Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Kucharska A.M. i inni: Polimorfizm A/G w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 u dzieci z cukrzycą typu 1 doniesienie wstępne Vol. 8/2009 Nr 1(26) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Polimorfizm A/G w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 u dzieci z cukrzycą typu 1 doniesienie wstępne Polymorphism 49 A/G in Exon 1 of CTLA-4 Gene in Children with Type 1 Diabetes Mellitus a Preliminary Study Anna M. Kucharska, Izabela Rogozińska, Beata Pyrżak, Grażyna Miszkurka, Alicja Wiśniewska Katedra i Klinika Pediatrii i Endokrynologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny Adres do korespondencji: Anna M. Kucharska, 00-576 Warszawa, ul. Marszałkowska 24, Klinika Pediatrii i Endokrynologii WUM, tel. 0 22 5227307, e-mail: amakucharska@tlen.pl Słowa kluczowe: gen CTLA-4, polimorfizm 49 A/G, cukrzyca 1 typu Key words: CTLA-4 gene. 49 A/G polymorphism, type 1 diabetes STRESZCZENIE/ABSTRACT Wstęp. CTLA-4 (ang. cytotoxic T lymphocyte-associated antigen -4) jest cząstką obecną na limfocytach T, pełniącą krytyczną rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej aktywowanej antygenem. Polimorfizmy w obrębie jej genu są uważane za istotny czynnik predysponujący do chorób autoimmunologicznych, w tym do cukrzycy typu 1. Celem pracy była analiza polimorfizmu A/G w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 u dzieci z cukrzycą typu 1 pozostających pod opieką naszej Kliniki. Materiał i metody. Analizowano próbki krwi 88 dzieci: 33 z cukrzycą 1 typu oraz 55 ze zdrowej grupy kontrolnej dobranej wiekowo. Polimorfizm w eksonie 1 analizowano przy pomocy metody SSCP i potwierdzano metodą RFLP z użyciem enzymu restrykcyjnego BbvI. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu T i testu korelacji Spearmana. Wyniki. Analiza polimorfizmu wykazała, że wśród pacjentów z cukrzycą typu 1 liczba homozygot z polimorficznym allelem G nie różniła się istotnie od grupy kontrolnej (18% vs 14,5%), natomiast homozygot z dzikim allelem A w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 było więcej wśród dzieci z cukrzycą niż w grupie kontrolnej (odpowiednio 47% vs 21,8%, p = 0,03). Badany polimorfizm nie korelował z wiekiem rozpoznania cukrzycy ani współwystępowaniem innych chorób autoimmunologicznych. Podsumowanie. Według wstępnej oceny w grupie naszych pacjentów z cukrzycą 1 typu nie potwierdzono istotnej roli polimorfizmu A/G w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 w genetycznej predyspozycji do choroby. Endokrynol. Ped. 8/2009;1(26):27-32. Introduction. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen -4 (CTLA-4) is a molecule present on T cells that plays a critical role in the down regulation of antigen-activated immune responses. CTLA-4 gene polymorphisms are consider as a strong candidates for conferring te genetic susceptibility to autoimmune diseases, among them to type 1 diabetes mellitus (DM). The aim of the study was to analyse the frequency of CTLA-4 exon 1 polymorphism (49 A/G) in children 27

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):27-32 with type 1 diabetes mellitus. Material and methods. Blood samples from 88 children were analysed: 33 with type 1 diabetes and 55 healthy, age-matched controls. CTLA-4 exon 1 polymorphism (49 A/G) was defined by SSCP analysis and confirmed by RFLP with BbvI enzyme. Statistical analysis was performed using t-test and Spearman correlation test. Results. Among patients with type 1 DM 18% of patients with type 1 diabetes mellitus were homozygous for polymorphic G allele, comparable with its frequency in the control group: 14,5 %, and there were more individuals homozygous for A allele at position 49 of exon 1 than in control group (47% vs 21,8% respectively). The polymorphism did not correlate with age of the DM onset and coexistence of other autoimmune diseases. Summary. According to preliminary evaluation in our patients with type 1 diabetes mellitus the polymorphism A/G at position 49 in exon 1 of CTLA-4 gene does not play any important role in genetic susceptibility for the disease. Pediatr. Endocrinol. 