Warszawa, r.

Warszawa, 11. 04. 2018 r. Dr hab. Joanna Gruszczyńska Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt Wydział Nauk o Zwierzętach Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr inż. Anny Wojciechowskiej pt. Analiza wpływu polimorfizmu genu kalpastatyny i kalpainy 3 w odniesieniu do cech użytkowości mięsnej wybranych ras owiec Niniejszą recenzję pracy doktorskiej sporządziłam na zlecenie Rady Wydziału Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego w Bydgoszcz zgodnie z uchwałą z dnia 19 stycznia 2018 roku (WHiBZ001.530.4.2018) na podstawie otrzymanego egzemplarza pracy doktorskiej. Praca doktorska została wykonana w Zakładzie Genetyki i Hodowli Zwierząt, na Wydziale Bioinżynierii Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego w Bydgoszcz pod kierunkiem prof. dr hab. Sławomira Mroczkowskiego (promotor) i dr inż. Ewy Grochowskiej (promotor pomocniczy). 1. Formalna ocena pracy Przedłożona mi do oceny praca doktorska spełnia wymagania postawione pracom naukowym w dziedzinie nauk rolniczych, dyscyplinie zootechnika. Niniejsza praca została wydrukowana w formie książki, zajmuje łącznie 82 strony, w tym zawiera 13 tabel i 5 rycin. Autorka treść pracy przedstawiła w 6 rozdziałach (z podrozdziałami), a mianowicie: Wstęp i cel badań, Przegląd literatury, Materiał i metody, Wyniki, Dyskusja, Podsumowanie i wnioski. Wykaz stosowanych skrótów poprzedza ogólny wstęp. Spis literatury obejmuje 80 pozycji, w tym: ogromną większość stanowią prace naukowe w czasopismach zagranicznych. Kolejność poszczególnych rozdziałów i podrozdziałów jest właściwa, co świadczy o przemyślanej koncepcji pracy doktorskiej. Poszczególne rozdziały i podrozdziały stanowią zwarty materiał informacyjno-wynikowy, osadzony w piśmiennictwie naukowym związanym z realizowanym tematem pracy doktorskiej. Dysertacja zakończona jest streszczeniem w języku polskim (1,5 strony) oraz streszczeniem w języku angielskim (1,5 strony). Tabele i ryciny umieszczono na końcu pracy (łącznie 29 stron). 1

2. Ocena merytoryczna pracy Rozprawa doktorska mgr inż. Anny Wojciechowskiej dotyczy bardzo ważnego zagadnienia współczesnej zootechniki, jakim jest poszukiwanie powiązania polimorfizmów w obrębie genów kalpainy (CAPN3) i kalpastatyny (CAST) z cechami użytkowości mięsnej owiec. Informacje o związku polimorfizmów w obrębie badanych genów (CAPN3 i CAST) z cechami użytkowości mięsnej u owiec zapewne będą wykorzystywane w doskonaleniu genetycznym tych cech u badanego gatunku. W dość syntetycznym przeglądzie literatury dysertacji Autorka dokonała charakterystyki kalpastatyny i kalpainy, polimorfizmów badanych genów jak i metod wykorzystywanych do określenia polimorfizmu genów CAST i CAPN. Pani mgr inż. Anna Wojciechowska nie postawiła żadnej hipotezy badawczej. Natomiast cele podjętych badań zostały jasno sformułowane: 1. Określenie frekwencji alleli i genotypów genów kalpastatyny i kalpainy3 w populacji owiec ras: kamieniecka, pomorska i merynos polski odmiana barwna. 