S ł u p s k i e P r a c e B i o l o g i c z n e 1 2005 Grzegorz Wawrzyniak Akademia Wychowania Fizycznego, Poznań Z BADAŃ ONTOGENETYCZNEJ ZMIENNOŚCI WSKAŹNIKA ELEKTROFORETYCZNEJ RUCHLIWOŚCI JĄDER KOMÓRKOWYCH Miarą dojrzałości biologicznej dzieci jest poziom ich rozwoju fizycznego. Kontrola rozwoju służy określeniu położenia osobnika na tle populacji i zakresu zmienności danej cechy biologicznej. Są to najczęściej cechy ilościowe: wysokość i masa, grubość fałdów skórno-tłuszczowych itp. Charakteryzując procesy rozwoju, rozumiane jako rozwój biologiczny polegający na zwiększaniu się wymiarów (w czasie i przestrzeni), oceniać możemy tempo przyrostów cechy w odstępach czasu lub poziom rozwoju cechy w ontogenezie w danym momencie jej trwania w momencie badania. Oceniamy obraz fenotypowy osobnika przyjmując często, iż wyższa wartość cechy odpowiada wyższemu poziomowi rozwoju. Oceniany poziom rozwoju jest funkcją czynników genetycznych i środowiskowych, zapewniających indywidualność osobników. Ze względu na realizację cechy przez osobników na różnym, właściwym sobie poziomie rozwoju (indywidualny poziom w ramach normy adaptacyjnej właściwej dla populacji), obserwujemy zróżnicowanie fenotypowe. Na podstawie zmian natury czynnościowej, odpornościowej czy też adaptacyjnej, zachodzących w obrębie organizmu, możemy wyodrębnić trzy zasadnicze fazy rozwojowe. Najbardziej dynamiczna faza trwająca od momentu zapłodnienia do osiągnięcia przez osobnika pełnej dojrzałości nazywa się fazą progresywną. Charakteryzuje się ona procesami wzrostu różnicowania i dojrzewania. W następnym etapie, stabilnym, stan funkcjonalny organizmu utrzymywany jest w granicach pewnego stałego poziomu. Procesy inwolucyjne ulegają nasileniu w fazie trzeciej kończącej się śmiercią organizmu. W fazie progresywnej określamy stopień zaawansowania procesów rozwojowych, a więc drogę, jaka pozostała osobnikowi do osiągnięcia pełnej dojrzałości. Wiek biologiczny w fazie inwolucyjnej określa odcinek, jaki pozostał do przebycia osobnikowi do zakończenia życia. Wiek biologiczny określa tutaj stopień zużycia organizmu, czyli prawdopodobieństwo śmierci. Faza stabilna nie charakteryzuje się kierunkowymi zmianami i dlatego trudno znaleźć punkt odniesienia, wobec którego należałoby ocenić osobnika. Brakuje wyznacznika, który byłby miernikiem rozwoju bez względu na etap ontogenezy. Konieczne jest więc znalezienie takiego wyznacznika, który informowałby o stanie całego organizmu. Cechy morfologiczne, najłatwiejsze do zmierzenia 165
w badaniach antropologicznych, mają największy udział w ujmowaniu i opisywaniu zjawisk rozwojowych, zwłaszcza dotyczących fazy progresywnego wzrastania. Cechy biologiczne jednak, stanowiąc podstawę wyznaczników wieku rozwojowego (kryterium kostne, zębowe, morfologiczne, drugorzędowych cech płciowych itp.) w pewnym okresie ontogenezy przed rozpoczęciem realizacji ontogenezy ujmowanej jako okres stabilny osiągają stan nieróżnicowania osobników między sobą ze względu na różny stopień zaawansowania w rozwoju. Niemal rutynowo przy ocenie poziomu rozwoju fizycznego dzieci określa się wiek rozwojowy masy i wysokości. Jest to słuszne postępowanie metodologiczne, traktujące wzrastanie jako proces natury ilościowej, będący wynikiem interakcji komponenty genetycznej i modyfikującego wpływu środowiska. Cechy te jednak mogą stać się zawodne w ocenie poziomu rozwoju biologicznego, będącego zarazem wskaźnikiem stanu zdrowia i odżywienia populacji, gdy same w sobie stanowią kryterium doboru do dyscypliny sportowej, np. w akrobatyce preferowane są dzieci o małej masie i niskim wzroście, poniżej wartości przeciętnych. Zrodziła się więc potrzeba poszukiwania takiego wyznacznika, który dawałby możliwość oceny wieku rozwojowego (poziomu rozwoju) bez względu na etap ontogenezy, nie stanowiłby kryterium doboru do dyscypliny oraz spełniał wszystkie warunki dopuszczające cechę, właściwość biologiczną jako wyznacznik