8/2009;1(26):27-32. Wstęp CTLA-4 (ang. cytotoxic T lymphocyte-associated antigen -4) jest cząstką obecną na limfocytach T, pełniącą krytyczną rolę w negatywnej regulacji odpowiedzi immunologicznej aktywowanej antygenem. Upośledzenie jej funkcji prowadzi do rozwoju niekontrolowanej odpowiedzi immunologicznej [1, 2]. Rejon CTLA-4 jest obecnie jednym z istotniejszych, poza układem HLA, czynników genetycznych predysponujących do rozwoju chorób autoimmunologicznych [3 5]. Asocjację genu CTLA-4 wykazano w cukrzycy typu 1 [6 10], w autoimmunologicznych zapaleniach tarczycy [11 13], autoimmunologicznym zapaleniu stawów [14], celiakii [15] i innych. Rejon ten jest uważany za istotny w warunkowaniu ogólnej podatności na choroby autoimmunologiczne, niezależnie od specyficzności narządowej. Wśród opisanych polimorfizmów genu CTLA-4 najbardziej atrakcyjnym kandydatem do badań czynnościowych wydaje się polimorfizm w kodonie 17. Polega on na zamianie adenozyny na guaninę w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 (49 A/G), czego konsekwencją jest zmiana sekwencji wiodącego peptydu CTLA-4. Sugeruje się, że efektem tej zmiany jest upośledzenie ekspresji powierzchniowej peptydu CTLA-4 i przez to upośledzenie negatywnej regulacji odpowiedzi autoimmunologicznej [16]. Dla tego polimorfizmu uzyskano najbardziej zgodne wyniki w autoimmunologicznych chorobach tarczycy (AIChT) [13]. Początkowo dane dotyczące różnych grup etnicznych wskazywały na istotne znaczenie polimorfizmu 49 A/G także w cukrzycy 1 typu [6, 7, 10], jednakże według metaanalizy Kavvoury i wsp. wyniki dotyczące cukrzycy 1 typu nie są tak zgodne, jak w przypadku AIChT [9]. Celem pracy była analiza polimorfizmu A/G w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 u dzieci z cukrzycą typu 1 pozostających pod opieką naszej Kliniki. Materiał i metody Analizowano próbki krwi 88 dzieci: 33 z cukrzycą typu 1 oraz 55 z grupy kontrolnej. W grupie badanej było 21 dziewcząt i 12 chłopców. Średni wiek rozpoznania cukrzycy wynosił 8,45±3,3 lat, mediana 9,0 lat. W grupie kontrolnej było 55 dzieci dobranych wiekowo, bez chorób autoimmunologicznych. Pacjenci z grupy kontrolnej byli diagnozowani w klinice z powodu niskiego wzrostu, bólów głowy, omdleń lub otyłości. Polimorfizm w eksonie 1 analizowano przy pomocy metody SSCP i potwierdzano metodą RFLP z użyciem enzymu restrykcyjnego BbvI. Genomowe DNA izolowano z krwi żylnej przy użyciu zestawów Genomic Midi AX (ASA Biotechnology). Metodą łańcuchowej reakcji polimerazy PCR (ang. polymerase chain reaction) amplifikowano fragment genu CTLA-4 z użyciem oligonukleotydów: forward 5 GCTCTACTTCCTGA- AGACCT-3 oraz reverse 5 -AGTCTCACTCAC- CTTTGCAG-3, według opisu sekwencji ludzkiego cdna dla CTLA-4 podanego przez Harper i Balzano [17]. Stosowano następujące warunki reakcji: denaturacja przez 10 minut w temp. 95 0 C, następnie 35 cykli przez 45 sekund w temp. 94 0 C; przyłączenie starterów: 45 sekund w temp. 58 0 C; wydłużanie: 45 sekund w temp. 72 0 C; wydłużanie końcowe: 10 minut w temp. 72 0 C. Polimorfizm genu CTLA-4 w pozycji 49 eksonu 1 badano metodą konformacji pojedynczych nici DNA, SSCP (ang. single strand conformation polymorphism) oraz równolegle każdą próbkę badano metodą trawienia enzymami restrykcyjnymi badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych, RFLP (ang. restriction fragment lenght polymorphism) wg wcześniej podanego opisu [18]. Badanie wykonywała ta sama osoba, w czasie oznaczeń nie miała informacji, czy badana próbka pochodzi od pacjenta z cukrzycą, czy z grupy kontrolnej. Analizowano korelacje między genotypem w badanym locus i wybranymi parametrami klinicznymi: 28