2. Poszukiwanie powiązań pomiędzy poszczególnymi genotypami a cechami użytkowości mięsnej w badanej grupie zwierząt. Przedstawiona do oceny dysertacja jest wynikiem kilkuletnich badań prowadzonych przez mgr inż. Annę Wojciechowską we współpracy z Zakładem Doświadczalnym Kołuda Wielka, Instytutu Zootechniki, Państwowego Instytutu Badawczego, Zakładem Produkcyjno - Doświadczalnym w Bałcynach (woj. warmińsko - mazurskie) oraz prywatnym hodowcą (domniemam, gdyż w pracy doktorskiej nie została zamieszczona taka informacja) z miejscowości Szczenurze (woj. pomorskie). Badaniami objęto 273 jagnięta pochodzące z 3 ras owiec w tym: 96 szt. rasy merynos polski odmiany barwnej w typie wełnisto - mięsno - plennym, 77 szt. owiec wełnisto mięsnych rasy kamienieckiej oraz 100 szt. owiec mięsnych rasy pomorskiej. Oceniając pracę należy podkreślić, że metody zastosowane w badaniach zostały przemyślane i właściwie dobrane, dzięki czemu umożliwiły poprawne przeprowadzenie interesujących badań. Autorka wykorzystując zestaw komercyjny wyizolowała genomowy DNA z krwi jagniąt, pobranej z żyły jarzmowej, przeprowadziła analizę jakości otrzymanych izolatów, dokonała amplifikacji wybranych genów metodą łańcuchowej reakcji polimerazy, a następnie otrzymany produkt PCR - badany fragment genu CAST poddano trawieniu trzema enzymami restrykcyjnymi: MspI, NcoI i Hin6I wg metodyki Palmera i wsp., (1998, 2000) oraz Grochowskiej (2012). 2

Do wykrycia polimorfizmów w obrębie genu CAPN3 zastosowano metodę genotypowania niejednorodnego materiału genetycznego MSCCP (ang. Multitemperature Single Strand Conformation Polymorphism) - modyfikację klasycznej metody - polimorfizmu pojedynczych konformerów jednoniciowych cząsteczek DNA (ang. Single Strand Conformation Polymorphism - SSCP), wykorzystywanej w badaniach przesiewowych. W trakcie elektroforezy temperatura żelu poliakryloamidowego była zmieniana w sposób skokowy wg określonego schematu i dzięki temu podniesione zostało prawdopodobieństwo wykrycia mutacji oraz znacznie skrócony czas analizy. Dzięki temu Pani mgr Anna Wojciechowska zapewne uniknęła otrzymania wyników ujemnie fałszywych, co mogłoby się zdarzyć w przypadku przeprowadzenia klasycznej metody SSCP, gdyby między cząsteczkami migrującymi w żelu z taką samą prędkością wystąpiła różnica pod względem jednego nukleotydu, a kształt i opór w czasie ruchu były identyczne. Następnie produkt reakcji PCR osobników homozygotycznych (obu typów) i heterozygotycznych pod względem genu CAPN3 (ekson 10) reprezentujących specyficzne profile prążków MSSCP oczyszczono i poddano sekwencjonowaniu. W celu analizy homologii zsekwencjonowanych sekwencji badanego genu do sekwencji opublikowanych w bazie GenBank NCBI wykorzystano algorytm BLAST. Program DNA Dragon (Sequentix) zastosowano do dopasowania i porównania względem siebie sekwencji osobników homozygotycznych i heterozygotycznych pod względem alleli: CAPN3*01, CAPN3*02, CAPN3*04. Dane o płci, typie urodzenia cechach użytkowości mięsnej badanych owiec Doktorantka otrzymała od pracowników ośrodków hodujących poszczególne rasy owiec, wykorzystane w pracy doktorskiej. Na tej podstawie oszacowała podstawowe parametry statystyczne takie jak średnia arytmetyczna i odchylenie standardowe oraz przyrosty masy ciała jagniąt trzech ras owiec w 56. dniu życia. W analizach statystycznych wykorzystała wyniki oceny poubojowej 30 tryczków rasy merynos polski odmiany barwnej. Na podstawie