Praktyczne konsekwencje wprowadzenia badań DNA HBV u dawców krwi

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 1, str PIOTR GRABARCZYK, GRZEGORZ LISZEWSKI, MARIA MIKULSKA, ANETA KOPACZ, MAGDALENA ŁĘTOWSKA, EWA BROJER, GRUPA BADAWCZA ds. WIRUSÓW REGIONALNYCH CENTRÓW KRWIODAW- STWA I KRWIOLECZNICTWA Praktyczne konsekwencje wprowadzenia badań DNA HBV u dawców krwi Practical consequences of HBV DNA screening implementation in blood donors Z Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Kierownik: Prof. dr hab. Ewa Brojer Z Zakładu Diagnostyki Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii Kierownik: Doc. dr hab. Magdalena Łętowska STRESZCZENIE W pracy omówiono metodyką i wyniki badań przeglądowych DNA HBV, które w roku 2005 wprowadzono jako obowiązkowe u polskich dawców krwi obok dotychczas wykonywanych badań anty-hcv, anty-hiv, HBsAg i RNA HCV. Podsumowano teŝ wyniki analiz serologicznych (anty-hbc,anty-hbs, anty-hbe) i molekularnych (poziomu wiremii i analizy sekwencji genu kodujacego białko HBs u dawców z DNA HBV, a bez HBsAg. SŁOWA KLUCZOWE: Dawcy krwi DNA HBV HBsAg Ukryte zakaŝenia HBV SUMMARY In present paper we review methodology and results of obligatory HBV DNA screening launched in 2005 in Polish blood donors. We present the results of serological (anti-hbc, anti- HBs, HBsAg and anti-hbe) and molecular (viraemia level and sequence analysis of the gene encoding HBs antigen) study of HBV DNA positive donors without HBsAg. KEY WORDS: Blood donors DNA HBV HBsAg Occult HBV WSTĘP Stan obecny wirusologicznych badań przeglądowych dawców krwi technikami biologii molekularnej na świecie Od 2000 roku dawcy krwi w krajach rozwiniętych, w tym w Polsce, badani są w kierunku markerów wirusowych nie tylko technikami serologicznymi (anty-hcv, anty-hiv i HBsAg), lecz takŝe technikami opartymi na namnaŝaniu kwasów nukleinowych wirusów techniką PCR (polymerase chain reaction reakcja łańcuchowa

2 46 P. GRABARCZYK i wsp. polimerazy) lub TMA (transcription mediated amplification namnaŝanie przez transkrypcję). Badania molekularne pozwalają na identyfikację dawców z aktywnym zaka- Ŝeniem w okresie okienka serologicznego i mają wyŝszą czułość niŝ badania serologiczne. Stosuje się róŝne algorytmy badań. Najczęściej bada się techniką PCR tzw. pule osocza zlane próbki od wielu (6 96) dawców. Alternatywną metodą TMA badane są na ogół pojedyncze próbki. Obligatoryjnie bada się dawców w kierunku RNA HCV; w niektórych krajach równolegle wykonuje się badania RNA HIV, a w nielicznych DNA HBV [1, 2, 3, 4]. Badania DNA HBV wykonywane są rutynowo od kilku lat tylko w nielicznych krajach np. w Niemczech i w Japonii [5, 6]. W obu tych krajach wykonuje się badania w pulach osocza złoŝonych z próbek 96 dawców. W roku 2005 w Polsce rozpoczęto badania DNA HBV. Przedmiotem obecnej pracy jest przedstawienie przyczyn i celów, dla których te badania wprowadzono oraz prezentacja ich wstępnych wyników. PRZYCZYNY WPROWADZENIA BADAŃ DNA HBV Ocenia się, Ŝe na świecie Ŝyje około 300 mln osób zakaŝonych HBV. Polska nale- Ŝy do krajów o wysokim stopniu zapadalności na wirusowe zapalenie wątroby typu B (wzw typu B) [7]. Do roku 2005 badania przeglądowe