzną analizę budowy powłoki na grubości jej narastania. Jest to bardzo ważna informacja odnośnie adhezji i defektów, zlokalizowanych na granicy powłoka/podłoże. Często ujawniający się poprawny charakter powłoki na powierzchni, nie daje informacji o adhezji i defektach w warstwach głębszych. Rysunek 5 i 6 prezentuje obrazy 3D badanych materiałów: Ti, TiN, TiO, Ti(C,N), DLC, DLC+Si (DLC dotowane Si), DLC+Ti (DLC dotowane Ti). Rys. 3. Obraz wysokorozdzielczy (HREM) mikrostruktury powłoki TiN na poliuretanie, przekrój poprzeczny Counts a) a) b) b) Ti-K 300 Si-K 150 O-K N-K 200 C-K 100 50 0.239 nm 0.05 0.10 0.15 0.0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Position (um) Position (um) Rys. 4. Mikrostruktura TEM oraz HREM przekroju poprzecznego powłoki Ti(C,N)/PU uzyskana z cienkiej folii wytworzonej metodą FIB; analizę prowadzono dla powłok zawierających małą oraz dużą ilość atomów węgla; mikrokolumnowa mikrostruktura HREM wytworzonych powłok ujawnia defekty w postaci dyslokacji Counts 100 Ti-K Si-K O-K N-K C-K 17

Rys. 5. Tomograficzna analiza badanych powłok Ti, TiN i TiO z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii akustycznej SAM (Scanning Acustic Microscopy); uwidocznione są obszary przylegania powłoki do podłoża (jasny kontrast); obrazy warstw: 0, 1/3, 2/3 i 1 grubości powłoki 100 nm Rys. 6. Tomograficzna analiza badanych powłok Ti(C,N). DLC, DLC+Si, DLC+Ti z wykorzystaniem skaningowejmikroskopii akustycznej SAM (Scanning Acustic Microscopy); uwidocznione są obszary przylegania powłoki do podłoża (jasny kontrast); obrazy warstw: 0, 1/3, 2/3 i 1 grubości powłoki 100 nm Migracja komórkowa Kanały migracyjne Przemieszczanie się komórek na podłożu analizowane jest w biologii z wykorzystaniem kanałów migracyjnych. Przy zastosowaniu odparowania z wykorzystaniem techniki ablacji laserowej wykonano kanały migracyjne szerokości ok. 20-30 µm i głębokości równej połowie grubości powłok (około 50 nm). Oddziaływanie impulsowe promieniowania laserowego jest źródłem wielu zjawisk fizycznych [7]. Jednym z nich jest fala akustyczna, generowana w trakcie oddziaływania impulsowego promieniowania laserowego z materią. Istnieje kilka ważnych mechanizmów odpowiedzialnych za generację fali akustycznej indukowanej impulsem laserowym do których należy: przebicie dielektryczne, ablacja materiału gwałtowne odparowanie, efekt termosprężysty, elektrostrykcja i ciśnienie radiacyjne. Te wszystkie zjawiska musiały być wzięte pod uwagę w celu przygotowania charakterystycznych kanałów migracyjnych. W zrealizowanych badaniach, do analizy wstępnej zastosowano komórki Dictyostelium discoideum jako organizm modelowy Są to organizmy jednokomórkowe, wolno-żyjące, łatwe w analizie, unieśmiertelnione [1]. Badano szereg procesów takich jak przykładowo: adhezja komórek w warunkach hydrodynamicznych [8], różnicowanie się komórek oraz migracja na podłożu. Badania prowadzono w aspekcie statycznym, czyli bez zadania zewnętrznych sił ścinających i w układzie dynamicznym, gdzie zewnętrzna siła wprowadzana była przy zastosowaniu próżniowej komory przepływu. Na etapie aktualnej realizacji badań podjęto wieloskalową analizę mikrostruktury kanałów migracyjnych z wykorzystaniem metod TEM, a mikroskopię konfokalną zastosowano do testowania migracji komórkowej kultury komórek śródbłonka HUVEC otrzymane z żyły pępowinowej (HUVEC human umbilical vein endothelial cells). Komórki te są powszechnie używane do badań fizjologicznych i farmakologicznych [10-14]. Komórki osadzono na powierzchni wybranych materiałów (azotku tytanu, węgloazotku tytanu) z wytworzonymi kanałami migracyjnymi. 18

