Wpływ palenia papierosów na poziom inhibitorów cysteinowych peptydaz w ślinie

Czas. Stomatol., 2010, 63, 2, 108-115 2010 Polish Dental Society http://www.czas.stomat.net Wpływ palenia papierosów na poziom inhibitorów cysteinowych peptydaz w ślinie Influence of cigarette smoking on the level of cysteine peptidase inhibitors in saliva Jan Wnukiewicz 1, Eugeniusz Nosow 2, Aleksander Nosow 1, Eliza Nazar 3, Maciej Siewiński 4 1 Z Katedry i Kliniki Chirurgii Szczękowo-Twarzowej AM we Wrocławiu, Kierownik: dr hab. J. Wnukiewicz prof. nadzw.; 2 Centrum Stomatologiczne Prestigedent we Wrocławiu, Kierownik: lek. stom. E. Nosow; 3 Zakład Materiałów Polimerowych i Węglowych Politechniki Wrocławskiej, Kierownik: dr hab. M. Bryjak; 4 Zakład Nauk Podstawowych AM we Wrocławiu, Kierownik: prof. dr hab. I. Choroszy-Król Summary Aim of the study: To evaluate the effect of cigarette smoking on cysteine peptidase inhibitors in inactive complexes of saliva. Material and methods: Saliva samples were collected from 63 donors who were categorized as follows: group 1 heavy smokers who have smoked more than 20 cigarettes per day for the last 10 years; group 2 weak smokers who have smoked a maximum of 5 cigarettes per day for the last 10 years, and group 3 of non-smokers who have not smoked for the last 10 years. Active ICP 37 inhibitors, total amount of ICP -80 inhibitors and inhibitors in inactive complexes ΔICP which may manifest themselves upon exposure to cigarette smoke were all assessed in saliva. Results: Statistically significant differences in levels of individual proteins were revealed. The highest level of complexes was found in the heavy smokers group, while the lowest level in non-smokers. It seems that these differences reflect the impact of cigarette smoke on inhibitors of cystatine peptydases. Conclusion: Inhibitors play an important role in protecting organisms against inflammation or development of neoplastic tissue. Cigarette smoke reduces their protective effect in saliva. Streszczenie Cel pracy: wpływ palenia papierosów na poziom w ślinie inhibitorów cysteinowych peptydaz związanych w nieaktywne kompleksy. Materiał i metody: próbki śliny pobrane od 63 osób podzielono na trzy grupy: palących 20 i więcej papierosów dziennie co najmniej 10 lat, palących do 5 papierosów dziennie co najmniej 10 lat oraz niepalących od co najmniej 10 lat. W ślinie oznaczano inhibitory aktywne ICP-37, całkowitą ilość inhibitorów ICP-80 oraz inhibitory związane w nieaktywne kompleksy ΔICP, które mogą powstać po kontakcie z dymem papierosowym. Wyniki: stwierdzono istotne statystycznie różnice pomiędzy poziomem badanych białek. Badając poziom tych inhibitorów w formie kompleksów stwierdzono najwyższy ich poziom u palących ponad 20 papierosów dziennie, zaś najmniejszy u niepalących. Wydaje się, że związane jest to z działaniem dymu papierosowego na inhibitory cysteinowych peptydaz. Podsumowanie: inhibitory pełnią kluczowe funkcje ochronne przed stanami zapalnymi i nowotworami, zaś palenie papierosów zmniejsza w ślinie ich efekt ochronny. KEYWORDS: saliva, cysteine peptidase inhibitors, cigarettes smoking HASŁA INDEKSOWE: ślina, inhibitory cysteinowych peptydaz, palenie papierosów 108