dawców krwi w naszym kraju były oparte, podobnie jak w innych krajach Europy na badaniu HBsAg metodą immunoenzymatyczną. Częstość wykrywania antygenu HBs u dawców pierwszorazowych w ostatnich latach wynosiła około od 0,04% do 1,4% w zaleŝności od regionu (8). Wśród dawców regularnie oddających krew była około 10 krotnie niŝsza. Zgodnie z analizami prowadzonymi w innych krajach [9] ryzyko przeniesienia zakaŝenia HBV przez krew badaną jedynie metodami serologicznymi wynosi około 1: (Tabela 1). Tabela 1. Ryzyko przeniesienia zakaŝenia przez przetoczenie w zaleŝności od metod badań przeglądowych dawców (wg Stramer, 2004)* [4] Table 1. Estimated risk of transfusion transmitted infection for different blood donors screening methods (according S.Stramer, 2004) [4] Wirus Badania serologiczne Badania molekularne w mini pulach w poj. donacjach HIV 0,75 (1: ) 0,52 (1: ) 0,33 (1: ) HCV 4,3 (1: ) 0,61 (1: ) 0,43 (1: ) HBV 5,5 (1: ) 4,8 (1: ) 2,4 (1: ) *dane dotyczą Stanów Zjednoczonych, gdzie częstość markerów zakaŝenia wirusem HBV i HCV jest niŝsza niŝ w Polsce. RYZYKO ZAKAśENIA HBV PRZEZ KREW BADANĄ SEROLOGICZNIE I METODY JEGO OGRANICZANIA Największe ryzyko przeniesienia zakaŝenia HBV przez krew badaną testami serologicznymi wiąŝe się z przetoczeniem krwi pobranej u dawcy we wczesnym okresie zakaŝenia, przed pojawieniem się HBsAg [10, 11]. W przeciwieństwie do zakaŝenia

3 Praktyczne konsekwencje wprowadzenia badań DNA HBV 47 HCV poziom wiremii HBV w okresie okienka serologicznego jest niski i wynosi od kilku kopii do kilku tysięcy kopii DNA w ml osocza. Wirus namnaŝa się powoli liczba wirionów podwaja się co 2 6 dni [5, 12]. W następnym okresie, w ostrej fazie zakaŝenia, gdy we krwi wykrywany jest antygen HBs DNA-emia wynosi od kopii/ ml. Antygen HBs wykrywa się w surowicy jako pierwszy serologiczny marker zakaŝenia po około 30 do 60 dniach po ekspozycji. Moment wykrycia zakaŝenia zaleŝy od czułości stosowanych testów. Testy serologiczne oparte na technikach enzymatycznych, które w Polsce były uzywane do roku 2006 mają czułość 0,13 0,62 ng HBsAg/ml, co odpowiada około IU DNA HBV/ml (1 IU= około 4 kopii). Testy nowej generacji oparte na chemiluminometrii mają czułość 0,07 0,12 ng/ml ( IU DNA HBV/ml) [11]. Czułość analityczna testów opartych na technikach biologii molekularnej jest wyŝsza i dla testu TMA (Chiron Corp) wynosi około 6 16 IU DNA HBV/ml [13, 14], a dla testu Ampliscreen HBV (Roche Diag) około 5 IU/ml [15]. UŜycie tych metod do badań przeglądowych pozwala na skrócenie okienka serologicznego przy badaniach pulowanego osocza o 9 11 dni, a pojedynczych donacji o dni. Drugą przyczyną przeniesienia zakaŝenia HBV przez krew dawcy badanego w kierunku HBsAg moŝe być tzw. ukryte zakaŝenie HBV manifestujące się obecnością DNA HBV przy niewykrywaniu antygenu HBs [10]. Taki stan moŝe mieć charakter przewlekły u tzw. zdrowych nosicieli HBV lub moŝe wystąpić w końcowych etapach zakaŝenia, które ulega ograniczeniu (tzw. drugie okienko serologiczne przed wytworzeniem anty-hbs, lub w okresie późniejszym, gdy poziom anty-hbs spada). W tych dwóch grupach osób poziom DNA HBV w osoczu jest na ogół bardzo niski waha się od kilku do kilkudziesięciu