Ziarna pyłku i zarodniki grzybów w powietrzu różnych regionów polski

Ziarna pyłku i zarodniki grzybów w powietrzu różnych regionów polski

Ziarna pyłku i zarodniki grzybów w powietrzu różnych regionów polski Praca zbiorowa pod redakcją prof. dr hab. Elżbiety Weryszko-Chmielewskiej Polskie Towarzystwo Botaniczne Wydawnictwo Norbertinum Lublin Warszawa 2014

Recenzent prof. dr hab. Jacek Dutkiewicz Projekt okładki Aneta Sulborska Paweł Niczyporuk Opracowanie redakcyjne Weronika Haratym Korekta Małgorzata Ożóg Opracowanie komputerowe Paweł Niczyporuk Copyright by Polskie Towarzystwo Botaniczne, Warszawa 2014 Copyright by Katedra Botaniki Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie, 2014 ISBN 978-83-7222-551-1 Norbertinum Wydawnictwo Drukarnia Księgarnia spółka z o.o. ul. Długa 5, 20-346 Lublin tel. 81 744 11 58, fax 81 744 11 48 norbertinum@norbertinum.pl www.norbertinum.pl

Spis treści Katarzyna Borycka Nowe metody i trendy w badaniach aerobiologicznych......................... 9 New methods and trends in aerobiological study Myszkowska Dorota, Ziemianin Monika, Piotrowicz Katarzyna, Stępalska Danuta, Szczepanek Kazimierz, Czarnobilska Ewa Analiza sezonów pyłkowych wybranych taksonów roślin w Krakowie w latach 2001 2013....................................................... 27 The analysis of pollen seasons of selected plant taxa in Cracow in 2001 2013 Katarzyna Dąbrowska -Zapart, Kazimiera Chłopek Dynamika sezonów pyłkowych wybranych taksonów roślin w powietrzu Sosnowca w latach 2001 2013................................... 47 The dynamics of pollen seasons of selected plant taxa in the air of Sosnowiec in 2001 2013 Małgorzata Malkiewicz Dynamika sezonów pyłkowych drzew (Alnus, Corylus, Betula) i roślin zielnych (Ambrosia, Artemisia, Poaceae) w powietrzu Wrocławia w latach 2003 2013....... 63 The dynamics of pollen seasons of selected trees (Alnus, Corylus, Betula) and herbaceous plants (Ambrosia, Artemisia, Poaceae) in the air of Wrocław in 2003 2013 Barbara Majkowska -Wojciechowska, Zofia Balwierz, Marek L. Kowalski Sezonowa dynamika stężeń pyłku najczęściej uczulających drzew, traw i chwastów w Łodzi, w latach 2003 2013...................................... 81 The seasonal dynamics of pollen concentrations of taxa with the highest allergenic potential including some trees, grasses and weeds in Łódź in the period 2003 2013 Małgorzata Puc Pyłek wybranych roślin alergennych w powietrzu Szczecina..................... 103 The pollen of selected allergenic plant taxa in the air of Szczecin

6 Spis treści Idalia Kasprzyk, Katarzyna Borycka, Agata Dulska -Jeż Dynamika sezonów pyłkowych wybranych taksonów roślin w powietrzu Rzeszowa w latach 2001 2013................................... 121 The dynamics of pollen seasons of selected plant taxa in the air of Rzeszów in 2001 2013 Elżbieta Weryszko -Chmielewska, Krystyna Piotrowska -Weryszko Charakterystyka sezonów pyłkowych wybranych taksonów roślin w Lublinie w latach 2001 2013........................................................ 137 Characteristics of pollen seasons of selected plant taxa in Lublin in 2001 2013 Agnieszka Dąbrowska Dynamika sezonów pyłkowych drzew (Alnus, Corylus, Betula) i roślin zielnych (Ambrosia, Artemisia, Poaceae) w powietrzu Lublina w latach 2001 2013 (metoda grawimetryczna).................................................. 151 The dynamics of pollen seasons of selected trees (Alnus, Corylus, Betula) and herbaceous plants (Ambrosia, Artemisia, Poaceae) in the air of Lublin in 2001 2013 (gravimetric method) Agnieszka Grinn -gofroń Wieloletnie badania nad rodzajami Alternaria, Cladosporium i Ganoderma w Szczecinie (2004 2013).................................................. 163 Long term studies on the fungal genera Alternaria, Cladosporium and Ganoderma in Szczecin (2004 2013) Aneta Sulborska, Weronika Haratym, Beata Żuraw Zarodniki Alternaria w aeroplankotnie Lublina w latach 2007 2013.............. 171 Alternaria spores in the aeroplankton of Lublin in the years 2007 2013 Danuta Stępalska, Jerzy Wołek, Katarzyna Piotrowicz Stężenia zarodników Didymella w Krakowie w latach 1997 2006................ 185 Didymella spore concentrations in Cracow in 1997 2006 Joanna Kaczmarek, Adam Dawidziuk, Idalia Kasprzyk, Małgorzata Jędryczka Sezonowe zmiany stężenia askospor grzybów kompleksu Leptosphaeria maculans L. biglobosa na Podkarpaciu w okresie dziesięciolecia (2005 2014)............... 199 Seasonal changes in ascospore concentrations of fungal species belonging to the Leptosphaeria maculans L. biglobosa complex in the Carpathian foothills over ten years (2005 2014)