2010, 63, 2 Inhibitory cysteinowe peptydaz w ślinie Wstęp Ślina pełni wielofunkcyjną rolę w jamie ustnej, w tym ochronną przed powstaniem stanów zapalnych lub nowotworów. Zadanie to polega na działaniu specyficznych białek, które są wytwarzane głównie w gruczołach ślinowych. Jednymi z nich są białka zawierające duże ilości reszt prolinowych, których obecność może redukować poziom mikroorganizmów w jamie ustnej zmniejszając prawdopodobieństwo rozwoju stanu zapalnego tkanek przyzębia [1]. Podobną rolę przeciwbakteryjną oraz przeciwgrzybiczną wykazują białka zawierające duże ilości reszt histydynowych, które hamują aktywność glikolityczną mikroorganizmów. W ślinie występują ponadto stateryny, przeciwciała, mucyny enzymy pochodzenia gruczołowego biorące udział we wstępnym rozkładaniu pokarmów [18]. Dym tytoniowy składa się prawie z 4 tysięcy związków chemicznych, z których ponad 400 składników smolistych to substancje rakotwórcze, w tym aminy aromatyczne, nitrozoaminy, utleniacze (takie jak wolne rodniki tlenu), a także akroleina, α i β-nienasycone aldehydy oraz aldehyd octowy. Substancje te mogą indukować mutacje w genie p53, niekontrolowany rozwój komórek i powstawanie nowotworu [9]. Reznick i wsp. [13] wykazali, że ślina narażona na kontakt z dymem papierosowym traci swoje właściwości ochronne i staje się czynnikiem uszkadzającym komórki jamy ustnej. Autorzy badając wpływ dymu papierosowego na komórki stwierdzili, że ślina poddana działaniu dymu papierosowego wywoływała więcej uszkodzeń w białkach pełniących autogenne funkcje ochronne niż sam dym. Na podstawie uzyskanych wyników potwierdzono, że mieszanina śliny i dymu jest bardziej toksyczna dla komórek jamy ustnej niż sam dym papierosowy [13]. Dym papierosowy jest uznawany za istotną przyczynę powstawania przewlekłego zapalenia oskrzeli, rozedmy i raka płuc oraz chorób układu krążenia. Ślina jest pierwszym fizjologicznym płynem organizmu człowieka, który z dymem papierosowym ma bezpośredni kontakt i dlatego właśnie w niej obserwuje się najwyższe stężenia toksycznych substancji pochodzących z papierosów. Składniki dymu papierosowego mają pośredni wpływ na oskrzela, płuca czy przewód pokarmowy, w których mogą indukować stany zapalne lub powstawanie nowotworów. W ślinie narażonej na działanie toksycznych składników dymu papierosowego obserwuje się utratę jej zdolności obronnych [6]. Z kolei obecność w ślinie związków kancerogennych może okazać się pośrednią przyczyną nowotworów przewodu pokarmowego [5]. Cel pracy W pracy badano wpływ dymu papierosowego na poziom specyficznych inhibitorów cysteinowych w ślinie. Materiał i metody Badano ślinę pobraną od 63 osób bez klinicznych cech zapalenia przyzębia w wieku 18-60 lat, które podzielono na trzy grupy: 1 grupa palący 20 papierosów dziennie i więcej od co najmniej 10 lat (21 osób), 2 grupa palący do 5 papierosów dziennie co najmniej 10 lat (21 osób), 3 grupa niepalący od co najmniej 10 lat (21 osób). Próbki śliny w 2 i 3 grupie zostały zebrane w Centrum Stomatologicznym Prestigedent we Wrocławiu. Próbki śliny 1 grupy zebrano od wolontariuszy. 109

