S ł u p s k i e P r a c e B i o l o g i c z n e 6 2009 INTENSYWNOŚĆ LIPOPEROKSYDACJI I OKSYDACYJNEJ MODYFIKACJI BIAŁEK WE KRWI I W WĄTROBIE TROCI WĘDROWNEJ (SALMO TRUTTA TRUTTA) Z WRZODZIEJĄCĄ MARTWICĄ SKÓRY INTENSITY OF LIPID PEROXIDATION AND OXIDATIVE MODIFICATION OF PROTEINS IN THE BLOOD AND LIVER OF BROWN TROUT (SALMO TRUTTA TRUTTA) WITH ULCERATIVE DERMAL NECROSIS Natalia Kurhalyuk 1, Katarzyna Pałczyńska 1, Magdalena Szornak 1, Halyna Tkachenko 2 1 Akademia Pomorska Zakład Fizjologii Zwierząt Instytut Biologii i Ochrony Środowiska ul. Arciszewskiego 22b, 76-200 Słupsk e-mail: kurhalyuk @ apsl.edu.pl 2 Lwowski Uniwersytet Medyczny im. Danyla Halickiego Zakład Higieny i Toksykologii ul. Pekarska 69, Lwów, Ukraina ABSTRACT 80 individuals of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) from river Słupia (central Pomerania) were studied. Fish-catching took place in exact co-operation from Landscape Park The valley of Słupia as well as the Board of Polish Angling Relationship in Słupsk. The blood from 13 and 26 healthy males and females (control group) as well as 23 males and 18 females with ulcerative dermal necrosis (UDN; study group) was collected directly after catch of fish. Our investigations show that negative results of UDN coincide with functioning of antioxidative system. Decreases of catalase activity in blood and liver create the unfavorable conditions for elimination of free radicals especially in males. Pathophysiological mechanism of UDN impact is connected with increase of aldehydic derivatives of oxidative proteins from liver. The increases of oxidative proteins in blood has different 81
source than in the liver. Aldehydic derivatives from oxidative modification of proteins (OMP) estimated by modification of proteins in blood and related with intensification of oxidative stress processes were higher in females. Pro- and antioxidative imbalance in blood of brown trout from UDN was higher and significant for females. It is possible to conclude the importance of liver ketonic derivatives from OMP in males than in the females in pathogenesis of UDN. Słowa kluczowe: troć wędrowna, Salmo trutta trutta, wrzodziejąca martwica skóry, intensywność procesów lipoperoksydacji, oksydacyjna modyfikacja białek, środowisko Key words: brown trout, Salmo trutta trutta, ulcerative dermal necrosis, intensity of lipid peroxidation, oxidative modification of proteins, environment WPROWADZENIE Postępująca degradacja środowiska naturalnego zagraŝa istnieniu wielu populacji zwierząt oraz człowieka (Kamiński i in. 2009a, b, Kurhayluk i in. 2007). Większość organizmów jest przystosowana do przeŝycia w specyficznych środowiskach i wymiera, gdy zostanie przekroczona bariera zdolności adaptacyjnych do poziomu zanieczyszczeń środowiska. Termin zanieczyszczenie jest definiowany jako degradacja ekosystemu, gdy obce substancje chemiczne i fizyczne bądź biologiczne zmiany oddziałują na Ŝycie człowieka, zwierząt i roślin niekorzystnie, aŝ do wyraźnie szkodliwego wpływu (Siwicki 1999). Ryby to najliczniejsza i zróŝnicowana gatunkowo gromada kręgowców. Według Łukjanienko (1974) stanowią one najbardziej wraŝliwy obiekt testowy i mogą być wykorzystywane przy ocenie jakości wód. Dzięki swoim wyjątkowym zdolnościom adaptacyjnym są one dogodnym obiektem badań na poziomie organizmu, komórkowym i molekularnym (Pagenkopf 1983). W ostatnich latach w Polsce obserwuje się gwałtowny wzrost zanieczyszczeń wód oraz ich degradację w wyniku szeroko rozumianej, często nierozwaŝnej, działalności gospodarczej człowieka (Cydzik i in. 1992). Słupia jest jedną z głównych rzek Pomorza Środkowego, w których