Autoreferat (opis dorobku i osiągnięć naukowych) Polimorfizm wybranych genów i możliwości jego wykorzystania w hodowli owiec Zakład Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Katedra Nauk o Zwierzętach Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy Bydgoszcz, 2018 rok
Spis treści 1. Życiorys naukowy...3 2. Osiągnięcie naukowe wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.)...4 2.1 Tytuł osiągnięcia naukowego...5 2.2 Wykaz oryginalnych prac twórczych wchodzących w skład osiągnięcia naukowego....5 2.3 Omówienie celu naukowego wyżej wymienionych publikacji, jak również osiągniętych wyników oraz ich ewentualnego wykorzystania...7 2.3.1 Wprowadzenie...7 2.3.2 Cel naukowy... 13 2.3.3 Materiał i metody... 13 2.3.4 Osiągnięte wyniki i ich omówienie... 15 2.3.5 Osiągnięcia wynikające z realizacji badań i możliwości ich wykorzystania... 25 3. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych... 27 3.1 Analiza molekularna wybranych populacji drobiu.... 28 3.2 Identyfikacja polimorfizmu wybranych genów oraz analiza powiązania niektórych SNP z cechami użytkowymi zwierząt gospodarskich.... 29 3.2.1 Gen białka prionowego... 29 3.2.2 Geny kandydujące związane z użytkowością mięsną owiec... 32 3.2.3 Geny białek mleka bydła... 34 3.2.4 Gen leptyny koni... 35 3.3 Badanie wpływu różnych czynników na stan i kondycję populacji bociana białego (Ciconia ciconia) w Polsce.... 36 3.4 Pozostałe prace naukowe.... 39 3.5 Piśmiennictwo wykorzystane w autoreferacie... 39 3.6 Informacja dotycząca nagród, staży naukowych oraz projektów badawczych.... 41 3.6.1 Nagrody za działalność naukowo badawczą.... 41 3.6.2 Projekty badawcze... 42 3.6.3 Staże naukowe... 43 4. Podsumowanie całkowitego dorobku naukowego... 43 5. Streszczenie najważniejszych aspektów działalności dydaktyczno-organizacyjnej.... 46 2
1. Życiorys naukowy 1.1. Dane personalne (z domu Wiśniewska) Zakład Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Katedra Nauk o Zwierzętach Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy ul. Mazowiecka 28 85-084 Bydgoszcz 1.2. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe Stopień naukowy doktora nauk rolniczych w dyscyplinie zootechnika, specjalność genetyka zwierząt Data i miejsce uzyskania stopnia naukowego: 30 września 2008 roku, Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego im. J. i J. Śniadeckich w Bydgoszczy Tytuł rozprawy doktorskiej: Polimorfizm genu białka prionowego owiec i jego związek z wybranymi cechami produkcyjnymi Promotor: prof. dr hab. Sławomir Mroczkowski Recenzenci: prof. dr hab. Marek Bednarczyk prof. dr hab. Roman Niżnikowski Rozprawa doktorska wyróżniona na wniosek obu Recenzentów uchwałą Rady Wydziału Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego im. J. i J. Śniadeckich w Bydgoszczy i nagrodzona w konkursie Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego na najlepszą pracę doktorską z zakresu zootechniki (II miejsce, 2009 rok). Tytuł zawodowy magistra inżyniera, kierunek: biotechnologia Data i miejsce uzyskania tytułu zawodowego: 29 czerwca 2004 roku, Wydział Rolniczy Akademii Techniczno-Rolniczej im. J. i J. Śniadeckich w Bydgoszczy, Tytuł pracy magisterskiej: Wykorzystanie metody RAPD-PCR do charakterystyki wybranych populacji kaczek Promotor: prof. dr hab. Marek Bednarczyk. 3
Dyplom ukończenia studiów podyplomowych w zakresie Informatyki Stosowanej Data i miejsce uzyskania dyplomu: 29 czerwca 2007 roku, Wydział Telekomunikacji i Elektrotechniki Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego im. J. i J. Śniadeckich w Bydgoszczy. 1.3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych adiunkt - od marca 2009 roku do dnia dzisiejszego Zakład Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Katedry Nauk o Zwierzętach (ówczesna Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt) Wydziału Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego im. J. i J. Śniadeckich w Bydgoszczy kierownik Pracowni Molekularnej od 2010 do 2012 roku Laboratorium Genetyki Molekularnej Wydziału Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego im. J. i J. Śniadeckich w Bydgoszczy asystent od października 2005 roku do lutego 2009 roku Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Wydziału Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego im. J. i J. Śniadeckich w Bydgoszczy 2. Osiągnięcie naukowe wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.) Osiągnięcie naukowe stanowiące podstawę do ubiegania się o stopień naukowy doktora habilitowanego stanowi cykl pięciu publikacji powiązanych tematycznie. 4
2.1 Tytuł osiągnięcia naukowego Polimorfizm wybranych genów i możliwości jego wykorzystania w hodowli owiec 2.2 Wykaz oryginalnych prac twórczych wchodzących w skład osiągnięcia naukowego. [H1] Szkudlarek-Kowalczyk M., Wiśniewska E., Milewski S., Mroczkowski S.: Prion protein gene (PRNP) polymorphism in a flock of sheep of Kamieniecka breed. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 2010, 54, 645-649. Impact Factor 2010 = 0,321; 20 punktów MNiSW 2010 Mój indywidualny wkład w powstanie pracy, szacowany na 45%, polegał na: zainicjowaniu idei naukowej, stworzeniu koncepcji badań, wiodącej roli w zaplanowaniu doświadczenia, optymalizacji metodyki analizy DNA, nadzorowaniu badań laboratoryjnych, udziale w napisaniu publikacji oraz uczestnictwie w przygotowaniu manuskryptu do druku i przeprowadzeniu przez korektę po recenzjach. [H2] Wiśniewska E., Piwczyński D., Mroczkowski S.: Microsatellite polymorphisms in the ovine prion protein gene in relation to PrP genotypes. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 2010, 54, 705-711. Impact Factor 2010 = 0,321; 20 punktów MNiSW 2010 Mój indywidualny wkład w powstanie pracy, szacowany na 85%, polegał na: zainicjowaniu idei naukowej, stworzeniu koncepcji badań, zaplanowaniu doświadczenia, opracowaniu i optymalizacji metodyki analizy DNA, współudziale w wykonaniu badań laboratoryjnych, nadzorowaniu części badań laboratoryjnych, przygotowaniu bazy danych do analizy statystycznej, statystycznym opracowaniu części wyników analiz molekularnych, interpretacji uzyskanych wyników, napisaniu publikacji, przygotowaniu manuskryptu do druku, przeprowadzeniu publikacji przez korektę po recenzjach, pozyskaniu części środków finansowych na przeprowadzenie doświadczenia, pełnieniu funkcji autora korespondencyjnego. 5