J. Wnukiewicz i in. Czas. Stomatol., Pobieranie śliny Ślinę pobierano w ilości 4-6 ml do sterylnych probówek po posiłku i płukaniu jamy ustnej. Próbki zamrażano w temperaturze -20 o C. Po kilku dniach ślinę rozmrażano i wirowano (12000 obr./min). Klarowne supernatanty przenoszono do nowych probówek i ponownie zamrażano, aż do chwili rozpoczęcia dalszych badań. Badania biochemiczne Aktywność inhibitorów oznaczano względem papainy (Fluka), która rozkładała substrat BANA (Fluka), a ilość uwolnionego beta-naftylo-amidu, który tworzy barwny kompleks z DMBA (Sigma). W każdej próbie śliny oznaczano stężenie białka metodą Bratforda [3]. Aktywność inhibitorów cysteinowych peptydaz oznaczano zmodyfikowaną metodą kolorymetryczną względem substratu BANA [8]. Po oznaczeniu stężenia białka, w każdej próbie oznaczano aktywność inhibitorów względem papainy. Wolne inhibitory oznaczono jako CPI-37. Po ogrzaniu próbek do temperatury 80 o C odzyskiwano inhibitory związane w nieaktywne kompleksy i oznaczano jako ICP-80. Różnicę pomiędzy poziomami inhibitorów CPI-80 oraz CPI-37 określono mianem nieaktywnych biologicznie kompleksów inhibitorowych ΔCPI. Jako jednostkę aktywności enzymatycznej (papainy) przyjmowano taką jej ilość, która powoduje uwolnienie z substratu 1 nmol beta-naftylo-amidu, a za jednostkę inhibitorową taką ilość inhibitora, która hamuje 1 jednostkę. Wyniki podawano w przeliczeniu aktywności inhibitorowej na 1,0 ml płynu (śliny) po odwirowaniu lub na 1,0 mg białka [15]. Analiza statystyczna Do oznaczeń statystycznych używano programu Microsoft Office Excel 2007. W pracy skoncentrowano się na przedstawieniu poziomu inhibitorów związanych w nieaktywne biologicznie kompleksy ΔICP, które okazały się najbardziej istotne statystycznie. Porównanie inhibitorów wolnych ICP-37 oraz całkowitej ich ilości ICP-80 nie wykazywały istotnych różnic. Wyniki Uzyskane w pracy wyniki zestawiono w tabelach 1, 2 i 3 oraz zilustrowano na ryc. 1. Znamienne statystycznie różnice stwierdzono porównując poziom inhibitorów związanych w kompleksy (ΔICP) w trzech grupach badanych próbek śliny. Najwyższe ich poziomy stwierdzono w grupie 1, niższe w 2, natomiast najniższe w 3. Ryc. 1. Średnie poziomy inhibitorów cysteinowych peptydaz związanych w nieaktywne kompleksy w przeliczeniu na 1 mg białka w ślinie osób z poszczególnych grup. Nie wykazano istotnych statystycznie różnic porównując poziomy ICP-37 i ICP-80 w badanych próbkach śliny. Istotne statystycznie różnice wykazano jedynie przy oznaczaniu kompleksów ΔICP. Inhibitory te uwalniały się po ogrzaniu śliny do 80 o C. 110