wyników reakcji PCR-RFLP oraz MSSCP oszacowano frekwencję poszczególnych alleli, genotypów oraz haplotypów pod względem genu CAST i CAPN3. Stosując test zgodności rozkładu χ 2 sprawdzono czy populacja jest w równowadze genetycznej Hardy - Weinberga. Analizę wpływu polimorfizmu genów kalpainy (CAPN3) i kalpastatyny (CAST) na badane cechy użytkowości mięsnej u owiec dokonano stosując wieloczynnikową analizę wariancji wykonaną z zastosowaniem dwóch modeli, oddzielnie dla każdej stosowanej metody, osobno 3

dla każdej rasy owiec. Wszystkie analizy statystyczne wykonano z wykorzystaniem programu Statistica v.12 (Statsoft). Na podstawie przeprowadzonych badań w poprawny i przejrzysty sposób Doktorantka przeprowadziła w rozdziale Wyniki i jego podrozdziałach oraz rozdziale Dyskusja badań własnych, szczegółową analizę wyników odnosząc je zarazem do literatury naukowej. Wykonując pracę doktorską Pani mgr inż. Anna Wojciechowska wykazała się dużym zrozumieniem tematyki badań. Uzyskane przez Autorkę wyniki są interesujące, zwłaszcza, że dotyczą rodzimych ras owiec. Wykorzystując metodę PCR-RFLP w analizie polimorfizmu genu CAST u badanych trzech ras owiec Doktorantka zastosowała 3 enzymy restrykcyjne (MspI, NcoI Hin6I), otrzymała po 2 allele w przypadku cięcia każdym z ww enzymów, ale otrzymała nie 9 rodzajów genotypów jak pisze w dysertacji na stronie 40 tylko 8, gdyż pod względem enzymu NcoI nie stwierdziła genotypu NN (dane z tabeli 8). W sumie odnotowano u 3 badanych ras owiec 5 haplotypów (a, b, c, d, e) oraz 8 genotypów (aa,ab, ac, ad, ae,cc, cd, ee). Doktorantka dowiodła, iż: - występuje istotny wpływ polimorfizmu w genie CAST (wykorzystanie enzymu restrykcyjnego MspI) na masę ciała w 56. dniu życia jagniąt rasy kamienieckiej oraz na masę ciała w 56. dniu życia jagniąt i przyrosty dobowe w badanej populacji merynosa barwnego, a także polimorfizmu wykrytego przy zastosowaniu endonukleazy Hin6I - istotny wpływ na masę ciała w 2. dniu życia jagniąt rasy kamienieckiej. - wpływ genotypu pod względem genu CAPN3 na wyniki użytkowości rzeźnej tryczków merynosa barwnego w odniesieniu do następujących cech: masa tkanki kostnej w udźcu oraz procentowa zawartość tkanki mięśniowej w udźcu. Stwierdzono istotne statystycznie różnice pomiędzy osobnikami o genotypach CAPN3*02 CAPN3*02 i CAPN3*01 CAPN3*01. Autorka ponadto stwierdza, iż uzyskane wyniki są podstawą do dalszych badań na większych populacjach i innych rasach owiec. Wnioski odnoszą się do przeprowadzonych badań, mają charakter ogólny, trafnie odpowiadają na cele postawione w pracy. 3. Uwagi krytyczne i dyskusyjne Język pracy jest poprawny, jakkolwiek zauważa się drobne nieścisłości w tekście, które jednak nie umniejszają wartości naukowej niniejszej pracy. Nasuwają się także następujące uwagi: 4