Spis treści 7 Agnieszka Wojciechowska Białka stresu pyłku roślin klasyfikacja, charakterystyka, implikacje zdrowotne i środowiskowe........................................ 219 Pollen pathogenesis related proteins classification, characteristics, health and environmental implications Elżbieta Weryszko -Chmielewska, Krystyna Piotrowska -Weryszko, Aneta Sulborska, Anna Matysik -Woźniak Biologiczne i chemiczno -fizyczne zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego................................................. 251 Biological and chemico physical pollutants of the atmospheric air Danuta Stępalska, Dorota Myszkowska V Europejskie Sympozjum Aerobiologiczne (Kraków, 3 7 września 2012)......... 265 The 5th European Symposium on Aerobiology (Cracow, 3 7 september 2012)

Nowe metody i trendy w badaniach aerobiologicznych Katarzyna Borycka Uniwersytet Rzeszowski, Katedra Biologii Środowiska Streszczenie Najpowszechniej używaną aparaturą stacji aerobiologicznych jest pułapka wolumetryczna oparta na prototypie Hirsta, a podstawową metodą identyfikacji sporomorf analiza morfologiczna. Najnowsze techniki oznaczania w powietrzu zawartości ziaren pyłku, zarodników grzybów, bakterii i wirusów wykorzystują systemy automatycznego i półautomatycznego zliczania obiektów wraz z cyfrową analizą obrazu, spektroskopię oraz detekcję molekularną (PCR). Analizie stężenia alergenów w powietrzu służą testy immunoenzymatyczne: ELISA oraz chemiluminescencji (HIA). Detekcja molekularna z zastosowaniem aptamerów umożliwia uniezależnienie analiz immunologicznych od kosztownej produkcji przeciwciał, a najnowsze techniki wykorzystujące biosensory: spektrometria rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) i mikrowaga kwarcowa (QCM) od czasochłonnych reakcji enzymatycznych. Zakres stosowanej do badań aerobiologicznych aparatury zwiększa się o pułapki wolumetryczne zasysające powietrze do probówek oraz wysokoi niskoobjętościowe aparaty kaskadowe. Oprócz analiz powietrza dużych obszarów miejskich, badania aerobiologiczne zaczynają także odpowiadać na indywidualne potrzeby osób uczulonych, koncentrując się na jakości powietrza we wnętrzach budynków z zastosowaniem aparatury przenośnej. Wstęp Badania z dziedziny aerobiologii koncentrują się wokół biernego rozprzestrzeniania w powietrzu organizmów żywych, takich jak: wirusy, bakterie, zarodniki

10 Katarzyna Borycka grzybów, mszaków i paprotników, ziarna pyłku roślin, drobne owady i pajęczaki oraz ich fragmentów, a także innych cząsteczek pochodzenia organicznego. Tworzą one tzw. aeroplankton. Informacje o uwalnianiu, przemieszczaniu i depozycji tych obiektów znajdują praktyczne zastosowanie we wszelkich obszarach związanych z rolnictwem, leśnictwem i klimatologią (Emberlin 2003, Weryszko- Chmielewska 2007, Ogihara i wsp. 2014). Jednakże w dobie coraz większej zachorowalności na różnego rodzaju alergie i inne dolegliwości powodowane przez zanieczyszczenia powietrza (Isolauri i wsp. 2004), to nauki medyczne najczęściej korzystają z prowadzonego przez aerobiologów monitoringu jakości powietrza. Z tego powodu, spośród elementów aeroplanktonu niezmiennie najwięcej uwagi poświęca się obecności w powietrzu ziaren pyłku, zarodników grzybów oraz ich alergenów (Weryszko -Chmielewska 2007). Podstawową techniką badawczą w aerobiologii jest metoda wolumetryczna, natomiast identyfikacja analizowanych obiektów oparta jest na ocenie cech morfologicznych. Ziarna pyłku oznacza się pod mikroskopem optycznym na podstawie takich cech jak: kształt i rozmiar, liczba i typ apertur oraz urzeźbienie egzyny i zlicza z powierzchni szkiełka mikroskopowego (Carvalho i wsp. 2008). Dla bakterii i niektórych grzybów bazową metodą jest hodowla na pożywkach agarowych, a następnie identyfikacja powstałych kolonii (Alvarez i wsp. 1995, Carvalho i wsp. 2008, Viegas i wsp. 2014). Aby skrócić czas analiz i uczynić je mniej pracochłonnymi, aerobiolodzy we współpracy z naukowcami z rozmaitych dyscyplin badawczych podejmują próby zaadaptowania nowych metod analitycznych. Poniższy przegląd najnowszych dokonań w dziedzinie aerobiologii stanowi próbę syntezy technik badawczych, które w przyszłości mogą uzupełnić lub zastąpić czaso- i pracochłonne metody oparte na analizie morfologicznej. Ponadto, zwraca uwagę na nowe aspekty poruszane w ostatnich latach w badaniach aeroplanktonu, ze szczególnym uwzględnieniem obecnych w nim ziaren pyłku, zarodników grzybów i ich alergenów. Nowe metody badań w aerobiologii Aparatura aerobiologiczna Rozpowszechniona obecnie na całym świecie aparatura stacji aerobiologicznych, oparta na prototypie Hirsta (1952), umożliwia analizę zawartości ziaren pyłku i zarodników grzybów w określonej jednostce objętości powietrza. Metodę taką nazywa się wolumetryczną (objętościową), a pozyskane za jej pomocą próby