2010, 63, 2 Inhibitory cysteinowe peptydaz w ślinie T a b e l a 1. Poziom inhibitorów cysteinowych peptydaz (ICP) w ślinie osób palących, od co najmniej 10 lat po 20 i więcej papierosów dziennie (1 grupa) Nr Ilość białka mg/ml Poziom ICP-80 Poziom ICP-37 Kompleksy ICP j/ml j/mg białka j/ml j/mg białka j/ml j/mg białka 1 1,69 244,92 145,03 115,96 68,67 128,96 76,36 2 0,61 69,03 112,82 20,93 34,21 48,10 78,61 3 0,53 135,98 255,40 96,07 180,44 39,91 74,96 4 0,26 51,22 197,00 35,10 135,00 16,12 62,00 5 0,44 84,50 193,65 64,48 147,77 20,02 45,88 6 0,82 139,23 169,61 89,18 108,64 50,05 60,97 7 0,77 202,80 261,81 107,77 139,13 95,03 122,68 8 0,70 157,17 223,95 82,29 117,25 74,88 106,69 9 2,04 311,22 152,55 115,18 56,46 196,04 96,09 10 1,26 104,91 83,56 61,36 48,87 43,55 34,69 11 1,76 145,47 82,52 84,63 48,01 60,84 34,51 12 0,77 202,80 261, 81 107,77 139,13 95,03 122,68 13 0,62 118,69 191,93 77,61 125,50 41,08 66,43 14 0,43 54,47 127,36 41,47 96,96 13,0 30,40 15 0,80 119,86 149,93 93,08 116,44 26,78 33,50 16 3,33 329,94 99,03 120,38 36,13 209,56 62,90 17 0,84 54,21 64,90 21,45 25,58 32,76 39,22 18 0,77 185,64 240,75 109,07 141,45 76,56 99,30 19 0,41 117,00 285,00 84,24 205,20 32,76 79,80 20 0,78 107,97 164,63 71,92 109,58 36,04 55,05 21 1,26 111,80 89,05 71,89 57,26 39,91 31,79 Średnia 145,18 169,18 79,61 101,79 67,00 67,40 SD ± 75,99 ± 68,47 ± 29,478 ± 49,33 ± 52,78 ± 28,74 Najwyższy poziom ΔICP stwierdzono w 1 grupie, czyli palących najwięcej papierosów. W 2 grupie poziom uwalnianych inhibitorów był niższy, zaś w 3 grupie poziom tego wskaźnika był najniższy. Różnice były istotne statystycznie. Omówienie wyników i dyskusja Nagler i wsp. [9] stwierdził, że działanie dymu papierosowego jest odpowiedzialne za około 90% przypadków stanów zapalnych oraz zmian nowotworowych jamy ustnej osób 111

J. Wnukiewicz i in. Czas. Stomatol., T a b e l a 2. Poziom inhibitorów w ślinie osób palących od co najmniej 10 lat nie więcej jak 5 papierosów dziennie (2 grupa) Nr Ilość białka w próbie mg/ml Poziom ICP-80 Poziom ICP-37 Kompleksy ΔICP j/ml j/mg białka j/ml j/mg białka j/ml j/mg białka 1 1,76 145,47 82,52 84,63 48,01 60,84 34,51 2 0,77 202,80 261,81 107,77 139,13 95,03 122,68 3 3,33 329,94 99,03 120,38 36,13 209,56 62,90 4 0,41 117,00 285,00 84,24 205,20 32,76 79,80 5 1,92 154,44 80,48 93,73 48,85 60,71 31,64 6 0,93 111,54 119,31 85,15 91,08 26,39 28,23 7 0,69 150,02 217,98 96,98 140,91 53,04 77,07 8 0,62 118,69 191,93 77,61 125,50 41,08 66,43 9 1,26 119,21 94,95 84,76 67,51 34,45 27,44 10 0,42 92,30 221,76 89,44 214,89 2,86 6,87 11 0,28 47,19 165,76 39,78 139,73 7,41 26,03 12 0,73 101,92 140,42 85,80 118,21 16,12 22,21 13 1,28 88,40 69,26 80,99 63,46 7,41 5,81 14 2,44 157,95 64,83 85,93 35,27 72,02 29,56 15 0,82 139,23 169,61 89,18 108,64 50,05 60,97 16 0,61 69,03 112,82 20,93 34,21 48,10 78,61 17 0,99 113,23 114,61 87,10 88,16 26,13 26,45 18 084 54,21 54,21 64,90 21,45 32,76 39,22 19 0,28 47,19 165,76 39,78 139,73 7,41 26,03 20 0,73 101,92 140,42 85,80 118,21 16,12 22,21 21 0,26 51,22 197,00 35,10 135,00 16,12 62,00 Średnia 119,66 145,21 78,09 100,91 43,63 44,60 SD ± 61,83 ± 64,21 ± 24,09 ± 53,41 ± 43,92 ± 28,42 palących tytoń. Wolne rodniki pochodzące z dymu papierosowego mogą inicjować transformację komórek prawidłowych do nowotworowych. Synergizm obserwowany podczas działania składników dymu papierosowego i śliny może być ściśle związany z procesami utlenienia/redukcji, które indukują powstanie wolnych rodników. Ślina traci wtedy swoje zdolności ochronne, a nawet staje się płynem wywołujących efekty toksyczne w jamie ustnej. Wyniki ww. obserwacji skłoniły nas do wykonania badań dotyczących poznania zmian 112

