diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostic 2010 Volume 46 Number 4 383-389 Praca oryginalna Original Article Użyteczność aparatu CellaVision DM8 w ocenie obrazu wzoru odsetkowego krwinek białych u pacjentów onkologicznych Usefulness of CellaVision DM8 for evaluation of the white blood cell differential in cancer patients Barbara Masłyk 1, Regina Deja 1, Joanna Gliwińska 1, Zofia Kołosza 2, Elżbieta Nowara 3 1 Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, 2 Zakład Epidemiologii Nowotworów, 3 Klinika Onkologii Klinicznej i Doświadczalnej, Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Gliwice Streszczenie Cel: Celem pracy było sprawdzenie użyteczności aparatu CellaVision DM8 w ocenie wzoru odsetkowego krwinek białych. CellaVision DM8 jest urządzeniem umożliwiającym automatyczną analizę obrazu rozmazu krwi obwodowej. Metody: Analizy porównawczej wzoru odsetkowego krwinek białych dokonano dla dwóch metod odniesienia: rozmazu mikroskopowego oraz aparatu hematologicznego Sysmex XE-2100. Do oceny porównania metod wykorzystano analizę korelacji i regresji prostoliniowej, a dla oceny istotności różnic pomiędzy wynikami test t-studenta; z wykorzystaniem programu statystycznego STATISTICA wersja 7.1. Dla porównania zgodności pomiarów wykonanych analizowanymi metodami użyto graficznej techniki wg. Bland i Altman. Wyniki: System CellaVision DM8 jest urządzeniem pomocnym w ocenie wzoru odsetkowego krwinek białych, z dobrą korelacją pomiędzy wynikami otrzymanymi z użyciem aparatu hematologicznego Sysmex XE-2100 oraz różnicowaniem mikroskopowym. System CellaVision DM8 zapewnia uzyskanie wstępnego wyniku leukogramu, jego archiwizację oraz dostęp do wykonanych przez urządzenie zdjęć komórek krwi kilku operatorom jednocześnie. Summary Aim: The aim of study was checking usefulness of CellaVision DM8 for evaluation of the white blood cell differential. CellaVision DM8 automatically performs a preliminary white blood cell differential count of peripheral blood smears. Methods: In this study, we compare following methods: automated Sysmex XE-2100, manual microscopy and CellaVision DM8 differential count. Linear regression analysis and t-student test were used to compare these methods, using STATISTICA software (version 7.1). The Bland and Altman technique was used to compare agreement of the results obtained by analyzed methods. Results: The CellaVision DM8 is a device helpful for evaluation of the white blood cell differential, with a good correlation between results received by manual and Sysmex XE-2100 differential count. System CellaVision DM8 ensures faster analisys access to the images and possibility to review to other persons simultaneously. Słowa kluczowe: diagnostyka hematologiczna, różnicowanie krwinek białych, korelacja, CellaVision DM8 Keywords: hematological diagnostics, white blood cell differential, correlation, CellaVision DM8 Wstęp Różnicowanie krwinek białych w rozmazie krwi obwodowej jest podstawowym testem wykorzystywanym przez klinicystów u pacjentów z chorobą nowotworową. Wykorzystywane rutynowo w laboratoriach analitycznych analizatory hema - tologiczne umożliwiają różnicowanie krwinek białych na 5 (lub 6) subpopulacji: neutrofile, limfocyty, monocyty, eozynofile i bazofile, (komórki LUC). Jednakże, szczególnie u pa - cjentów onkologicznych, u chorych często pojawiają się komórki nieprawidłowe i patologiczne np. limfocyty wykazujące różne nieprawidłowości, komórki blastyczne, czy niedoj rzałe granulocyty. Obraz różnicowania otrzymywany 383