Nowe metody i trendy w badaniach aerobiologicznych 11 analizuje mikroskopowo. W ostatnich latach różne ośrodki naukowe eksperymentują z wprowadzaniem innych typów aparatury, które byłyby pomocne we wdrażaniu do monitoringu aerobiologicznego nowego rodzaju metod analitycznych. Aby pozyskane próby można było poddać analizom immunologicznym, molekularnym i spektroskopowym, skonstruowano urządzenia wolumetryczne zasysające powietrze bezpośrednio do probówek. W powszechnym użyciu są dwie pułapki tego typu: cyklon firmy Burkard (multi -vial cyclone sampler) (Fernández- González i wsp. 2010, 2011, Guedes i wsp. 2014) oraz aparat Coriolis (Coriolis air sampler) (Carvalho i wsp. 2008, Gómez -Domenech i wsp. 2010). Pierwszy z nich, zaliczany do aparatury niskoobjętościowej, zasysa 16.5 l powietrza min 1 do 1.5 ml probówek typu Eppendorf. Dzięki mechanizmowi zegarowemu zawartość jednej probówki odpowiada 1 dobie. W drugim wysokoobjętościowym przepływ powietrza można regulować dowolnie w przedziale 200 630 l min 1. Dzięki sile zasysania, a w aparacie Coriolis dodatkowo dzięki ruchowi wirowemu probówki, cząsteczki osadzają się na jej wewnętrznej ścianie. Próby mogą być pozyskiwane na sucho (multi -vial cyclone sampler) (Fernández -gonzález i wsp. 2010, 2011) lub na mokro (Coriolis air sampler) do buforu bądź wody (Carvalho i wsp. 2008, Gómez -Domenech i wsp. 2010). Odrębną grupę pułapek stanowią aparaty kaskadowe. Mają one tę przewagę nad poprzednimi, iż umożliwiają podział zasysanych cząsteczek na frakcje zróżnicowane pod względem średnicy aerodynamicznej. Wzorowane są na aparacie Andersena (Andersen 1958), który składa się z metalowych części zestawionych pionowo na zmianę ze szkiełkami mikroskopowymi lub szalkami Petriego wypełnionymi podłożem mikrobiologicznym. Średnica perforacji każdej z części maleje od góry do dołu. W nowszych urządzeniach używa się filtrów z włókna szklanego, które pozwalają na zatrzymanie cząsteczek o średnicy nawet poniżej 0.7 µm (De Linares i wsp. 2007). Rozmaite wersje aparatury różnią się objętością zasysanego powietrza od 10 do 30, a najnowsze do 100 l min 1 (Andersen 1958, De Linares i wsp. 2007, http://www.burkard.co.uk/perssamp.htm, http://www.mbv.ch/mas- 100 -nt_23 -en.html). W ostatnich latach do badań alergenów wykorzystuje się wysokoobjętościowy aparat kaskadowy (High -Volume Cascade Impactor) CHEMVOL, pozwalający na zasysanie nawet 800 l powietrza min 1. Składa się on z kilku osobnych części, z których każda zawiera okrągły filtr z pianki poliuretanowej. W zależności od tego ile frakcji cząsteczek chce się uzyskać, tyle części jedna na drugiej montuje się w aktualnie używanej aparaturze. Od góry kolejno umieszcza się filtry, na których zatrzymywane będą cząsteczki o coraz mniejszej średnicy (od > 10 do > 0.12 μm). Filtry zmienia się codziennie o tej samej godzinie, a następnie, po pocięciu