trocie wędrowne odbywają swoje tarło (Dębowski i in. 2000). Rzeka ta przyjmuje zanieczyszczenia pochodzące ze źródeł obszarowych, punktowych, liniowych i rozproszonych, których ilość oraz jakość ma istotny wpływ na stan czystości jej wód (Wołos i in. 2002). W ostatnich latach w Słupi pojawiły się osobniki troci wędrownej (ryc. 1, 2) z chorobą zwaną wrzodziejącą martwicą skóry (ulcerative dermal necrosis UDN), o czym świadczą liczne komunikaty w prasie i operatach rybackich (Pietrzak 2009, Bartel i in. 2009). Osłabiony organizm ryby ma słaby system odpornościowy, zmniejsza się ilość śluzu, powiększa się ilość bakterii i ryba szybko zostaje zaatakowana przez grzyby pleśniawkę, która w skrajnych przypadkach moŝe pokrywać całą powierzchnię jej ciała (Kozińska i Pękala 2007a, b). Czynnikami sprzyjającymi są takŝe zanieczyszczenia wody, niska temperatura (poniŝej 10 C) oraz osłabienie ryby w czasie wędrówek na tarło (Chodyniecki 1986). Czynnik chorobowy przenoszony jest z prądem wody, więc choroba rozprzestrzenia się bardzo szybko (Kozińska 2001, 2007a, b). 82
Ryc. 1. Troć wędrowna (Salmo trutta trutta), listopad 2008, Słupsk, płn. Polska Fig. 1. Migratory brown trout (Salmo trutta trutta), November 2008, Słupsk, N Poland Ryc. 2. Troć wędrowna (Salmo trutta trutta) z wrzodziejącą martwicą skóry Fig. 2. Migratory brown trout (Salmo trutta trutta) with ulcerative dermal necrosis (UDN) 83
Celem naszej pracy było porównanie bilansu pro- i antyoksydacyjnego ocenianego poprzez intensywność procesów lipoperoksydacji, aktywność enzymów antyoksydacyjnych (katalazy CAT i dysmutazy ponadtlenkowej SOD) oraz procesy oksydacyjnej modyfikacji białek (OMB) we krwi i homogenacie tkanki wątroby osobników troci wędrownej (Salmo trutta trutta) zdrowych i z chorobą wrzodziejącej martwicy skóry (UDN). TEREN, MATERIAŁ I METODY BADAŃ Materiał do badań pobrano w 2008 roku od 80 osobników troci wędrownej (Salmo trutta trutta) zasiedlających rzekę Słupię (Pomorze Środkowe). Połowy ryb odbyły się we ścisłej współpracy z dyrekcją Parku Krajobrazowego Dolina Słupi oraz Zarządem Okręgu Polskiego Związku Wędkarskiego w Słupsku. Krew do badań od 13 zdrowych samców i 26 samic (grupa kontrolna) oraz 23 chorych na UDN samców i 18 samic pobierano bezpośrednio po odłowieniu ryb (ryc. 1, 2). Krew była pobierana z ogonowych naczyń krwionośnych tradycyjnymi strzykawkami i igłami (firma Polfa Luer, N8). Materiał konserwowano w probówkach z EDTA i schłodzony transportowano do laboratorium Zakładu Fizjologii Zwierząt Instytutu Biologii i Ochrony Środowiska Akademii Pomorskiej w Słupsku. Tkankę wątroby (1:10) homogenizowano w schłodzonym buforze, zawierającym 0,1M Tric-HCl (ph 7,2), i przeliczano na 1 mg białka (Bradford 1976). Intensywność procesów stresu oksydacyjnego wyznaczono poprzez pomiar poziomu malonodialdehydu (MDA), który jest ostatecznym produktem zmian lipidowych wywołanych przez stres oksydacyjny według metody Kamyshnikova (2004). Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej wyznaczono, wykorzystując hemolizat erytrocytarny (1:1000). Aktywność tę określono poprzez pomiar stopnia inhibicji nadtlenku, co pozostaje w zaleŝności od transformacji kwercetyny (metoda Kostiuka i in. 1990). Aktywność katalazy oznaczono w plazmie krwi, mierząc ilość H 2 O 2, pobranego w jednostce czasu (min) i objętości (l) z zastosowaniem molibdenianu amonowego (Koroluk i in. 1988). Oksydacyjną modyfikację białek (OMB) oznaczono metodą Levine i in. (1990). Poziom OMB oznacza się poprzez tworzenie grup aldehydowych (OMB A) i ketonowych (OMB B) odpowiednio w związkach reszt aminokwasowych białek osocza krwi. Otrzymane