Kucharska A.M. i inni: Polimorfizm A/G w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 u dzieci z cukrzycą typu 1 doniesienie wstępne wiekiem wystąpienia cukrzycy, współistnieniem innych chorób o podłożu autoimmunologicznym, jak celiakia, choroba Hashimoto. Jako badanie przesiewowe w kierunku celiakii oznaczano IgA EmA metodą imunoenzymatyczną. Przeciwciała przeciwtarczycowe oznaczano testem immunoenzymatycznym z użyciem mikrocząstek firmy Abbott: AxSYM Anty-Tg (wynik prawidłowy: poniżej 34 IU/ml) oraz AxSYM Anty-TPO (wynik prawidłowy: poniżej 12 IU/ml). Analizę statystyczną przeprowadzono przy pomocy programu Statistica 7.0 z użyciem testu T-studenta i testu korelacji Spearmana. Wyniki W grupie dzieci z cukrzycą 18% pacjentów miało polimorficzny genotyp GG i w porównaniu z grupą kontrolną częstość ta nie różniła się istotnie statystycznie (18% vs 14,5%, p > 0,05) rycina 1. Heterozygoty stanowiły 36% w grupie z cukrzycą i 64% w grupie kontrolnej. Wśród pacjentów z cukrzycą typu 1 było więcej homozygot z allelem A w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 niż w grupie kontrolnej: odpowiednio 45% vs 21,8%; p = 0,03. Nie stwierdzono związku między genotypem w badanym locus i wiekiem zachorowania na cukrzycę w badanej grupie. U 6% chorych z cukrzycą (n = 2) rozpoznano dodatkowo celiakię, u 30% (n = 11) stwierdzono obecność przeciwciał przeciwtarczycowych, u 12% (n = 4) niedoczynność tarczycy. Z grupy dzieci z cukrzycą wyodrębniono podgrupę dzieci ze współistniejącym z cukrzycą autoimmunologicznym zapaleniem tarczycy i porównano rozkłady genotypów tej podgrupy z całą grupą badaną i z grupą kontrolną. Podgrupa z cukrzycą i współistniejącym autoimmunologicznym zapaleniem tarczycy w porównaniu z całą grupą dzieci z cukrzycą typu 1 miała wyższą częstość homozygot GG (36% vs 18%, p = 0,04) i niższą częstość homozygot AA (36% vs 45%, p > 0,05) (ryc. 2). Nie stwierdzono natomiast istotnej statystycznie różnicy genotypów w badanym locus w grupie z cukrzycą i jednocześnie AIChT w porównaniu z grupą kontrolną. Dyskusja Według bieżących badań genetycznych w chorobach autoimmunologicznych asocjacja w rejonie 2q33 jest najsilniejsza dla genu CTLA-4, ale nadal jest otwarte pytanie, który z opisanych dotąd polimorfizmów tego genu ma znaczenie czynnościowe. Biorąc pod uwagę rolę CTLA-4 jako negatywnego regulatora aktywacji limfocytów T, możemy oczekiwać, że polimorfizm, który upośledza funkcję CTLA-4 i/lub jego ekspresję, może wywoływać zwiększoną aktywację, a przez to prowadzić Ryc. 1. Udział poszczególnych genotypów w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 w badanych grupach Fig. 1. The contribution of particular genotypes at position 49 of exon 1 of CTLA-4 gene in examined groups 29

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;2(23):21-32 8/2009;1(26):27-32 Ryc. 2. Porównanie rozkładu genotypów w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 w badanych grupach Fig. 2. The comparison of the genotypes distribution at position 49 of exon 1 of CTLA-4 gene in examined groups do procesów autoimmunologicznych. Badany przez nas polimorfizm A/G w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 wywołujący zamianę threoniny na alaninę w peptydzie sygnałowym powoduje modyfikację procesów potranslacyjnych w siateczce endoplazmatycznej, której