/LF]EDZ\NU\W\FKEDGDQ\FK

PRZEGL Nr 2 EPIDEMIOL Badania 2005; 59:511 517 serologicznych i molekularnych markerów HCV 511 Ewa Brojer BADANIA SEROLOGICZNYCH I MOLEKULARNYCH MARKERÓW HCV U DAWCÓW KRWI W POLSCE Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Zak³ad Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Kierownik: Barbara Zupañska W pracy omówiono algorytmy i przedstawiono wyniki badañ przegl¹dowych i weryfikacyjnych HCV u polskich krwiodawców. U dawców bada siê obecnoœæ przeciwcia³ anty-hcv, a u tych u których przeciwcia³ siê nie wykrywa poszukuje siê materia³u genetycznego HCV RNA metodami biologii molekularnej. S³owa kluczowe: dawcy krwi, anty-hcv, HCV RNA Key words: blood donors, anti-hcv, HCV RNA CEL I SKALA BADAÑ DAWCÓW KRWI Celem s³u by krwi jest zapewnienie chorym wystarczaj¹cej iloœci bezpiecznej krwi koniecznej dla ratowania ich ycia. Badania przegl¹dowe dawców w kierunku markerów wirusowych s¹ jednym ze sposobów zapewnienia bezpieczeñstwa przetoczeñ. Nie mniej wa ny jest sposób kwalifikacji dawcy dokonywany przez lekarza przed ka dym oddaniem krwi (1). Generalnie, dawcami nie mog¹ byæ osoby chore przewlekle, te które przeby³y ó³taczkê i takie, które nale ¹ do grup ryzyka zaka eñ wirusowych. Dyskwalifikacje czasowe spowodowane s¹ chorobami ostrymi, zabiegami operacyjnymi, inwazyjn¹ diagnostyk¹ medyczn¹. Oddawanie krwi w Polsce jest dobrowolne i nieodp³atne, poniewa wiadomo, e czêstoœæ zaka eñ wirusami u dawców oddaj¹cych krew w celach zarobkowych jest wiêksza ni wœród dawców kieruj¹cych siê pobudkami altruistycznymi. W Polsce tylko 0.5% krwi pobieranej jest od dawców otrzymuj¹cych rekompensaty finansowe. Rocznie w Polsce pobiera siê oko³o 1 miliona donacji. Dokonuje siê badañ u oko³o 180 tysiêcy dawców pierwszorazowych (w innych krajach okreœlanych czêsto jako kandydaci na krwiodawców) oraz u oko³o 250 tysiêcy dawców wielokrotnych, którzy regularnie oddaj¹ krew. Badania przegl¹dowe w kierunku wykrycia markerów wirusowych prowadzi siê testami posiadaj¹cymi miêdzynarodowe certyfikaty (obecnie certyfikat CE). Stosuje siê testy o najwy szej czu³oœci i swoistoœci. Du ¹ uwagê zwraca siê na walidacjê stosowanych metod i kontrolê jakoœci ich przeprowadzania.