wyniki badań poddano analizie statystycznej (Gondko i in. 2001) przy pomocy programu STATISTICA (firmy StatSoft Polska, v.8.0). Do określenia istotności róŝnic pomiędzy aktywnością enzymów i koncentracją produktów TBARS i OMB w róŝnych grupach ryb (zdrowe-chore oraz samce-samice) stosowano testy Levene a jednorodności wariancji i rozsądnie istotnej róŝnicy RIR Tukeya dla nierównych liczebności (test HSD). Korelacje pomiędzy stęŝeniem produktów lipoperoksydacji i aktywnością enzymów antyoksydacyjnych obliczono metodą regresji prostej (p < 0,05). Do oceny ich istotności wykorzystano test One-way ANOVA. 84
WYNIKI I DYSKUSJA W organizmach Ŝywych, wewnątrz i na zewnątrz komórek występuje kilka antyoksydacyjnych systemów obronnych, które usuwają toksyczne metabolity czy aktywne formy tlenu. Wszelkie zmiany w wymienionych systemach obronnych mogą prowadzić równieŝ do powaŝnych zaburzeń procesów metabolicznych i struktur komórkowych (Gabryela 1996). Analiza wyników aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) we krwi i homogenacie tkanki wątrobowej osobników troci wędrownej (Salmo trutta trutta) róŝnej płci z wrzodziejącą martwicą skóry (UDN) nie wykazała istotnych zmian tego parametru (ryc. 3A, B). Nasze badania, określające zmiany aktywności funkcjonowania następnego enzymu bilansu antyoksydacyjnego katalazy (CAT), przedstawione są na rycinie 4. Sugerują one istotność interakcji pomiędzy produkcją i eliminacją z udziałem radykała hydroksylowego we krwi i tkance wątroby. Stwierdzono wartość testu F = 10,22 we krwi na poziomie p < 0,00 (ryc. 4A); zanotowano zmniejszenie aktywności tego enzymu u samców troci wędrownej z UDN o 16,8% (p < 0,00) oraz samic z UDN o 11% (p < 0,01), czyli zmiany u samców zachodziły z większą intensywnością (p < 0,01). Badając aktywność CAT w homogenacie tkanki wątroby, zaobserwowano równieŝ istotne statystycznie obniŝenie aktywności tego enzymu (ryc. 4B): w grupie samców z UDN uzyskano zmniejszenie aktywności CAT o 74,5% (F = 33,88, p < 0,00), a samic z UDN o 36,6% (p < 0,00). Nasze badania pokazują, Ŝe negatywne skutki UDN dotyczą funkcjonowania bariery antyoksydacyjnej na poziomie katalazy zarówno we krwi, jak i w wątrobie, co stwarza niekorzystne warunki do eliminacji wolnych rodników (rodnika hydroksylowego i peroksydów tkankowych), oraz Ŝe niekorzystne tendencje do zmniejszania się wartości enzymu są silniejsze w grupie samców niŝ samic. Z danych zamieszczonych w literaturze wynika, Ŝe czynniki chemiczne, fizyczne, biologiczne i bakteriologiczne, np. wysoki poziom metali cięŝkich, niska zawartość tlenu czy wysoka temperatura, mogą wpływać bezpośrednio na zawartość składników komórkowych (poziom enzymów obrony antyoksydacyjnej; Barrett 1991). W dalszej kolejności zmiany te mogą mieć odbicie równieŝ w ultrastrukturze i funkcji tkanek i narządów (Dorval i in. 2005). Wiadomo, Ŝe metale cięŝkie oraz niektóre pestycydy znajdujące się w wodzie mogą, ze względu na moŝliwość generowania rodników, pośrednio naruszyć enzymatyczny system antyoksydacyjny ryb, co moŝe spowodować powaŝne zaburzenia szlaków metabolicznych oraz struktur komórkowych. Szkodliwe bądź toksyczne działanie metali przejawia się m.in. inhibicyjnym wpływem na szereg enzymów, prowadząc tym samym do zaburzeń wielu szlaków metabolicznych (Hylland i in. 1992). Z literatury wynika, Ŝe metale cięŝkie oraz niektóre pestycydy, przy intensywnej chemizacji, mogą generować rodniki tlenowe w organizmach mieszkańców akwenów wodnych. W tym przypadku metale pośrednio przyczyniają się do uszkodzeń składników komórkowych, takich jak lipidy, białka, węglowodany czy kwasy nukleinowe (Janssens i in. 2000). Dlatego następna seria badań była poświęcona analizie we krwi i wątrobie ryb poziomu procesów lipoperoksydacji (ryc. 5A, B), które uwaŝane są za podstawowe mechanizmy integralności błon komórkowych 85