2010, 63, 2 Inhibitory cysteinowe peptydaz w ślinie T a b e l a 3. Poziom inhibitorów cysteinowych peptydaz w ślinie osób nie palących papierosów od co najmniej 10 lat (3 grupa) Nr Ilość białka w próbie mg/ml Poziom ICP-80 Poziom ICP-37 Kompleksy ICP j/ml j/mg białka j/ml j/mg białka j/ml j/mg białka 1 1,28 88,40 69,26 80,99 63,46 7,41 5,8 2 0,54 63,57 118,02 57,33 106,43 6,24 11,58 3 0,73 95,03 130,31 83,85 114,98 11,18 15,33 4 0,73 92,82 127,28 85,67 117,48 7,15 9,80 5 0,82 72,67 88,92 67,99 83,19 4,69 5,73 6 1,25 102,44 82,14 84,37 67,65 18,07 14,49 7 2,44 157,95 64,83 85,93 35,27 72,02 29,56 8 1,11 75,01 67,88 72,93 66,00 2,08 1,88 9 0,99 113,23 114,61 87,10 88,16 26,13 26,45 10 1,19 107,51 90,37 84,76 71,25 22,75 19,12 11 1,01 80,86 80,29 76,96 76,41 3,90 3,87 12 0,54 63,57 118,02 57,33 106,43 6,24 11,58 13 0,73 92,82 127,28 85,67 117,48 7,15 9,80 14 1,26 119,21 94,95 84,76 67,51 34,45 27,44 15 1.25 104,91 83,56 61,36 48,87 43,55 34,69 16 0,73 95,03 130,31 83,85 114,98 11,18 15,33 17 1,26 111,80 89,05 71,89 57,26 57,26 39,91 18 0,80 119,86 149,93 93,08 116,44 26,78 33,50 19 0,62 118,69 191,93 77,61 125,50 41,08 66,43 20 0,43 54,47 127,36 41,47 96,96 13,00 30,40 21 2,44 157,95 64,83 85,93 35,27 72,02 29,56 Średnia 99,42 105,29 76,71 84,62 23,54 21,06 SD ± 26,70 ± 31,68 ± 12,64 ± 27,88 ± 21,52 ± 15,01 poziomu inhibitorów cysteinowych peptydaz w ślinie osób palących papierosy. W innych badaniach Nagler i wsp. [10] przedstawili proces stresu oksydacyjnego stwierdzając nadmierne wytwarzanie reaktywnych form tlenu. Stanowi to istotny czynnik w patomechanizmie wielu chorób ogólnoustrojowych. Broniąc się przed toksycznym wpływem reaktywnych form tlenu, pojawiają się mechanizmy obronne. Zalicza się do nich powstawanie substancji nazwanych antyoksydantami, które pojawiają się w płynach biologicznych, w tym m.in. w ślinie. Stwierdzono, że w ślinie osób palących papierosy pojawiają się duże ilości związków mających w swojej budowie grupy tiolowe, które mogą wiązać się 113

J. Wnukiewicz i in. Czas. Stomatol., z inhibitorami cysteinowych peptydaz osłabiające ich działanie obronne [8]. Stwierdzono, że cysteinowe peptydazy odgrywają kluczową rolę w inicjacji procesów nowotworowych, takich jak transformacja nowotworowa, inwazja, przerzuty, zahamowanie apoptozy i inne [16]. Wyizolowano dotychczas trzy geny cysteinowych peptydaz odgrywających rolę w procesach towarzyszących stanom zapalnym przyzębia. Enzymy te zostały określone nazwą gingipainy (gingipaina R1, R2 i K), które katalizują degradację tkanek przyzębia [7]. Z pełnej śliny ludzkiej, wyizolowano ponadto trzy cystatyny wytwarzane w gruczołach ślinowych, które określone zostały symbolami S, SN i SA. Inhibitory te wykazują prawie 90% wzajemnej homologii