[H3] Szkudlarek-Kowalczyk M., Wiśniewska E., Mroczkowski S.: Polymorphism of calpastatin gene in sheep. Journal of Central European Agriculture, 2011, 12, 3, 425-432. 8 punktów MNiSW 2011 Mój indywidualny wkład w powstanie pracy, szacowany na 45%, polegał na: zainicjowaniu idei naukowej, stworzeniu koncepcji badań, wiodącej roli w zaplanowaniu doświadczenia, optymalizacji metodyki analizy DNA, nadzorowaniu badań laboratoryjnych, udziale w napisaniu publikacji oraz uczestnictwie w przygotowaniu manuskryptu do druku i przeprowadzeniu przez korektę po recenzjach. [H4] Grochowska E., Borys B., Grześkowiak E., Mroczkowski S.: Effect of the calpain small subunit 1 (CAPNS1) gene polymorphism on meat quality traits in sheep. Small Ruminant Research 2017, 150, 15-21. Impact Factor 2016 = 0,947; 30 punktów MNiSW 2016 Mój indywidualny wkład w powstanie pracy, szacowany na 70%, polegał na: zainicjowaniu idei naukowej, stworzeniu koncepcji badań, wiodącej roli w zaplanowaniu doświadczenia, opracowaniu i optymalizacji metodyk analizy DNA, przeprowadzeniu badań laboratoryjnych z zakresu genetyki molekularnej, przygotowaniu bazy danych do analizy statystycznej, opracowaniu statystycznym wyników doświadczenia, interpretacji uzyskanych wyników, napisaniu pracy w j. angielskim, przygotowaniu manuskryptu do druku, przeprowadzeniu publikacji przez korektę po recenzjach, pozyskaniu środków finansowych na badania, napisaniu i kierowaniu projektem badawczym własnym NCN, w ramach którego powstała w/w praca (N N311 521440), pełnieniu funkcji autora korespondencyjnego. [H5] Grochowska E., Borys B., Janiszewski P., Knapik J., Mroczkowski S.: Effect of the IGF-I gene polymorphism on growth, body size, carcass and meat quality traits in Coloured Polish Merino sheep. Archives Animal Breeding 2017, 60, 161-173. Impact Factor 2016 = 0,389; 20 punktów MNiSW 2016 6
Mój indywidualny wkład w powstanie pracy, szacowany na 65%, polegał na: zainicjowaniu idei naukowej, stworzeniu koncepcji badań, wiodącej roli w zaplanowaniu doświadczenia, opracowaniu i optymalizacji metodyk analizy DNA, przeprowadzeniu badań laboratoryjnych z zakresu genetyki molekularnej, przygotowaniu bazy danych do analizy statystycznej, opracowaniu statystycznym wyników doświadczenia, interpretacji uzyskanych wyników, napisaniu pracy w j. angielskim, przygotowaniu manuskryptu do druku, przeprowadzeniu publikacji przez korektę po recenzjach, pozyskaniu środków finansowych na badania, napisaniu i kierowaniu projektem badawczym własnym NCN, w ramach którego powstała w/w praca (N N311 521440), pełnieniu funkcji autora korespondencyjnego. Sumaryczna wartość punktowa MNiSW powyższych publikacji zgodna z wykazem punktacji MNiSW obowiązującym w roku wydania pracy wynosi 98 punktów. Sumaryczny współczynnik Impact Factor (IF) wg bazy Journal Citation Reports (JCR) powyższych publikacji zgodny z rokiem ukazania się pracy (dla pracy H4 i H5 podano IF za 2016 rok) wynosi 1,978. Oświadczenia współautorów przedstawionych powyżej prac naukowych wraz z określeniem ich indywidualnego udziału przedstawiono w Załączniku nr 6. 2.3 Omówienie celu naukowego wyżej wymienionych publikacji, jak również osiągniętych wyników oraz ich ewentualnego wykorzystania 2.3.1 Wprowadzenie Doskonalenie genetyczne zwierząt gospodarskich od lat opiera się na tradycyjnych metodach hodowlanych. W latach 20. ubiegłego wieku pod wpływem takich badaczy jak: Fisher, Wright i Haldane wyodrębnił się nawet nowy dział genetyki - genetyka cech ilościowych. Zastosowanie różnych metod statystycznych w hodowli zwierząt pozwoliło na opisanie reguł odpowiedzialnych za dziedziczenie i zmienność cech ilościowych. Większość ważnych ekonomicznie cech zwierząt gospodarskich należy do grupy cech ilościowych, które dziedziczą się poligenicznie, a poza tym są uwarunkowane wieloma czynnikami środowiska. Z tego względu z hodowlanego punktu widzenia tak ważne jest znalezienie genów, które biorą udział w kształtowaniu fenotypu danej cechy ilościowej oraz określenie ich polimorfizmu w obrębie danej rasy i gatunku zwierząt. Okazało się to możliwe dopiero w drugiej połowie XX wieku, kiedy odnotowano szybki rozwój genetyki molekularnej i inżynierii genetycznej oraz towarzyszący im postęp w technikach umożliwiających analizę 7
materiału genetycznego. Znaczącym przełomem okazało się odkrycie w 1983 roku łańcuchowej reakcji polimerazy DNA (ang. PCR polymerase chain reaction) przez Kary ego Mullisa. Nowe narzędzia genetyki molekularnej pozwoliły na poznanie budowy i polimorfizmu wielu genów, jak również całych genomów. Przyczyniają się one do osiągnięcia dużego postępu zarówno w doskonaleniu zwierząt gospodarskich, w tym owiec, jak również w diagnostyce i terapii chorób genetycznych (Van der Werf, 2007; Charlier i wsp., 2008; Yue i wsp, 2017). Podstawowymi metodami hodowlanymi są selekcja zwierząt i ich odpowiednie kojarzenie, których tradycyjnie dokonuje się posługując się parametrami genetycznymi oraz indeksami selekcyjnymi. Obecnie techniki genetyki molekularnej pozwalają na prowadzenie selekcji zwierząt w zakresie cech ilościowych na podstawie dodatkowych informacji o ich genotypie (ang. MAS marker assisted selection, selekcja wspomagana markerami), a nie tylko w oparciu o parametry genetyczne i indeksy selekcyjne oszacowane za pomocą metod hodowlanych wykorzystujących narzędzia statystyczne (Van der Werf, 2007). Ponadto zastosowanie testów DNA umożliwia identyfikację i eliminację nosicieli niekorzystnych mutacji genowych powodujących choroby genetyczne lub warunkujących niską genetyczną oporność na różne choroby zakaźne (Hunter i wsp., 1996; Charlier i wsp., 2008). Zastosowanie nowoczesnych narzędzi genetyki molekularnej w hodowli zwierząt wymaga między innymi znajomości budowy i polimorfizmu określonych genów. Polimorfizm genetyczny oznacza występowanie dwóch lub więcej alleli w tym samym locus w danej populacji z częstością większą niż częstość mutacji, przy czym jako wartość graniczną przyjęto 1% (Cavalli-Sforza i Bodmer, 1971). Polimorfizm genetyczny wynika zarówno z różnic ilościowych, jak i jakościowych, występujących w sekwencjach homologicznych odcinków DNA i może występować w sekwencjach kodujących i niekodujących genomu zwierzęcia. Zjawisko polimorfizmu warunkuje zmienność występującą na poziomie DNA pomiędzy osobnikami danego gatunku (Charon i Świtoński, 2012). Natomiast skutkiem polimorfizmu występującego w genach kodujących daną cechę ilościową, jest najczęściej zmienność fenotypowa zwierząt w obrębie danej właściwości organizmu. Obecnie zainteresowania badawcze genetyków dotyczące zmienności genów warunkujących poziom określonych cech ilościowych koncentrują się przede wszystkim na polimorfizmach pojedynczych nukleotydów (ang. SNP single nucleotide polymorphism). Polimorfizmy te mogą występować w obszarach międzygenowych, natomiast z punktu widzenia genetyki cech ilościowych najciekawsze są te zlokalizowane w obrębie genów 8