rezultatem jest mniej efektywna glikozylacja i zmniejszona ekspresja powierzchniowa peptydu CTLA-4 [16]. Xu i wsp. przeprowadzili bezpośrednią ocenę czynnościową polimorfizmu 49 A/G. Według ich oceny prawdopodobnie nie jest on odpowiedzialny bezpośrednio za ekspresję białka CTLA-4, ale raczej pozostaje w niezrównoważonym sprzężeniu z innym polimorfizmem o znaczeniu czynnościowym [19]. W naszym materiale oczekiwaliśmy wyższej częstości allelu polimorficznego G i homozygot GG, podobnie jak w badaniu Krokowskiego i wsp., którzy oceniali częstość polimorfizmu 49 A/G genu CTLA-4 u dzieci z Polski środkowej. Krokowski podał w grupie kontrolnej 29% AA, 56% AG i 15% GG [20]. Częstość GG w naszej kontroli była podobna. Natomiast w naszej grupie dzieci z cukrzycą było więcej homozygot dzikich AA niż w grupie kontrolnej, a liczba homozygot GG była podobna jak w kontroli. Podobne wyniki podali autorzy z Czech, którzy nie stwierdzili asocjacji 49 A/G z DM, przy czym rozkład genotypów w grupie dzieci z cukrzycą i w grupie kontrolnej był jednakowy [21]. W ostatnich latach zwraca się uwagę na wpływ czynników genetycznych na wiek wystąpienia choroby. Według danych Zalloua [10] i Takary [22] genotyp GG w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 występuje częściej u pacjentów z wcześnie ujawniającą się cukrzycą. Obaj autorzy za wczesny okrs ujawnienia się cukrzycy uznają wiek poniżej 25-30 lat. Opierając się na takim kryterium w naszej grupie częstość homozygot GG powinna być wyższa, gdyż średni wiek ujawnienia się cukrzycy wynosił 8 lat i 4 miesiące, a najstarszy pacjent w momencie rozpoznania cukrzycy miał 14 lat i 9 miesięcy. Wśród naszych pacjentów z cukrzycą nie stwierdzono korelacji między wiekiem rozpoznania a genotypem w badanym locus. Najbardziej zgodne wyniki dotyczą asocjacji polimorfizmu 49 A/G genu CTLA-4 i autoimmunologicznych chorób tarczycy, zarówno choroby Gravesa, jak choroby Hashimoto. Wykazano także jego związek z występowaniem przeciwciał przeciwtarczycowych [23]. W cukrzycy typu 1 wyniki różnych 30

Kucharska A.M. i inni: Polimorfizm A/G w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 u dzieci z cukrzycą typu 1 doniesienie wstępne autorów nie są zgodne. Niektórzy potwierdzili asocjację [6-8, 10, 20, 24], inni nie wykazali asocjacji z chorobą [21, 25]. Opublikowane ostatnio duże badanie Uedy i wsp. potwierdza asocjację z cukrzycą 1 typu, ale raczej słabą (RR = 1,1) [3]. Według ostatnich doniesień asocjacja jest większa u pacjentów z cukrzycą typu 1 i współwystępującym autoimmunologicznym zapaleniem tarczycy [26]. Potwierdzono to w badaniu rodzin obciążonych wysokim ryzykiem cukrzycy typu 1 skojarzonej z AIChT [27]. Asocjację między allelem G w pozycji 49 eksonu 1 i cukrzycą typu 1 z towarzyszącym autoimmunologicznym zapaleniem tarczycy wykazano także u młodych pacjentów z Japonii [28]. Kolejne badania potwierdzają te obserwacje. Howson i wsp. [29] badali gen CTLA-4 w grupie pacjentów z cukrzycą typu 1 posiadających przeciwciała przeciw peroksydazie tarczycowej (TPO) i wolnych od przeciwciał. Asocjacja i iloraz szans (ang. Odds ratio, OR) były wyższe w grupie z cukrzycą i przeciwciałami anty TPO. Podobnie Ikegami podał, że asocjację między polimorfizmem 49 A/G genu CTLA-4 można stwierdzić jedynie u pacjentów z cukrzycą typu 1 i współwystępującym autoimmunologicznym zapaleniem tarczycy [28]. Dane te sugerują, że CTLA-4 bierze udział w warunkowaniu genetycznej predyspozycji do rozwoju autoimmunologicznych chorób tarczycy oraz autoimmunologicznych zespołów wielogruczołowych, lecz ma raczej mały udział w określaniu genetycznej predyspozycji do samej cukrzycy [27]. Zbliżoną opinię przedstawili autorzy z zespołu profesora Tomera. Według