TECHNIKI ŚRODOWISKO I METODY Rys. 7. Siatka kanałów migracyjnych wytworzona na drodze ablacji i skanowania wiązką laserową na powłokach węglowych (DLC) oraz węglowych dotowanych atomami Ti lub Si. a) DLC 0 stopni obrotu w stosunku do kierunku przepływu komórek. Czas trwania eksperymentu 25 sek. b) DLC 45 stopni obrotu w stosunku do kierunku przepływu komórek. Czas trwania eksperymentu 25 sek. c) Ti DLC 0 stopni obrotu w stosunku do kierunku przepływu komórek. Czas trwania eksperymentu 25 sek. d) Si DLC 45 stopni obrotu w stosunku do kierunku przepływu komórek. Czas trwania eksperymentu 25 sek. Powierzchnia modyfikowana - kanalik migracyjny Powierzchnia niemodyfikowana a) b) c) d) Rys.8. Element pojedynczy siatki kanałów migracyjnych Rys.9. Obraz SEM z wytworzonymi kanałami migracyjnymi oraz wymiary siatki Migracja komórek HUVEC Uwidacznia się ułożenie włókien aktynowych w kierunku kanału migracyjnego. Koniec włókien aktynowych jest w miejscu wysuniętych lamelipodiów, przemieszczających komórkę do kanału. Powierzchnia kanałów migracyjnych sprzyja adhezji komórkowej. Zostało to udokumentowane we wcześniejszych badaniach na przykładzie prostych organizmów dictyostelium, a obecnie na liniach komórek wyżej wykształconych śródbłonka (HUVEC). Powłoki porowate; polielektrolity Kwas hialuronowy (HA) jest biopolimerem, który w przeciwieństwie do innych glikozaminoglikanów nie tworzy kowalencyjnego wiązania z białkami, a więc nie może być częścią typowych proteoglikanów. Może to jednak być centrum, które wiąże inne proteoglikany do postaci agregatu proteoglikanów. Prace na temat powłok; warstwa na warstwie ( layer- -by-layer ) osadzania kwasu hialuronowego i poli-l-lizyny (PLL) do komórek realizowane są aktualnie w IMIM PAN. Ali Khademhosseini et al. [15] 10 8 6 Efekt osadzania powtórnego h = 2 μm 4 2 Głębokość kanału migracyjnego h = 2 μm 30 μm 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Rys.10. Przekrój poprzeczny studzienki wytworzonej pojedynczym strzałem laserowym; uwidacznia się obszar nierówności brzegu kanału migracyjnego 19

100 nm Rys. 11. Wybór miejsca wycięcia cienkiej folii metodą FIB z kanału migracyjnego Rys.12. Mikrostruktura TEM przekroju kanału migracyjnego oraz dyfrakcje elektronowe z obszaru niemodyfikowanego (lewa strona) i modyfikowanego (prawa strona); nano-ziarna występują w warstwie niemodyfikowanej jako efekt procesu osadzania metodą fizyczną (PVD) dając dyfrakcję o charakterze pierścieniowym; większe ziarna tworzą się w obszarze po oddziaływaniu ablacyjnym wiązką laserową i częściowym nadtopieniem i krystalizacją (dyfrakcja punktowa) 50 μm 20 μm 20 μm Rys. 13. Migracja komórek HUVEC w kanałach Rys. 14. Adsorpcja białek na porowatych powłokach wytworzonych z polielektrolitu i Zhiyong Tang et. al. [16] podają metodę obrazowania dwóch typów komórek na powierzchni za pomocą właściwości komórek kwasu Fibronectin 50 μg/ml 19,5 19 18,5 18 17,5 17 16,5 16 15,5 Cross PEG1 PEG1 cross PLL cross Cross PEG2 PEG2 cross hialuronowego (HA). Autorzy wykazali wykonalność podejścia do unieruchomienia PLL i fibronektyny (FN) na podłożach szklanych. Eksperymen- PLL poli-l-lysina Cross siecowanie PGE poli(tlenek etylenu) ty wykazały, że przyczepność albuminy surowicy wołowej (BSA), immuneglobuliny (IgG) i fibronektyny (FN) była istotnie zmniejszona na kwasie hialuronowym (HA) w porównaniu do kontroli na szkle. Fizycznie i chemicznie połączone adsorbowane FN okazały się być rozprowadzany tylko na górze (PLL/HA) + PLL powłok [17, 18]. Wskazywano, iż FN szybko kompleksuje z PLL, z małą lub bez penetracji FN do masowego podłoża. Kowalencyjne wiązanie FN do PLL/HA powłok okazały się niezbędne do gęstego wzrostu. Adsorpcja białko na powierzchni ciał stałych jest szeroko rozpowszechnionym zjawiskiem o dużym biologicznych i biotechnologicznym znaczeniu [19-22]. Ideą funkcjonalizacji powierzchni powinna być możliwość do wiązania specyficznych białek i przygotowanie powierzchni do komórkowej kolonizacji. Głównym białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej jest fibronektyna, dlatego powierzchnia była funkcjonalizowana przez fibronektyny. Normalne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej 20

TECHNIKI ŚRODOWISKO I METODY Rys. 15. Fluorescencyjna analiza komórek śródbłonka HUVEC osadzonych na porowatych powłokach (HUVEC) hodowano w optymalizowanych ośrodkach. Aby zaznaczyć mitochondria, komórki inkubowano z sondy MitoTracker. Komórki biernie dyfundują poprzez błony komórkowe i gromadzą się w aktywnych mitochondriach. Sondy MitoTracker eliminują niektóre z trudności w pracy z komórkami chorobotwórczymi, ponieważ mitochondria są barwione, komórki mogą być utrwalane przed badaniem próbki. Wyniki wybarwionych komórek przedstawiono na rys. 15. Oddziaływanie krew materiał Testy hemozgodności (hemocompatibility) przeprowadzono dla wielowarstwowych porowatych powłok typu PLL/HA usieciowanych i modyfikowanych PLL z komórek HUVEC wspomaganych fibronektyną. Analizy te, koncentrują się na materiale medycznym, mają więc na celu wykrycie niekorzystnych interakcji pomiędzy sztuczną powierzchnią i krwią, które mogą aktywować lub nisz- czyć elementy morfotyczne (składniki) krwi [23]. W warunkach przepływu aortalnego (tętniczego), ze względu na wysokie naprężenia generowane przepływem, płytka krwi jest podstawą dla badania hemozgodności. Klasyczne instrumentarium do badania dynamicznego he- 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 100 μm mozgodności obejmuje komorę przepływu z powierzchnią kontaktu między krwią i płytką testowaną. W obecnym badaniu analizowano uproszczony model naprężenie ścinającego krew, na podstawie stożka i płyty wiskozymetru rotacyjnego. Kilka wskaźników aktywacji płytek krwi poddano analizie; w tym płytki krwi i granulocyty płytek, markery aktywacji płytek krwi; integryny receptora IIb / IIIa) i selektyny P. Istnieją receptory na powierzchni płytek krwi, które biorą udział w adhezji i agregacji. Są to głównie selektyny, odpowiedzialne za początkowe etapy procesu przyczepności. Selektyna P, która jest typowa dla płytek krwi jest glikoproteiną, jest zgromadzona w formie płytek granulek i transportowana do błony komórkowej po aktywacji płytek krwi. Test bas PS PU HU HU Ti Ti ADP Impakt-R jest nowym urządzeniem do badania funkcji płytek krwi w warunkach przepływu aortalnego w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Urządzenie do badania adhezji płytek i agregacji anty-koagulantów pełnej krwi w elementach naczyniowych (rurki) w warunkach przepływu tętniczego zostało zaprojektowane i wykonane w IMIM PAN. Dodatkowo zapewnia ono szybkie monitorowanie odpowiedzi na różne leki przeciwzakrzepowe. Zaskakujące było