12 Katarzyna Borycka każdego na 3 części (3 powtórzenia), przechowuje do dalszych analiz (Buters i wsp. 2010, 2012, Albertini i wsp. 2013). Niskoobjętościowe aparaty kaskadowe (Low Pressure Impactor LPI) używane są do analiz bardzo małych cząsteczek rzędu kilku nanometrów najczęściej lotnych związków organicznych, produktów spalania paliw (Virtanen i wsp. 2010) i innych drobnych zanieczyszczeń powierza, jak np. aminokwasy (Di Filippo i wsp. 2014). Aparaty takie dzielą cząsteczki na kilkanaście frakcji różnych rozmiarów, z których najmniejsze mogą dochodzić do 30 nm w aparacie DLPI (Di Filippo i wsp. 2014), a nawet do 6 nm w ELPI (Electrical Low Pressure Impactor). Aparat ELPI umożliwia ponadto szybkie określenie rozmiarów i koncentracji cząsteczek w czasie rzeczywistym w oparciu o pomiar ich ładunków elektrycznych (http:// www.dekati.com/products/fine%20particle%20measurement /ELPI%2B ). Do monitoringu jakości powietrza we wnętrzach budynków najczęściej wykorzystuje niewielkich rozmiarów aparaturę, tzw. osobistą lub przenośną. Pułapki takie mają krótki czas zasysania powietrza bezpośrednio na szkiełka mikroskopowe, pożywki agarowe lub do probówek z odpowiednim buforem. Objętość zasysanego powietrza to od 10 do 20 l min 1, natomiast w nowszym urządzeniu MAS -100 do 100 l min 1 (Alvarez i wsp. 1995, Viegas i wsp. 2014, Usachev i wsp. 2014, http://www.burkard.co.uk/perssamp.htm, http://www.mbv.ch/mas -100- nt_23 -en.html). Metody usprawniające tradycyjną analizę mikroskopową Współpraca palinologów z informatykami zaowocowała w ostatnich latach opracowaniem systemów półautomatycznego i automatycznego oznaczania i zliczania ziaren pyłku z powierzchni szkiełka mikroskopowego (Boucher i wsp. 2002, Holt i wsp. 2011). Systemy takie składają się z wyposażonego w kamerę mikroskopu optycznego podłączonego do komputera. Ich działanie sprowadza się do przeszukiwania całej powierzchni szkiełka, lokalizowania obiektów (w tym wypadku ziaren pyłku), rozpoznania typów ziaren i ich zliczania. Identyfikacja możliwa jest dzięki wcześniejszemu stworzeniu bazy obrazów i ich dokładnemu matematycznemu opisaniu odpowiednimi parametrami, do których oznaczany obiekt jest porównywany. W systemie półautomatycznego zliczania opisanym przez Boucher i wsp. (2002) ziarna pyłku lokalizowane są dzięki podbarwieniu ich fuksyną, a identyfikacja odbywa się na podstawie obrazu trójwymiarowego. Obiecującą propozycją jest system całkowicie zautomatyzowanego zliczania ziaren (Holt i wsp. 2011). Obiekty wyszukiwane są na obrazie czarno -białym przy niewielkim powiększeniu obiektywu (4x). Ich identyfikacja odbywa się już pod obiektywem 20x. Neuronowe

Nowe metody i trendy w badaniach aerobiologicznych 13 oprogramowanie pozwala na porównanie 43 parametrów opisujących cechy morfologiczne ziarna. Co istotne dla palinologów: mogą oni na końcu przejrzeć wszystkie obrazy, które system zapisał i pogrupował na poszczególne typy ziaren i zweryfikować poprawność oznaczeń. Ponadto, po przeskanowaniu całej powierzchni szkiełka komputer tworzy trójwymiarową mapę punktowej lokalizacji poszczególnych obiektów na szkiełku. Autorzy twierdzą, że dokładność opracowanej przez nich techniki wynosi od 88 do 100%. Dodatkowo, cechuje ją wysoka powtarzalność przy każdym kolejnym zliczaniu ziaren z tego samego szkiełka, o wiele wyższa niż w przypadku porównania wyników dla grupy palinologów analizujących ten sam preparat. Niedokładności mogą powstawać wówczas, gdy ziarna pyłku mocno zachodzą jedno na drugie, co utrudnia rozpoznanie obrazu. Niedawno opracowaną techniką jest Direct Vision System (http://www. aeromedi.org/index.php?option=com_content&view=article&id=88&itemid=9), umożliwiający cyfrową analizę obrazu. Dzięki zastosowaniu specjalnego barwnika redprot, przyjmującego kolor od jasnoróżowego do ciemnoniebieskiego, możliwe jest oznaczanie białek, bakterii, ziaren pyłku, zarodników grzybów oraz drobnych organizmów (np. roztoczy) zarówno w roztworach, jak i na powierzchniach: szklanych, metalowych oraz na membranach. Częścią systemu jest urządzenie aeroscope służące do automatycznej, precyzyjnej manipulacji szkiełkiem mikroskopowym, co daje możliwość wykonania szybkich seryjnych analiz. Oznaczanie ziaren pyłku do rodzaju możliwe jest dzięki różnicom w rozchodzeniu się barwnika w komórce. Komputerowy program do analizy obrazu skanuje poszczególne piksele w różnych odcieniach szarości i zaznacza rejony odpowiadające kolorem oraz rozmiarem poszukiwanym obiektom. Metody oparte na właściwościach fizyko chemicznych W ostatnich latach w aerobiologii podjęto próby wprowadzenia technik badawczych wykorzystujących różne rodzaje promieniowania. Ich zastosowanie możliwe jest dzięki występowaniu różnic w chemicznej kompozycji ściany komórkowej. Głównym budulcem trwałej struktury ściany ziaren pyłku wszystkich taksonów jest sporopolenina (Weryszko -Chmielewska 2003, Ivleva i wsp. 2005), posiadająca w swej strukturze głównie karotenoidy i ich estry warunkujące rozróżnianie gatunków metodą spektroskopii (Schulte i wsp. 2009). Zróżnicowanie ilościowe rozmaitych składników chemicznych przekłada się na występowanie różnych grup funkcyjnych i wiązań chemicznych między nimi. Wzbudzone falą o określonej długości, każde z nich emituje promieniowanie o charakterystycznej dla siebie częstotliwości. Zarówno ilościowe jak i jakościowe zróżnicowanie znajduje odbicie