wieku rozwojowego. Taką propozycją oceny wieku rozwojowego fizjologicznego jest elektroforetyczna ruchliwość jąder komórkowych (Electrophoretical Mobility of Nuclei EMN), która wykorzystuje fakt poruszania się jąder komórkowych w zmiennym polu elektrycznym oraz fakt zmiany proporcji między liczbą komórek posiadających ruchliwe jądro i komórek o jądrze nie ruszającym się. Do oceny stopnia ruchliwości jąder komórkowych stosuje się aparat Biotest, pozwalający przeprowadzić elektroforezę (zmienne pole elektryczne o napięciu 20-30 V, natężeniu 0,l ma i częstości zmian pola elektrycznego w granicach 1-2 Hz). W opisanym badaniu wykorzystuje się nabłonek jamy ustnej, ze względu na łatwość i bezinwazyjność pobrania materiału. Pobrana tkanka umieszczona w 0,09% NaCl nie wymaga dodatkowego przygotowania. Komórki i jądra są dobrze widoczne już pod 160-krotnym powiększeniem. Do obserwacji wybiera się komórki z drugiej warstwy, a więc dojrzałe. Pomija się natomiast komórki najmniejsze niedojrzałe i największe złuszczające się. Eliminuje się również z obserwacji komórki o jądrach pałeczkowatych lub zaczernionych, jak również o stosunkowo małej lub zdecydowanie dużej ilości cytoplazmy. Selekcja powyższa po wykonaniu kilkudziesięciu preparatów nie sprawia żadnych trudności. Elektroforetyczna ruchliwość jąder komórkowych (EMN) jako miernik rozwoju może być stosowana co trzeba podkreślić przez całą ontogenezę. Wskaźnik EMN wykazuje przez wszystkie fazy kierunkowość jego wartość początkowo wzrasta, mając dodatnią korelację z wiekiem, osiąga wartość maksymalną w wieku około 17 lat, po czym przy ujemnej korelacji z wiekiem jego wartość spada (ryc. l). Wartość liczbowa wskaźnika EMN odzwierciedla stosunek komórek o jądrach ruchliwych do komórek o jądrach pasywnych w zmiennym polu elektrycznym (Makałowska 1992, Wawrzyniak 1998). 166
wskaźnik EMN wiek kalendarzowy Ryc. 1. Ontogenetyczna zmienność EMN Fig. 1. The ontogenetic mutuality of EMN ratio wiek rozwojowy wiek BV wiek MC wiek EMN wiek kalendarzowy Ryc. 2. Wiek rozwojowy dzieci uprawiających akrobatykę sportową Fig. 2. The developmental age of children practicing sport acrobatic 167
Cecha Tabela l Wartości współczynnika korelacji między wiekiem a poszczególnymi cechami Table 1 The values of coefficient correlation between age and individual characteristics Wysokość Liczba zębów Wskaźnik EMN Wysokość Liczba zębów Wskaźnik EMN Wiek 0,7522** 0,808** 0,214** 0,701** 0,686** 0,255** ** poziom istotności 0,01 Tabela 2 Wartości współczynnika korelacji między wiekiem rozwojowym chłopców i dziewcząt Table 2 The values of coefficient correlation between boys and girls developmental age Cecha Wiek wysokości Wiek zębowy Wiek wysokości Wiek zębowy Wiek wsk. EMN 0,232** 0,140 0,164* 0,176* Wiek wysokości 0,539** 0,501** * poziom istotności 0,05 ** poziom istotności 0,01 Dzięki dużej czułości wskaźnik EMN może służyć jako miernik oceny zróżnicowania między różnymi grupami wyodrębnionymi ze względu na działanie czynników zewnętrznych (różny poziom aktywności ruchowej, proces chorobowy, poziom higieny życia alkohol, papierosy, stres). Wskaźnik EMN może służyć ocenie grup zawodników uprawiających różne dyscypliny sportowe (ryc. 2; Wawrzyniak 1997) oraz wpływu wysiłku treningowego na stopień ruchliwości jąder komórkowych i szybkości biologicznej samoregeneracji organizmu po ustaniu obciążenia treningowego. Wskaźnik EMN jako właściwość biologiczna organizmu spełnia wszystkie warunki kryterium wieku rozwojowego: 1. wykazuje zmienność w trakcie rozwoju; zmienność ta może przejawiać się poprzez zmianę wartości przeciętnych lub zmianę zakresu zmienności; 2. wykazuje skorelowanie z wiekiem kalendarzowym, korelacja ta nie jest zbyt silna, 3. odzwierciedla istotne zmiany będące przejawem zjawisk rozwojowych, 4. zmienność cechy w obrębie grupy wiekowej jest na tyle silna, że można wyodrębnić wyraźne grupy biologicznie starsze i młodsze, 5. zmiany w obrębie rozkładu cechy charakteryzują się jednakowym kierunkiem u wszystkich osobników, to znaczy poszczególne etapy występują u nich w ta- 168