zróżnicowanie obserwowane dla podobnych powłok zawierających komórki HUVEC (rys.17). Odpowiedź uwidoczniła się w obserwacjach obrazów fluorescencyjnych. Stwierdzono nieciągłości w powłoce, które prawdopodobnie wpływały na tworzenie się skrzeplin (rys.18). AGG platelet aggregates PAC1% activated platelets with IIb/IIIa receptor P selectin activated platelets with P selectin receptor AGR-PLT platelet aggregates; SMAL-AGG small aggregates = 2 platelets; BIG-AGG big aggregates > 2 platelets; PS reference substrate - polystyren; PU polyurethane; HU HUVEC deposited on the porous coatings; ADP control adenosyno - tri phosporane - platelet activation Rys.16. Oddziaływanie krew-materiał dla różnych materiałów; agregaty płytkowe, płytki aktywowane z receptorem IIb/IIIA; płytki aktywowane z receptorem P selektyny jako funkcja analizowanego rodzaju powłoki AGG PAC1% P selectin 21

30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 bas PS PU HU HU Ti Ti ADP AGR-PLT-UL SMAL-AGG-1uL BIG-AGG-1UL AGR-PLT platelet aggregates; SMAL-AGG small aggregates = 2 platelets; BIG-AGG big aggregates > 2 platelets; PS reference substrate - polystyren; PU polyurethane; HU HUVEC deposited on the porous coatings; ADP control adenosyno - tri phosporane - platelet activation Rys. 17. Oddziaływanie krew-materiał; agregaty płytkowe, małe agregaty, duże agregaty, jako funkcja analizowanego rodzaju powłoki Defekt Komórka podziałowa Rys. 18. Analiza fluorescencyjna komórek HUVEC osadzonych na porowatej powłoce; defekt w podłożu przełożył się na defekt formowania monolayeru Rys. 19. Obserwacje fluorescencyjne; Komórki HUVEC osadzone na strukturze porowatej. Barwienia: Cytoszkielet: Phalloidyna (zielone włókna), Jądra komórkowe: DAPI (niebieski), Receptory błonowe: Barwione przeciwciała Anti-non-muscle Myosin IIA antibody (pomarańczowy), Mitochondria komórkowe: Mitotrucker (zielone punkty) Podsumowanie i wnioski Realizowane badania w IMIM PAN w zakresie tematyki inżynierii biomedycznej stanowią element kompleksowego podejścia do zaprojektowania materiału do kontaktu z krwią z przeciwskrzeplinową powłoką funkcjonalną oparta o warstwę organiczną. (rys. 20). Za najbardziej obiecujące pod względem strukturalnym i oddziaływania z krwią wybrano TiN, Ti(C,N) i Si+DLC. Stwierdzono, że grubość powłoki odgrywa znaczącą rolę w zastosowaniach biomedycznych. Powłoki różnią się właściwością adhezji płytek; Ti, TiOx i DLC charakteryzuje w badanym modelu najwięk- Ti(C,N) i Si+DLC mają najkorzystniejsze (lepsze niż PU) wskaźniki biozgodności. Koncepcja kanałów migracyjnych pozwoliła na zaobserwowanie zjawisk i dokładną analizę oddziaływania komórka-materiał. Jest to jednak koncepcja tzw. analizy podstawowej. Doświadczenia uzyskane przy zastosowasze zużycie płytek. Na powłokach Ti i DLC osadzają się również agregaty płytkowe stąd ich zmniejszona liczba, a także małe wskaźniki aktywacji PAC1 i SelP [23]. Powłoki: TiN, Ti(C,N) i Si+DLC powodują najmniejsze uszkodzenia płytek, przy czym po uwzględnieniu liczby agregatów płytkowych i aktywacji płytek powłoki 22