sformułowanej przez nich teorii związek genu CTLA-4 z cukrzycą typu 1 może wynikać nie z bezpośredniego efektu pojedynczych genów, ale z interakcji między genami i modyfikacji genowo- -epigenetycznej [26]. W naszym materiale nie stwierdzono asocjacji między allelem G i obecnością przeciwciał przeciwtarczycowych. Wynik ten może być obciążony błędem z uwagi na małą liczebność grupy. Należy jednak uznać, że była ona reprezentatywna, gdyż częstość występowania przeciwciał przeciwtarczycowych była zgodna z podawaną przez innych autorów częstością chorób tarczycy u chorych z cukrzycą typu 1 i wynosiła 30% [30]. Należy także podkreślić, że o ile w całej grupie z cukrzycą częstość homozygot dzikich AA była większa niż w grupie kontrolnej, to po wyodrębnieniu podgrupy z cukrzycą i współwystępującym autoimmunologicznym zapaleniem tarczycy proporcja homozygot AA do homozygot GG zmieniała się na korzyść tych ostatnich [ryc. 2]. Z obserwacji tej wynika, że homozygoty polimorficzne GG występowały częściej wśród pacjentów z cukrzycą i współwystępującą autoimmunologiczną chorobą tarczycy niż wśród pacjentów z samą cukrzycą. Podsumowanie Według wstępnej oceny w grupie naszych pacjentów z cukrzycą 1 typu nie potwierdzono istotnej roli polimorfizmu A/G w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 w genetycznej predyspozycji do choroby. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Tivol E.A., Borriello F., Schwieitzer A.N. et al.: Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4. Immunity, 1995:3, 541-547. [2] Waterhouse P., Penninger J.M., Timms E. et al.: Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in CTLA-4. Science, 1995:270, 985-988. [3] Ueda H., Howson J.M., Esposito L. et al.: Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease. Nature, 2003:423, 506-511. [4] Vaidya B., Pearce S.: The emerging role of the CTLA-4 gene in autoimmune endocrinopathies. European Journal of Endocrinology, 2004:150, 619-626. [5] Holmberg D., Cilio C.M., Lundholm M., Motta V.: CTLA-4 (CD152) and its involvement in autoimmune disease. Autoimmunity, 2005: 38, 225-233. [6] Nistico L., Buzzetti R., Pritchard L.E. et al.: The CTLA-4 gene region of chromosome 2q33 is linked to, and associated with, type 1 diabetes. Hum. Mol. Genet., 1996:5(7), 1075-1080. [7] Marron M.P., Raffel L.J., Garchon H.J. et al.: Insulin dependent diabetes mellitus (IDDM) is associated with CTLA-4 polymorphisms in multiple ethnic groups. Hum. Mol. Genet., 1997:6, 1275-1282. [8] Lohmueller K.E., Pearce C.L., Pike M. et al.: Meta-analysis of genetic association studies supports a contribution of common variants to susceptibility to common disease. Nat Genet., 2003:33, 177-182. [9] Kavvoura F.K., Ioannidis J.P.: CTLA-4 gene polymorphisms and susceptibility to type 1 diabetes mellitus: a HuGe Review and metaanalysis. Am. J. Epidemiol., 2005:162, 3-16. 31

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):27-32 [10] Zalloua P.A., Abhee A., Shbaklo H. et al.: Patients with early onset of type 1 diabetes have significantly higher GG genotype at position 49 of the CTLA-4 gene. Hum. Immunol., 2004:65, 719-724. [11] Tomer Y.: Unraveling the genetic susceptibility to autoimmune thyroid diseases: CTLA-4 takes the stage. Thyroid, 2001:11, 167-169. [12] Jacobson E.M., Tomer Y.: The CD40, CTLA-4, Thyroglobulin, TSH receptor, and PTPN22 gene quintet and its contribution to thyroid autoimmunity: back to the future. J. Autoimmun., 2007:28, 65-98. [13] Kavvoura F.K., Akamizu T., Awata T. et al.: Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4 gene polymorphisms and autoimmune thyroid disease: a meta-analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2007:92, 3162-3170. [14] Seidl