zarówno w częściach kodujących, jak i w odcinkach niekodujących. Odkrycie i identyfikacja SNP pozwala na prowadzanie analiz statystycznych dotyczących powiązania określonych ich wariantów z poziomem wybranych cech ilościowych zwierząt. Na postawie takich wieloletnich analiz udało się stworzyć mikromacierze DNA, które stosuje się w badaniach prowadzonych na różnych gatunkach zwierząt, np. w odniesieniu do różnych ras bydła (m.in. Zwierzchowski i Świtoński, 2009). Nie można jednak zapomnieć o znaczącej roli, jaką odegrały i nadal odgrywają sekwencje mikrosatelitarne w genetyce cech ilościowych i genetyce populacji. Markery te mogą być zlokalizowane w chromosomach poza genami, ale są również spotykane w obrębie genów, najczęściej w sekwencjach flankujących lub intronach. Wykorzystywane są przede wszystkim do identyfikacji pochodzenia zwierząt, analizy zróżnicowania genetycznego oraz w mapowaniu loci cech ilościowych (ang. QTL quantitative trait locus) i typowaniu genów kandydujących związanych z określonymi cechami produkcyjnymi zwierząt gospodarskich (m.in. Zwierzchowski i Świtoński, 2009). W ostatnich dekadach w polskim i europejskim owczarstwie odnotowano kilka problemów, spośród których moje zainteresowanie badawcze wzbudziło zagadnienie epidemii trzęsawki (ang. scrapie) oraz doskonalenie cech mięsnych związane ze zmianą kierunku użytkowania owiec w naszym kraju (m.in. Kawecka, 2008; Krupiński, 2008). Trzęsawka jest neurodegeneracyjną chorobą prionową występująca u owiec i kóz. Zaliczana jest do grupy pasażowalnych encefalopatii gąbczastych (ang. TSE transmisible spongiform encefalopaty), do której należy między innymi: gąbczasta encefalopatia bydła (ang. BSE - bovine spongiform encephalopathy) oraz nowy wariant choroby Creutzfelda- Jacoba (ang. nvcjd - new variant of Creutzfeldt Jakob disease) ludzi. Czynnik chorobotwórczy stanowi białko PrP sc, które jest konformacyjną odmianą komórkowego białka prionowego (PrP c ) występującego w komórkach zwierząt i ludzi (Prusiner, 1998). Z tego względu organizm nie rozpoznaje chorobotwórczego białka PrP sc jako patogena. Po wniknięciu do organizmu białko to indukuje konwersję komórkowych protein prionowych do formy patogennej poprzez zmianę struktury przestrzennej (Prusiner, 1998). Wraz ze zmianą konformacji przestrzennej białko prionowe nabiera nowych właściwości fizyko-chemicznych, staje się nierozpuszczalne w wodzie i odporne na działanie wielu czynników fizycznych i chemicznych degradujących proteiny (m.in. Alper i wsp., 1967; Prusiner, 1998). W konsekwencji gromadzi się w komórkach, doprowadzając do nieodwracalnych zmian w tkankach (Prusiner, 1998; Kitamoto i wsp., 1991). Niestety obecnie choroba ta ma status nieuleczalnej. Z tego względu profilaktyka odegrała i nadal odgrywa znaczącą rolę w ograniczeniu zachorowań owiec na trzęsawkę. 9
Największą ilość przypadków trzęsawki w populacji owiec odnotowano w Europie, a w szczególności w Wielkiej Brytanii w okresie między 1993 a 2004 rokiem (APHA, 2015). Ze względu na powiązanie występowania przypadków nowego wariantu Creutzfelda-Jacoba u ludzi ze spożyciem zakażonego prionami mięsa owiec (Brown, 1997), wprowadzono restrykcyjne przepisy zobowiązujące hodowców do wybicia zwierząt chorych i wprowadzenia odpowiedniej procedury w stadach, z których one pochodziły (WE, 2001). Było to motywowane tym, iż choroba ta może być przenoszona między osobnikami w stadzie i może pozostawać w stanie utajenia nawet przez kilka lat. Czas ten zwany inkubacją jest okresem, w którym zwierzę niestety może zarażać. Zakażenia klasyczną postacią trzęsawki następują minimum rok, a najczęściej dwa do pięciu lat przed pojawieniem się objawów klinicznych choroby u owiec (m.in. Foster i wsp., 2006). Biorąc powyższe pod uwagę epidemia scrapie odbiła się niekorzystnie na chowie owiec w Europie, doprowadzając do strat finansowych (Van der Werf, 2007). Późniejsze długoletnie badania doprowadziły do poznania etiologii tej choroby. Odkryto, iż oporność na klasyczną postać trzęsawki warunkowana jest polimorfizmem w genie białka prionowego (PRNP), przy czym haplotyp (dalej zwany allelem) ARR wyznacza najwyższą genetycznie warunkowaną oporność na tę chorobę, natomiast VRQ ma działanie przeciwstawne (m.in. Belt i wsp., 1995; Hunter i wsp., 1996). Gen PRNP, zbudowany z trzech eksonów i dwóch intronów, ma swoje locus w długim ramieniu 13. chromosomu (Lee i wsp., 1998). W oparciu o te odkrycia w Wielkiej Brytanii, jak również w pozostałych krajach Unii Europejskiej, wprowadzono programy hodowlane skierowane na podwyższenie genetycznie warunkowanej oporności owiec na klasyczną postać trzęsawki (WE, 2003). Polska jako kraj członkowski Unii Europejskiej była również zobowiązana do przebadania krajowej populacji owiec pod kątem zakażeń i polimorfizmu genu białka prionowego oraz do wprowadzenia odpowiednich programów mających na celu podwyższenie genetycznie uwarunkowanej oporności owiec na trzęsawkę. Pogłowie owiec w Polsce jest bardzo zróżnicowane. Istnieje kilkanaście ras o różnym pochodzeniu. Wprowadzanie odpowiedniego programu hodowlanego mającego na celu zwiększenie genetycznej oporności owiec określonej rasy na klasyczną postać trzęsawki wymagało znajomości polimorfizmu genu białka prionowego w wybranej rasie z uwzględnieniem czynnika stada, co skłoniło mnie do przeprowadzenia analizy zmienności genetycznej w obrębie tego genu w wybranych rasach owiec w Polsce. W czasie, kiedy europejskie pogłowie owiec dotknięte zostało epidemią trzęsawki, w polskim owczarstwie rozpoczął się kryzys zapoczątkowany spadkiem cen wełny na rynkach światowych, ale przede wszystkim na rynku polskim w związku z transformacją ustrojową, 10