TECHNIKI ŚRODOWISKO I METODY niu kanałów migracyjnych pozwoliły na wykonanie już odpowiedniej funkcjonalizacji powierzchniowej, stosując powłoki półporowate, umożliwiające łatwe dokowanie białek, dostarczenie mediów hodowlanych do komórek i odpowiednią stabilność całej struktury materiałowo- biologicznej. Analiza adsorpcji białek, bardzo istotna w zastosowaniach do implantów kontaktujących się z krwią, pozwoliła na Analizowano przeżywalność i proliferację śródbłonka na powłokach po modyfikacji, a uzyskane rezultaty obrazowano na zdjęciach uzyskiwanych z badań wybarwionych preparatów mikroskopem konfokalnym. Przeprowadzone badania pozwalają na wyciągnięcie ogólnych wniosków: modyfikacja powierzchni PU z zastosowaniem powłok na bazie tytanu i węgla umożliwia podwyższenie właściwookreślenie wpływu rodzaju powłoki na jego adsorpcję (badania adsorpcji albumin). Badania prowadzono konstruując prekursory analogu tkankowego poprzez uzyskanie materiałów porowatych na drodze wytwarzania wielowarstw polimerowych z polielektrolitów. Wykonane próby funkcjonalizacji i badania adsorpcji białka do powierzchni wykazały istotny wzrost adsorpcji do powierzchni po modyfikacji. Funkcja antytrombogenna Powłoka porowata Podłoże z powłoką ceramiczną Rys. 20. Model projektu powłoki przeciwskrzeplinowej oparty o biomimetyczną porowatą warstwę funkcjonalną ści biomedycznych w implantach do kontaktu z krwią, wykorzystanie metod diagnostyki biomedycznej pozwala na przedstawienie charakterystyki materiałów w aspekcie ich biomedycznego zastosowania, perspektywicznym jest zastosowanie zaawansowanych metod funkcjonalizacji powierzchni z wykorzystaniem metod symulujących naturalne procesy tworzenia naczyń (angiogenezy). Podziękowanie za współpracę Prof. Franz Bruckert Laboratoire des Matériaux et du Génie Physique, Grenoble Institute of Technology - Minatec, Grenoble, France, D.Dr. Juergen M.Lackner, Dr. Wolfgang Waldhauser JOANNEUM RESEARCH Forschungs-GmbH, MATERIALS Functional Surfaces, Leoben, Austria, Dr Piotr Wilczek Fundacja Rozwoju Kardiochirurgii w Zabrzu, Prof. Marek Sanak Uniwersytet Jagieloński Collegium Medicum, 23

Prof. Marek Kowalczuk Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych PAN w Zabrzu, Prof. Jan Marczak Wojskowa Akademia Techniczna, Instytut Optoelektroniki, Warszawa. Badania finansowane z działalności statutowej IMIM PAN oraz projektów: CardioBioMat Era-Net- -MNT/15/2009 Nanostructural materials for implants and cardiovascular biomedical devices oraz Polsko-Francuski projekt wymiany: Polonium2009-2011 New gradient materials fabricated by laser method for blood contact application Literatura [1] B.D. Ratner, A.S. Hoffman, F.J. Schoen, J.E. Lemons: Biomaterials Science; Copyright Elsevier Inc, 1 (2004) [2] Costerton B., Cook G., Shirliff M., Stoodley P., Pasmore M: Chapter 4.8: Biofilms, Biomaterials and Device-Related Infections, in Biomaterials Science; An Introduction to Materials in Medicine, Edited by: Buddy D.Rather, Allan S.Hoffman, Frederick J.Schoen, Jack E.Lemons,, Elsevier Inc., 2nd edition, 2004, 345 [3] S. Shih-Horng, S. Conroy, L. Tung-Liang, S. Min-Shyan, L. Ih-Houng: Chapter: Surface Coatings, and S.L. McArthur, K. McLean., Chapter: Surface Modification; in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, edited by: G.E. Wnek, G.L. Bowlin Eds., 2 (2004), 1412 [4] B. Major: Ablacja i osadzanie laserem impulsowym; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne AKAPIT, Kraków, 2002 [5] J.M. Lackner: Industriallyscaled hybrid Pulsed Laser Deposition at Room Temperature, Published by Orekop sc., Kraków, 2005 [6] J.M. Lackner, W. Waldhauser, A. Alamanou, Ch. Teichert, F. Schmied, Ł. Major, B. Major: Mechanisms for self-assembling topography formation in low-temperature vacuum deposition of inorganic coatings on polymer