Użyteczność aparatu CellaVisionTMDM8 w ocenie obrazu wzoru odsetkowego krwinek białych u pacjentów onkologicznych w takich przy padkach z aparatu hematologicznego nie jest w pełni zadowalający, zawiera bowiem ograniczone informacje o morfologii komórek nieprawidłowych. Wynik leukogramu pochodzący z aparatu hematologicznego zostaje oflagowany i niezbędna jest weryfikacja różnicowania za pomocą metody manualnej mikroskopowej. Weryfikacji takiej dokonać mogą pracownicy z dużym doświadczeniem, rutynowo oceniający rozmazy krwi obwodowej. Różnicowanie mikroskopowe jest procesem zarówno czaso-, jak i pracochłonnym. Niejednokrotnie wydłuża to znacznie czas oczekiwania na wynik rozmazu mikroskopowego, co może utrudnić klinicystom podjęcie decyzji terapeutycznych. Dlatego od kilku lat na rynek diagnostyczny wprowadzane są urządzenia umożliwiające automatyczną analizę obrazu rozmazu krwi obwodowej. Przykładem takiego aparatu jest CellaVision Diffmaster8 (CellaVision DM8; CellaVisionAB, Lund, Sweden). Analizatory, wyposażone w zautomatyzowane, wysokiej klasy mikroskopy lokalizują leukocyty w preparacie (slajdzie) i dokonują wstępnej klasyfikacji krwinek białych oraz wstępnej charakterystyki erytrocytów i płytek krwi. Zdjęcia komórek krwi prezentowane są operatorowi na ekranie monitora do weryfikacji i bezpośredniej autoryzacji lub reklasyfikacji. Aparat dokonuje wstępnej klasyfikacji krwinek białych, umożliwiając jednocześ nie ich weryfikację i reklasyfikację przez operatora systemu, a wy - niki oraz zdjęcia komórek można przeglądać w do wolnym, dogodnym dla użytkownika czasie. Systemy wypo sażone są w specjalistyczne oprogramowania umożliwiające przesyłanie wyników i obrazów komórek na od ległość, w tym do innych szpitali zapewniających możliwość konsultacji trudnych przypadków. Może to być początkiem rozwoju tzw. telehematologii. Celem przedstawianej pracy było sprawdzenie użyteczności aparatu CellaVision DM8 w ocenie różnicowania krwinek białych w rozmazie krwi obwodowej. Materiał i metody Próbki krwi, pacjenci Badaniem objęto 92 próbki krwi pacjentów leczonych w Centrum Onkologii Instytucie, o/gliwice (Klinice Onkologii Klinicznej i Doświadczalnej), u których w oznaczeniu morfologii krwi stwierdzono obecność komórek nieprawidłowych. Do analiz wykorzystano krew pełną pobieraną do rutynowych badań hematologicznych. Krew pobierano w standardowych warunkach; bezpośrednio do plastikowych, próżniowych, sterylnych probówek (Becton Dickinson), o pojemności 2 ml, zawierających K2EDTA jako antykoagulant. Oznaczenia morfologii oraz preparaty rozmazu krwi obwodowej wykonano do dwóch godzin od chwili pobrania. Aparat hematologiczny Oznaczenia morfologii krwi obwodowej wykonano na analizatorze hematologicznym Sysmex XE-2100, wykorzystywanym w rutynowej pracy laboratoryjnej. Analizator oprócz podstawowych oznaczeń liczby krwinek czerwonych (Rbc), białych (Wbc) oraz płytek krwi (Plt) różnicuje leukocyty na 5 głównych subpopulacji: neutrofile (neut), limfocyty (lymph), monocyty (mono), eozynofile (eo) i bazofile (baso). Ponadto dokonuje zliczania subpopulacji niedojrzałych granulocytów (IG) zawierającej metamielocyty, mielocyty oraz promielocyty; jako parametr badawczy. Granulocyty obojętnochłonne o jądrze pałeczkowatym (band) nie są zliczane jako od dziel - na subpopulacja, lecz włączane do klasy neutrofili. Do różnicowania leukocytów na poszczególne podklasy wykorzystywana jest metoda fluorescencyjnej cytometrii przepływowej; metoda barwienia fluorescencyjnego w połączeniu z intensy - wno ścią rozproszenia światła. Wiązka światła emitowana przez laser półprzewodnikowy prześwietla próbkę, co umo ż - li wia różnicowanie komórek analizując trzy typy sygnałów: rozproszone światło czołowe (objętość komórki), rozproszo - ne światło boczne (zawartość komórki: jądro i ziarnistości) oraz boczną fluorescencję (zawartość kwasów nukleinowych w komórce). Metoda fluorescencyjnej cytometrii przepływowej pozwala na przedstawienie bardzo precyzyjnego obrazu każdej wykrytej komórki [5]. W przypadku obecności nieprawidłowych