C., Donner H., Fisher B. et al.: CTLA-4 codon 17 dimorphism in patients with rheumatoid arthritis. Tissue Antigens, 1998:51, 62-66. [15] Naluai A.T., Nilsson S., Samuelsson L. et al.: The CTLA-4/CD28 gene region on chromosome 2q33 confers susceptibility to coeliac disease in a way possibly distinct from that of type 1 diabetes and other inflammatory disorders. Tissue Antigens, 2000:56, 350-355. [16] Anjos S., Nguyen A., Ounissi-Benkalha H. et al.: A common autoimmunity predisposing signal peptide variant of the cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 results in inefficient glycosylation of the susceptibility allele. J. Biol. Chem., 2002:277, 46478-46486. [17] Harper K., Balzano C., Rouvier E. et al.: CTLA-4 and CD28 activated lymphocyte molecules are closely related in both mouse and human as to sequence, message expression, gene structure and chromosomal location. J. Immunol., 1991:147, 1037-1044. [18] Kucharska A., Górska E., Wiśniewska A. i in.: Wpływ polimorfizmu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 na ekspresję jego produktu na powierzchni limfocytów T u dzieci z chorobą Hashimoto. Endokrynologia Pediatryczna, 2007:6, Nr 2 (19), 9-14 [19] Xu Y., Graves P., Tomer Y., Davies T.: CTLA-4 and autoimmune thyroid disease: lack of influence of the A49G signal peptide polymorphism on functional recombinant human CTLA-4. Cell Immunol., 2002:215, 133-140. [20] Krokowski M., Bodalski J., Bratek A. et al.: CTLA-4 gene polymorphism is associated with predisposition to IDDM in a population from central Poland. Diab Metab., 1998:24, 241-243. [21] Cinek O.P., Sumnik Z., Bendlova B. et al.: The CTLA-4 +49 A/G dimorphism is not associated with type 1 diabetes in Czech children. Eur. J. Immunogenet., 2002:29, 219-222. [22] Takara M., Komiya I., Kinjo Y. et al.: Association of CTLA-4 gene A/G polymorphism in Japanese type 1 diabetic patients with younger age of onset and autoimmune thyroid disease. Diabetes Care, 2000:23, 975-978. [23] Zaletel K.: Determinants of thyroid autoantibody production in Hashimoto s thyroiditis. Expt. Rev. Clin. Immunol., 2007:3(2), 217-223. [24] Donner H., Rau H., Walfish P.G. et al.: CTLA-4+49 alanine-17 confers genetic susceptibility to Graves disease and to type 1 diabetes mellitus. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1997:82, 143-146. [25] Ban Y., Taniyama M., Tozaki T. et al.: No association of type 1 diabetes with a microsatellite marker for CTLA-4 in a Japanese population. Autoimmunity, 2001:34, 39-43. [26] Huber A., Menconi F., Corathers S. et al.: Joint genetic susceptbility to type 1 diabetes and autoimmune thyroiditis: from epidemiology to mechanisms. Endocr. Rev., 2008:29, 697-725. [27] Golden B., Levin L., Ban Y. et al.: Genetic analysis of families with autoimmune diabetes and thyroiditis: evidence for common and unique genes. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2005:90, 4904-4911. [28] Ikegami H., Awata T., Kawasaki E. et al.: The association of CTLA-4 polymorphism with type 1diabetes is concentrated in patients complicated with autoimmune thyroid disease: a multicenter collaborative study in Japan. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2006:91, 1087-1092. [29] Howson J.M., Dunger D.B., Nutland S. et al.: A type 1diabetes subgroup with a female bias is characteristic by failure in tolerance to thyroid peroxidase at an early age and a strong association with the cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 gene. Diabetologia, 2007:50, 741-746. [30] Barker J.M.: Type 1 Diabetes Associated Autoimmunity: Natural History, Genetic Associations, and Screening. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2006:91, 1210-1217. 32