surfaces, Bull.Pol.Ac.:Tech., 58 (2010), 281 [7] J. Marczak: Laserowe oczyszczanie dzieł sztuki, Inżynieria Materiałowa 6 (2008) [8] R. Major, F. Bruckert, J.M. Lackner, W. Waldhauser, M. Pietrzyk, B. Major: Kinetics of eucariote cells adhesion under shear flow detachment on the PLD deposited surfaces, Bull.Pol.Ac.:Tech., 56 (2008), 223 [9] J. Sarna, R. Kustosz, R. Major, J.M. Lackner, B. Major: Polish Artificial Heart - new coatings, technology, diagnostics, Bull. Pol.Ac.:Tech., 58 (2010), 329 [10] O. Ayalon, H. Sabanai, M.G. Lampugnani, E. Dejana, and B. Geiger: Spatial and temporal relationships between cadherins and PECAM-1 in cell-cell junctions of human endothelial cells, J. Cell Biol., 126 (1994), 247 [11] T. Sakamoto, C. Spee, Z. Scuric, E.M. Gordon, D.R. Hinton, W.F. Anderson, S.J. Ryan: Ability of retroviral transduction to modify the angiogenic characteristics of RPE cells Graefe, Arch Clin Exp Ophthalmol., 236 (1998), 220 [12] C.H. Arts, J.D. Blankensteijn, G.J. Heijnen-Snyder, H.J. Verhagen, P.P. Hedeman, J.J. Sixma, B.C. Eikelboom and P.G. de Groot: Reduction of non-endothelial cell contamination of microvascular endothelial cell seeded grafts decreases thrombogenicity and intimal hyperplasia, Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg., 23 (2002), 404 [13] A. Armulik, A. Abramsson and C. Betsholtz: Endothelial/ pericyte interactions, Circ. Res., 97 (2005), 512 [14] B.M. Leung, M.V. Sefton: A Modular Tissue Engineering Construct Containing Smooth Muscle Cells and Endothelial Cells, Annals of Biomedical Engineering, 35 (2007), 2039 [15] A. Khademhosseini, Y. Suh Kahp, M. Yang Jen, G. Eng, J. Yeh, S. Levenberg, R. Langer: Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-l-lysine for patterned cell co-cultures; Biomaterials, 25 (2004), 3583 [16] Z. Tang, Y. Wang, P. Podsiadło and N.A. Kotov: Biomedical Applications of Layer-by-Layer Assembly: From Biomimetics to Tissue Engineering, Adv. Mater., 18 (2006), 3203 [17] O.V. Semenov, A. Malek, A.G. Bittermann, J. Voros and A.H. Zisch: Engineered Polyelectrolyte Multilayer Substrates for Adhesion, Proliferation, and Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Tissue Eng., 15 (2009) [18] I. Wong, H. Chih-Ming: Surface molecular property modifications for poly(dimethylsiloxane) (PDMS) based microfluidic devices, Microfluid Nanofluid Review DOI 10.1007/s10404-009-0443-4, March 2009 [19] T. Ballet, L. Boulange, Y. Brechet, F. Bruckert and M. Weidenhaupt: Protein conformational changes induced by adsorption onto material surfaces: an important issue for biomedical applications of material science; Bull.Pol.Ac.:Tech., 58 (2010), 303 [20] Fibronectin (pure) Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science 68298 Mannheim Germany. [21] C. Picart, J. Mutterer, L. Richert, Y. Luo, G.D. Prestwich, P. Schaaf, J.C. Voegel and P. Lavalle: Molecular basis for the explanation of the exponential growth of polyelectrolyte multilayers, PNAS, 99 (2002), 12531 [22] L. Richerc, F. Boulmedais, J. Mutterer, E. Ferreux, G. Decher, P. Schaaf, J.C Voegel and C. Picart: Improvement of Stability and Cell Adhesion Properties of Polyelectrolyte Multilayer Films by Chemical Cross-Linking; Biomacromolecules, 5 (2004), 284 [23] M. Sanak, B. Jakieła., W. Węgrzyn: Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests, Bull.Pol. Ac.:Tech., 58 (2010), 317 * Prof. dr hab. inż. Bogusław Major, członek korespondent PAN 24