Dotyczące 2. Przeglądu literatury: Podrozdział 2.1 - str. 12 powinno być w chromosomie, a nie na chromosomie ; - str. 12 ostatnie zdanie gen kandydujący na cechy mięsa owczego gen kandydujący danej cechy, a nie na daną cechę. Uwaga dotyczy także Podrozdziału 2.4 str. 15. Gen kandydujący jest to sekwencja DNA (gen) w chromosomie, którą podejrzewa się za prawdopodobną przyczynę choroby lub związek z odpowiednim poziomem fenotypowym danej cechy. Zdanie ostatnie ze strony 12 a także zdanie następne na str. 13 należy przeredagować pod kątem stylistycznym. Podrozdział 2.2 - str. 13. W pracy zastosowana została nazwa rasy - owca romney - w Polsce nazwa stosowana dla tej rasy to rasa kent - uwaga dotyczy całej pracy. -str. 13 nieodpowiedni zapis nazwy loci. W pracy jest: MspI/CAST; NcoI/CAST; Hin6I/CAST; TaqI/CAST, a powinna być pisana najpierw nazwa genu, a potem nazwa enzymu restrykcyjnego np.: CAST/MspI itp. Uwaga dotyczy całej pracy, także rozdziału Wyniki str. 25-29 i Dyskusja str. 32-39, Podsumowanie i wnioski str. 40, oraz Streszczenie str. 41 i tabeli 3. Podrozdział 2.3. - str. 14 Zdanie Ponadto odkryto kalpainy nietypowe u drożdży, grzybów, insektów powinno być Ponadto odkryto kapaliny nietypowe u drożdży, grzybów, owadów. -str.15 W pracy jest Podjęto próby i wykazano powiązania polimorfizmu z wybranymi cechami użytkowości mięsnej badanych owiec, takimi jak: masa ciała po urodzeniu, masa ciała po odsadzeniu od piersi matki, masa ciała po całkowitym odsadzeniu..., powinno być Podjęto próby i wykazano powiązania polimorfizmu z wybranymi cechami użytkowości mięsnej badanych owiec, takimi jak: masa ciała po urodzeniu, masa ciała po odsadzeniu.... Podrozdział 2.5 - str. 16. Zdanie Są one dziedzicznymi sekwencjami DNA, które ujawniają się utworzeniem lub zanikiem fragmentu rozpoznawanego przez endonukleazy restrykcyjne albo zmianę liczby nukleotydów między tymi lokalizacjami wymaga przeredagowania. - str. 16 W pracy jest... po wcześniejszej amplifikacji produktu, powinno być... po wcześniejszej amplifikacji produktu PCR. - str. 16 W pracy jest Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne miejsca w dwuniciowym DNA..., powinno być Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje w dwuniciowym DNA.... 5

- str. 16. W pracy jest Wynik reakcji wizualizowany jest w świetle UV na żelu agarozowym..., powinno być Wynik reakcji wizualizowany jest w świetle UV w żelu agarozowym.... - str. 16 Zdanie W celu rozdziału produktu PCR przeprowadzana jest elektroforeza pionowa na żelu poliakrylamidowym..., powinno być W celu rozdziału produktu PCR przeprowadzana jest elektroforeza pionowa w żelu poliakryloamidowym.... - str. 16. Doktorantka w rozdziale Przegląd literatury pisze W celu wizualizacji żeli wykorzystywany jest zestaw dedykowanych odczynników Silver Stain DNA Kit. Chciałabym nadmienić, że w laboratoriach do barwienia żeli poliakryloamidowych stosowane są nie tylko metody komercyjne, ale także inne bardzo skuteczne metody barwienia srebrem. Do rozdziału Materiał i Metody Uwaga generalna nie litera x ale znak iloczynu powinien być stosowany w przypadku opisu stężeń i znaku matematycznego mnożenia (iloczynu dotyczy str. 21). Podrozdział 3.2 - str. 17 Brak informacji w całej pracy o tym, czy uzyskano zgodę stosownej komisji etycznej na pobieranie krwi od zwierząt wykorzystanych w doświadczeniu. - str. 17 Powinno być wyizolowany DNA, a nie Wyizolowane DNA..., gdyż kwas dezoksyrybonukleinowy jest rodzaju męskiego. Podrozdział 3.3 - str. 18. W pracy jest na żel agarozowy nanoszono DNA..., powinno być do kieszonek żelu agarozowego nanoszono DNA.... - str. 18. W pracy jest Obecność na żelu