kiej samej kolejności, a różnice międzyosobnicze wynikają jedynie ze zróżnicowania tempa rozwoju tej właściwości, 6. cecha jest silnie wrażliwa na działanie czynników środowiskowych. W celu ukazania wzajemnych powiązań wybranych cech biologicznych w aspekcie oceny poziomu rozwoju dzieci wykonano pomiary wysokości, masy 144 chłopców i 147 dziewcząt. Dokonano również pomiaru elektroforetycznej ruchliwości jąder komórkowych oraz liczby wyrżniętych zębów. Powyższe cechy wykazują istotny statystycznie związek z wiekiem kalendarzowym i zależności te można opisać funkcją regresji (tab. l i 2). Siła związku kształtuje się odmiennie w przypadku poszczególnych cech, dlatego krzywe regresji w różny sposób wyjaśniają związki między cechami. Poszczególne wyznaczniki informują o innych właściwościach organizmu, inne jest podłoże ich istnienia i kształtowania się w ontogenezie. Wskaźnik EMN kształtuje się w ontogenezie niezależnie od zaawansowania w rozwoju cech morfologicznych (ryc. 3, 4). Daje to możliwość dostarczenia pełniejszej informacji o rozwoju fizycznym dzieci i młodzieży. Zainteresowanie się wskaźnikiem EMN jest wynikiem aspektu zmienności tej właściwości na wszystkich etapach ontogenezy. Niezwykle łatwy pomiar (w ramach podstawowego przygotowania biologicznego) daje asumpt do wdrożenia tej metody do badań dzieci, młodzieży, ludzi starszych ukazując osobnika na tle zmienności populacji. Ogromne zainteresowanie budzi fakt ekosensytywności cechy. Nie do końca poznany jest wpływ wszystkich czynników środowiska zewnętrznego oddziałującego na organizm. Pojawia się zatem ogromne pole badawcze, pozwalające jednocześnie na wdrażanie do auksologii już uzyskanych rezultatów. wiek rozwojowy wiek zębowy wiek wsk. EMN wiek BV Ryc. 3. Wiek rozwojowy chłopców Fig. 3. The developmental age of boys 169
wiek rozwojowy wiek zębowy wiek wsk. EMN wiek BV Ryc. 4. Wiek rozwojowy dziewcząt Fig. 4. The developmental age of girls PIŚMIENNICTWO Makałowska I., 1992, Przydatność i zakres stosowalności kryteriów oceny wieku biologicznego w badaniach ontogenetycznych na przykładzie metody EMN i metody analizy morfologicznej. UAM, praca doktorska Wawrzyniak G., 1997, A proposal of estimation of developmental age in young acrobats, Diagnostika pohyboveho systemu. Olomouc Wawrzyniak G., 1998, The estimation of the level of the electrophoretical mobility of nuclei (EMN) index. Poznań, maszynopis Summary FROM EXAMINATION OF ONTOGENETIC VARIABLE OF THE ELECTROFORETICAL MOBILITY OF NUCLEI The level of biological development of children and youths may be an indicative of the state of health and nutrition of a given population. In auxological study it is important to establish the development level and direction of a given variable compared with the population and if the development proceeds smoothly (not necessarily at the highest level of development). A means to meet these aims can be among others electroforetic method of mobility 170
of nuclei. To measure electroforetic mobility of nuclei the oral cavity cuticle is used. Cells from the second layer built of mature cells, which have not yet been degenerated, are selected for observation. To draw samples of cuticle sterile haematological knives are used which ensure painless and bloodless sampling. The samples are stored in Eppendorf test tubes in the temperature of 10ºC, in 0.09% solution of NaCl. The cells can be stored for 1 to 5 days; longer storing is not advisable due to the damage of the cells by microorganisms. Samples of cells are observed with a microscope enlarged to 160 the size in alternating electric field of 20-30 V of voltage, 0.1 ma intensity and the frequency of change of poles of 1-2 Hz. Electrophoresis is carried out using a Biotest device constructed especially for this type of study. 171