14 Katarzyna Borycka w widmach pasmowych rejestrowanych przy pomocy spektroskopu (Ivleva i wsp. 2005, Guedes i wsp. 2014). Dotychczasowe badania nad szerszym zastosowaniem technik spektroskopowych wskazują, że możliwa jest identyfikacja typów ziaren pyłku w mieszaninach, w których większość stanowi jeden rodzaj (Ivleva i wsp. 2005, Gottardini i wsp. 2007) lub w próbkach z dni, w których stężenie ziaren pyłku danego typu osiągało najwyższe wartości (Guedes i wsp. 2014). Chociaż najnowsze badania zaowocowały stworzeniem bazy spektrów promieniowania charakterystycznych dla alergennych taksonów roślin (Guedes i wsp. 2014), trudnością na dzień dzisiejszy byłoby prawdopodobnie oznaczenie tą metodą niskich stężeń na początku i pod koniec sezonu pyłkowego. Do tej pory opisano próby wykorzystania spektroskopii w podczerwieni (Gottardini i wsp. 2007) i spektroskopii Ramana (Ivleva i wsp. 2005, Sengupta 2005, Guedes i wsp. 2014), z których więcej uwagi w badaniach aerobiologicznych poświęcono tej drugiej. Spektroskopia Ramana W spektroskopii Ramana widmo uzyskuje się dzięki silnemu promieniowaniu monochromatycznemu, do wytworzenia którego wykorzystuje się laser (Ivleva i wsp. 2005). Próbki nie wymagają wstępnego przygotowania, ich analiza trwa krótko, a ziarna pyłku można rozróżnić do rodzaju co udało osiągnąć się także dla taksonów z rodziny Poaceae (Guedes i wsp. 2014). Problemem jest często dodatkowa autofluorescencja ziaren, zaburzająca obraz widma. Aby tego uniknąć badane cząsteczki pokrywa się cienką warstwą metalu. Dzięki temu uzyskuje się wzmocniony sygnał i tym samym ostrzejszy obraz widma. Jest to tzw. powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana (SERS), której zastosowanie przetestowano także dla bakterii (Sengupta i wsp. 2005). Detekcja molekularna Bardzo obiecującą alternatywą dla analizy mikroskopowej wydaje się być detekcja materiału genetycznego przy zastosowaniu technik PCR (Polymerase Chain Reaction). Metodę tę zaczęto wykorzystywać do oznaczania bakterii i zarodników niektórych grzybów obecnych w powietrzu (Alvarez i wsp. 1995, Williams i wsp. 2001, Calderon i wsp. 2002). Dla ziaren pyłku znalazła dotychczas szersze zastosowanie do identyfikacji materiału kopalnego (Parducci i Suyama 2011). Oznaczenia molekularne możliwe są po pozyskaniu prób bezpośrednio z powietrza zassanego

Nowe metody i trendy w badaniach aerobiologicznych 15 do probówki na sucho (Williams i wsp. 2001) lub na mokro (Carvalho i wsp. 2008, Gómez -Domenech i wsp. 2010). Ostatnie doświadczenia wskazują także na możliwość zaadaptowania techniki w powiązaniu z najpowszechniejszą aparaturą aerobiologiczną opartą na prototypie Hirsta (Calderon i wsp. 2002, Kaczmarek i wsp. 2009, Longhi i wsp. 2009). Powodem, dla którego metoda PCR nie jest dotychczas szeroko wykorzystywana w badaniach aerobiologicznych, są trudności z precyzyjnym oznaczeniem stężenia DNA, które przekładałoby się na ilość badanego materiału (bakterii, zarodników grzybów czy ziaren pyłku). Uzyskanie tak dokładnych wyników dzięki wyznakowaniu fluorescencyjnemu cząsteczek DNA (np. barwnikiem Sybr Green) umożliwia ilościowy PCR (real -time PCR, qpcr). Metoda ta wymaga jednak bardzo czystego materiału genetycznego. W przeciwnym wypadku inhibicja polimerazy podczas syntezy DNA może prowadzić do zahamowania reakcji lub obniżenia minimalnego progu detekcji niewielkie stężenia, istotne z punktu widzenia aerobiologii, mogą nie zostać zarejestrowane (Demeke i Jenkins 2010). Tymczasem zarówno w powietrzu (Calderon i wsp. 2002), jak i w samym ziarnie pyłku (St. Pierre i wsp. 1994) znajdują się potencjalne inhibitory reakcji, takie jak: niebiologiczne zanieczyszczenia powietrza (Calderon i wsp. 2002), DNA innych organizmów (Williams i wsp. 2001), elementy kompozycji ściany ziaren polisacharydy i związki polifenolowe (Alvarez i wsp. 1995, Demeke i Jenkins 2010). Mimo, iż ostatnie badania wskazują, że możliwa jest detekcja nawet tak niewielkich ilości jak 3 ziarna pyłku (Longhi i wsp. 2009), to należy liczyć się ze stratami DNA podczas kolejnych etapów przygotowywania próby. Aby pokonać te trudności, metodyka PCR dla potrzeb aerobiologii różni się od standardowej procedury większą liczbą cykli amplifikacji (do 40, czyli o 5 10 więcej niż standardowo) oraz wysoce specyficznymi i krótkimi starterami (Longhi i wsp. 2009, Suyama 2011). W przypadku ziaren pyłku, z powodu ich wielowarstwowej ściany komórkowej, odpornej na działanie wysokiej temperatury i większości czynników chemicznych (w tym silnych kwasów) (Weryszko -Chmielewska 2003), trudnością jest sama izolacja materiału genetycznego. W celu jej ułatwienia stosuje się wytrząsanie próbki w młynkomikserach typu Fast Prep z kulkami szklanymi w buforze z różną kombinacją rozmaitych detergentów, takich jak: CTAB, SDS, Nonident P-40 (Williams i wsp. 2001, Calderon i wsp. 2002, Kaczmarek i wsp. 2009, Longhi i wsp. 2009, Parducci i Suyama 2011). Łatwiejszą izolację bakteryjnego DNA przeprowadza się bez wytrząsania, z użyciem detergentu SDS lub przez naprzemienne traktowanie wysoką i niską temperaturą (Alvarez i wsp. 1995). Warto zaznaczyć, że technika real -time PCR może znaleźć szersze zastosowanie nie tylko przy monitoringu skierowanym do alergików. Byłaby cenną pomocą