prążka..., powinno być obecność w żelu prążka.... - str. 18 i str. 19 Jeśli praca doktorska jest napisana w języku polskim, to należy stosować odpowiednie określenia fachowe także w tym języku tzn. nie primery tylko startery; nie elongacja tylko wydłużanie, nie annealing tylko hybrydyzacja. - str. 19 Zdanie wzorcem masy molekularnej użytym na żelu..., powinno być wzorcem masy molekularnej użytym w żelu.... - str. 19 Obecność jednego prążka o długości 168 pz, świadczyła o prawidłowym przebiegu reakcji PCR o nazwie CAPN3, natomiast obecność prążka o długości 622 pz reakcji PCR o nazwie CAST jest to zbędna informacja, gdyż czytelnika nie interesuje jak Autor nazwie poszczególne reakcje PCR. 6

Podrozdział 3.5 - str. 19 Nazwa enzymu restrykcyjnego w przeważającej jej części powinna być pisana kursywą tzn. pierwsza litera nazwy rodzaju i dwie pierwsze litery nazwy gatunkowej np. AluI. Podrozdział 3.6 - str. 20 Brak informacji jaki obciążacz tzn. o jakim składzie zastosowano w analizie MSSCP. - str. 20 W pracy jest Elektroforezę wykonano na 10% żelu poliakrylamidowym., powinno być Rozdział elektroforetyczny dokonano w 10% żelu poliakryloamidowym. Podrozdział 3.7 - str. 20 Nieprawidłowo nazwano zarówno poszczególne allele genu CAPN3, jak i genotypy - uwaga dotyczy całej pracy także rozdziału Wyniki str. 25-27, str. 30-31, rozdziału Dyskusja str. 38 i 39, Podsumowanie i wnioski str. 40, oraz Streszczenie str. 41. oraz tabel: 6 i 10, ryciny 5. Według nomenklatury genetycznej NCBI nazwy alleli powinny być następujące: CAPN3*01; CAPN3*02; CAPN3*04, a nazwy genotypów: CAPN3*01*01; CAPN3*01*02; CAPN3*02*02; CAPN3*01*04. Proszę o wyjaśnienie, dlaczego zastosowano taki, a nie inny zapis genotypów (01'01; 01'02; 02'02; 04'01) oraz nieprawidłową kolejność alleli w genotypie 04'01, zamiast CAPN3*01*04. Podrozdział 3.8 - str. 21 Czy Doktorantka sama kontrolowała masę ciała i przyrosty jagniąt? Jeśli nie, to wydaje mi się, że Autorka powinna napisać, że tę część pracy/analiz wykonał ktoś inny, obecna forma budzi wątpliwości i nie jest zrozumiała i wystarczająca dla czytelnika. Podrozdział 3.9 - str. 22 Liczba mnoga locus, to loci. - str. 23 W modelu 2 brakuje przy błędzie losowym w legendzie litery m. Nazwy łacińskie należy pisać kursywą. - str. 23 Cytowanie pakietu Statistica v.12.0 nie jest pełne - powinno być uzupełnione o rok wprowadzenia na rynek. Do rozdziału 4 Wyniki Podrozdział 4.1 - str. 24 Co Doktorantka ma na myśli pisząc DNA charakteryzował się zadowalającym stężeniem? Tzn. jakim? 7

Brak w tym rozdziale powołania się na ryciny własne, które by pokazały prawidłowość amplifikacji sekwencji badanych genów. Takich rycin nie zamieszczono w pracy. Podrozdział 4.2 - str. 24. Zdanie Zastosowanie wyżej wymienionych enzymów powodowało wystąpienie różnic w długościach produktów otrzymanych po trawieniu amplikonów o długości 622 pz uzyskanych w reakcji powielania fragmentu genu CAST należy przeredagować pod kątem stylistycznym. Podrozdział 4.4 - str. 26 Zdanie zaczynające się W obrębie wszystkich badanych populacji jagniąt..., powinno być w następującej formie W obrębie wszystkich badanych populacji.. lub W obrębie wszystkich badanych ras owiec.. - str. 26 Zdanie we wszystkich