E Brojer 512 Nr 2 ALGORYTM BADANIA MARKERÓW ZAKA ENIA HCV U DAWCÓW KRWI Przed ka dym oddaniem krwi u dawcy wykonuje siê badanie przeciwcia³ anty-hcv. Ka dy dawca z dodatnim wynikiem testu jest odsuniêty od oddania krwi. U dawców bez przeciwcia³ obligatoryjnie wykonuje siê badania testami biologii molekularnej (lub badanie antygenu rdzeniowego HCV), które pozwalaj¹ wykryæ zaka enie HCV przed pojawieniem siê przeciwcia³. U dawców wielokrotnych, u których wykryje siê przeciwcia³a, wykonuje siê dodatkowo badania weryfikacyjne: bada siê RNA HCV, a u tych, u których nie wykrywa siê RNA, bada siê przeciwcia³a testem uzupe³niaj¹cym opartym na technice Western Blot. Celem tych badañ jest udzielenie dawcy mo liwie wyczerpuj¹cej informacji co do charakteru wykrytych przeciwcia³. U dawców pierwszorazowych z dodatnimi wynikami testu przegl¹dowego w kierunku przeciwcia³ anty-hcv nie wykonuje siê badañ weryfikacyjnych. Kierowani s¹ oni do lekarzy pierwszego kontaktu, którzy powinni poprowadziæ ich dalsz¹ diagnostykê. WYNIKI BADAÑ PRZEGL DOWYCH ANTY-HCV I BADAÑ WERYFIKACYJNYCH U DAWCÓW Z PRZECIWCIA AMI Czêstoœæ powtarzalnie dodatnich wyników testów przegl¹dowych anty-hcv u polskich dawców jest wy sza ni obserwowana w wiêkszoœci krajów Europy Zachodniej. Wed³ug danych Rady Europy w 2002 roku w Polsce wykrywalnoœæ przeciwcia³ anty-hcv wœród dawców pierwszorazowych wynosi³a 891/100 0000, a wœród dawców wielokrotnych 70/ 100 000. Porównanie tych wyników z wynikami w innych krajach przedstawia tabela I. Tabela I. Table I. Czêstoœæ wykrywania przeciwcia³ anty HCV u dawców krwi w Polsce i w innych krajach wed³ug danych Rady Europy The frequency of anti-hcv detection in blood donors in Poland and other European countries based on Council of Europe data.udm /LF]EDZ\NU\W\FKEDGDQ\FK SLHUZV]RUD]RZ\FK ZLHORNURWQ\FK 3ROVND /LWZD àrwzd %XáJDULD )UDQFMD +RODQGLD 1RUZHJLD :LHOND%U\WDQLD

Badania serologicznych i molekularnych markerów HCV Nr 2 513 Analizy czêstoœci wykrywania przeciwcia³ s¹ w polskim krwiodawstwie prowadzone regularnie. W ci¹gu ostanich 10 lat obserwuje siê wyraÿny (o 21% rocznie) spadek wykrywalnoœci osób z przeciwcia³ami wœród dawców wielokrotnych. W grupie dawców pierwszorazowych, stanowi¹cych do pewnego stopnia reprezentacjê populacji zdrowych osób yj¹cych w Polsce, tendencja zni kowa jest nieznaczna i wynosi ok. 4% rocznie (2). Jeœli przyjmie siê, e rocznie pion krwiodawstwa w Polsce bada oko³o 400 tysiêcy osób, a œrednio u 0,5% uzyskuje siê powtarzalnie dodatnie wyniki testów przegl¹dowych, to ogólna liczba osób z przeciwcia³ami anty-hcv wynosi rocznie oko³o 2 tysi¹ce osób. Tyle osób kierowanych jest wiêc do lekarzy pierwszego kontaktu w celu dalszej diagnostyki (2). Nie ma jak dot¹d opracowañ oceniaj¹cych, jaka czêœæ z tych osób korzysta z porad lekarzy specjalistów chorób zakaÿnych. U dawców wielokrotnych wykonuje siê badania weryfikacyjne RNA HCV. Wyniki badañ uzyskane w roku 2003 przedstawia tabela II. Przeanalizowano czêstoœæ wykrywania RNA HCV w próbkach osocza, w