86 Ryc. 3. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD, U/min ml) we krwi (A) i homogenacie wątroby (B) u troci wędrownej (Salmo trutta trutta) róŝnej płci z wrzodziejącą martwicą skóry (UDN) Fig. 3. Superoxide dysmutase activity (SOD, U/min ml) in blood (A) and liver (B) from individuals of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) with ulcerative dermal necrosis (UDN)
Ryc. 4. Aktywność katalazy (CAT, µm/min L) we krwi (A) i homogenacie wątroby (B) u troci wędrownej (Salmo trutta trutta) róŝnej płci z wrzodziejącą martwicą skóry (UDN) Fig. 4. Catalase activity (CAT, µm/min L) in blood (A) and liver (B) from individuals of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) with ulcerative dermal necrosis (UDN) 87
88 Ryc. 5. Intensywność procesów lipoperoksydacji, oceniana poprzez poziom produktów rozpadu kwasu tiobarbiturowego (TBARS) w osoczu krwi (A, µm/l) i homogenacie wątroby (B, µm/mg protein) troci wędrownej (Salmo trutta trutta) róŝnej płci z wrzodziejącą martwicą skóry (UDN) Fig. 5. Intensity of lipid peroxidation (TBARS-products) in plasma (A, µm/l) and liver (B, µm/mg protein) from individuals of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) with ulcerative dermal necrosis (UDN)
Ryc. 6. Poziom procesów oksydacyjnej modyfikacji białek (OMB, aldehydowe pochodne) w osoczu krwi (A, U/mL) i homogenacie wątroby (B, U/mg protein) u troci wędrownej (Salmo trutta trutta) róŝnej płci z wrzodziejącą martwicą skóry (UDN) Fig. 6. Aldehydic derivatives from oxidative modification of proteins (OMP) in blood (A, U/mL) and liver (B, U/mg protein) from individuals of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) with ulcerative dermal necrosis (UDN) 89
90 Ryc. 7. Poziom procesów oksydacyjnej modyfikacji białek (OMB, mkm/l, ketonowe pochodne) w osoczu krwi (A, U/mL) i homogenacie wątroby (B, U/mg protein) u troci wędrownej (Salmo trutta trutta) róŝnej płci z wrzodziejącą martwicą skóry (UDN) Fig. 7. Ketonic derivatives from oxidative modification of proteins (OMP) in blood (A, U/mL) and liver (B, U/mg protein) from individuals of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) with ulcerative dermal necrosis (UDN)
(Trenzado i in. 2006). Analiza wariancji (test F = 13,82, p < 0,00) wykazała istotność zmian w narządach tego gatunku ryb pod wpływem UDN. U samców z objawami choroby w porównaniu z osobnikami zdrowymi zanotowaliśmy wysoce istotny wzrost o 122,5% (p < 0,00) intensywności procesów lipoperoksydacji, oceniany przez poziom TBARS-produktów. U samic troci wędrownej zaobserwowano odwrotne zjawisko wysoce istotne zmiany dotyczyły obniŝenia o 26,2% (p < 0,01) zawartości produktów z kwasem 2-tiobarbiturowym, co moŝna wytłumaczyć ich wyŝszą odpornością w trakcie tarła (hormony płciowe). W homogenacie tkanki wątroby w grupie samców i samic równieŝ zanotowano podwyŝszenie intensywności lipoperoksydacji o 67,9%, jednak analiza wariancji (test F), testy Levene a jednorodności wariancji oraz HSD wykazały nieistotność zachodzących negatywnych zmian. Badania z ostatnich lat pokazują, Ŝe wywołany niekorzystnymi czynnikami środowiska stres oksydacyjny zwiększa podatność komórek na dezintegracyjny wpływ wolnych rodników i ułoŝenie kompozycji białkowo-lipidowej (Dorval i in. 2005, Scandalios 2005). Taki stan nieodwracalnie doprowadza do wzmoŝonej hemolizy białek. Intensywność tych zmian moŝna ocenić na podstawie analizy oksydacyjnej