komórek we krwi analizator odpowiednio oflagowuje wynik badania. Bezpośrednio po automatycznej analizie morfologii krwi obwodowej patologiczne próbki krwi, zgodnie z rutynową procedurą stosowaną w laboratorium, przekazane zostają do weryfikacji mikroskopowej. Różnicowanie mikroskopowe We wszystkich próbkach włączonych do badania wstępnie rozpoznano obecność niedojrzałych granulocytów, nieprawidłowych limfocytów, komórek blastycznych i/lub zwiększonej liczby poszczególnych subpopulacji. Rozmazy krwi obwodowej wykonano w standardowych warunkach, używając barwienia metodą May-Grünwald Giemsa. Z każdej próbki wykonano równocześnie dwa rozmazy: pierwszy do oceny mikroskopowej, drugi do oceny wzoru odsetkowego krwinek białych z użyciem aparatu CellaVision DM8. We wszystkich preparatach, niezależnie od metody różnicowania, weryfikowano 100 komórek. Oceny wzoru odsetkowego krwinek białych, porównywanymi metodami, dokonywał ten sam operator. Oceny rozmazów mikroskopowych dokonano przy użyciu mikroskopu świetlnego Olympus CX41. CellaVision DM8 Aparat CellaVision DM8 automatycznie wstępnie różnicuje krwinki białe w rozmazie krwi obwodowej. Preparaty (slajdy) umieszczane są w specjalnych magazynkach po 8 slajdów, a wydajność aparatu to klasyfikacja do 20 slajdów/godzinę. System wyposażony jest w zautomatyzowany mikroskop, który lokalizuje potencjalne leukocyty w preparacie, a na - stęp nie za pomocą cyfrowej kamery wykonuje wysokiej rozdzielczości zdjęcia poszczególnych komórek. Standardem do różnicowania jest 100 obrazów komórek, które oceniane są z wykorzystaniem specjalnego oprogramowania. System posiada tzw. bibliotekę komórek referencyjnych dla po - szcze gólnych subpopulacji, a także agregatów płytkowych, 384
B. Masłyk i inni cieni komórek i artefaktów. Obrazy komórek przedstawiane są operatorowi na ekranie monitora w kolejnych subpopulacjach, tzw. galeriach komórek. Użytkownik może analizować komórki w kilku opcjach przeglądów: przeglądzie zawierającym wszystkie zidentyfikowane komórki, przeglądzie wybranych kilku subpopulacji, jak również może powiększyć każdą indywidualną komórkę i porównać z zawartymi w systemie komórkami referencyjnymi. Operator może zaakceptować sugerowaną przez system klasyfikację lub dokonać reklasyfikacji przemieszczając poszczególne komórki do innych klas. Po weryfikacji preparatu operator dokonuje autoryzacji wyniku, czyli podpisania preparatu. Podpisanie preparatu następuje po weryfikacji wszystkich prezentowanych klas komórek, możliwe jest także dodanie przez użytkownika odpowiednich komentarzy do wyniku leukogramu. Następnie wynik transmitowany jest poprzez Laboratoryjny System Informatyczny do odbiorcy. Wyniki różnicowania prezentowane są w postaci zdjęć, udziału procentowego i wartości liczbowych zliczonych typów komórek oraz nasilenia występowania określonej patologii. Metody Różnicowania leukocytów w preparatach krwi obwodowej dokonano w tym samym czasie, w następującej kolejności: analiza na analizatorze hematologicznym, rozmaz mikroskopowy oraz różnicowanie na aparacie CellaVision DM8. Porównanie metod obejmowało dwa etapy: 1. porównanie metody różnicowania CellaVision DM8 z refe rencyjną metodą mikroskopową w zakresie następujących subpopulacji: neutrofile, niedojrzałe granulocyty, limfocyty, monocyty, eozynofile, bazofile, atypowe limfocyty oraz komórki blastyczne 2. porównanie metody różnicowania CellaVision DM8 z metodą fluorescencyjnej cytometrii przepływowej Sysmex XE-2100 w zakresie subpopulacji: neutrofile, niedojrzałe granulocyty, limfocyty, monocyty, eozynofile oraz bazofile Opracowanie statystyczne wykonano z wykorzystaniem programu STATISTICA (wersja 7.1). Do oceny zależności pomiędzy wynikami analizowanych metod użyto analizy korelacji i regresji prostoliniowej. Istotność