których uzyskano ró ne wartoœci ekstynkcji próbki badanej do kontroli (S/Co) w teœcie przegl¹dowym. Ogólnie RNA wykryto u 18% dawców z przeciwcia³ami. Czêstoœæ RNA HCV zale a³a od wartoœci S/Co testu przegl¹dowego. Przy wartoœci >4,0 RNA HCV wykryto u 65% osób. Podobne wyniki uzyskiwali inni autorzy (3). W badaniach tych podkreœla siê, e wartoœæ S/Co powy ej 3,8 ma du ¹ wartoœæ prognostyczn¹ dla przewidywania, e badana osoba jest zaka ona HCV. Analiza wartoœci S/Co testu EIA u dawców wielokrotnych, których próbki by³ skierowane na badania w IHiT wskazuje, e jedynie u 27% stwierdzono wysokie >4 wartoœci S/Co, a a u 52% osób wartoœci te waha³y siê od 1,0-1,99 (tabela II). Niskie wartoœci S/Co w teœcie EIA, szczególnie w populacji o niskim ryzyku zaka enia, jak¹ s¹ dawcy krwi, z du ym prawdopodobieñstwem reprezentuj¹ tzw. wyniki biologiczne fa³szywie dodatnie (BFP ang. biologically false positive) o nieznanym pod³o u (4). Wœród rozwa anych przyczyn takich wyników wymienia siê szczepienia przeciw grypie czy obecnoœæ autoprzeciwcia³ (5,6). Nale- y w tym miejscu przypomnieæ, e w badaniach wczeœniejszych, zarówno tych, przepro- Tabela II. Table II. Zale noœæ wykrywania RNA HCV u dawców z przeciwcia³ami anty- HCV od wartoœci S/Co testu EIA The correlation of HCV RNA detection in anti-hcv positive blood donors and the S/Co value of EIA test 7HVWDQW\+&9(,$ /LF]ED :\QLN 6&R %DGDQ\FK 51$+&9GRGDWQLFK 6áDERGRGDWQL 'RGDWQL 6LOQLHGRGDWQL! 2JyáHP

E Brojer 514 Nr 2 Tabela III. Table III. Czêstoœæ wykrywania przeciwcia³ w teœcie RIBA u dawców z dodatnimi wynikami testów przegl¹dowych, a bez wykrywanego RNA HCV RIBA results in EIA anti-hcv positive/hcv RNA negative blood donors Gvp ihihqh pu @D6h C8W SI6C8W SD76 SD76 ƒyv SD76 %$ ' ' $! % "% $( à wadzanych w IHiT, jak i w innych krajach, czêstoœæ wykrywania RNA HCV u dawców z przeciwcia³ami by³a wy sza i wynosi³a oko³o 60-80%; nie analizowano w nich jednak wartoœci S/Co w teœcie przegl¹dowym (7,8). Dodatkowe informacje o zaka eniu HCV wnosz¹ badania testami RIBA, LiaTek lub inne oparte na technice Western Blot, w których bada siê reaktywnoœæ przeciwcia³ do poszczególnych bia³ek HCV. Ich wartoœæ do potwierdzenia swoistoœci przeciwcia³ wykrywanych w badaniach przegl¹dowych. jest doœæ ograniczona, czêsto bowiem uzyskiwane wyniki s¹ w¹tpliwe (9). U polskich dawców test ten jest stosowany tylko u dawców wielokrotnych z przeciwcia³ami w teœcie EIA bez wykrytego RNA HCV. Analiza przeprowadzona na podstawie kolejnych próbek, które wp³ynê³y do naszego laboratorium z Reginalnych Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa wykaza³a, e u 6 % takich dawców wyniki RIBA s¹ dodatnie, 36% w¹tpliwe i 59% ujemne (tabela III). Wynik dodatni testu RIBA potwierdza swoistoœæ przeciwcia³, a wyniki ujemne z du ym prawdopodobieñstwem wskazuj¹, e wynik testu przegl¹dowego jest fa³szywie dodatni i nie wynika z zaka enia HCV obecnie lub w przesz³oœci. Wyniki w¹tpliwe testu RIBA wnosz¹ natomiast ma³o informacji, co do oceny, czy dawca jest zaka ony