otwarciem się naszego rynku na świat i koniecznością zmiany kierunku użytkowania owiec. Niestety zmiany te niekorzystnie odbiły się na rentowności chowu owiec w Polsce, doprowadzając do likwidacji większości stad o wełnistym kierunku użytkowania. W rezultacie populacja owiec została drastycznie zmniejszona. Jednym ze sposobów polepszenia tej trudnej sytuacji w polskim owczarstwie wydawało się być podjęcie zabiegów hodowlanych mających na celu ukierunkowanie polskiego pogłowia na mięsne użytkowanie (Krupiński, 2008). Było to tym bardziej uzasadnione ze względu na fakt, iż polscy hodowcy mogą dostarczać jagnięcinę nie tylko na rynek krajowy, ale także na rynki europejskie (m.in. Krupiński, 2008). Nowe podejście znalazło odzwierciedlenie w polityce hodowlanej. Ministerstwo Rolnictwa i Gospodarki Żywnościowej już w Programie Doskonalenia Pogłowia Owiec do 2010 w Polsce wskazało na konieczność genetycznego doskonalenia tego gatunku zwierząt pod względem szybszego tempa wzrostu jagniąt oraz poprawy cech jakościowych tuszy. Selekcja w kierunku poprawy cech użytkowości mięsnej i rzeźnej owiec wydaje się być więc istotnym czynnikiem, który może doprowadzić do podwyższenia rentowności chowu i hodowli owiec w naszym kraju. Niestety w Polsce nie prowadzi się wielu badań z zakresu genetyki molekularnej owiec. Choć w niektórych krajach na świecie, np. w Wielkiej Brytanii czy Nowej Zelandii, zostały wprowadzone programy selekcji wspomaganej markerami mające na celu genetyczne doskonalenie owiec pod względem cech użytkowości mięsnej i reprodukcyjnej (Van der Werf, 2007), w Polsce nadal mamy znikome informacje na temat polimorfizmu genów odpowiedzialnych za kształtowanie cech mięsnych i rzeźnych rodzimych ras. W tym świetle niezwykle istotnym i naglącym problemem stało się określenie uwarunkowań genetycznych wpływających na polepszenie cech związanych z użytkowością mięsną rodzimych ras owiec. Analiza piśmiennictwa przedmiotu badań dostarcza informacji na temat wielu genów, które mogą pełnić rolę genów kandydujących cech związanych z mięsnością, wartością rzeźną jagniąt oraz jakością jagnięciny (Van der Werf, 2007). W tym ujęciu intersujące wydały mi się geny kodujące białka systemu kalpainowego, odpowiedzialnego za proces kruszenia mięsa (Melody i wsp., 2004). Jednym ze składników systemu kalpainowego jest kalpastatyna, która pełni rolę specyficznego inhibitora kalpain. Hamuje ona aktywność kalpain we włóknie mięśniowym i tym samym odpowiada za proces kruszenia mięsa podczas dojrzewania (Koohmaraie, 1992). Ponadto bierze udział we wzroście mięśni, przemianach protein oraz migracji mioblastów (Goll i wsp., 1992). Gen kodujący kalpastatynę (CAST) został wytypowany przez Palmer a i wsp. (1998) jako gen kandydujący cech jakości mięsa owczego. Większość badaczy analizowała jednak związek polimorfizmu tego genu z cechami 11
wzrostu owiec (m.in. Byun i wsp., 2008; Chung i Davis, 2012). Tylko nieliczni przeprowadzili analizy statystyczne mające na celu ocenę powiązania polimorfizmu genu CAST z cechami rzeźnymi oraz kruchością mięsa owczego (Bickerstaffe i wsp., 2008; Zhou i wsp., 2008). Obok kalpastatyny składnikami systemu kalpainowego są aktywowane przez jony wapnia kalpainy należące do grupy wewnątrzkomórkowych, cysteinowych endopeptydaz. Wyróżniamy dwie podstawowe izoformy: µ-kalpainę (kalpaina I, CAPN1) i m-kalpainę (kalpaina II, CAPN2) będące heterodimerami składającymi się z dużych podjednostek katalitycznych i małych regulatorowych (Goll i wsp., 2003). Kalpainy biorą udział w szeregu procesów biologicznych, spośród których można wymienić migrację, proliferację i apoptozę na poziomie komórkowym, natomiast na poziomie tkankowym uczestniczą w rozwoju mięśni (Goll i wsp., 1992; Sultan i wsp., 2000). Z tego względu geny kodujące kalpainy są rozważane jako geny kandydujące cech mięsnych i cech jakości mięsa owczego. Gen małej podjednostki 1 kalpainy (CAPNS1) ma swoje locus w chromosomie 14. i składa się z 12 eksonów (Chung i Davis, 2014). W piśmiennictwie naukowym z tego zakresu można znaleźć tylko nieliczne doniesienia na temat polimorfizmu w tym genie w populacji owiec (m.in. Nassiry i wsp., 2007; Dehavi i wsp. 2012; Chung i Davis, 2014). Nie odnaleziono jednak pozycji dotyczących związku polimorfizmu w genie CAPNS1 z cechami użytkowości rzeźnej jagniąt. Jedynie Chung i Davis (2014) analizowali powiązanie zmienności w obrębie tego genu z cechami wzrostu owiec. Insulino podobny czynnik wzrostu 1 (IGF-I) jest polipeptydowym hormonem białkowym podobnym w budowie do insuliny. Wiąże się on z receptorem IGF-IR w tkankach, natomiast we krwi z proteinami wiążącymi IGF (IGF-BP), które mogą regulować działanie tego czynnika (Jones i Clemmons, 1995; Schams i wsp., 1999). IGF-1 odgrywa rolę w pobudzaniu komórek i tkanek do wzrostu i podziału, bierze udział w embriogenezie, regulacji metabolizmu i syntezie protein oraz wzroście szkieletu (Baxter, 1986; Clemmons i wsp., 1987). Biorąc powyższe pod uwagę gen insulino podobnego czynnika wzrostu 1 (IGF- I) jest rozważany jako gen kandydujący cech dotyczących wzrostu oraz użytkowości mięsnej owiec. Natomiast w piśmiennictwie naukowym z tego zakresu można znaleźć tylko nieliczne wyniki analiz asocjacyjnych dotyczących wpływu polimorfizmu w tym genie na cechy wzrostu i wymiary ciała owiec (m.in. Tahmoorespur i wsp., 2009; Gholibeikifard i wsp., 2013; Hajihosseinlo i wsp., 2013; Proskura i Szewczuk, 2014) czy wybrane cechy rzeźne (Behzadi i wsp., 2015). Spośród nich tylko badania Proskury i Szewczuk (2014) dotyczyły jednej rodzimej rasy owiec. 12
Stan wiedzy na temat związku genów CAPNS1 i IGF-I z wybranymi cechami wzrostu, wymiarami ciała, mięsnością, użytkowością rzeźną i jakością jagnięciny wskazały na konieczność podjęcia dalszych badań naukowych w tym kierunku, których wyniki w przyszłości znajdą zastosowanie w hodowli owiec w kierunku polepszenia ich cech mięsnych. 2.3.2 Cel naukowy Dwa wyżej opisane problemy polskiego i europejskiego owczarstwa wymagały poznania genetycznych uwarunkowań owiec wybranych ras w naszym kraju i stały się podstawą do wyznaczenia kierunku badań z zakresu genetyki molekularnej tego gatunku zwierząt w mojej pracy naukowej. Z tego względu głównym, wspólnym celem badawczym cyklu prac stanowiących podstawę do ubiegania się o stopień naukowy doktora habilitowanego jest analiza polimorfizmu wybranych genów istotnych z naukowego punktu widzenia oraz o dużym znaczeniu pod względem oceny możliwości wykorzystania uzyskanych wyników w praktyce chowu i hodowli owiec. Celami szczegółowymi podjętych prac badawczych była: identyfikacja SNP w genie białka prionowego w stadzie owiec kamienieckich, podział owiec na grupy genetycznie regulowanej oporności na klasyczną postać trzęsawki oraz przedstawienie stymulacji wprowadzania kojarzeń ukierunkowanych na podwyższenie oporności na tę chorobę [H1]; oznaczenie polimorfizmu wybranych sekwencji mikrosatelitarnych zlokalizowanych w obrębie genu PRNP oraz ocena ich związku z genotypami białka prionowego w stadach owiec następujących ras: merynos polski, czarnogłówka i ile de france [H2]; analiza polimorfizmu genu kalpastatyny w grupie owiec czterech ras: merynos polski, berrichon du cher, czarnogłówka i ile de france [H3]; identyfikacja polimorfizmu w genie CAPNS1 oraz ocena jego związku z cechami jakości mięsa jagniąt merynosa odmiany barwnej [H4]; analiza polimorfizmu genu IGF-I oraz jego powiązania z cechami wzrostu, wymiarami ciała, mięsnością, wartością rzeźną oraz jakością mięsa owiec rasy merynos odmiany barwnej [H5]. 2.3.3 Materiał i metody W prezentowanym cyklu badań analizami objęto osobniki obu płci reprezentujące owce sześciu ras utrzymywanych w Polsce. Polimorfizm analizowano w następujących genach: 13