różnic pomiędzy otrzymanymi wynikami oceniono wykorzystując test t-studenta dla prób zależnych. Do porównania zgodności pomiarów pomiędzy metodami użyto graficznej metody Bland i Altman, przyjmując średnią różnic+/-2sd jako 95% zakres zgodności dla poszczególnych pomiarów. Wyniki: 1. Porównanie wyników różnicowania CellaVision DM8 z metodą mikroskopową Wyniki analizy korelacji i regresji prostoliniowej oraz wyniki testu t-studenta dla poszczególnych subpopulacji krwinek białych zebrano w Tabeli I. W przypadku aparatu CellaVision DM8 włączone do analizy poszczególne podklasy leukocytów podlegały wcześniejszej weryfikacji i reklasyfikacji przez operatora systemu. Nieistotne statystycznie różnice w średniej wartości zliczeń komórek oznaczanych podklas leukocytów otrzymano w zakresie niedojrzałych granulocytów, limfocytów, eozynofili oraz komórek blastycznych. Dla pozostałych subpopulacji krwinek białych wykazano istotne różnice średnich z pomiarów; przy czym niższą wartość średnią w różnicowaniu mikroskopowym niż Cella- Vision DM8 otrzymano dla neutrofili, bazofili i atypowych limfocytów, wyższą natomiast w zakresie monocytów. Zaobserwowano dobrą zgodność wyników otrzymanych automatyczną metodą CellaVision DM8 oraz referencyjną metodą mikroskopową dla trzech głównych subpopulacji leukocytów: neutrofili, limfocytów i eozynofili. Nieco niższe wartości współczynnika korelacji uzyskano dla monocytów oraz niedojrzałych granulocytów. Natomiast znacząco niższe dla bazofili, atypowych limfocytów i komórek blastycznych. W kolejnym etapie pracy do oceny porównania metod zastosowano graficzną analizę Bland-Altman. Wyniki uzyska ne tą techniką przedstawiono na odpowiednich wykresach [ryc. 1, 2, 3, 4]. Pozostałe oceniane subpopulacje leukocytów nie zostały zaprezentowane obrazowo z uwagi na niewielką liczbę zliczanych komórek. Średnia różnic zliczeń komórek pomiędzy metodami automatyczną CellaVision Tabela I. Korelacja wyników oznaczeń otrzymanych z użyciem aparatu CellaVisionTMDM8 vs różnicowania mikroskopowego. Wbc x mikroskop x CellaVision p = (test t) równanie regresji r = p = NEUT 47,97 50,47 0,0003 y = 0,3224 + 1,0455*x 0,9573 0,0000 IG 2,43 2,05 NS y = 0,2266 + 0,7493*x 0,8773 0,0000 LYMPH 28,40 27,41 NS y = -2,5604 + 1,0553*x 0,9530 0,0000 MONO 14,36 11,47 0,0000 y = 0,3472 + 0,7745*x 0,7465 0,0000 EO 4,79 4,45 NS y = 0,0782 + 0,9127*x 0,9672 0,0000 BASO 0,50 0,89 0,0016 y = 0,6118 + 0,5481*x 0,3600 0,0004 ATYP LYMPH 1,22 2,62 0,0000 y = 1,6978 + 0,7777*x 0,5338 0,0000 BLAST 0,38 0,55 NS y = 0,3856 + 0,4206*x 0,4479 0,0000 385
Użyteczność aparatu CellaVisionTMDM8 w ocenie obrazu wzoru odsetkowego krwinek białych u pacjentów onkologicznych Rycina 1. Analiza porównawcza wyników neutrofili (%) otrzymanych z uży - ciem aparatu CellaVision DM8 vs różnicowania mikroskopowego (wg Bland- Altman). Rycina 3. Analiza porównawcza wyników monocytów (%) otrzymanych z uży - ciem aparatu CellaVision DM8 vs różnicowania mikroskopowego (wg Bland- Altman) Rycina 2. Analiza porównawcza wyników limfocytów (%) otrzymanych z uży - ciem aparatu CellaVision DM8 vs różnicowania mikroskopowego (wg Bland- Altman) Rycina 4. Porównanie wyników eozynofili (%) otrzymanych z użyciem aparatu CellaVision DM8 vs różnicowania mikroskopowego (wg Bland-Altman) DM8 i mikroskopową wynosi: -2,51 dla neutrofili; 0,99 dla limfocytów; 2,89 dla monocytów; 0,34 dla eozynofili; 0,39 dla bazofili; 0,38 dla niedojrzałych granulocytów; -1,43 dla atypowych limfocytów oraz -0,17 dla komórek blastycznych. Przedstawione różnice w ilości zliczanych krwinek białych w poszczególnych subpopulacjach, względem średniej wartości wyników otrzymanych analizowanymi metodami, wskazują na zgodność większości wyników otrzymanych obydwoma metodami. 