analizowanych loci CAST wśród badanych jagniąt..., powinno być u jagniąt badanych ras owiec. Pragnę zauważyć, że gen kalpastatyny (CAST) ma swój locus, a Doktorantka analizowała polimorfizm fragmentów restrykcyjnych w obrębie genu. - str. 32 W rozdziale Dyskusja zdanie wymaga przeredagowania Analizy PCR-RFLP pozwoliły zidentyfikować genotypy genu kalpastatyny w locus MspI, NcoI, Hin6I w populacjach jagniąt trzech ras: Po pierwsze jak można zidentyfikować genotypy w locus, po drugie MspI, NcoI, Hin6I, to enzymy restrykcyjne, a nie loci, po trzecie nie populacja jagniąt, raczej jagnięta pochodziły z danej populacji owiec, czy rasy owiec. Ponieważ powyższe nieścisłości pojawiają się w kilku miejscach w pracy, dlatego też proszę o wyjaśnienie przez Doktorantkę pojęć: locus i populacja. Podrozdział 4.5 W pracy powinien być zastosowany czas przeszły. Podrozdział 4.6 - str. 27-31 W omówieniu wyników podając wartości średnie cech należy także podawać wartość odchylenia standardowego. Do rozdziału 5 Dyskusja - str. 32 W ostatnim zdaniu brakuje nazwy rasy owiec arabskich pochodzących z Iranu. - str. 33 Elyasi i wsp., z 2009 r. prowadzili badania na dwóch rasach owiec i ich mieszańcach, a nie trzech rasach owiec, jak w pracy pisze Doktorantka. 8

- str. 35 Zdanie Wszystkich pięciu haplotypów nie stwierdzono u żadnej z badanych ras owiec, jak i zdanie na str, 36 Do podobnych do badań własnych stwierdzeń doszli Khan i wsp. (2012) - wymagają poprawy stylistycznej. Do Rozdziału 6. Podsumowanie i wnioski - str. 40 w pkt. 1. Metoda PCR-RFLP, która została wykorzystana w badaniu nad polimorfizmem genu kalpastatyny w populacji owiec kamienieckich, pomorskich i merynosa barwnego pozwoliła zidentyfikować allele i genotypy genu CAST w locus: MspI (allele: M i N oraz genotypy: MM, MN, NN) NcoI (allele: M i N oraz genotypy: MM, MN, NN) Hin6I (allele: A i B oraz genotypy: AA, AB, BB) co dało łącznie pięć haplotypów (a,b,c,d,e) oraz osiem genotypów (aa, ab, ac, ad, ae, cc, cd, ee). Nie można określić genotypu w locus genu. ad pkt5. Należy napisać polimorfizm genu a nie polimorfizm w genie. Uwagi do rozdziału 7. Literatura W spisie literatury pominięto 10 następujących publikacji, które zostały zacytowane w pracy: Chung i wsp., 2009 str. 11; Dedien i wsp., 2003 str. 12; Koćwin -Podsiadła i wsp., 2003 str. 13; Dehnav i wsp., 2011 str. 13; Mohammadi i wsp., 2008 str.: 13, 32, 33; Szkudlarek - Kowalczyk, 2014 str.: 13, 36, 37; Lee i wsp., 2008 str. 14; Dehnavi i wsp., 2008 a czy str.: 15, 32, 33, 34, 36; Gabor i wsp., 2009 str.: 32, 33; Wiśniewska i wsp., 2011 str. 34. Niektóre pozycje literatury nie są ułożone alfabetyczne i nie mają ujednoliconego zapisu. Pierwszy autor na liście w rozdziale Literatura powinien być cytowany w tekście (Ahani Azari i wsp., 2012), a nie tak jak cytuje Doktorantka w pracy Azari i wsp., 2012. Uwagi do tabel: - str. 54 tabela 2 - Jaki bufor został wykorzystany w każdej z analiz restrykcyjnych (MspI, NcoI, Hin6I)? - w tabeli 6 powinien być zapis G/T, a nie T/G, - w tabeli 8 str. 61 - brakuje nazwy enzymu restrykcyjnego Hin6I, - w tabeli 11 str. 69 - dane liczbowe w tabeli powinny być z przecinkiem, a nie kropką, - w tabeli 11, 12, 13 str. 69-76 - miana cech powinny być napisane w nawiasach. 9