modyfikacji białek (Levine i in. 1990; nagromadzenie ketonowych i aldehydowych pochodnych), a przedstawiono je we krwi i homogenacie tkanki wątroby ryb na rycinach 6 i 7 (odpowiednio A i B). Wynika z nich, Ŝe w analizie wariancji (test F = 32,86447, p < 0,000) i teście HSD wysoce istotne zmiany dotyczące zawartości produktów oksydacyjnej modyfikacji białek występują w grupie samców i samic. We krwi chorych na UDN samców zanotowaliśmy wzrost zawartości białek ze zmienioną strukturą wskutek oksydacyjnych uszkodzeń o 129,78% (p < 0,000), a wartość tego parametru wśród samic z UDN wzrosła o 163,42% (p < 0,000). Test HSD dla nierównych liczb takŝe potwierdza wysoce istotne zmiany w grupie samic w porównaniu z grupą samców z UDN: intensyfikacja stresu oksydacyjnego wywołuje w strukturze białek krwi samic z UDN o 25,92% (p < 0,001) więcej negatywnych zmian. Wartość parametru OMB A (aldehydowe pochodne OMB) dla tkanki wątroby (ryc. 6) równieŝ wykazała wzrost, jednak zmiany nie były wysoce istotne. Stąd moŝna wnioskować, Ŝe patofizjologiczne mechanizmy wpływu UDN są w mniejszym stopniu związane z oksydacyjnymi aldehydowymi pochodnymi białek wątroby, a zwiększona ich zawartość we krwi ma inne źródło pochodzenia niŝ wątroba i wymaga dokładniejszych badań. Nie mniej interesująca wydaje się analiza róŝnorodnych mechanizmów interakcji pomiędzy parametrami bilansu antyoksydacyjnego na poziomie ketonowych pochodnych OMB we krwi i wątrobie osobników troci wędrownej róŝnej płci z UDN. Test jednorodności wariancji Levene a był nieistotny, co pozwala stwierdzić, Ŝe nie mamy podstaw do odrzucenia hipotezy zerowej o równości wariancji. Analiza wariancji dla OMB typu B równieŝ wykazała istotność efektów testu F = 5,93 (p < 0,001). We krwi samców i samic troci wędrownej z UDN, w porównaniu ze zdrowymi osobnikami, zanotowano wzrost ketonowych pochodnych OMB na róŝnym poziomie: odpowiednio o 42,33% (p < 0,05) oraz 64,41% (p < 0,001). Podobnie w serii badań pochodnych aldehydowych OMB (ryc. 6 i 7) zmiany dotyczące intensyfikacji procesów nasilenia stresu oksydacyjnego, oceniane przez modyfikacyjne 91
procesy w białkach krwi, były wyŝsze w grupie samic niŝ samców. NaleŜy zaznaczyć, Ŝe zmiany te, związane z zachwianiem równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej we krwi troci z UDN w relacji chore samce-chore samice, są istotne (p < 0,05). Dla homogenatu tkanki wątroby w grupie samców z UDN wzrost poziomu ketonowych pochodnych o 12,14% był istotny (analiza wariancji F = 735,09, test HSD, p < 0,001), czego nie stwierdziliśmy w grupie chorych samic. MoŜna zatem wnioskować o większym udziale wątrobowych ketonowych pochodnych OMB w grupie samców niŝ samic w patogenezie pleśniawki. Następnym etapem badań było przeanalizowanie róŝnorodnych interakcji zachodzących pomiędzy wskaźnikami bilansu antyoksydacyjnego z udziałem korelacyjnych zaleŝności, które przedstawione zostały w tabeli 1. Znaczenie antyoksydacyjnego systemu obrony w odpowiedzi na stres spowodowany UDN u ryb tego cennego na Pomorzu gatunku (Cydzik i in. 1992, Dębowski i Radtke 1998) odzwierciedla kształtowanie moŝliwości adaptacyjnych organizmów (Palace i in. 1998, Rokicki i in. 1998). Tak więc dokonana analiza korelacji świadczy o róŝnych procesach utrzymywania równowagi redox pod wpływem czynników środowiskowych, wywołujących pleśniawkę, w zaleŝności od płci: u chorych na UDN samców istotne znaczenie w obniŝeniu toksycznego działania ROS na białka osocza krwi ma dysmutaza ponadtlenkowa (r = -0,6040, p < 0,05), u samic te relacje (SOD-produkty TBARS) dotyczyły zawartości jednego z końcowych produktów peroksydacji