HCV. Czêstoœæ wykrywania RNA u takich osób jest niska (9). Nie mo na wykluczyæ, e RNA HCV mo e zostaæ wykryte w kolejnym badaniu. Z naszych nieopublikowanych doœwiadczeñ wynika te, e u czêœci dawców, w¹tpliwe wyniki testu RIBA, a tak e wyniki RIBA ujemne, przy dodatnich wynikach testu przegl¹dowego utrzymuj¹ siê przez wiele miesiêcy mimo, e nie wykrywa siê RNA HCV. Wiadomo, e u oko³o 15-30% osób, które wyeliminowa³y zaka enie HCV dochodzi do obni enia stê enia przeciwcia³, a tak e zaniku ich wykrywalnoœci (10). To zjawisko tzw. serorewersji nie jest dostatecznie poznane. BADANIA PRZEGL DOWE TECHNIKAMI BIOLOGII MOLEKULARNEJ W CELU WYKRYCIA RNA HCV U DAWCÓW BEZ PRZECIWCIA Od 2000 roku dawcy krwi w wiêkszoœci krajów rozwiniêtych, w tym w Polsce badani s¹ w kierunku markerów wirusowych nie tylko technikami serologicznymi lecz tak e technikami opartymi na namna aniu kwasów nukleinowych wirusów (technika PCR polymerase chain reaction lub TMA transcription mediated amplification), co pozwala na identyfikacjê dawców z aktywnym zaka eniem HCV przed pojawieniem siê przeciwcia³ w okresie okienka serologicznego (9-14). W wiêkszoœci krajów bada siê dawców w kierunku RNA HCV; w niektórych krajach równolegle wykonuje siê badania HIV RNA,

Badania serologicznych i molekularnych markerów HCV Nr 2 515 a w nielicznych dodatkowo HBV DNA. Stosuje siê dwa podstawowe algorytmy badañ: wykrywanie materia³u genetycznego wirusów w zlanych w pule próbek od wielu dawców lub w próbkach od pojedynczych dawców. Najczêœciej badane s¹ tzw. pule osocza zlane próbki od 8-96 dawców. W Polsce do roku 2004 badano pule po 48 donacji metod¹ PCR u ywaj¹c testu Cobas Ampliscreen HCV firmy Roche Diag. W roku 2003, w niektórych Centrach Krwiodawstwa ten system badañ zast¹piono badaniami pojedynczych donacji metod¹ TMA, testem Procleix HCV/ HIV1 firmy Chiron Corp. Od 2005 roku, ze wzglêdu na wprowadzenie badañ HBV DNA wymagaj¹cych wiêkszej czu³oœci testu do wykrycia zaka enia, badana pula nie mo e sk³adaæ z wiêcej ni 24 donacji. Technik¹ TMA bada siê, jak dotychczas, pojedyncze próbki. Czêstoœæ wykrywania RNA HCV u dawców bez przeciwcia³ waha siê w ró nych krajach od 0-4,3 na 1 milion donacji (tabela IV) (11-16). Najwiêcej, bo blisko 40 mln badañ wykonano w USA i u 170 dawców bez przeciwcia³ wykryto RNA HCV (17). W Polsce przebadano dotychczas 3,6 mln i RNA HCV wykryto u 62 dawców bez przeciwcia³ (17 na 1 milion donacji). Badania RNA HCV u dawców bez przeciwcia³ zwiêkszaj¹ bezpieczeñstwo wirusologiczne przetoczeñ. Przy stosowaniu badañ technikami biologii molekularnej pulowanego osocza ryzyko zaka enia wynosi 1: 1,16 mln, a przy zastosowaniu badañ pojedynczych próbek 1: 2,3 mln. Tabela IV. Table IV. Porównanie czêstoœci wykrywania RNA HCV w próbkach osocza dawców bez przeciwcia³ anty-hcv w ró nych krajach The comparison of HCV RNA frequency in plasma samples of anti-hcv negative blood donors in various countries.udm :LHONR üsxol /LF]ED+&951$ GRGDWQLFK PLOLRQGRQDFML $QJOLD $XVWUDOLD )UDQFMD +RODQGLD -DSRQLD.DQDGD 1LHPF\ 3ROVND 86$ Wczesne wykrycie zaka enia u dawcy mo e mieæ te znaczenie dla przebiegu choroby i daje mo liwoœæ wczesnego rozpoczêcia leczenia. Wiadomo, e poziom wiremii w okresie okienka serologicznego jest wy szy ni po pojawieniu siê przeciwcia³. Mo na siê spodziewaæ, e w okresie okienka serologicznego zwiêkszone mo e byæ ryzyko prze-