16 Katarzyna Borycka w ochronie roślin przed chorobami grzybowymi (Frenguelli 1998, Calderon i wsp. 2002, Kaczmarek i wsp. 2009) oraz w identyfikacji gatunków grzybów, których nie można hodować na pożywkach albo których rozróżnienie na podstawie cech morfologicznych jest trudne czy wręcz niemożliwe (Kaczmarek i wsp. 2009, Viegas i wsp. 2014). Metody immunologiczne badanie alergenów Za objawy uczulenia i astmy odpowiedzialne są alergenne białka zlokalizowane w pylnikach, na powierzchni egzyny, intyny lub w cytoplazmie ziaren pyłku (Weryszko -Chmielewska 2003) oraz we wnętrzu zarodników (Green i wsp. 2006). Uwolnione poza ich obręb w procesie pylenia oraz kiełkowania łagiewki pyłkowej (u drzew) (Grote i wsp. 2003), kiełkowania zarodników (Green i wsp. 2006) lub w efekcie pękania uwodnionego ziarna (u traw) (Suphioglu i wsp. 1992, Taylor i wsp. 2002), migrują w powietrzu jako wolne cząstki łatwo przenikające do dróg oddechowych. Dogłębne poznanie lokalizacji i mechanizmów uwalniania alergenów możliwe było dzięki zastosowaniu takich technik jak: western blot (detekcja białek przez ich rozdział elektroforetyczny, unieruchomienie na membranie i przyłączenie specyficznych dla nich przeciwciał) (Suphioglu i wsp. 1992) czy skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) (Taylor i wsp. 2002, Grote i wsp. 2003). Jeśli dane aerobiologiczne mają służyć osobom uczulonym, bardziej zasadną wydaje się być detekcja immunologiczna alergennych białek niż typowa analiza morfologiczna ziaren pyłku i zarodników grzybów (Ekebom i wsp. 1996, Buters i wsp. 2010, 2012). Powodem jest opisywany przez wielu autorów brak synchronizacji terminów sezonów pyłkowych z terminami występowania w powietrzu ich najważniejszych alergenów (Ekebom i wsp. 1996, Takahashi i wsp. 2001, De Linares i wsp. 2007, Fernández González i wsp. 2010, Albertini i wsp. 2013, Galán i wsp. 2013). Ponadto, potencjał alergenny ziaren pyłku (liczba alergenów uwolnionych przez 1 ziarno) niejednokrotnie różni się między latami oraz dniami sezonu (Buters i wsp. 2010), co może być związane z ich geograficznym pochodzeniem (Buters i wsp. 2012, Galán i wsp. 2013) oraz warunkami atmosferycznymi (Fernández -gonzález i wsp. 2011, Suphioglu i wsp. 1992). Skalę tych różnic dobrze obrazują badania, w których Buters i wsp. (2012) stwierdzili, że zawartość alergenu Bet v 1 uwalnianego przez jedno ziarno obecne w powietrzu może wahać się nawet dziesięciokrotnie w różnych rejonach Europy. W badaniach immunologicznych trzeba jednak pamiętać o możliwości zafałszowania wyników, gdy alergeny wykazują podobieństwo w budowie cząsteczkowej między sobą, jak np. alergeny brzozy i olszy czy brzozy i dębu. Łatwo dochodzi wówczas do reakcji krzyżowych