kopii w mililitrze. Nie wykrycie HBsAg w trakcie toczącej się infekcji ma często związek z zakaŝeniem mutantem HBV. Mutanty mogą mieć zmienioną strukturę antygenu powierzchniowego tak, Ŝe nie istnieją w nim epitopy rozpoznawane przez testy serologiczne uŝywane do wykrywania HBsAg. Poziom wiremii u osób zakaŝonych takim mutantem moŝe być, choć nie musi, stosunkowo wysoki. Nie wykrywanie antygenu wynika bowiem z jego własności antygenowych, a nie ze zbyt małej czułości testu serologicznego. W genomie zmutowanych szczepów obecne są inne niŝ w szczepie dzikim podstawienia amninokwasów w regionie a, szczególnie w pętli 4 w pozycji 145. Mutacje mogą zachodzić teŝ w promotorze białek rdzenia lub w regionie pre-core. Niektóre mutanty wirusa cechują się zmniejszoną zdolnością replikacji wirusa [16, 17]. U osób z ukrytym zakaŝeniem HBV wykrywa się na ogół przeciwciała anty-hbc. Obecne u nich mogą teŝ być inne serologiczne markery zakaŝenia (anty-hbe, czy niskie stęŝenie anty-hbs). Nie jest znana częstość wykrywania ukrytego zakaŝenia HBV szczególnie wśród osób bez objawów klinicznych. W regionach o endemicznym występowaniu zakaŝenia HBV, ukryte zakaŝenie wykrywano u 1 24% osób z anty- HBc [10, 18]. W badania przeprowadzonych w Regionalnym Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Krakowie anty-hbc wykryto u 60/1012 dawców krwi (6%). U Ŝadnego z nich nie wykryto DNA HBV przy pomocy testu TMA o czułości 5 IU/ml (J. Kuśmierczyk informacja ustna).

4 48 P. GRABARCZYK i wsp. WaŜnym zagadnieniem z punktu widzenia bezpieczeństwa biorców krwi jest zakaźność preparatów krwi od osób z ukrytym zakaŝeniem HBV. ZaleŜy ona od dawki wirusa oraz od stanu immunologicznego biorcy, a w przypadku HBV takŝe od stęŝenia przeciwciał anty-hbs, które mają własności neutralizujące. Wysokie stęŝenie tych przeciwciał chroni przed przeniesieniem zakaŝenia, a przy niskim poziomie anty-hbs (<0.1IU/ml) około 10% donacji moŝe przenieść zakaŝenie [19]. UwaŜa się, Ŝe krew dawców z przeciwciałami anty-hbc, u których nie wykrywa się HBV DNA nie moŝe być źródłem zakaŝenia. Krew opisanego ostatnio dawcy, u którego wykryto DNA HBV dopiero przy pomocy ultra czułej metody (stęŝenie 3,8 IU/ml) nie przeniosła zakaŝenia. W archiwalnych próbkach osocza tego dawcy wykryto DNA HBV w stęŝeniu od 8 do 260 IU/ml. W badaniach typu look back nie wykazano przeniesienia zakaŝenia przez preparaty krwi przygotowane z tych donacji [20]. BADANIA DNA HBV W POLSCE Metodyka badań przeglądowych i weryfikacyjnych Badania przeglądowe DNA HBV wykonywane są w Pracowniach Biologii Molekularnej w 12 Centrach Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa. Stosuje się dwie metody badań. W Centrach w Białymstoku, Bydgoszczy, Gdańsku, Kaliszu, Olsztynie, Poznaniu, Raciborzu wykonuje się badania metodą PCR (Cobas Ampliscreen HBV Roche) ze zlanych w pulę próbek od 24 dawców. Od początku 2007 stopniowo wprowadzano badania oparte na technice Real time PCR testem typu multiplex (HCV,HBV,HIV) Cobas 201 w pulach po 6 donacji. W Centrach w Kielcach, Krakowie, Lublinie, Łodzi, Rzeszowie, Warszawie i Szczecinie wykonuje się badania pojedynczych próbek metodą TMA (Ultrio HBV/HCV/HIU; Chiron Corp). Test