2. Porównanie wyników różnicowania CellaVision DM8 z metodą fluorescencyjnej cytometrii przepływowej Sysmex XE-2100 Wyniki analizy korelacji i regresji prostoliniowej oraz testu t-studenta dla poszczególnych subpopulacji leukocytów ozna czanych z użyciem aparatu CellaVision DM8 oraz Sysmex XE-2100 zebrano w Tabeli II. W przypadku aparatu CellaVision DM8 włączone do analizy podklasy leukocytów podlegały wcześniejszej weryfikacji i reklasyfikacji przez operatora. Nieistotne statystycznie różnice w średniej wartości zliczeń komórek oznaczanych podklas leukocytów otrzy mano w zakresie dwóch subpopulacji: limfocytów i eozynofili. Dla pozostałych podklas krwinek białych wykazano istotne różnice średnich z pomiarów. Niższą wartość średnią różnicowania na aparacie hematologicznym niż CellaVision DM8 otrzymano dla neutrofili i bazofili, wyższą natomiast w zakresie niedojrzałych granulocytów oraz monocytów. Podobnie, jak w przypadku metod ocenianych w pierwszym etapie badania, dobrą współzależność wyników odnotowano także pomiędzy automatyczną metodą CellaVision DM8 a metodą fluorescencyjnej cytometrii przepływowej dla głównych subpopulacji krwinek białych: neutrofili, limfocytów i eozynofili. Nieznacznie gorszą korelację wykazano dla monocytów, a najniższą zgodność wyników pomiędzy metodami dla subpopulacji bazofili. Wysoka wartość współczynnika korelacji dla głównych subpopulacji krwinek białych (neutrofile, limfocyty, eozynofile) wskazuje na silną liniową 386
B. Masłyk i inni Tabela II. Korelacja wyników oznaczeń otrzymanych z użyciem aparatu CellaVision DM8 vs Sysmex XE-2100. Wbc x XE-2100 x CellaVision p = (test t) równanie regresji r = p = NEUT 46,13 50,47 0,0000 y = 1,5227 + 1,0611*x 0,9634 0,0000 IG 2,96 2,05 0,0000 y = -0,0874 + 0,7214*x 0,9222 0,0000 LYMPH 28,29 27,41 NS y = -0,8807 + 0,9999*x 0,9510 0,0000 MONO 17,30 11,47 0,0000 y = 0,0611 + 0,6592*x 0,7731 0,0000 EO 4,64 4,45 NS y = -0,0422 + 0,969*x 0,9813 0,0000 BASO 0,63 0,89 0,0491 y = 0,6465 + 0,3778*x 0,2291 0,0280 zależność pomiędzy wartościami zliczeń uzyskanymi obydwoma metodami. Zadowalającą, lecz nieco niższą wartość współczynnika korelacji uzyskano dla subpopulacji monocytów. Niższy natomiast współczynnik regresji wyznaczono dla podklasy bazofili, lecz znaczący wpływ na taki wynik statystyczny może mieć niewielka liczba komórek różnicowanych w tej subpopulacji. Uzyskany natomiast wysoki współczynnik korelacji dla niedojrzałych granulocytów świadczy o wysokiej korelacji tych oznaczeń wykonywanych obydwoma metodami automatycznymi. W kolejnym etapie pracy do oceny porównania metod zastosowano graficzną analizę Bland-Altman. Uzyskane wyniki przedstawiono na odpowiednich wykresach [ryc. 5, 6, 7, 8]. Pozostałe oceniane subpopulacje leukocytów nie zostały Rycina 5. Analiza porównawcza wyników neutrofili (%) otrzymanych z uży - ciem aparatu CellaVision DM8 vs Sysmex XE-2100 (wg Bland-Altman). Rycina 7. Analiza porównawcza wyników monocytów (%) otrzymanych z uży - ciem aparatu CellaVision DM8 vs Sysmex XE-2100 (wg Bland-Altman). Rycina 6. Analiza porównawcza wyników neutrofili (%) otrzymanych z uży - ciem aparatu CellaVision DM8 vs Sysmex XE-2100 (wg Bland-Altman). Rycina 8. Porównanie wyników eozynofili (%) otrzymanych z użyciem aparatu CellaVision DM8 vs Sysmex XE-2100 (wg Bland-Altman). 387