Nowe metody i trendy w badaniach aerobiologicznych 17 z niespecyficznymi dla danego taksonu przeciwciałami (Ekebom i wsp. 1996, Buters i wsp. 2010). Dodatkowo, często podejmowanym przez naukowców tematem jest weryfikacja rozmiarów cząsteczek, które mogą wywoływać objawy alergii. Dlatego coraz częściej używa się aparatury z filtrami dzielącymi cząsteczki na różne frakcje (Andersen 1958, De Linares i wsp. 2007, Buters i wsp. 2010, 2012, Albertini i wsp. 2013), choć do detekcji immunologicznej możliwe jest również zastosowanie urządzeń zasysających powietrze do probówek (Carvalho i wsp. 2008, Fernández- González i wsp. 2010, 2011, Gómez -Domenech i wsp. 2010). Metody immunoenzymatyczne ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Do jakościowych i ilościowych oznaczeń alergenów najpowszechniej wykorzystuje się enzymatyczny test podwójnej immunosorpcji, tzw. sandwich ELISA (De Linares i wsp. 2007, Buters i wsp. 2010, 2012, Fernández -gonzález i wsp. 2010, 2011, Albertini i wsp. 2013). Białka alergeny, zostają najpierw wypłukane z filtrów aparatów kaskadowych lub z osadu zebranego do probówki roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Celem zwiększenia zagęszczenia alergenów, próby po takiej ekstrakcji poddaje się zwykle liofilizacji (Buters i wsp. 2010, 2012, Albertini i wsp. 2013). Test ELISA polega na przyłączeniu obecnego w roztworze alergenu do specyficznego dla niego przeciwciała związanego wcześniej z wielodołkową płytką z tworzywa sztucznego. Następnie z alergenem łączy się drugie specyficzne przeciwciało, a z nim kompleks streptawidyna enzym (peroksydaza). Jest to etap, w którym przeciwciała zostają znakowane dzięki silnemu powinowactwu streptawidyny do aminokwasu biotyny. Wiążący się do enzymu substrat zapoczątkowuje reakcję barwną, której intensywność mierzy się spektrofotometrcznie. Na podstawie wartości absorbancji przy określonej długości fali oblicza się stężenie alergenu w próbie (De Linares i wsp. 2007, Fernández -gonzález i wsp. 2010, 2011). Test ELISA jest bardzo czułą metodą, a jego wiarygodność w dużej mierze zależy od stabilnych warunków termicznych i precyzji wykonania analiz. Dlatego też duży nacisk kładzie się na weryfikację wiarygodności testów. Służą temu sporządzane osobno dla każdej z analiz: krzywa wzorcowa oraz co najmniej dwie kontrole pozytywne o znanych stężeniach alergenów. Ponadto, aby zweryfikować liniowość otrzymanych wyników, pojedyncza próba testowana jest w kilku rozcieńczeniach (Buters i wsp. 2012, Albertini i wsp. 2013).

18 Katarzyna Borycka Immunologiczny test chemiluminescencji HIA (Halogen Immunoassay) Aby umożliwić analizę stężenia alergenów z wykorzystaniem najpowszechniejszej w stacjach aerobiologicznych aparatury opartej na prototypie Hirsta, podjęto próby testów immunoenzymatycznych na membranach poliwinylowych z fluorkiem. Analiza możliwa jest do przeprowadzenia bezpośrednio na taśmie zdjętej z bębna aparatu. Podobnie jak przy teście ELISA do alergenów przyłączone zostają przeciwciała, z tym że reakcja barwna widoczna jest w postaci efektu halo, tworzącego się zarówno wokół ziaren pyłku, jak i cząsteczek alergenów. Stężenie alergenów jest proporcjonalne do chemiluminescencji mierzonej przy pomocy luminometru w relatywnych jednostkach świetlnych (RLU) bądź gęstości optycznej wyznaczanej po przejściu światła przez warstwę halo (Ekebom i wsp. 1996, Razmovski i wsp. 2000, Madeja i wsp. 2005). Dodatkową zaletę metody stanowi możliwość uzyskania obrazu na filmie rentgenowskim, który może odzwierciedlać godzinowe stężenia alergenów (Ekebom i wsp. 1996, Madeja i wsp. 2005) oraz ich lokalizację w ziarnach pyłku i zarodnikach grzybów (Green i wsp. 2006). Zastosowanie tej techniki ogranicza jednak dłuższy czas analiz niż przy teście ELISA (Ekebom i wsp. 1996). Ponadto, pułapki oparte na prototypie Hirsta cechuje ograniczona zdolność do gromadzenia cząsteczek o średnicy mniejszej niż 3 µm, co przemawia za wykorzystywaniem do badań nad alergenami aparatury wysokoobjętościowej (Emberlin 2003). Detekcja molekularna alergenów z wykorzystaniem aptamerów Absolutną nowością, zarówno dla aerobiologii, jak i alergologii, jest technika łącząca detekcję molekularną i immunologiczną. Jako jedyna metoda oznaczania alergennych białek nie wykorzystuje przeciwciał, lecz krótkie odcinki nici DNA (oligonukleotydy) zwane aptamerami. Są one znakowane aminokwasami, do których duże powinowactwo wykazuje np. neutrawidyna. Po jej przyłączeniu do kompleksu białko (aptamer), dodaje się enzym z substratem, czego wynikiem jest reakcja barwna. Wyzwalana w jej efekcie chemiluminescencja odzwierciedla stężenie alergenu. Dotychczas pojawiło się jedno doniesienie o możliwości wykorzystania aptamerów do detekcji alergenów ziaren pyłku. Być może w przyszłości technika ta pozwoli na ominięcie ograniczeń, jakie posiadają typowe testy immunologiczne, a więc kosztownej produkcji przeciwciał i uzależnienia reakcji od wąskiego zakresu warunków termicznych (Ogihara i wsp. 2015).