Ultrio jest, podobnie jak test Cobas 201 testem typu multiplex. Dodatni wynik badania świadczy o obecności RNA HCV, RNA HIV lub DNA HBV. Dla ustalenia, który z wirusów jest obecny w próbce trzeba wykonać dalsze badania trzema testami wykrywającymi kaŝdy z badanych wirusów (tzw. testy dyskryminacji). Zgodnie z przyjętym obecnie algorytmem krew od wszystkich dawców bez markerów serologicznych z dodatnimi wynikami testów molekularnych, a takŝe dawców, których wyniki badań wzbudzają wątpliwości (np. dodatnie w teście typu multiplex, a ujemne we wszystkich trzech testach dyskryminacji) jest niszczona. Osocze tych dawców oraz dostępne próbki archiwalne i nowo pobrane są przesyłane do IHiT w celu dalszych badań. Wykonuje się w nich badania DNA HBV; jeśli ilość osocza jest wystarczająca to izolację DNA wykonuje się metodą automatyczną (Nuclisens Extractor- Biomerieux) z duŝej objętości (2 ml). Ocenia się teŝ poziom wiremii (Amplicor Monitor HBV Roche Diag lub techniką real time PCR Arthus) oraz wykonuje badania serologicznych markerów zakaŝenia HBV: HBsAg testami o wyŝszej czułości, niŝ te uŝyte do badań przeglądowych oraz badania anty-hbc, anty-hbs, anty-hbe i HBeAg.

5 Praktyczne konsekwencje wprowadzenia badań DNA HBV 49 Wyniki badań przeglądowych oraz charakterystyka serologiczna i molekularna donacji HBV DNA dodatnich HBsAg ujemnych Do końca 2005 roku badania DNA HBV wykonano w próbkach osocza dawców bez markerów serologicznych. DNA HBV wykryto w 8/ próbek badanych w pulach oraz w 9/ badanych pojedynczo testem TMA. Dodatkowo DNA HBV wykryto w 11 próbkach, w których wyniki testu Ultrio były dodatnie, a wyniki testu dyskryminującego ujemne. Częstość wykrywania DNA HBV wynosiła 0,003% (1:36000). Poziom wiremii w momencie wykrycia DNA HBV przy ujemnym wyniku testu przeglądowego HBsAg wynosił od <10 IU/ml do 4, IU/ml. Wiremia u 21/28 dawców była około 10 IU/ml, u 4/ do 1000 IU, a u , IU/ml. U dwóch dawców z poziomem wiremii 3, i 1, IU/ml wykryto HBsAg testem o wyŝszej czułości. Tabela 2. Analiza markerów serologicznych w próbkach dawców bez HBsAg z wykrytym DNA HBV Table 2. Serological markers analysis in blood donors samples HBsAg negative, HBV DNA positive Przeciwciała anty- HBc Liczba dawców IgM Total HBs HBe HBe Ag Dwudziestu trzech dawców było badanych w kierunku anty-hbs, anty-hb-c i anty-hbe (Tabela 2). U 4 nie wykryto Ŝadnych markerów serologicznych HBV. Badania kolejnych próbek u 3 z nich potwierdziły, Ŝe dawca w momencie wykrycia DNA HBV był w okienku serologicznym w następnej próbce wykryto HBsAg. U jednego z nich po 11 tygodniach nie wykryto HBsAg ani DNA HBV. Wykryto natomiast anty- HBc, anty-hbe i anty HBs. Aktywność ALT była w granicach normy. Dawca nie zgłaszał Ŝadnych dolegliwości i nie miał świadomości, Ŝe przebył zakaŝenia HBV (Rycina 1 AR). U 17 dawców badania wykazały obecność anty-hbc: u 8 był to jedyny marker serologiczny, u 6 towarzyszyły mu przeciwciała anty-hbe, u 2 dawców przeciwciała anty-hbs, a u 1 przeciwciała anty-hbs i anty-hbe. U jednego dawcy wykryto tylko przeciwciała anty-hbs, a u jednego anty-hbs i anty-hbe. Przykładowe wyniki badań kolejnych próbek u analizowanych dawców przedstawiono na Rycinie 1.