Użyteczność aparatu CellaVisionTMDM8 w ocenie obrazu wzoru odsetkowego krwinek białych u pacjentów onkologicznych zaprezentowane obrazowo z uwagi na niewielką liczbę zliczanych komórek. Średnia różnic pomiarów pomiędzy metodami automatycznymi Sysmex XE-2100 i CellaVision DM8 wynosi: -4,34 dla neutrofili; 0,88 dla limfocytów; 5,84 dla monocytów; 0,19 dla eozynofili; -0,25 dla bazofili oraz 0,91 dla niedojrzałych granulocytów. Różnice w wartościach oznaczeń pomiędzy analizowanymi metodami są nieznacz - ne i porównywalne z tymi, jakie uzyskano pomiędzy metodami mikroskopową vs CellaVision DM8. Również otrzymane w tym etapie badania różnice w ilości zliczanych krwinek białych w poszczególnych subpopulacjach, względem średniej wartości wyników otrzymanych analizowanymi metodami, wskazują na zgodność większości wyników otrzymanych obydwoma metodami. Dyskusja Ocena wzoru odsetkowego krwinek białych jest klinicznie ważnym, czułym w wykrywaniu patologicznych zmian doty - czą cych komórek krwi obwodowej, a dodatkowo wyróż nia - jącym się niewielkimi kosztami wykonania, stąd często zlecanym testem laboratoryjnym [2, 4]. Pomimo dynamicznego rozwoju nowoczesnych technik biologii molekularnej, cytogenetyki i immunologii ocena morfologii komórek pozostaje pierwszym krokiem do szybkiej, wstępnej diagnozy chorych. Wymaga to wykonania wysokiej jakości różnicowania leukocytów krwi obwodowej dla dokładnej oceny morfologii komórek [3]. Automatyczne analizatory hematologiczne dostarczają wielu użytecznych informacji dotyczących morfologii krwi; zarówno liczbowych, jak i obrazowych (histogramy, skattergramy) i wykonują niezawodne różnicowanie leukocytów dla próbek prawidłowych, stąd jest to niezwykle uży - teczny skryningowy test z wysoką precyzją i dokładnością rozdziału. Jednakże próbki krwi obwodowej chorych zawierające niedojrzałe lub patologiczne komórki nadal wymagają różnicowania mikroskopowego [1, 2, 4]. Mimo znaczącego postępu w metodyce stosowanej w analizatorach hematologicznych, brak jak dotąd znaczącej poprawy w automatyzacji oceny rozmazu krwi obwodowej [3]. Niezależnie od aparatu około 10% [1, 2], 15% [3], a nawet 28% [4] wyników różnicowania leukocytów zostaje oflagowanych w aparacie hematologicznym i wymaga weryfikacji mikroskopowej. W naszym laboratorium oznaczenia morfologii krwi wykonywane są na aparacie Sysmex XE-2100, a oflagowane subpopulacje leukocytów wahają się w granicach 15-20%. W takich przypadkach, zgodnie z ustaloną procedurą stosowaną w laboratorium, próbki zostają zakwalifikowane do oceny mikro - skopowej. Zatem, pomimo rutynowo wykorzystywanego automatycznego różnicowania komórek w pracowniach hematologicznych, istotną część pracy stanowi weryfikacja mikroskopowa preparatów patologicznych. Ocena rozmazów mikroskopowych wymaga znacznego wkładu czasu oraz wykwalifikowanego personelu [1, 3, 8]. Analizowane próbki mogą ponadto stwarzać trudności w różnicowaniu ze względu na nietypowe, nieprawidłowe cechy, a poszczególne oceniane komórki niełatwo jest odzyskać w celu ponownej weryfikacji czy ewentualnej konsultacji [4, 7]. Zatem wymogi standaryzacji oraz skrócenia czasu oczekiwania na wynik leukogramu spowodowały poszukiwania nowych rozwiązań metodycznych [6, 7]. Jednym z takich rozwiązań jest zautomatyzowana metoda oceny komórek rozmazu krwi obwodowej, oznaczenia dotychczas wykonywanego manualnie, z wykorzystaniem systemu CellaVision DM8. CellaVision DM8 jest aparatem automatycznie dokonu ją - cym oceny obrazu rozmazu mikroskopowego krwi obwodowej. Wyposażony w wysokiej klasy mikroskop oraz kamerę cyfrową lokalizuje komórki na slajdzie, wykonuje ich zdjęcia, a dzięki wyrafinowanemu oprogramowaniu wstępnie klasyfikuje krwinki białe do odpowiednich subpopulacji. Do identyfikacji komórek oprogramowanie używa wzorca bazującego na licznych parametrach tj. wielkość i gęstość jądra, ziarnistość i wielkość komórek, ilość cytoplazmy czy współczynnik cytoplazma/jądro [9]. Komórki następnie zostają przedstawione operatorowi na ekranie do wizualnej weryfikacji. Operator może zatwierdzić sugerowaną klasyfikację, bądź dokonać reklasyfikacji poszczególnych komórek. Różne klasy komórek mogą być przeglądane razem, w kolejnych subpopulacjach (galeriach) lub też poszczególne komórki mogą być indywidualnie powiększone i przeglądane z wykorzystaniem wirtualnego