- gen białka prionowego (PRNP), - gen kalpastatyny (CAST), - gen małej podjednostki 1 kalpainy (CAPNS1), - gen insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-I). Wybrane fragmenty w/w genów powielono w reakcji PCR. U osobników analizowanych pod kątem polimorfizmu genu białka prionowego nie stwierdzono objawów klasycznej postaci trzęsawki do dnia pobrania krwi. W zestawieniu poniżej zaprezentowano wykaz objętych badaniami ras owiec oraz zastosowanych metod analizy polimorfizmu DNA z uwzględnieniem genów i numerów publikacji (H1-H5) wchodzących w skład wyżej przedstawionego osiągnięcia naukowego. Rasa owiec Gen PRNP CAST CAPNS1 IGF-I owca kamieniecka H1 merynos polski H2 H3 merynos odmiany barwnej H4 H5 berrichon du cher H3 ile de france H2 H3 czarnogłówka H2 H3 Metoda analizy polimorfizmu PCR-RFLP H1, H2 H3 H5 PCR-SSCP PCR-MSSCP H4 sekwencjonowanie H4 H5 sekwencje mikrosatelitarne H2 Polimorfizm genu PRNP oznaczano w trzech kodonach (136., 154. i 171.) trzeciego eksonu przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych BspHI, BspDI, BseLI wg protokołu Lühken i wsp. (2008). Metoda ta pozwala na oznaczenie 15 najczęściej spotykanych w populacji owiec genotypów białka prionowego. Analizę molekularną tego genu dodatkowo wzbogacono identyfikując polimorfizm długości sekwencji mikrosatelitarnych zlokalizowanych w 1. i 2. intronie oraz 3. eksonie. W kolejnym etapie badań SNP w genie kalpastatyny identyfikowano przy użyciu enzymów restrykcyjnych MspI oraz NcoI wg metodyki Palmera i wsp. (1998). W przypadku genu CAPNS1 polimorfizm we fragmencie o długości 190 pz, obejmującym 5. i 6. ekson wraz z intronem, oznaczono metodą MSSCP (ang. multitemperature single-strand conformation polymorphism, wielotemperaturowy polimorfizm konformacyjny jednoniciowego DNA) według autorskiej metodyki z 14
wykorzystaniem starterów opublikowanych przez Nassiry i wsp. (2007). W celu ustalenia sekwencji nukleotydów w poszczególnych allelach produkty PCR osobników homozygotycznych oraz heterozygotycznych poddano sekwencjonowaniu w obu kierunkach w firmie Genomed (Warszawa). Natomiast polimorfizm w 1. eksonie genu IGF-I oznaczono przy użyciu enzymu restrykcyjnego HaeII według metodyki Yilmaz i wsp. (2005) po wprowadzeniu autorskich modyfikacji. Produkty PCR wybranych osobników homozygotycznych i heterozygotycznych również poddano sekwencjonowaniu w obu kierunkach w firmie Genomed (Warszawa). Jagnięta merynosa odmiany barwnej odchowano w Instytucie Zootechniki Państwowego Instytutu Badawczego Zakładzie Doświadczalnym Kołuda Wielka w latach 2011-2013 i oceniono pod względem 78 cech przyżyciowych i poubojowych. Analizy te przeprowadzono w ramach projektu badawczego własnego nr N N311 521440. Owce ras: merynos polski, ile de france, berrichon du cher oraz czarnogłówka pochodziły ze stad utrzymywanych w województwie kujawsko-pomorskim, natomiast owce kamienieckie ze stada w województwie warmińsko-mazurskim. Analizy statystyczne mające na celu ocenę powiązania polimorfizmu genu CAPNS1 z cechami jakości jagnięciny oraz IGF-I ze wszystkimi ocenionymi cechami przyżyciowymi i poubojowymi przeprowadzono za pomocą pakietu statystycznego SAS (SAS, 2014) przy użyciu liniowego modelu mieszanego lub uogólnionego liniowego modelu mieszanego. Istotność różnic pomiędzy poszczególnymi grupami reprezentującymi odmienne genotypy analizowano testem Tukey a-kramera. 2.3.4 Osiągnięte wyniki i ich omówienie Epidemia trzęsawki, śmiertelnej pasażowalnej choroby prionowej, była naglącym problemem europejskiego owczarstwa. Odkrycie związku między opornością owiec na klasyczną postać trzęsawki a polimorfizmem w genie białka prionowego (m.in. Belt i wsp., 1995; Hunter i wsp., 1996) dało możliwość walki z tą nieuleczalną chorobą poprzez odpowiednie kojarzenie zwierząt z wykorzystaniem informacji o ich genotypie w locus genu PRNP. W związku z powyższym w początkowym etapie swoje prace badawcze z zakresu genetyki molekularnej owiec w Polsce skoncentrowałam na analizie polimorfizmu genu białka prionowego. Eksperymenty przeprowadzone na całym świecie wykazały, że częstość występowania poszczególnych polimorfizmów w genie PRNP pozostaje pod wpływem takich czynników jak: rasa owiec, region, a nawet stado (m.in. Lühken i wsp., 2008). W chwili podjęcia badań 15
niewiele było informacji na temat zmienności występującej w trzech tripletach 136., 154. i 171. zlokalizowanych w 3. eksonie genu PRNP w stadach owiec kamienieckich w naszym kraju, dlatego przedmiotem badań w publikacji [H1] było oznaczenie SNP w tych kodonach oraz określenie frekwencji alleli i genotypów białka prionowego w populacji owiec tej rodzimej rasy. [H1] Szkudlarek-Kowalczyk M., Wiśniewska E., Milewski S., Mroczkowski S.: Prion protein gene (PRNP) polymorphism in a flock of sheep of Kamieniecka breed. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 2010, 54, 645-649. Na podstawie wyliczonych frekwencji alleli stwierdzono, że owce kamienieckie charakteryzowały się stosunkowo dobrymi genetycznymi założeniami dotyczącymi oporności na klasyczną postać trzęsawki. Wskazywał na to dominujący udział allela ARR, związanego z najwyższą genetycznie regulowaną opornością owiec na klasyczną postać trzęsawki, w puli czterech allelomorfów w tym locus. W analizowanym stadzie stwierdzono stosunkowo dużą zmienność w locus genu PRNP, wykryto bowiem dziewięć spośród piętnastu najczęściej spotykanych układów allelicznych białka prionowego owiec. Genotypy te przyporządkowano do klas genetycznie regulowanej oporności owiec na klasyczną postać trzęsawki według schematu opublikowanego przez Ministerstwo Środowiska, Żywności i Spraw Wiejskich Wielkiej Brytanii (DEFRA, 2006). Osobniki charakteryzujące się najwyższą genetycznie regulowaną opornością na klasyczną postać trzęsawki (ARR/ARR) były najliczniejszą grupą (35,2%), natomiast owce o genotypach należących do 3., 4. i 5. klasy oporności na tę chorobę stanowiły łącznie 15,7% analizowanej grupy. Wyniki te wskazały na stosunkowo korzystny układ alleli i genotypów białka prionowego wśród analizowanych owiec kamienieckich. Dla porównania Niżnikowski i wsp. (2006) oraz Lühken i wsp. (2008) stwierdzili mniej korzystne uwarunkowania genetycznie regulowanej oporności owiec kamienieckich na klasyczną postać trzęsawki wynikające z niższych frekwencji allela ARR i genotypu ARR/ARR. Przyczyny tego rezultatu można upatrywać w mniejszej liczebności badanej populacji i innym sposobie doboru osobników do analizy. W tym aspekcie należy również zwrócić uwagę, że nie tylko czynnik rasowy, ale i czynnik stada wpływają na frekwencje alleli i genotypów w locus genu PRNP owiec. Celem programów hodowlanych ukierunkowanych na podwyższenie genetycznie uwarunkowanej oporności owiec na klasyczną postać trzęsawki jest zwiększanie frekwencji allela ARR i genotypu ARR/ARR, przy jednoczesnym brakowaniu osobników homo- lub heterozygotycznych pod względem allelomorfa VRQ (WE, 2003). Idealnym 16
rezultatem byłoby osiągnięcie populacji monomorficznej pod względem allela ARR, co wskazywałoby na jej genetycznie regulowaną oporność na zakażania klasyczną postacią trzęsawki. Z tego względu, jednym z celów hodowlanych w doskonaleniu genetycznym owiec kamienieckich powinno być podniesienie frekwencji alleli i genotypów warunkujących genetycznie regulowaną oporność na tę chorobę. Przeprowadzona w badaniach własnych teoretyczna symulacja kojarzeń skierowanych na podwyższenie genetycznie warunkowanej oporności owiec kamienieckich na klasyczną postać trzęsawki wykazała, iż w czwartym pokoleniu byłoby możliwe uzyskanie ponad 90% udziału owiec z genotypem ARR/ARR. Powyższe wyniki były obiecujące w porównaniu z rasami o bardzo niskiej frekwencji allela ARR, takimi jak np. owca romanowska (Rejduch i wsp., 2009), czy owce ras akkaraman, bergamascaw lub manchega (Lühken wsp., 2008), u których wprowadzanie odpowiedniego schematu kojarzeń i osiągnięcie oczekiwanego celu hodowlanego, czyli osobników o genetycznie regulowanej oporności na klasyczną postać trzęsawki, stanowiło duże i długoterminowe wyzwanie. Gen białka prionowego owiec ma swoje locus w długim ramieniu 13. chromosomu (13q15). W jego skład wchodzą trzy eksony, z których dwa pierwsze są krótkie, zbudowane odpowiednio z 52 i 98 par zasad. Natomiast 3. ekson liczy aż 4028 nukleotydów i zawiera otwartą ramkę odczytu (ORF) długości 768 par zasad, w której występują opisane w publikacji [H1] SNP. Trzy części kodujące genu PRNP przedzielone są dwoma intronami liczącymi odpowiednio po 2421 i 14031 nukleotydów (Lee i wsp., 1998). Obecnie widomo, iż części kodujące, ale także niekodujące, pełnią ważną rolę w ekspresji genu. Z tego względu w kolejnym etapie moich badań z zakresu genetyki molekularnej owiec swoją uwagę skupiłam na zmienności genetycznej występującej nie tylko w eksonach, ale także w intronach tego genu. Dodatkowo odkryto, że ponad połowę (57,1%) sekwencji genu białka prionowego stanowią elementy powtarzalne (Lee i wsp., 1998). Niestety w chwili podjęcia badań własnych niewiele informacji można było znaleźć na temat polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych w owczym genie białka prionowego w piśmiennictwie dotyczącym tego zagadnienia. Jedną z nielicznych pozycji była praca autorstwa Geldermann a i wsp. (2003), którzy odkryli 23 sekwencje mikrosatelitarne z minimum trzema powtórzeniami w owczym genie PRNP. Ponadto Preuss i wsp. (2005) zidentyfikowali polimorfizm trzech sekwencji mikrosatelitarnych w obrębie tego genu wśród owiec różnych ras utrzymywanych w Niemczech. Natomiast w Polsce nie przeprowadzono wcześniej podobnych analiz molekularnych. Biorąc powyższe pod uwagę do kolejnego eksperymentu, którego wyniki przedstawiłam w publikacji [H2], wytypowałam dwie sekwencje mikrosatelitarne S11 i S15 17
znajdujące się odpowiednio w 1. i 2. intronie oraz jedną S24 znajdującą się w 3. eksonie genu białka prionowego. [H2] Wiśniewska E., Piwczyński D., Mroczkowski S.: Microsatellite polymorphisms in the ovine prion protein gene in relation to PrP genotypes. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 2010, 54, 705-711. Spośród trzech analizowanych sekwencji mikrosatelitarnych (S11, S15 i S24) sekwencja S11 okazała się najbardziej polimorficzna. Wykryto 3 allele występujące w 5 różnych układach allelicznych w tym locus, natomiast w przypadku sekwencji mikrosatelitarnej S15 oznaczono 3 allele i 3 genotypy. Mikrosatelita S24 cechowała się najmniejszą zmiennością genetyczną, wykryto bowiem tylko 2 allele i 2 genotypy. Wyniki te są najprawdopodobniej konsekwencją lokalizacji analizowanych sekwencji mikrosatelitarnych w genie PRNP. Fragmenty DNA umiejscowione w intronach (S11, S15) okazały się bowiem bardziej polimorficzne niż sekwencja S24 zlokalizowana w część kodującej genu. W przypadku sekwencji mikrosatelitarnych S11 i S15 wykryto niższy ich polimorfizm w porównaniu z badanymi Preuss a i wsp. (2005). W badaniach własnych frekwencje poszczególnych alleli wyżej wymienionych sekwencji mikrosatelitarnych różniły się w zależności od rasy owiec. Podobne zależności zaobserwowali w swoich analizach Preuss a i wsp. (2005). Rezultaty te potwierdziły teorię, iż czynnik rasowy wpływa na zmienność genetyczną występującą w locus genu białka prionowego. Kolejnym problemem badawczym, było uzyskanie odpowiedzi na pytanie, czy i w jakim stopniu analizowane sekwencje mikrosatelitarne są związane z opornością owiec na trzęsawkę? W toku badań stwierdzono wysoko istotny związek genotypów białka prionowego zarówno z allelami, jak i genotypami, sekwencji mikrosatelitarnych. Wykryto, iż w grupie owiec najbardziej genetycznie opornych na klasyczną postać trzęsawki (NSP1) w locus sekwencji mikrosatelitarnej S11 najczęściej występował genotyp 152/152pz, S15 genotyp 179/179pz, natomiast S24 genotyp 144/144pz. W przeciwieństwie do wyników analiz Preuss a i wsp. (2005) stwierdzono również obecność innych alleli w loci tych mikrosatelit w grupie homozygot ARR/ARR, przy czym ich frekwencje różniły się w zależności od rasy owiec. Powyższe rezultaty wskazują na możliwość zastosowania analizowanych sekwencji mikrosatelitarnych jako markerów genetycznych w badaniach nad zmiennością genu białka prionowego i związaną z nią genetycznie regulowaną opornością owiec na trzęsawkę. 18