6 50 P. GRABARCZYK i wsp. AR kopie HBV DNA\ml ALAT 15 HBcAb-/- ALAT 20 HBcAb-/- HBsAb- HBeAb- HBsAg tygodnie ALAT 20 HBcAb+/+ HBsAb+ HBeAb+ PA ALAT 11 HBcAb -/ + HBeAg + HBsAg + kopie HBV DNA/ml ALAT 18 HBc Ab -/- HBs Ab - ALAT 22 HBcAb -/ tygodnie

7 Praktyczne konsekwencje wprowadzenia badań DNA HBV 51 PW HBV DNA kopie/ml ALAT 25 HBcAb+/- HBsAb- HBeAb+(66) HBsAg- ALAT 28 HBcAb+/- HBsAb- HBeAb+(67) ALAT 38 HBcAb+/- HBsAb- HBeAb+(65) ALAT 34 HBcAb+/- HBsAb- HBeAb+(61) tygodnie KB HBcAb+/+ HBeAb +(82) poziom wiremii (kopie/ml) tygodnie HBcAb+/+ HBcAb+/- HbeAg - HBeAb +(87) HBeAb +

8 52 P. GRABARCZYK i wsp. HM anty HBs IU/L ALAT 20 DNA HBV - nb HBcAb +/- ALAT 15 DNA HBV - nb HBcAb +/- ALAT 20 DNA HBV - HBcAb +/ tygodnie ALAT 20 DNA HBV - HBcAb +/- ALAT 23 DNA HBV - HBcAb+/ - ALAT 23 DNA HBV + HBcAb +/- Ryc. 1. Badania kolejnych próbek osocza dawców, u których w badaniach przeglądowych wykryto HBV DNA, a nie wykryto HBsAg. AR PA zakaŝenie HBV w okienku serologicznym bez Ŝadnych markerów serologicznych; PW przewlekłe ukryte zakaŝenie; KB faza eliminacji zakaŝenia, HM zakaŝenie ukryte, (oznaczenia ab przeciwciała, ag antygen, nb nie badane, HBcAb+/ : wynik badania anty HBc total/igm) Fig. 1. Testing of follow-up and look-back plasma samples from blood donors with HBV DNA screening assay positive results and HBsAg negative: AR PA HBV infection in window period without any serological marker, PW chronic occult infection, KB infection limitation, HM chronic occult infection (abreviations: ab - antibodies, ag antigen, nb not tested, HBcAb+/ : testing results of anti HBc total/igm) PODSUMOWANIE Wykrycie DNA HBV u dawcy krwi powoduje odsunięcie od oddawania krwi, czego konsekwencją jest z pewnością zwiększenie bezpieczeństwa przetoczeń (Tabela 1). Inną konsekwencją prowadzonych badań jest przekazywanie dawcom informacji o wykryciu DNA HBV bez wykrytego HBsAg. Dawca jest kierowany do lekarza pierwszego kontaktu, który powinien zająć się jego dalszymi losami. Niestety nie jest obecnie wiadomo jaki schemat postępowania naleŝy przyjąć. Nie ma na ten temat opinii równieŝ w innych krajach. KaŜdy przypadek wymaga indywidualnej obserwacji i decyzji. Z przeprowadzonych przez nas badań wynika, Ŝe poziom wiremii u dawców w momencie identyfikacji zakaŝenia HBV jest niski. Dla wypowiedzenia się jaki etap zaka- Ŝenia zidentyfikowano, jaka jest prognoza i jaki sposób postępowania naleŝy przyjąć konieczne jest wykonanie panelu badań serologicznych i molekularnych w próbce