w sekwencji aminokwasów oraz 60% podobieństwo w stosunku do cystatyny C najczęściej spotykanego w organizmie człowieka inhibitora cysteinowych peptydaz. Pełnią one funkcje ochronne przed degradacją tkanek prawidłowych przez cysteinowe peptydazy [14]. Aktywność cysteinowych endopeptydaz w płynie kieszonki zębowej oraz tkanek przyzębia kontrolowana jest in vivo przez autogenne inhibitory, które mogą pochodzić zarówno ze śliny jak i krwi. Mechanizm oraz kinetyka reakcji tych inhibitorów z cysteinowymi peptydazami została już dokładnie zbadana i opisana [12]. Blankenvoorde i wsp. [2] stwierdzili, że cystatyna S w ślinie hamuje rozwój P. gingivitalis oraz aktywność cysteinowych endopeptydaz wydzielanych przez te bakterie oraz, że inhibitory wyizolowane z białka jaj oraz śliny hamują in vitro rozwój P. gingivalis w płynie kieszonki dziąsłowej. Okazało się ponadto, że podobną rolę mogą pełnić cystatyny białka jaja kurzego [2]. Okazało się także, że katepsyna B odgrywa kluczową rolę w rozwoju nowotworów jamy ustnej, w tym raków języka, gdzie wzrost aktywności u osób dorosłych cysteinowych peptydaz jest prawie 40-krotnie wyższa niż w tkankach prawidłowych [19]. Stwierdzono też, że cysteinowe peptydazy mogą katalizować zmiany w budowie specyficznych inhibitorów, w tym kininogenu i cystatyny C [17]. Wiele zespołów naukowych potwierdziło wyraźne powiązanie wpływu palenia papierosów na rozwój stanów zapalnych jamy ustnej oraz nowotworów [4, 11]. Z uzyskanych w niniejszej pracy wyników można wnioskować, że pojawiające się w ślinie osób palących papierosy substancje mogą blokować aktywność inhibitorów cysteinowych peptydaz i ograniczać zdolność obronną organizmu przed patogennymi zmianami w organizmie wywołanymi przez enzymy z grupy cysteinowych peptydaz. Świadczy o tym zróżnicowanie poziomu tych inhibitorów związanych w kompleksy. Podsumowanie Palenie papierosów obniża aktywność poziomu inhibitorów cysteinowych peptydaz w ślinie. Zmniejszenie ich poziomu może ograniczyć zdolność obronną organizmu i wpłynąć na zwiększenie zablokowania aktywności, a przez to skuteczności działania ochronnego przed cysteinowymi peptydazami. Może to doprowadzać do pojawiania się nowotworów lub stanów zapalnych jamy ustnej. Piśmiennictwo 1. Akintoye M, Dasso D I, Hay N, Ganeshkumar A, Spielma I: Partial characterization of a human submandibular/sublingual salivary adhesion-promoting protein. Arch Oral Biol 2002, 47: 337-345. 2. Blankenvoorde M F J, Henskens Wim van t Hot Y M C, Amerongen A V N: Inhibition of 114

2010, 63, 2 Inhibitory cysteinowe peptydaz w ślinie the growth and cysteine proteinase activity of porphyromonas gingivalis by human salivary cystatin S and chicken cystatin. Biol Chem 1996, 377: 847-850. 3. Bradford M M: A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principial of protein-dye binding. Anal Biochem 1976, 72: 248-254. 4. Hershkovichab O, Olivab J, Naglera R M: Lethal synergistic effect of cigarette smoke and saliva in an in vitro model: does saliva have a role in the development of oral cancer? Europ J Cancer 2004, 40: 1760-1767. 