W Polsce, ale także w wielu innych krajach na świecie, doskonalenie owiec w kierunku polepszenia ich cech użytkowości mięsnej ma coraz większe znaczenie (Van der Werf, 2007; Krupiński, 2008). Biorąc powyższe pod uwagę w dalszym toku moich badań dotyczących możliwości wykorzystania polimorfizmu wybranych genów w hodowli owiec swoje zainteresowania naukowe skupiłam na genach kandydujących cech mięsnych tego gatunku zwierząt gospodarskich. Jednym z genów kandydujących związanych z cechami mięsnymi owiec jest kalpastatyna. Enzym ten pełni rolę specyficznego inhibitora kalpain i wchodzi w skład systemu kalpainowego odpowiedzialnego za proces kruszenia mięsa (Melody i wsp., 2004). Niestety w chwili rozpoczęcia analiz molekularnych znajomość polimorfizmu tego genu w rodzimych populacjach owiec różnych ras była niewystarczająca, aby podjąć dalsze analizy asocjacyjne i sformułować ewentualne zalecenia hodowlane. Biorąc powyższe pod uwagę podjęłam się realizacji badań naukowych mających na celu identyfikację polimorfizmu tego genu w populacjach owiec następujących ras: merynos polski, berrichon du cher, czarnogłówka i ile de france, których wyniki przedstawiłam w publikacji [H3]. [H3] Szkudlarek-Kowalczyk M., Wiśniewska E., Mroczkowski S.: Polymorphism of calpastatin gene in sheep. Journal of Central European Agriculture, 2011, 12, 3, 425-432. Analizami molekularnymi, w których wykorzystano enzymy restrykcyjne MspI i NcoI, objęto dwa SNP w genie kalpastatyny. Przeprowadzone analizy locus CAST/MspI i CAST/NcoI wykazały obecność dwóch alleli M i N oraz trzech genotypów MM, MN i NN w każdym miejscu restrykcyjnym. Podobnie jak w przypadku genu białka prionowego, przeprowadzone analizy molekularne wykazały, iż czynnikiem determinującym częstości alleli i genotypów w locus genu kalpastatyny była rasa owiec. Ponadto stwierdzono, że owce ras mięsnych (berrichon du cher, czarnogłówka i ile de france) charakteryzowały się wyższymi frekwencjami allela M w locus CAST/MspI w porównaniu z owcami merynosowymi reprezentującymi typ wełnisto-mięsny. Natomiast analiza locus CAST/NcoI wykazała małe zróżnicowanie frekwencji alleli i genotypów między genotypowanymi rasami owiec. Allel N wystąpił tylko w grupie owiec rasy czarnogłówka. Pozostałe rasy okazały się być monomorficzne w tym locus. Wyniki te sugerują, że polimorfizm w locus CAST/NcoI jest związany z czynnikiem rasowym, natomiast kierunek użytkowania, wełnisto-mięsny lub mięsny, nie odgrywa dużego znaczenia. 19
Podobne badania mające na celu identyfikację polimorfizmu w genie kalpastatyny podjęto w populacjach owiec różnych ras na świecie (m.in. Nassiry i wsp., 2007; Sutikno i wsp., 2008). Natomiast w Polsce przed ukazaniem się wyników badań własnych opisanych w publikacji [H3], analizy w tym kierunku obejmujące owce ras: plenna owca olkuska, polska owca górska, suffolk, polska owca długowełnista oraz mieszańce (F1) merynos polski owca romanowska i populacje owiec linii syntetycznych BCP i SCP podjęli tylko Kaczor (2006) oraz Greguła-Kania i Gruszecki (2007). Rezultaty wyżej wymienionych prac badawczych własnych i innych autorów potwierdzają wniosek dotyczący wpływu czynnika rasowego na zmienność w genie kalpastatyny owiec. Piśmiennictwo przedmiotu badań dostarcza informacji dotyczących powiązania polimorfizmu genu kalpastatyny z takimi cechami jak np.: masa ciała przy urodzeniu (Byun i wsp., 2008), przyrosty dobowe do momentu odsadzenia (Byun i wsp., 2008; Nassiry i wsp., 2006) i wydajność rzeźna niektórych wyrębów np. polędwicy (Bickerstaffe i wsp., 2008). Wyniki te wskazują, iż gen kalpastatyny powinien być rozpatrywany jako gen kandydujący nie tylko w przypadku cech jakości jagnięciny i baraniny, ale również w przypadku cech wzrostu, mięsności i wydajności rzeźnej owiec. Przed wprowadzeniem SNP w genie kalpastatyny jako dodatkowego kryterium selekcji w programach hodowlanych owiec zalecane jest przeprowadzenie walidacji otrzymanych wyników badań własnych w stadach owiec innych ras. Obok kalpastatyny głównymi składnikami wyżej wspomnianego systemu kalpainowego są kalpainy. Enzymy te uczestniczą w szeregu procesów, z których można wymienić migrację, proliferację i apoptozę komórek oraz udział w rozwoju tkanki mięśniowej (Goll i wsp., 1992; Sultan i wsp., 2000). Mimo to duża część badań naukowych koncentruje się na znaczeniu enzymów systemu kalpainowego oraz polimorfizmu kodujących je genów tylko w procesie kruszenia mięsa. Ponadto w przypadku kalpain, a szczególnie genu małej podjednostki 1 kalpainy, znaleziono tylko nieliczne prace naukowe dotyczące polimorfizmu tego genu w populacji owiec oraz tylko jedną pracę przedstawiającą powiązanie tego polimorfizmu z cechami wzrostu jagniąt (Chung and Davis, 2014). Natomiast w Polsce nie podjęto wcześniej żadnych badań w tym kierunku. Z tego względu w kolejnym etapie moich prac badawczych opisanych w publikacji [H4] celem analiz było określenie polimorfizmu genu CAPNS1 i jego związku z cechami jakości mięsa tryczków merynosa odmiany barwnej. 20
[H4] Grochowska E., Borys B., Grześkowiak E., Mroczkowski S.: Effect of the calpain small subunit 1 (CAPNS1) gene polymorphism on meat quality traits in sheep. Small Ruminant Research 2017, 150, 15-21. Wybrana w badaniach własnych metoda MSSCP pozwala na skanowanie populacji w celu oznaczenia nowych polimorfizmów. Ze względu na brak dostępnych protokołów w toku badań opracowano autorską metodykę, która pozwoliła na identyfikację 3 alleli (A1, B1 i C1) występujących w sześciu układach allelicznych w genotypowanej populacji merynosa odmiany barwnej. W analizowanym fragmencie genu wykryto dwie transwersje C/T - w 44. i 154. pozycji (licząc od pierwszego nukleotydu w sekwencji GenBank nr KU759704) zlokalizowane odpowiednio w 5. intronie oraz 6. eksonie. Sekwencji allelomorfa B1 nie znaleziono w bazie NCBI GenBank, dlatego dodano jego sekwencję do tej bazy pod nr KU759704. Inni autorzy, np. Nassiry i wsp. (2007) oraz Dehnavi i wsp. (2012), stwierdzili niższą zmienność w locus genu CAPNS1 wśród owiec różnych ras w porównaniu z merynosem odmiany barwnej, zidentyfikowali bowiem tylko po dwa allele oraz dwa genotypy w analizowanych populacjach owiec. Określenie rodzaju polimorfizmu wykrytego przez tych badaczy jest jednak niemożliwe ze względu na brak danych dotyczących sekwencji analizowanego fragmentu genu. Jednakże na podstawie wyników badań własnych oraz wyżej wymienionych autorów można wyciągnąć wniosek, iż rasa owiec jest czynnikiem determinującym polimorfizm w genie CAPNS1. Degradacja