Badanie dynamiki białek jądrowych w żywych komórkach metodą mikroskopii konfokalnej PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI () ćwiczenie prowadzone we współpracy z Pracownią Biofizyki Komórki
Badanie dynamiki białek jądrowych w żywych komórkach metodą mikroskopii konfokalnej Wysokorzędowe struktury chromatyny W jądrze interfazowym wyróżnia się dwie formy strukturalne chromatyny: heterochromatynę i euchromatynę. Heterochromatyna stanowi tę część chromatyny w interfazie, która pozostaje w formie silnie skondensowanej. Pod mikroskopem elektronowym jest widoczna jako ciemne regiony występujące na peryferiach jądra. Wykazano, że heterochromatyna jest transkrypcyjnie nieaktywna, lecz może pełnić ważne funkcje regulujące transkrypcję. Euchromatyna, ze względu na większe rozproszenie, nie jest tak dobrze widoczna jak heterochromatyna. Euchromatyna to region jądra, w którym zachodzi transkrypcja. W obrębie euchromatyny i heterochromatyny występują wysokorzędowe struktury chromatyny zaangażowane w regulację transkrypcji. Struktury te decydują, czy dany gen będzie dostępny dla układu enzymatycznego odpowiedzialnego za transkrypcję. Wiele modeli wysokorzędowych struktur chromatyny zakłada, że są one tworzone przez włókna układające się w regularne helisy, jednak nie znajduje to potwierdzenia w najnowszych badaniach. Wbrew powszechnej opinii, DNA nie występuje in vivo w postaci 30 nm włókna o regularnym ułożeniu nukleosomów. W żywych komórkach nukleosomy tworzą nieregularną trójwymiarową strukturę zygzaka, natomiast struktura 30 nm włókna jest obserwowana jedynie w wyizolowanej chromatynie, wraz ze wzrostem stężenia soli w roztworze. Badania tej formy struktury DNA pokazały, że nukleosomy są w niej zwinięte w lewoskrętną helisę. Nazwano ją solenoidem (Rys.1), na jeden obrót helisy przypada tu 6 nukleosomów. Układ ten może jednak powstawać tylko w warunkach doświadczalnych. Dopiero przyjęcie modelu nieregularnego ułożenia nukleosomów (Rys. 2), a nie solenoidu, pozwala wytłumaczyć fakt, że odcinki łącznikowe między nukleosomami w komórce mają różną długość. Rysunek 1. Model solenoidu. 2
Rysunek 2 Model włókna chromatyny z nieregularnym ułożeniem nukleosomów. Funkcje wysokorzędowych struktur chromatyny Należy podkreślić, że wysokorzędowe struktury chromatyny nie służą wyłącznie do ciasnego upakowania DNA w jądrze, ale pełnią istotną rolę w regulacji ekspresji genów. Badania ludzkiego chromosomu X pokazały, że nie ma różnicy w stopniu kondensacji chromatyny na poziomie molekularnym między aktywnym a nieaktywnym chrmosomem X. Natomiast chromosom X podlegający transkrypcji ma znacznie większą powierzchnię, a zatem to właśnie wysokorzędowa struktura chromosomu zapewne decyduje o jego funkcji. W jądrze interfazowym każdy chromosom zajmuje ograniczoną przestrzeń, a poszczególne terytoria chromosomowe są od siebie oddzielone tzw. domenami wewnątrzchromosomowymi. RNA powstały w procesie transkrypcji na powierzchni terytorium chromosomowego trafia następnie do domen wewnątrzchromosomowych, gdzie podlega dalszej obróbce i transportowi. Zatem wysokorzędowa struktura chromatyny może decydować o tym, czy dany gen znajdzie się w odpowiedniej części regionu chromosomowego i ulegnie transkrypcji. Obecnie przyjmuje się, że wysokorzędowe struktury chromatyny są tworami bardzo dynamicznymi. Występowanie wielu rodzajów struktur wysokorzędowych pozwala na precyzyjną kontrolę kluczowych procesów, takich jak transkrypcja czy replikacja. Rola histonu H1 w tworzeniu wysokorzędowych struktur chromatyny Histon H1 jest ulokowany na zewnątrz nukleosomu, gdzie wiąże się z łącznikowym DNA i oddziałuje z podjednostką H2A rdzenia. Jeśli odcinek DNA nawinięty na nukleosom zostanie skrócony z 160 do 140 par zasad, to H1 zostaje uwolniony z nukleosomu. Usunięcie histonu H1 uniemożliwia powstanie wysokorzędowych struktur chromatyny o największym stopniu upakowania, ponieważ jego ładunek elektryczny jest niezbędny do zobojętnienia ujemnego ładunku DNA. Badania pokazały, że histon H1 jest białkiem o dużej dynamice, istnieją też doniesienia pokazujące, że histon ten może pełnić istotną rolę w regulacji transkrypcji genów. 3
Technika FRAP W doświadczeniach tych w żywych komórkach umieszczonych na stoliku mikroskopu część jądra zostanie naświetlona dużą dawką światła tak, aby doprowadzić do wyblaknięcia GFP związanego z histonami. Następnie w określonych odstępach czasu będą rejestrowane obrazy tego jądra, w których będzie obserwowany powrót fluorescencji w wyblakniętym rejonie dzięki nieustannej wymianie histonów między miejscami wiązania z DNA. Pomiar tempa powrotu fluorescencji i jej poziomu po osiągnięciu równowagi pozwolą na określenie dynamiki białek histonowych oraz frakcji histonów na stałe związanych z DNA. Rys. 3. Schemat doświadczenia techniką FRAP.. Cel ćwiczenia: Celem ćwiczeń jest obserwacja struktury chromatyny w żywych komórkach przy użyciu mikroskopu konfokalnego. W ćwiczeniu zostaną wykorzystane żywe oraz utrwalone komórki z histonami H1 i H2B wyznakowanymi GFP. Przebieg doświadczenia: 1. Procedura utrwalania komórek: a. Komórki przepłukać PBS 3 x 5 min (2 ml na szalkę) b. Utrwalić 4% formaldehydem 15 min w temperaturze pokojowej (2 ml na szalkę) c. Przepłukać 2xPBS (2 ml na szalkę) 2. Plan doświadczenia: a. Obrazowanie żywych komórek z histonem H1-GFP oraz pomiar dynamiki b. Obrazowanie utrwalonych komórek z histonem H1-GFP oraz pomiar dynamiki c. Obrazowanie żywych komórek z histonem H2B-GFP oraz pomiar dynamiki d. Obrazowanie utrwalonych komórek z histonem H2B-GFP oraz pomiar dynamiki 4
DNA w żywych i utrwalonych komórkach będzie barwione różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, następnie zarejestrowane zostaną obrazy tych komórek. Na ich podstawie porównane zostaną właściwości różnych barwników i ich oddziaływanie na dynamikę histonów w żywych komórkach. Temat referatu: Zagadnienia: Rola białek histonowych w organizacji wysokorzędowych struktur chromatyny Metoda FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) Podstawy mikroskopii konfokalnej Białka fluorescencyjne Struktura chromatyny Zalecana literatura: FRAP analysis of binding: proper and fitting. Brian L. Sprague and James G. McNally, Trends in Cell Biology, Volume 15, Issue 2, 84-91, 1 February 2005 Dynamic binding of histone H1 to chromatin in living cells. Misteli T, Gunjan A, Hock R, Bustin M, Brown DT. Nature. 2000 Dec 14;408(6814):877-81. 5