9 Praktyczne konsekwencje wprowadzenia badań DNA HBV 53 wyjściowej, w kolejnych próbkach dawcy oraz ewentualnie w dostępnych próbkach wcześniejszych. W naszych badaniach wykazaliśmy, Ŝe identyfikujemy dawców na róŝnych etapach zakaŝenia. Spośród dawców bez markerów serologicznych u wszystkich prócz jednego w kolejnej próbce wykryto HBsAg, co potwierdziło, Ŝe zidentyfikowano u nich zakaŝenie w okienku serologicznym. Dalsze obserwacje u jednego z dawców z okienka wykazały bardzo szybkie samowyleczenie z eliminacją HBsAg i DNA HBV. Dawcy z DNA HBV i z obecnymi przeciwciałami anty-hbc i/lub anty-hbs i/ lub anty-hbe stanowili natomiast bardzo zróŝnicowaną grupę. Byli wśród nich dawcy we wczesnym okresie zakaŝenia z przeciwciałami anty-hbc klasy IgM i dawcy w okresie zdrowienia, gdy zanika HBsAg, a jeszcze nie pojawia się anty-hbs. U niektórych dawców obserwowano przewlekłe ukryte zakaŝenie z wahającym się poziomem wiremii. U jednego z badanych wykryto mutację w pozycji 145 genu S. Wydaje się, Ŝe ocena ilości DNA HBV oraz analiza mutacji genomu wirusa stanowią konieczne badania konsultacyjne w tej grupie dawców. Bardzo waŝne byłoby poddanie tej grupy dawców specjalistycznym badaniom hepatologicznym by ocenić istotność kliniczną ukrytego zakaŝenia. Z pewnością badania dawców z wykrytym DNA HBV pozwalają na nowe obserwacje naturalnego przebiegu zakaŝenia HBV i mogą wnieść nowe dane na temat biologii tego znanego od wielu lat wirusa. Obserwacje dawców z okienka pozwolą na analizę częstości i przebiegu samoistnej eliminacji zakaŝenia u osób, które nie mają Ŝadnych objawów klinicznych i w inny sposób niŝ badania w krwiodawstwie nie byłyby zidentyfikowane. Dodatkowe badania takich osób (np. badania HLA, badania immunologicznej odpowiedzi komórkowej) mogą zidentyfikować nieznane dotąd mechanizmy skutecznej walki organizmu z zakaŝeniem HBV oraz istotne czynniki rokownicze. Badania u dawców z ukrytym zakaŝeniem pozwolą poszerzyć wiedzę o naturze tego zjawiska. Podziękowania Badania przeglądowe DNA HBV dawców krwi wykonane były w Pracowniach Biologii Molekularnej Regionalnych Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Białymstoku, Bydgoszczy, Gdańsku, Kaliszu, Kielcach, Krakowie, Łodzi, Poznaniu, Raciborzu, Rzeszowie, Szczecinie i Warszawie. Wszystkie te Centra, a takŝe Centra w Słupsku, Olsztynie, Zielonej Górze, Katowicach, i Radomiu prowadziły badania lekarskie, badania ALT i badania serologiczne oraz dostarczały do IHiT próbki osocza dawców. Dziękujemy wszystkim Pracownikom RCKiK za ich wysiłek. Badania częściowo finansowane z projektu badawczego nr N /3601 finansowanego przez MNiSW. PIŚMIENNICTWO 1. Coste J, Reesink HW, Engelfriet P i wsp. International Forum. Implementation of donors screening for infectious agents transmitted by blood by nucleic acid technology: update to Vox Sang 2005; 88:

10 54 P. GRABARCZYK i wsp. 2. Brojer E. Implementation of donor sreening for infectious agents transmitted by blood by nucleic acid technology in Poland.Vox Sang, 2005; 89: Brojer E, Łetowska M, Gronowska A. Nucleic Acid Testing for virus screening in Polish blood donors. Transf Med 2004; 14: Stramer SL, Glynn SA, Kleinman SH, i wsp. National Heart, Lung and Blood Institute Nucleic Acid Test Study Group: Detection of HIV-1 and HCV infections among antibody-negative blood donors by nucleic acid-amplification testing. N Engl J Med. 2004; 351: Roth K, Weber W i wsp. NAT for HBV and anti-hbc testing increase blood safety. Transfusion 2002; 42 (7): Murokawa, H, Yoshikawa, A, Ohnuma H i wsp. Epidemiology of blood donors in Japan, positive for hepatitis B virus and hepatitis C virus by nucleic acid amplification testing. Vox Sang 2005; 88: Magdzik W. Wirusowe zapalenie wątroby typu B w Polsce do 2002 roku. PZH. Warszawa Seyfried H, Grabarczyk P, Mikulska M. i wsp. Analiza częstości wykrywania antygenu HBs u polskich dawców krwi w latach (w przygotowaniu do druku). 9. Stramer S.L. US NAT yield: where are we after 2 years? Transfusion Clinique et Biol 2003; 10: Alain JP. Occult hepatitis B infection: implications in transfusion.vox Sang 2004; 86: Biswas R, Tabor E, Hsia CC, i wsp. Comparative sensitivity of HBV NATs and HBsAg assays for detection of acute HBV infection. Transfusion 2003; 43: Yoshikawa A, Gotanda Y, Itabashi M i wsp. HBV NAT positive blood donors in the early and late stages of HBV infection: analyses of the window period and kinetics of DNA HBV. Vox Sang 2005; 88: Brojer E, Łętowska M, Medyńska J. i wsp. Validation of Procleix Ultrio assay in Poland. Vox Sang 2004, 87 (suppl 3): Chudy M, Amberg I, Hanker-Dusel C. i wsp. Procleix Ultrio Assay performance trial. Vox Sang 2004; 87 (suppl 3), Koppelman M, Sjerps M, Reesink H i wsp. Evaluation of Cobas AmpliPrep-AmpliScreen assay for DNA HBV screening. Vox Sang 2004; 87 (suppl 3): Iwamoto M, Jernigan DB, Kao J. i wsp. A molecular analysisis of pres/susrface and pre-core.core promoter genes of hepatitis B virus in chronic hepatitis C patients with occult HBV infection. J Med Virol 2002; 68: Yamamoto K, Horkita M, Tsuda F. i wsp. Naturally occurring escape mutants of hepatitis B virus with various mutations in the S gene in carriers seropositive for antibody to hepatitis B surface antigen. J Virol 1994; 68: Kleinman SH, Kuhmns MC, Todd DS i wsp. Frequency of DNA HBV detection in US blood donors testing positive for anti-hbc: implications for transfusion transmission and donor screening. Transfusion 2003; 43: Mosley JW, Stevens CE, Aach RD i wsp. Donor screening for antibody to hepatitids B core antigen and hepatitis B virus infection in transfusion recipients. Transfusion 1995; 35: Dreier J, Kroger M, Diekmann J. i wsp. Low-level viraemia of hepatitis B virus in an anti-hbc- and anti-hbs-positive blood donor. Transfus Med 2004; 14: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres do korespondencji: Prof. dr hab. med. Ewa Brojer Instytut Hematologii i Transfuzzjologii ul. Chocimska Warszawa ebrojer@ihit.waw.pl