mikroskopu [6, 9]. Operator może dla porównania krwinek użyć biblioteki komórek referencyjnych w przypadku komórek trudnych do klasyfikacji, jak również może samodzielnie dodawać obrazy do zbioru biblioteki jako własne komórki referencyjne. W celu zatwierdzenia wyniku różnicowania konieczna jest weryfikacja wszystkich kategorii komórek. W przedstawionym opracowaniu porównania metod Cella- Vision DM8 i referencyjnej metody mikroskopowej oraz CellaVision DM8 i Sysmex XE-2100 dokonano z użyciem analizy korelacji i regresji prostoliniowej. W wyniku analizy przeprowadzonej na 92 losowo wybranych próbkach krwi (próbkach po wstępnej ocenie na aparacie hematologicznym i zakwalifikowanych do weryfikacji mikroskopowej) najwyższe współczynniki korelacji (r=0,95-0,98) otrzymano dla subpopulacji neutrofili, limfocytów i eozynofli; niezależnie od metody odniesienia. Stanowi to potwierdzenie bardzo dużej zgodności wyników zliczeń komórek tych subpopulacji otrzymanych analizowanymi metodami. Podobnie wysokie zależności wykazali inni autorzy [1, 2, 3, 4] wykonując porównania CellaVision DM96 z referencyjną metodą manualną. Natomiast przy porównaniu dwóch metod automatycznych CellaVision DM96 i Sysmex XE-2100 po dob - ną wysoką współzależność pomiarów uzyskali Cornet oraz Linssen i wsp. oraz Van Gelder z zespołem [3, 5, 9]. Przy porównaniu wyników różnicowania CellaVisionTMDM8 z referencyjną metodą mikroskopową współczynniki regresji dla niedojrzałych granulocytów i monocytów były niższe i wynosiły r=0,88 i r=0,75 oraz nieznacznie wyższe w metodzie CellaVision DM8 vs Sysmex XE-2100 r=0,92 i r=0,77, odpowiednio. Podobne spostrzeżenia mieli inni badacze 388
B. Masłyk i inni [1, 3, 4, 9], a obserwowana niższa korelacja powyższych wyników najprawdopodobniej spowodowana jest heterogennym rozkładem monocytów w preparatach krwi obwodowej, co jest bardzo dobrze znanym problemem samej metody wykonania rozmazów. W konsekwencji, zarówno sama liczba zliczanych krwinek, jak i miejsca obserwacji komórek krwi dla metody mikroskopowej i automatycznej mogą się różnić, co w efekcie przyczynia się do występowania różnic w liczbie zliczanych monocytów [3]. Pozostałe włączone do badania subpopulacje leukocytów, zawierające tylko nieliczne zliczane komórki nie wykazały tak dobrej korelacji pomiędzy ocenianymi metodami. W porównaniu metod CellaVision DM8 oraz metody mikroskopowej współ czynnik regresji dla atypowych limfocytów wynosił r=0,53, a dla komórek blastycznych r=0,45, co również zwią zane jest prawdopodobnie z niewielką liczbą tych komórek w ocenianych próbkach. Najniższą wartość współczynnika korelacji, zatem najniższą współzależność wyników stwierdzono dla subpopulacji bazofili (r=0,36 i r=0,23), niezależnie od porównywanych metod. Podobne wyniki uzyskali inni badacze, gdzie współczynniki korelacji dla bazofili pomiędzy metodami automatyczną i manualną były niskie i wahały się w zakresie r=0,05-0,57 [1, 2, 3, 4, 9]. Oznaczone tak niskie współczynniki korelacji dla bazofili prawdopodobnie spowodowane są tym, że tylko w nielicznych próbkach obecne były granulocyty zasadochłonne, a tym samym obliczenia statystyczne dla takich niewielkich liczebnie grup, nie są w pełni zadowalające [1, 2]. Wskaźniki różnicowania krwinek białych są ważnym diagnostycznym kryterium w wielu chorobach, stąd niezmiernie istotną cechą przedstawianego systemu jest możliwość prze dyskutowania trudnych przypadków i skonsultowania z innymi specjalistami. CellaVision DM8 automatyzuje pracę tradycyjnie wykonywaną przez personel laboratorium używając mikroskopu, zapewnia przegląd wszystkich komórek jednocześnie dla możliwości szybkiego potwierdzenia, a automatyczna lokalizacja i wstępna klasyfikacja redukują subiektywną identyfikację komórek i poprawiają jakość wyniku. System zapewnia ponadto