lipidów, tj. dialdehydu malonowego (r = -0,6040, p < 0,001). Tabela 1 Korelacyjna analiza parametrów bilansu antyoksydacyjnego we krwi i homogenacie wątroby u troci wędrownej róŝnej płci z wrzodziejącą martwicą skóry (UDN) Table 1 Correlation analysis of antioxidative balance in blood and liver from individuals of migratory brown trout (Salmo trutta trutta) with ulcerative dermal necrosis (UDN) Relacje Współczynnik korelacji Poziom istotności Krew Samce UDN, SOD-OMB B Samice zdrowe, TBARS produkty-omb A Samice UDN, SOD-TBARS produkty Wątroba Samce zdrowe, SOD-OMB B Samce UDN, SOD-TBARS produkty Samce UDN, SOD-OMB A Samice zdrowe, SOD-CAT Samice zdrowe, SOD-OMB A -0,6040-0,8053 0,5799 0,6883 0,9537 0,4577 0,3982 0,8455 0,029 0,038 0,001 0,009 0,000 0,028 0,044 0,000 92
W przypadku wątroby wytwarzanie i eliminacja reaktywnych form tlenu u osobników zdrowych odzwierciedla formowanie nieco innych mechanizmów takiej równowagi (tab. 1), co w znacznym stopniu jest związane z bilansem hormonalnym podczas tarła. U zdrowych samców odnotowano korelacyjne zaleŝności na poziomie r = -0,6040 (p < 0,001) w relacji SOD-OMB B (pochodne ketonowe). U samic współczynnik korelacji według analizy statystycznej zanotowano na poziomie r = -0, 8455 (p < 0,000) w relacji SOD-OMB A (pochodne aldehydowe). U samców chorych na UDN zanotowano zmiany priorytetów odpowiedzi na natęŝenie stresu oksydacyjnego w patogenezie pleśniawki w następujących relacjach: SOD-produkty TBARS (r = 0,9537, p < 0,000) i SOD-OMB A (r = 0,4577, p < 0,05). Wiadomo, Ŝe woda, szczególnie bogata w substancje organiczne, jest korzystnym środowiskiem dla Ŝycia bakterii zasiedlających to środowisko. Dlatego flora bakteryjna ryb jest odbiciem populacji drobnoustrojów Ŝyjących w wodzie (Kozińska 2007a, b). Badania bakteriologiczne, dotyczące występowania UDN u ryb łososiowatych i innych gatunków, wykazują obecność następujących drobnoustrojów: Aeromonas hydrophila complex Aeromonas sorbia, Pseudomonas flurescens, Streptococus mutans, Streptococus sp. (Allen i in. 1983, Khoo 2000, West 2006). Jak wynika z literatury, bakterie Aeromonas są szeroko rozpowszechnione we wszystkich typach wód śródlądowych, osadach dennych (np. Allen i in. 1983) i u zwierząt wodnych. Choroba zakaźna ryb występuje zwykle wówczas, gdy wraŝliwa ryba i zjadliwy patogen spotkają się w odpowiednich warunkach środowiskowych, sprzyjających wystąpieniu choroby. Czynniki biotyczne (ryba, patogen) i abiotyczne (środowiskowe czynniki stresogenne) są bardzo ściśle powiązane z sobą (Chodyniecki 1986, Kozińska 2001). Niewykluczone, Ŝe czynnikami wpływającymi na powstanie UDN u tego cennego gatunku ryb mogą być zanieczyszczenia w Bałtyku i rzekach dioksyny, które występują w rybach bytujących w morzu. StęŜenia pollutantów w tkankach dorosłych ryb nie powodują w takiej mierze efektów toksycznych, jednak po wpłynięciu do wód minimalnie zasolonych lub słodkich ryby te chudną w trakcie tarła, co powoduje wzrost bioakumulacji ksenobiotyków. MoŜna zatem wnioskować, Ŝe takie podejście w badaniach toksykologicznych rozszerzyłoby określenie źródeł antropogenicznego zanieczyszczenia wód Słupi i Bałtyku, których skład ilościowy i jakościowy ma istotny wpływ na przeŝywalność populacji troci wędrownej. Wiadomo, Ŝe najwcześniejszym objawem UDN jest pojawienie się miejscowych zmian martwiczych skóry, które porasta grzybnia pleśni Saprolegnia parasitica, intensywnie rozwinięta w końcowej fazie schorzenia na znacznej powierzchni pozbawionej nabłonka skórze głowy (West 2006). Jak wynika z literatury, pleśń pokrywająca ryby jest efektem wtórnym choroby, a jej rozwój jest moŝliwy wtedy, gdy zostaje uszkodzona skóra (Kozińska, Pękala 2007a). Obserwuje się ogólne osłabienie chorych osobników i gromadzenie się ich w miejscach o wolniejszym przepływie wody (Jara i Chodynicki 1999). Na UDN bardziej podatne są samce, poniewaŝ skóra samców łososiowatych w trakcie tarła wskutek redukcji specjalnych komórek wydzielających śluz staje się bardziej podatna na infekcję (Pietrzak 2009). 93