Nowe metody i trendy w badaniach aerobiologicznych 19 Metody immunologiczne niewykorzystujące reakcji enzymatycznych Dogłębne poznanie zjawisk optyki i fizyki falowej dało możliwości do rozwoju technik pomiarowych opartych o biosensory. W przeciwieństwie do poprzednich, techniki te nie wykorzystują reakcji enzymatycznych, nie wymagają żadnego znakowania analizowanych białek, co znacznie skraca czas analizy (Takahashi i wsp. 2001, Antosiewicz i wsp. 2015). Duża czułość systemów pomiarowych sprawia, że możliwy jest niższy próg detekcji alergenów niż przy metodzie ELISA (Huang i wsp. 2008), ale z racji dużego wpływu temperatury na pomiar, analizy można przeprowadzać tylko w pomieszczeniach z kontrolowanymi warunkami termicznymi (Takahashi i wsp. 2001). Spektrometria rezonansu plazmonów powierzchniowych SPR (Surface Plasmon Resonance) Spektrometria rezonansu plazmonów powierzchniowych jest to technika optyczna, w której stężenie alergenów wyznacza się na podstawie zmian współczynnika załamania światła. Przeciwciała wiążą się do płytki szklanej pokrytej cienką warstwą złota. Za pomocą lasera wzbudzone zostają elektrony na powierzchni złota, dzięki czemu tworzy się pole elektryczne, a w konsekwencji następuje zmiana stężenia analizowanej substancji na powierzchni płytki. Zmiana stężenia warunkuje zmianę współczynnika załamania światła (Takahashi i wsp. 2001, Huang i wsp. 2008). Metoda ta pozwala na badanie stężenia alergenów w czasie rzeczywistym nawet co godzinę (gdy stężenia alergenów są wysokie) (Takahashi i wsp. 2001). Zastosowanie techniki SPR w aerobiologii nie ogranicza się tylko do detekcji alergenów. Za jej pomocą można oznaczać obecność wirusów, mikroorganizmów i drobnych cząstek organicznych (Usachev i wsp. 2014). Mikrowaga kwarcowa QCM (Quartz Crystal Microbalance) Wykorzystanie zjawiska piezoelektrycznego zachodzącego w kryształach umożliwiło skonstruowanie wagi kwarcowej, spełniającej rolę detektora cząstek molekularnych (Antosiewicz i wsp. 2015). Jest ona rezonatorem, pracującym z drganiami o znanej częstotliwości. Powleczoną złotem, krystaliczną powierzchnię wagi pokrywa się roztworem aldehydu glutarowego, do którego selektywnie przyłączają się przeciwciała. Całość analizy przeprowadza się w komorze, gdzie rozpylany jest roztwór badanej próby. Obecne w nim alergeny, łącząc się z przeciwciałami unieruchomionymi na wadze, obniżają jej częstotliwość drgań. Zmiana częstotliwości

20 Katarzyna Borycka jest proporcjonalna do zmiany masy, czyli ilości alergennych białek przyłączonych do przeciwciał (Poitras i Tufenkji 2009, Morris i wsp. 2014). Wagę kwarcową zaczęto wykorzystywać w aerobiologii na niewielką skalę do oznaczania obecności bakterii (Poitras i Tufenkji 2009) oraz alergenów zwierząt (Morris i wsp. 2014). W obydwu przypadkach konieczne jest zastosowanie przeciwciał. Choć będące nowością metody niewykorzystujące przeciwciał (detekcja z użyciem aptamerów) lub reakcji immunoenzymatycznych (SPR, QCM) są na dzień dzisiejszy kosztowne, to w przyszłości mogą być alternatywą dla testu ELI- SA, powszechnie uważanego za czasochłonny i mniej czuły niż wyżej wymienione. Nowe kierunki badań aerobiologicznych Oprócz ziaren pyłku i zarodników grzybów, w kręgu zainteresowań aerobiologów znajdują się także cząsteczki o najmniejszych średnicach aerodynamicznych, gdyż to one najgłębiej penetrują system oddechowy, powodując jego uszkodzenia. Obecnie aparaty kaskadowe umożliwiają wychwytywanie cząsteczek nawet tak małych jak 6 nm (http://www.dekati.com/products/fine%20particle%20measurement/elpi%2b ). Ostatnie badania wykraczają więc poza detekcję alergennych białek i skupiają się także na aminokwasach (Di Filippo i wsp. 2014) i węglowodorach aromatycznych oraz ich wpływie na zdrowie (Taylor i wsp. 2002, Lippmann i wsp. 2003, Virtanen i wsp. 2010, Bełcik i wsp. 2014). Wymienia się już nie tylko alergie związane z nadwrażliwością systemu immunologicznego, ale nierzadko mechaniczne uszkodzenia systemu oddechowego (Di Filippo i wsp. 2014), reakcje synergistyczne z alergenami ziaren pyłku (Taylor i wsp. 2002, Lippmann i wsp. 2003) oraz efekt mutagenny (Bełcik i wsp. 2014). Ponadto, cząsteczki zanieczyszczeń niebiologicznych stanowią ważny nośnik ułatwiający transport alergenów (Lippmann i wsp. 2003). Najnowsze badania wskazują również, iż niektóre zanieczyszczenia powietrza mogą uszkadzać ziarno pyłku, czego efektem jest zwiększenie ilości uwalnianych alergenów, co stwierdzono w oparciu o metody immunologiczne (Motta i wsp. 2006, Ghiani i wsp. 2012). Podejmując się badań z użyciem spektroskopii rentgenowskiej, zaobserwowano, iż metale ciężkie mogą akumulować się na powierzchni ziaren pyłku i migrować wraz z nimi, zwiększając negatywny wpływ na zdrowie (Duque i wsp. 2013). Nową koncepcją jest badanie indywidualnej ekspozycji na alergeny. W takich systemach immunodiagnostycznych wykorzystuje się reakcje alergenów z niespecyficznymi przeciwciałami IgE obecnymi w surowicy krwi każdego człowieka. Dzięki temu uzyskujemy informacje o poziomie reakcji alergicznych konkretnej