E Brojer 516 Nr 2 Tabela V. Table V. Ryzyko zaka enia przez krew przy zastosowaniu ró nych metod badania dawców The influence of screening method on the risk of HCV infection by blood transfusion 0HWRGDEDGDQLDGDZFyZ :LUXV SRMHG\QF]HGRQDFMH W\ONREDGDQLDDQW\+&9 0LQLSXOH1$7 1$7 +&9 QDW\V QDPOQ QDPOQ niesienia zaka enia drogami, które generalnie nie s¹ w przypadku HCV uwa ane za istotne (kontakty seksualne, przeniesienie wertykalne, przeniesienie w obrêbie rodziny). Informowanie dawcy o tym, e jest zaka ony, ogranicza wiêc równie rozprzestrzenianie siê HCV. Obserwacje dawców z wczeœnie wykrytym (w okienku serologicznym ) zaka eniem HCV pozwalaj¹ na badanie naturalnego przebiegu zaka enia u osób bez objawów ostrego zapalenia w¹troby typu C i na wykonywanie w tej grupie badañ epidemiologicznych. Nasze badania przeprowadzone u tych dawców pozwoli³y na ustalenie Ÿróde³ zaka enia u czêœci z nich. Dawcy informowani o tym, e wykryto u nich RNA HCV, a nie wykryto jeszcze przeciwcia³, przypominali sobie ryzykowne zachowania, czy sytuacje maj¹ce miejsce w ci¹gu ostatnich kilku miesiêcy (14). Ustaliliœmy te, e czêstoœæ genotypów HCV wœród osób bez przeciwcia³ jest odmienna ni w grupach przewlekle zaka onych; wiêksza jest czêstoœæ genotypów 3a i 4, a mniejsza genotypu 1b (16), Dalsze badania tej grupy powinny odpowiedzieæ na pytanie, jaka czêœæ tych dawców i po jakim czasie od zaka enia wyeliminuje wirusa. Jak dot¹d HCV RNA i przeciwcia³a anty-hcv w kolejnych próbkach wykryto u wszystkich dawców, a badanie dalszych próbek wykaza³o eliminacjê jedynie u dwóch osób spoœród 62 osób z tej grupy. Z pewnoœci¹ wiêc rozwa aæ nale y opracowanie schematu leczenia dla dawców krwi z ostrym, bezobjawowym zaka eniem HCV, których sukcesywnie identyfikowaæ bêdzie pion krwiodawstwa. W podsumowaniu nale y podkreœliæ, e metody badañ dawców stosowane obecnie na œwiecie i w Polsce nie tylko zapewniaj¹ maksymalne bezpieczeñstwo biorcom krwi lecz tak e spe³niaj¹ ogromn¹ rolê w identyfikacji osób zaka onych HCV. Dodatkowo, dziêki wprowadzeniu do badañ rutynowych w krwiodawstwie metod biologii molekularnej zaka- eni dawcy wielokrotni oraz ci, u których wykryto zaka enia w okresie okienka serologicznego zostaj¹ skierowani do lekarzy z wynikami wykrywania RNA HCV podstawowego badania potwierdzaj¹cego aktualnie tocz¹c¹ siê infekcjê. E Brojer SEROLOGICAL AND MOLECULAR MARKERS OF HCV INFECTION IN POLISH BLOOD DONORS SUMMARY The algorythms of blood donor screening for HCV and veryfication of the results of screening tests are presented. Currently blood donors in Poland are tested for anti-hcv and those with no antibodies are screened using molecular biology methods for HCV RNA.