5. Jarvis M J, Russell M A, Feyerabend C, Eiser J R, Morgan M, Gammage P, Gray E M: Passive exposure to tobacco smoke: saliva cotinine concentrations in a representative population sample of non-smoking schoolchildren. Br Med J 1985, 291: 927 929. 6. Madden T E, Clark V I, Kuramitsu H K: Revised sequence of the Porphyronomas gingivalis cysteine proteinase /hemaglutynin gene homology with streptococal pyrogenic exotoxin B/streptococal proteinase. Infect Immun 1995, 63: 238-247. 7. Liang P S, Chen T Y, Giovannucci E: Cigarette smoking and colorectal cancer incidence and morality systemic review and meta-analysis. Int J Cancer 2009, 124: 2406-2415. 8. Nagler R M, Klein I, Zarzhevsky N, Drigues N, Reznick A Z: Characterization of differentiated antioxidant profile. Free Radic Biol Med 2002, 32: 268 277. 9. Nagler R M: Oral cancer induced by cigarette smoke the mediatory role of the salivary antioxidant system Anticancer Res 2003, 23: 5125-5128. 10. Nishida N, Yamamoto Y, Tanaka M, Kataoka K, Kuboniwa M, Nakayama K, Morimoto K, Shizukuishi S: Association Between Involuntary Smoking and Salivary Markers Related to Periodontitis A 2-Year Longitudinal Study. J Periodontol 2008, 79: 2233-2240. 11. Potempa J, Pike R, Travis J: The multiplite forms of trypsin like activity present in various strains of Porphyromonas gingivalis are due to the presence of either Arg-gingipain or Lys-gingipain. Infect Immun 1995, 63: 1176- -1182. 12. Nagler R, Dayan D: The Dual Role of Saliva in Oral Carcinogenesis Oncology 2006, 71: 10 17. 13. Reznick A Z, Hershkovich O, Nagler R M: Saliva a pivotal player in the pathogenesis of oropharyngeal cancer. British J Cancer 2004, 91: 111 118. 14. Saitoh E, Isemura S, Sanada K: Cystatin superfamily. Evidence that family II cystatin genes are evolutionary related to family III cystatin genes. Biol Chem Hoppe-Seyler 1988, 369: 191 197. 15. Skaleric U, Babnik J, Curin V, Lah T, Turk V: Immunochemical quantitation of cysteine proteinase inhibitor cystatin C in inflamed human gingiva. Arch Oral Biol 1989, 34: 301-305. 16. Siewiński M, Kręcicki T, Berdowska I, Jarmułowicz J: Cysteine proteinase inhibitors in serum of patients with head and neck tumors. Diagnostic Oncology 1992, 2: 323- -326. 17. Siewiski M, Gutowicz J, Mikulewicz W, Zarzycki A: Participation of cysteine endopeptidases in the invasion and metastasis of tumor and in neoplastic transformation. Cancer Biotherapy Pharmaceut 1996, 11: 169 179. 18. Tarikere L, Gururaja J H, Levine D T, Tran G A Naganagowda K R Narayanan R, Levine M J: Candidacidal activity prompted by N-terminus histatin-like domain of human salivary mucin (MUC7). BBA Proteins and Proteomics 1999, 1431, 107-119. 19. Vigneswaran N, Wu J, Zacharias W: Upregulation of cystatin M during the progression of oropharyngeal squamous cell carcinoma from primary tumor to metastasis. Oral Oncol 2003, 38: 559-568. Adres autorów: 50-556 Wrocław, ul. Borowska 213 Tel.: 668324014 e-mail: jwnuk@msf.am.wroc.pl Paper received 24 June 2009 Accepted 19 February 2010 115