PODSUMOWANIE Analiza parametrów bilansu antyoksydacyjnego systemu obrony w odpowiedzi na stres, spowodowany wrzodziejącą martwicą skóry u osobników troci wędrownej, pozostaje bardzo istotnym motywem dalszych poszukiwań moŝliwości adaptacyjnych organizmów wodnych. Nasze badania pokazują, Ŝe negatywne skutki UDN dotyczą funkcjonowania bariery antyoksydacyjnej na poziomie katalazy, zarówno we krwi, jak i w wątrobie, co stwarza niekorzystne warunki do eliminacji wolnych rodników. Badania te pokazują równieŝ bardziej niekorzystne tendencje przebiegu choroby u samców niŝ u samic. U samców z UDN w porównaniu z samicami zanotowaliśmy wysoce istotny wzrost intensywności procesów lipoperoksydacji, oceniany przez poziom produktów rozpadu TBARS oraz oksydacyjnej modyfikacji białek. Analiza korelacyjna wyników świadczy o inicjowaniu róŝnych mechanizmów utrzymywania równowagi redox pod wpływem czynników środowiskowych wywołujących pleśniawkę, które są zaleŝne od płci ryb. PODZIĘKOWANIA Dziękujemy za pomoc w przeprowadzeniu badań Wojewódzkiemu Funduszowi Ochrony Środowiska i Gospodarki Wodnej w Gdańsku, Zarządowi Okręgu Polskiego Związku Wędkarskiego w Słupsku, firmie Wodociągi Słupsk Sp. z o.o. i Urzędowi Miejskiemu w Słupsku. LITERATURA Allen D.A., Austin B., Colwell R.R. 1983. Aeromonas media, a new species isolated from river water. Int. J. Syst. Bacteriology, 33: 599-604. Barrett J., 1991. Toxicity of aldehyde products of lipid peroxidation to adult Schistoma intercalatum in vitro. J. Parasitol., 21: 975-977. Bartel R., Bernaś R., Grecki K. i in. 2009. Wrzodzienica u łososi (Salmo salar) i troci (Salmo trutta trutta) w Polsce w latach 2007 i 2008 (in press). Bradford M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72: 248-254. Chodyniecki A. 1986. Zarys patologii ogólnej ryb. PWN, Warszawa: 42-45. Cydzik D., Kudelska D., Soszka H. 1992. Atlas stanu czystości jezior Polski badanych w latach 1984-1988. IKŚ, Warszawa. Dębowski P., Radtke G. 1998. Density and growth of young brown trout (Salmo trutta L.) in streams of Northern Poland versus habitat attributes. Polskie Archiwum Hydrobiologii, 45: 77-89. Dębowski P., Grochowski A., Miller M., Radtke G. 2000. Ichtiofauna dorzecza Słupi. Roczniki Naukowe PZW, 13: 109-136. Dorval J., Leblond V., Deblois Ch., Hontela A. 2005. Oxidative stress and endocrine endpoints impacted by agricultural chemicals. Env. Toxicology and Chemistry, 24 (5): 1273- -1280. 94
Gabryela T. 1996. Wpływ metali cięŝkich i wybranych czynników środowiska na aktywność enzymów antyoksydacyjnych u ryb. Wyd. Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź: 7-12. Gondko R., Zgirski A., Adamska M. 2001. Biostatyka w zadaniach. Uniwersytet Łódzki, Łódź. Hylland K., Haux C., Hogstrand Ch. 1992. Hepatic metallothionein and heavy metals in dab Limanda limanda from the German Bight. Mar. Ecol. Prog. Ser., 91: 89-96. Janssens B., Childress J.J., Baguet F., Rees J.