miofibryli post-mortem, która przebiega głównie za sprawą aktywności kalpain, wpływa na wiele cech jakości mięsa, spośród których można wymienić kruchość czy wyciek naturalny (Melody i wsp., 2004). Biorąc powyższe pod uwagę w badaniach własnych spodziewano się, że polimorfizm w genie CAPNS1 będzie miał istotny wpływ na kruchość mięsa, którą oceniono na podstawie współzależnego z tą cechą parametru prezentującego wartość siły cięcia w teście cięcia Warner-Bratzler. Co ciekawe, przeprowadzone analizy statystyczne nie potwierdziły tej teorii. Natomiast wykazały że genotyp w locus genu CAPNS1 był wysoko istotnie związany (P = 0,006) z wyciekiem naturalnym oraz wykazywał tendencję do powiązania (P = 0,056) z procentowym ubytkiem masy na gotowaniu. Rezultaty badań własnych ciężko skonfrontować z innym wynikami ze względu na brak piśmiennictwa naukowego z tego zakresu dotyczącego owiec. W przypadku trzody chlewnej Melody i wsp. (2004) wykazali korelacje między zdolnością mięsa wieprzowego do utrzymania wody i aktywnością kalpain. Natomiast Gandolfi i wsp. (2011) nie wykazali związku genotypów w locus genu CAPNS1 z wyciekiem naturalnym z mięsa wieprzowego. Podobnie Pinto i wsp. 21
(2011) nie stwierdzili związku polimorfizmu genu dużej podjednostki kalpainy I (CAPN1) zarówno z wyciekiem naturalnym, jak i ubytkiem masy na gotowaniu u bydła. Ribeca i wsp. (2013) nie potwierdzili tych wyników, wykazali bowiem wpływ polimorfizmu genu CAPN1 na wyciek naturalny z mięsa wołowego. Obecny stan wiedzy na ten temat wymaga przeprowadzenia dalszych analiz, jednakże na podstawie wyników badań własnych i wyżej wymienionych autorów można wnioskować o powiązaniu polimorfizmu w genach kodujących kalpainy ze zdolnościami mięsa owczego, wołowego lub wieprzowego do utrzymania wody. Interesującym stwierdzeniem sformułowanym przez Fiems a i wsp. (2000) był fakt, iż na subiektywną ocenę barwy mięsa może mieć wpływ zawartość tłuszczu śródmięśniowego. W badaniach własnych stwierdzono, że genotyp w locus genu CAPNS1 miał istotny wpływ zarówno na barwę L* mięsa (P = 0,037), jak i na procentową zawartość tłuszczu śródmięśniowego (P = 0,039). Podobnie Gandolfi i wsp. (2011) zaobserwowali związek SNP w genie CAPNS1 z barwą L* mięsa wieprzowego. Natomiast Pinto i wsp. (2011) oraz Ribeca i wsp. (2013) wykryli, że gen CAPN1 miał wpływ na barwę mięsa wołowego. W przypadku procentowej zawartości tłuszczu śródmięśniowego nie znaleziono w piśmiennictwie z tego zakresu wcześniejszych badań asocjacyjnych dotyczących owczego genu CAPNS1. W populacji bydła podobne badania przeprowadzili Chung i Davis (2011) obserwując związek między polimorfizmem genu i marmurkowatością wołowiny oraz Li i wsp. (2013) stwierdzając powiązanie zmienności w genie CAPN1 z zawartością tłuszczu śródmięśniowego oraz marmurkowatością mięsa wołowego. Biorąc powyższe pod uwagę można wywnioskować, iż zaobserwowane w badaniach własnych zależności prawdopodobnie wynikają z wielorakich funkcji, jakie pełnią kalpainy w organizmie. Istnieje również prawdopodobieństwo, że SNP w genie CAPNS1 nie są polimorfizmami funkcjonalnymi, ale pozostają w sprzężeniu z polimorfizmami w innych tego typu genach, przez co wykazują związek z wyżej wymienianymi cechami jakości mięsa. Podsumowując, rezultaty przeprowadzonej analizy statystycznej pozwoliły wyciągnąć wniosek, że gen CAPNS1 może być rozważany jako gen kandydujący wybranych cech jakości mięsa owczego, natomiast polimorfizm w tym genie może mieć wpływ na różne parametry jagnięciny. Były to pierwsze tego typu analizy w Polsce i na świecie, co wskazuje na konieczność ich kontynuacji i walidacji w odniesieniu do innych ras owiec. Obok jakości mięsa, innymi równie ważnymi cechami w użytkowaniu owiec w kierunku mięsnym są cechy związane ze wzrostem, wymiarami ciała, mięsnością oraz wartością rzeźną. Są to wszystko cechy ilościowe regulowane poligenowo. Między 22
poszczególnymi genami mogą zachodzić takie zależności jak sprzężenie genów, plejotropia czy epistaza. Biorąc powyższe pod uwagę, uzasadnionym jest badanie związków między polimorfizmem określonego genu a różnymi cechami produkcyjnymi owiec, nie tylko tymi wynikającymi z jego bezpośredniej funkcji w organizmie. Tego typu analizy statystyczne są niezbędne przed wykorzystaniem określonego polimorfizmu w praktyce hodowlanej. Z tego względu w kolejnym etapie moich prac badawczych opisanych w publikacji [H5] zajęłam się kompleksową analizą wpływu polimorfizmu genu IGF-I na szereg cech produkcyjnych owiec. [H5] Grochowska E., Borys B., Janiszewski P., Knapik J., Mroczkowski S.: Effect of the IGF-I gene polymorphism on growth, body size, carcass and meat quality traits in Coloured Polish Merino sheep. Archives Animal Breeding 2017, 60, 161-173. W eksperymencie, którym objęto owce merynosowe odmiany barwnej, dokonano pomiaru łącznie 78 cech przyżyciowych i poubojowych. Do oznaczenia polimorfizmu w amplifikowanym fragmencie genu IGF-I wykorzystano enzym restrykcyjny, co pozwoliło na zidentyfikowanie dwóch alleli A i B oraz dwóch genotypów AA i AB w objętej badaniami populacji owiec. Polimorfizm w genie IGF-I analizowali m.in. Yilmaz i wsp. (2005), Tahmoorespur i wsp. (2009), He i wsp. (2012) oraz Nazari i wsp. (2016) w populacjach owiec różnych ras na świecie. W Polsce detekcję SNP w 3. eksonie tego genu przeprowadzili Proskura i Szewczuk (2014) oraz Niżnikowski i wsp. (2015). Wyniki badań własnych i wyżej wymienionych autorów pozwalają wywnioskować, iż czynnikiem determinującym zmienność w genie IGF-I jest rasa owiec. Insulinopodobny czynnik wzrostu 1 stanowi jeden z elementów osi somatotropowej. Pełni rolę w wielu procesach biologicznych, z których można wymienić wzrost i różnicowanie komórek, embriogenezę, regulację metabolizmu, wzrost szkieletu i mięśni oraz syntezę protein (Baxter, 1986; Clemmons i wsp., 1987). Biorąc powyższe pod uwagę, wysunięto hipotezę badawczą, że analizowany polimorfizm w genie IGF-I będzie miał wpływ na cechy wzrostu jagniąt. Niestety przeprowadzone analizy statystyczne nie potwierdziły tej zależności zarówno w odniesieniu do masy ciała w poszczególnych okresach życia oraz do ich przyrostów, jak również w odniesieniu do cech biometrycznych. Podobne wyniki przedstawili Gholibeikifard i wsp. (2013), Proskura i Szewczuk (2014) oraz Nazari i wsp. (2016), którzy nie zaobserwowali związku między polimorfizmem genu IGF-I a cechami wzrostu jagniąt. Natomiast inni autorzy, m. in. Tahmoorespur i wsp. (2009) oraz Hajihosseinlo i wsp. (2013) 23