Badania serologicznych i molekularnych markerów HCV Nr 2 517 PIŒMIENNICTWO 1. Sabliñski J, êtowska, Krwiodawstwo i Krwiolecznictwo. Zbiór Przepisów. Warszawa, Ministerstwo Zdrowia, Krajowe Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa, Instytut Hematologii i Transfuzjologii 2000:40. 2. Seyfried H, Grabarczyk P, Brojer E, i in. Wyniki badañ przegl¹dowych przeciwcia³ anty-hcv i RNA HCV u Polskich dawców krwi. Przegl Epidemiol (z³o one do druku). 3. Dufour DR, Talastas M, Fernandez MD, i in. Low-positive anti-hepatitis C virus enzyme immunoassay results: an important predictor of low likelihood of hepatitis C infection. Clin Chem 2003;49:479-86. 4. Kiely P, Stewart Y, Castro L. Analysis of voluntary blood donors with biologic false reactivity on chemiluminescent immunoassays and implications for donor management. Transfusion 2003;43:584-90. 5. Theilmann L, Blazek M, Goeser T, i in. False-positive anti-hcv tests in rheumatoid arthritis. Lancet 1990;335:1346. 6. Simonsen L, Buffington J, Shapiro CN, i in. Multiple false reactions in viral antibody screening assays after influenza vaccination. Am J Epidemiol 1995;141:1089-96. 7. Alonso C, Pedroso ML, de Sanjose S, i in. Hepatitis C virus among blood donors: follow-up study. Transfusion 1994;34:527-30. 8. Moraczewska Z, Mikulska M, Brojer, E i in. Wykrywanie RNA HCV wœród polskich dawców krwi oraz w preparatach osoczopochodnych. Acta Haematol Pol 2000; 31:391-397. 9. Lemaire JM, Courouce AM, Defer C, i in. HCV RNA in blood donors with isolated reactivities by third-generation RIBA. Transfusion 2000;40:867-70. 10. Rodger AJ, Roberts S, Lanigan A, i in. Assessment of long-term outcomes of community-acquired hepatitis C infection in a cohort with sera stored from 1971 to 1975. Hepatology 2000; 32(3):582-7. 11. Eglin R. Implementation of genome amplification technology for HCV RNA detection. Transfusion Medicine 2002;12:265-73. 12. Brojer E, Liszewski G, Ni nik, i in. Detection of HCV core antigen in HCV RNA positive, anti- HCV negative blood donations from Polish blood donors. Transfusion 2001;41:304-305. 13. Jarvis LM, Simmonds P. Scottish experience with NAT. Transfusion Medicine 2002;12:259-264. 14. Brojer E, êtowska M, Gronowska A, i in. Rozpoznanie wczesnego etapu zaka enia HCV u dawców krwi poprzez badanie RNA HCV nowe wyzwanie dla transfuzjologii i hepatologii. Pol Merk Lek 2004;17:321-325. 15. Brojer E, Letowska M, Gronowska A. Nucleic acid testing for virus screening in Polish blood donors. Transfus Med 2004;14(1):79-80. 16. Brojer E, Gronowska A, Medyñska J, i in. The HCV genotype frequency in HCV RNA positive/ anti-hcv negative blood donors identified in NAT screening program in Poland. Transfusion 2004;44(12):1706-10. 17. Stramer SL, Glynn SA, Kleinman SH, i in. Detection of HIV-1 and HCV infections among antibody-negative blood donors by nucleic acid-amplification testing. N Engl J Med 2004; 351(8):760-8. Adres autora: Prof. dr hab. Ewa Brojer Zak³ad Immunologii Hematologiczanej i Transfuzjologicznej Instytutu Hematologii i Transfuzjologii ul. Chocimska 5, 00-957 Warszawa e-mail: ebrojer@ihit.waw.pl