-F. 2000. Reduced enzymatic antioxidative defense in deep-sea fish. J. Exp. Biology, 203: 3717-3725. Jara Z., Chodynicki A. 1999. Ichtiopatologia. Wydaw. AR, Wrocław: 124-127. Kamiński P., Kurhalyuk N., Jerzak L., Kasprzak M., Tkachenko H., Klawe J.J., Szady-Grad M., Koim B. 2009a. Ecophysiological determinations of antioxidant enzymes and lipoperoxidation in the blood of White Stork Ciconia ciconia from Poland. Environ. Res., 109: 29-39. Kamiński P., Kurhalyuk N., Kasprzak M., Jerzak L., Tkachenko H., Szady-Grad M., Klawe J.J., Koim B. 2009b. The impact of element-element interactions on antioxidant enzymatic activity in the blood of White Stork (Ciconia ciconia) chicks. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 56: 325-337. Kamyshnikov V.S. 2004. Reference book on clinic and biochemical researches and laboratory diagnostics, MEDpress-uniform, Moscow. Khoo L. 2000. Fungal diseases in fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Midicine, 9 (2): 102-111. Korolyuk M.A., Ivanova L.I., Majorova I.T. 1988. Methods of definition of catalase activity. Lab. Manuals, 1: 16-19. Kostiuk M.A., Popovich A.I., Kovaleva J.I. 1990. Easy and sensitive method of superoxide dismutase determination based on quercetine oxidation. Vopr. Med. Chem., 36 (2): 88-91. Kozińska A. 2001. Nowe dane o klasyfikacji i róŝnicowaniu bakterii z rodzaju Aeromonas i ich praktyczne znaczenie w ichtiopatologii. Post. Mikrobiol., 40: 43. Kozińska A. 2007a. Dominant pathogenic species of mesophilic aeromonads isolated from diseased and healthy fish cultured in Poland. Journal of Fish Diseases, 30: 293-301. Kozińska A. 2007b. Wirusowe i bakteryjne choroby ryb. Aktualne zagadnienia. PIWet-PIB, Puławy: 1-75. Kozińska A., Pękala A. 2007a. Przegląd najwaŝniejszych metod badawczych w diagnostyce bakteryjnych chorób ryb. W: Wirusowe i bakteryjne choroby ryb. Aktualne zagadnienia. PIWet-PIB, Puławy: 35-46. Kozińska A., Pękala A. 2007b. Przypadki flawobakterioz u pstrągów i karpi hodowanych w Polsce. Medycyna Wet., 63: 858-863. Kurhalyuk N., Tkachenko H., Kamiński P., Pałczyńska K., Szornak M., Mach A. 2007. Parametry antyoksydacyjnego bilansu we krwi młodych osobników bociana białego (Ciconia ciconia) z róŝnych środowisk Polski. Słupskie Prace Biologiczne, 4: 53-62. Levine R.L., Garland D., Oliver C.N., Amici A., Climent J., Lenz A.G., Ahn B.W., Shaltiel S., Stadtman E.R. 1990. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Menth. Enzymol., 186: 464-478. Łukjanienko W.I. 1974. Toksykologia ryb. Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa: 5-8. Pagenkopf G.K. 1983. Gill surfach interaction model for trace-metal toxicity to fishes: role of complexation ph and water hardness. Environm. Sci. Technol., 17: 342-347. Palace V.P., Baron C.L., Klaverkamp J.F. 1998. An assessment of Ah-inducible phase I and phase II enzymatic activities and oxidative stress indices in adult lake trout (Salvelinus namaycush) from Lake Ontario and Lake Superior. Aquatic Toxicology, 42: 149-168. 95
Pietrzak R. 2009. Epidemia zabija trocie. Wędkarski Świat, 1: 40. Rokicki J., Rolbiecki L., Ligaszewski M. 1998. Parasitofauna and the health status of salmonid fish in Tatra mountains. Medycyna Weterynaryjna, 54 (5): 318-320. Scandalios J.G. 2005. Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Braz. J. Med. Biol. Res., 38 (7): 995-1014. Siwicki A.K.1996. Biologiczne monitorowanie skaŝenia środowiska. Wyd. IRŚ, Olsztyn. Trenzado C., Hidalgo C.M., Garcia-Gallego M., Morales A.E., Furne M., Domezain J., Sanz A. 2006. Antioxidant enzymes and lipid peroxidation in sturgeon Acipencer naccarii and trout Oncorhynchus mykiss. A comparative study. Aquaculture, 254: 758-767. West P. 2006. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challenges for an old problem. Mycologist. 20: 99-104. Wołos A., Mickiewicz M., Teodorowicz M., Chmielewski H., Grzegorczyk J. 2002. Operaty Rybackie Zlewnia rzeki Słupi (woj. pomorskie), Olsztyn: 21-39. 96