możliwość wglądu w archiwalne wyniki pacjenta oraz znacząco redukuje czas wykonania rutynowych testów hematologicznych, szczególnie w przypadku próbek leukopenicznych. Wnioski Wstępne wyniki oceny automatycznego systemu różnicowania rozmazów krwi obwodowej, choć z pewnością wymagają jeszcze ustalenia dodatkowych wewnątrzlaboratoryjnych kryteriów oceny komórek w rutynowej pracy w oparciu o protokół H20A2 CLSI/NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute), a także ustawicznego szkolenia personelu obsługującego System oraz poszerzonej dalszej weryfikacji, są obiecujące, a System CellaVision DM8 wydaje się być urządzeniem pomocnym we wstępnej ocenie wzoru odsetkowego krwinek białych, z dobrą korelacją pomiędzy wynikami otrzymanymi z użyciem aparatu hematologicznego Sysmex XE-2100 oraz rozmazem mikroskopowym. Istotną cechą aparatu jest możliwość reklasyfikacji komórek jednocześnie przez zespół operatorów, co redukuje ryzyko subiektywnej identyfikacji komórek w preparatach trudnych oraz zapewnia możliwość oceny obrazu różnicowanych krwinek białych w dowolnym czasie, ułatwiając tym samym konsultacje indywidualnych preparatów. Dokonując klasyfikacji krwinek białych z wykorzystaniem systemu CellaVision DM8 uzyskaliśmy w krótkim czasie wstępny wynik leukogramu, dostęp do wykonanych przez urządzenie zdjęć komórek krwi dla kilku operatorom jednocześnie oraz dostęp do historii rozmazów pacjenta Nadal jednak referencyjną metodą badania rozmazu krwi obwodowej, która oprócz oceny ilościowej i jakościowej subpopulacji krwinek białych obejmuje dodatkową ocenę jakościową krwinek czerwonych i płytek krwi, pozostaje badanie mikroskopowe, szczególnie w przypadkach występowania komórek patologicznych. Piśmiennictwo 1. Briggs C, Longair I, Slavik M i wsp. Can automated blood film analysis replace the manual differential? An evaluation of the CellaVision DM96 automated image analysis system. Int J Lab Hematol 2009; 31: 48-60. 2. Ceelie H, Dinkelaar RB, van Gelder W. Examination of peripheral blood films using automated microscopy; evaluation of Diffmaster Octavia and Cellavision DM96. J Clin Pathol 2007; 60: 72-79. 3. Cornet E, Perol JP, Troussard X. Performance evaluation and relevance of the CellaVision DM96 system in routine analysis and in patients with malignant hematological diseases. Int J Lab Hematol 2008; 30: 536-542. 4. Kratz A, Bengtsson HI, Casey JE i wsp. Performance evaluation of the CellaVision DM96 system: WBC differentials by automated digital image analysis supported by an artificial neural network. Am J Clin Pathol 2005; 124: 770-781. 5. Linssen J, Jennissen V, Hildmann J i wsp. Identification and quantification of high fluorescence-stained lymphocytes as antibody synthesizing/secreting cells using the automated routine hematology analyzer XE-2100. Cytometry B Clin Cytom 2007; 72: 157-166. 6. Riley RS, Ben-Ezra JM, Massey D i wsp. The virtual blood film. Clin Lab Med 2002; 22: 317-345. 7. Swolin B, Simonsson P, Backman S i wsp. Differential counting of blood leukocytes using automated microscopy and a decision support system based on artificial neural networks-evaluation of DiffMaster Octavia. Clin Lab Haematol 2003; 25: 139-147. 8. Tatsumi N, Pierre RV. Automated image processing. Past, present, and future of blood cell morphology identification. Clin Lab Med 2002; 22: 299-315. 9. Van Gelder W, Ceelie H. Automated blood cell analysis: Virtual reality? Proceeding of the Sysmex European Symposium 2005:94-101. Adres do korespondencji: Barbara Masłyk Centrum Onkologii Instytut, O/Gliwice ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15, 44-101 Gliwice Tel. (32) 278 94 39 e-mail bmaslyk@io.gliwice.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: 2011-01-24) (Praca przekazana do opublikowania: 2011-02-10) 389