Uwagi do rycin - Rycina 1, 2, 3: - na zdjęciach powinien być zamieszczony opis długości w parach zasad [pz] prążków standardu masy, jaki został wykorzystany w badaniach tj. pbr322 DNA/AluI. Nieprawidłowe tytuły rycin 1, 2, 3 np.: Rozdział elektroforetyczny fragmentów restrykcyjnych genu CAST w locus Hin6I To nie jest locus. Powinno być np.: Rozdział elektroforetyczny produktu PCR (fragmentu genu CAST) ciętego enzymen restrykcyjnym Hin6I. Jakość ryciny 1 i 2 jest bardzo słaba, wręcz można mieć wątpliwości, co do odczytanych wyników. - Na rycinie 3 przedstawiono tylko 1 rodzaj genotypów, a powinny być przedstawione wszystkie rodzaje, skoro w badaniach je zidentyfikowano. - Tytuł ryciny 4 należałoby uzupełnić o następujące informacje: rozdział elektroforetyczny w 10% żelu poliakryloamidowym metodą MSSCP. Z wyników przedstawionych na tej rycinie pierwszy genotyp CAPN3*01 CAPN3*02 nie różni się obrazem konformerów od następnego genotypu oznaczonego CAPN3*02 CAPN3*02. - w opisie w rozdziale Materiał i metody nie znalazłam informacji, czy w zastosowanej analizie produkt PCR był oczyszczony. Jeśli tak, to jakim zestawem komercyjnym, jeśli nie, to dlaczego nie dokonano oczyszczenia produktu PCR z nadmiaru reagentów przed zastosowaniem cięcia wybranymi enzymami restrykcyjnymi i przeprowadzeniem metody MSSCP. Dlaczego nie przeprowadzono rozdziału elektroforetycznego produktu PCR w jednej ze studzienek żelu (ryc. 1-3)? Obraz rozdziału tego produktu byłby informacją/ kontrolą czystości uzyskanego produktu PCR. Zapoznając się szczegółowo z treścią niniejszej rozprawy doktorskiej, pozbawionej uchybień, dostrzegłam tylko drobne nieścisłości, sporadyczne błędy stylistyczne, które z obowiązku recenzenta wymieniłam. Wyrażam przekonanie, iż powyższe uwagi nie umniejszają merytorycznej wartości pracy oraz jej walorom poznawczym. 4. Podsumowanie i wniosek końcowy Pracę doktorską pt. Analiza wpływu polimorfizmu genu kalpastatyny i kalpainy 3 w odniesieniu do cech użytkowości mięsnej wybranych ras owiec, autorstwa Pani mgr inż. Anny Wojciechowskiej oceniam pozytywnie. Stanowi ona oryginalny, znaczący, o znamionach innowacyjności dorobek naukowy. Rozprawa wnosi do literatury przedmiotu wiele istotnych, udokumentowanych informacji w zakresie m.in. identyfikacji polimorfizmów w obrębie genów CAST i CAPN3, a także możliwości późniejszego wykorzystania określonych alleli w doskonaleniu genetycznym cech związanych z użytkowością mięsną 10

owiec. Stwierdzam, że Doktorantka ma dobre przygotowanie merytoryczne, w wystarczającym stopniu opanowała metody badawcze zarówno laboratoryjne jak i statystyczne. Stwierdzam, że przedstawiona mi do oceny rozprawa naukowa spełnia wymogi stawiane kandydatom ubiegającym się o stopień naukowy doktora nauk rolniczych, dyscyplina zootechnika, określone w Ustawie z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. z 2003 r. Nr 65, poz.595 z późniejszymi zmianami; tj. Dz. U. z 2014 r. poz. 1852). W związku z powyższym przedkładam Wysokiej Radzie Wydziału Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego w Bydgoszczy wniosek o dopuszczenie mgr inż. Anny Wojciechowskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. 11